Name: Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Anastasis in Säugetierzellen mit Live-Zell-Mikroskopie und Biosensoren nachweisen und verfolgen. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Umkehr von Apoptose und deren Folgen für die Zellbiologie.

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Wir danken Rev. Dr. Ralph Bohlmann und Rev. Dr. James Voelz für die Annahme, die das Wort &quot;Anastasis&quot;, um Umkehr der Apoptose zu beschreiben; Douglas R. Green für HeLa-Zellen, die Cytochrom-c--GFP; Charles M. Rudin und Eric E. Gardner für H446-Zellen; Heather Lamb für die Unterstützung bei Cartoon-Zeichnung auf dem Video; Yee Hui Yeo für wertvolle Diskussion des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von einem Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), die Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (HLT), Fulbright-Stipendium 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation Fellowship (HLT) unterstützt wird, gewährt NIH NS037402 (JMH) und NS083373 (JMH) und University Grants Committee der Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang ist ein Shurl und Kay Curci Foundation Fellow der Life Sciences Research Foundation.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Anastasis bezieht sich auf das Phänomen, bei dem Zellen, Zelltod aktiviert haben danach rückgängig den Sterbeprozess und zu überleben. Hier haben wir gezeigt, dass die Abbildung lebender Zellen verwendet werden, um zu bestätigen, dass die gleichen Einzelzellen in der Tat kann Apoptose-Prozess in einer späten Phase umkehren, und dann weiter überlebende und Wiedergabe werden. Unsere Protokolle beschreiben mehrere optimierte Zelltyp-spezifischen Behandlungsbedingungen, Apoptose zu induzieren und lassen einen großen Anteil ...

