Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Wanderverhalten von Zellen innerhalb der dreidimensionalen Umgebung zu analysieren. Betten Sie zunächst die interessierenden Zellen in ein dreidimensionales Kollagengitter ein. Zeichnen Sie dann die Bewegung der Zellen durch Zeitraffer-Videomikroskopie auf, beschreiben Sie die Migrationsparameter durch computergestützte Zellverfolgung und analysieren Sie die Zellverfolgungsdaten mit einer Tabellenkalkulationssoftware.

Letztlich kann mit dieser Methode untersucht werden, welche Faktoren und Signaltransduktionswege die Wanderung von Krebszellen oder normalen Zellen wie Leukozyten, Lymphozyten und Stammzellen im Zusammenhang mit Krebs regulieren. Das Wissen über die Zellmigration, modulierende Faktoren und die damit verbundenen Signaltranssektionswege könnte daher hilfreich sein, um neue therapeutische Strategien zu entwickeln, um die Migration von Tumorzellen und die Ausbreitung von Metastasen zu beeinträchtigen. Für die Migrationskammern schnell zwei Schichten geschmolzenes Paraffinwachs, Vaseline auf die Mitte eines Objektträgers streichen, eine Abdeckung hinzufügen, gleiten und mit zwei Schichten der Paraffinwachs- und Vaselinemischung versiegeln.

Stellen Sie dann die Migrationskammern in aufrechter Position in einem Gestell auf 1,5 Milliliter Reaktionsgefäße. Fügen Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension für die Kollagensuspension hinzu. Kombinieren Sie 50 Mikroliter 10 XMEM und 27 Mikroliter 7,5%ige Natriumbicarbonatlösung und mischen Sie sie gründlich.

Fügen Sie dann 375 Mikroliter flüssige Kollagensuspension hinzu und mischen Sie gründlich, um eine hellviolette Farbe zu erhalten, die einen pH-Wert von 7,5 anzeigt. Fügen Sie nun 100 Mikroliter der endgültigen Kollagensuspension zu 50 Mikrolitern der Zellsuspension hinzu und mischen Sie gründlich, während Sie die Initiierung der Kollagenfaser beachten. Polymerisation. Bei einem pH-Wert von 7,5 wird die Mischung in die Migrationskammern überführt.

Klopfen Sie vorsichtig auf die Migrationskammer, um die Kollagensuspensionszellenmischung gleichmäßig auf dem Boden der Migrationskettenkammer zu verteilen. Stellen Sie die Migrationskammern in aufrechter Position in das Gestell und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang. Wenn das polymerisierte Kollagengitter leicht trüb, aber immer noch eine hellviolette Farbe hat, füllen Sie die Migrationskammern mit dem entsprechenden Medium und versiegeln Sie die Migrationskammer mit Paraffinwachs.

Vaseline-Mischung. Stellen Sie die Heizung des Mikroskoptisches mit einer 10-fachen Vergrößerung an der Migrationskammer auf 37 Grad Celsius ein. Fokussieren Sie ca. 50 Zellen oder mehr im Sichtfeld.

Zeichnen Sie die Zellenmigration im Zeitraffermodus mit einer Multi-Kamera-Videoüberwachungssoftware auf. Speichern Sie die Filme für die Zellmigration in einem geeigneten Dateiformat. Verknüpfen Sie die Filmdateien für die Zellmigration mit einer Datenbank, die unterstützende Informationen wie Zelltyp und Versuchsbedingungen enthält.

Analysieren Sie als Nächstes die Zellmigrationsfilme mit einer geeigneten Zellverfolgungssoftwareanwendung für eine unvoreingenommene Analyse. Wählen Sie die Zellen für die Analyse nach dem Zufallsprinzip aus, ohne zu wissen, ob die Zellen insgesamt migrationsaktiv sind, und bestimmen Sie in einem typischen Zellmigrationsexperiment etwa 60 XY-Koordinaten pro Zelle. Im Falle einer Zellteilung wählen Sie nach dem Zufallsprinzip eine Tochterzelle aus, die bei der Verfolgung verfolgt werden soll.

Analysieren Sie Zellverfolgungsdaten, indem Sie eine geeignete Softwareanwendung wie ein Tabellenkalkulationsprogramm verwenden, um die Gesamtentfernung zu berechnen, die eine Zelle migriert hat. Multiplizieren Sie die Summe der numerischen Pixelwerte mit einem Korrekturfaktor für die Umrechnung in Mikrometer. Definieren Sie die Zellen, die weniger als den Schwellenwert von 25 Mikrometern überschritten haben, als nicht bewegliche Zellen, und ersetzen Sie die numerischen Werte durch ein Komma.

Berechnen Sie als Nächstes die Fortbewegungsaktivität als Prozentsatz der Zellen der verfolgten Zellpopulation, die sich zwischen zwei Zeitpunkten bewegt haben. Berechnen Sie außerdem die Zeit der aktiven Bewegung als Prozentsatz der Gesamtzeit, die eine Zelle im Verhältnis zum Zeitraum des Beobachtungszeitraums migriert wurde. Berechnen Sie dann die statistische Signifikanz mit dem Man-Whitney-U-Test und zeigen Sie die Zellmigrationsdaten an.

Eine typische Datendatei zur Zellverfolgung ähnelt einer Tabelle, in der jede Spalte für eine nachverfolgte Zelle steht. Die Zeilen enthalten die Positionsinformationen zur Zellbewegung. Im Laufe der Zeit kann das Bewegungsverhalten von Zellen durch die mittlere lokomotorische Aktivität der analysierten Zellpopulation und auch durch die Zeit der aktiven Bewegung charakterisiert werden.

Dieses Beispiel zeigt die Migrationsaktivitäten von 120 Zellen aus vier unabhängigen Experimenten. Jede Raute zeigt an, dass sich eine Zelle zwischen mindestens zwei Zeitpunkten bewegt hat. Die grauen Linien unterscheiden die beweglichen und nicht beweglichen Zellen.

Der Parameter der Lokaktivität kann als XY-Diagramm oder Boxplot dargestellt werden. Um die Dynamik der analysierten Zellpopulation zu visualisieren, zeigt ein Histogramm effektiv die aktive Zeit dieser Zellen an. Diese Analyse des Migrationsverhaltens von MDA HER2- und M-D-A-N-E-O-Brustkrebszelllinien deutet darauf hin, dass beide Zelllinien eine ähnliche spontane Bewegungsaktivität aufwiesen.

Der Parameter aktive Zeit zeigte eine etwas höhere Anzahl von spontan bewegten M-D-A-H-E-R-Zellen im Vergleich zu M-D-A-N-O-Brustkrebszellen. Die Stimulation mit 100 Nanogramm pro Milliliter EGF führte zu einer signifikant erhöhten Migrationsaktivität von MDA HER2, gemessen an der Anzahl der sich bewegenden Zellen und der Zeit der aktiven Bewegung. Interessanterweise migrierten M-D-A-N-E-O-Zellen als Reaktion auf EGF-Stimulation und zeigten ein zeitlich verschobenes aktives Muster. Die Behandlung mit dem Phospholipase c gamma one Inhibitor uc 3 1 22 reduzierte sowohl die spontane als auch die EGF-induzierte Migration sowohl von M-D-E-E-R two als auch von MDAN.

EEO-Zellen. Die Analyse des Time-Active-Parameters zeigte, dass die Behandlung von MDAN EEO-Zellen mit zwei Mikromolaren von U 7 3 1 2 2 zu einer deutlich verminderten lokomotorischen Aktivität führte, die hauptsächlich auf eine erhöhte Anzahl unbeweglicher Zellen zurückzuführen war. Einmal gemeistert, kann die Migration von Lymphozyten und Leukozyten in ein dreidimensionales Kollagen in etwa zwei Stunden aufgezeichnet werden, wobei Tumorzellen über Nacht aufgezeichnet werden.