Apoptose (griechisch für &quot;fallen in den Tod&quot;) wird im Allgemeinen angenommen, dass ein einseitiger Prozess endet in Zelle Selbstmord 1-7 sein. Genetische Störung der pro-Tod Gene Ergebnisse in der Überlebensrate von zusätzlichen Zellen, die sonst in ganzen Tieren sterben würde, einschließlich Zellen, die bereits die Apoptoseweg 8,9 eingeleitet haben. Auch genetische Manipulationen ermöglichen gesunden Säugetierzellen, die künstlich Anzeige &quot;essen mich&quot; Signale oder die Haftfähigkeit zu verlieren, ihre extrazellulären Matrix zum Tod durch Ganzzell-Phagozytose oder entosis bzw. 10,11 entkommen. Jedoch haben wir und andere gezeigt, dass ohne genetische Manipulation normalen gesunden Säugetierzellen und Zelllinien, können auch aus den frühen Stadien der Apoptose 12-15 erholen. Mit Werkzeugen, einzelne Zellen zu verfolgen, haben wir weiter gezeigt, sich nach späten Stadien der Apoptose 12,13, nachdem Zellen wichtige Kontrollpunkte, dass typische gebenly markieren den &quot;point of no return&quot; 2-6. Diese Checkpoints Stufe Apoptose spät schließen mitochondrialen Freisetzung von Cytochrom c, Aktivierung von Caspasen, eine Kernfragmentierung und Bildung von apoptotischen Körpern. Wir nahm eine griechische gesetztes Wort &quot;Anastasis&quot;, das bedeutet &quot;stieg auf Leben&quot;, um diese Umkehrung der Apoptose am Rande der Zelltod 2-6 beschreiben. Es sei denn, die gesamte Sterbe-Recovery-Prozess wird von lebenden Zellen beobachtet wird, wird es eine Herausforderung, Zellen, die anastasis aus Zellen, die nie apoptotischen Ereignisse erlebt unterzogen haben zu unterscheiden. Die jahrzehntelange Arbeit haben gezeigt, dass die morphologischen Merkmale der Zelltod durch Apoptose durch evolutionär konservierte biochemischen und molekularen Ereignisse 16-19 angetrieben. Diese Veranstaltungen fördern die Selbstzerstörung der Zellen, Entwicklungs- und homöostatischen Prozesse in einzelligen und mehrzelligen Organismen durch die Beseitigung beschädigter oder d zu regelnangerous Zellen 16-19. Während apoptotischen Zellen können leicht durch standardisierte morphologischen, biochemischen und molekularen Manifestationen Apoptose 1,5,6,16,20 unterschieden werden, gibt es bisher keine bekannte Marker spezifisch anastasis 12,13. Wichtig ist, dass Zellen, die anastasis laufen haben scheinen normale gesunde Zellen und Zellen, die gerade beginnen Umkehr Apoptose erscheinen als apoptotische sterbenden Zellen 12,13 sein. Damit neue Werkzeuge erforderlich sind, um mit Gewissheit, dass ein bestimmter überlebenden Zellen zuvor erlebt aktiven apoptotischen Prozessen abzuschließen. Apoptose ist im Allgemeinen als eine irreversible Kaskade angenommen, weil es eine schnelle und massive Zerstörungsprozess. Man könnte zwar Minuten bis Tage dauern für einige Zellen, die Apoptose auslösen, sobald Mitochondrien apoptogene Faktoren wie Cytochrom c in das Cytosol freigesetzt 21,22 kann Caspasen innerhalb von 5 Minuten 23,24 aktiviert werden, gefolgt von cytoplasmatischen undKernkondensation innerhalb von 10 Minuten 25 bis 27, und Zelltod kurz danach 25-27. Aktivierte Caspasen dirigieren Apoptose durch Spaltung und Inaktivierung wichtigsten strukturellen und funktionellen Komponenten für die Zwecke der zellulären Abbruch 2,28, wie die Endonuklease-Inhibitor DFF45 / ICAD 29,30. Caspasen aktiviert auch pro-apoptotischen Faktoren wie BCL-2-Familienmitglied BID, die Mitochondrien transloziert mitochondriale Freisetzung von Cytochrom c 31,32 fördern. Caspase-Aktivität führt auch zu Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin als &quot;essen mich&quot; Signal für die Förderung der Phagozytose von sterbenden Zellen durch Makrophagen oder Nachbarzellen durch Phagozytose 33. Außerdem apoptotische Vorgänge machen Mitochondrien dysfunktional, Störung zellulärer Bioenergetik und Stoffwechsel 34,35,36. So scheint Erholung von solchen Zerstörung intuitiv unwahrscheinlich. Entgegen der ursprünglichen erwartentionen können Zellen die Apoptose Prozess noch in einem späten Stadium umzukehren. Durch die kontinuierliche Überwachung das Schicksal der sterbenden Zellen in Kultur, beobachteten wir die Reversibilität der Bühne Apoptose spät in einem Spektrum von primären Zellen und Zelllinien 12,13. Die Entfernung der Tod Reizes Erholung von den offenkundigen Eigenschaften der Apoptose, wie mitochondriale Fragmentierung, Chromatin-Kondensation, DNA-Schäden, Plasmamembran Blasenbildung, Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin, Freigabe der mitochondrialen Cytochrom C, Caspase-Aktivierung, Kernfragmentierung, Zellschrumpfung, und Bildung von apoptotischen Körpern. Diese Beobachtungen werfen unbeantwortete Fragen zu den Funktionen, Folgen und Mechanismen der Rekonvaleszenz. Um diese Fragen anzugehen, ist eine Voraussetzung, um zuverlässig zu identifizieren Zellen, anastasis unterzogen wurden. Hier beschreiben wir Live-Mikroskopieverfahren und eine Caspase Biosensor zum Nachweis von Zellen, die zuvor rückgängig gemacht haben, spät Apoptose und then überlebt.

<table><tbody><tr><td>LSM780 Konfokalmikroskopie</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenkulturschale</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Transparent CultFoi</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO2 unabhängiges Medium</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Rot CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmarkiertes Annexin V</td><td>Biovision</td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

strategien für die spurhaltung anastasis, einer zelle Überleben phänomen, das apoptose kehrt

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (griechisch für &quot;Rising to life&quot;) bezieht sich auf die Wiederherstellung von sterbenden Zellen. Bevor diese Zellen zu gewinnen, sie durch wichtige Kontrollpunkte der Apoptose, einschließlich mitochondriale Fragmentierung, Freigabe der mitochondrialen Cytochrom c in das Zytosol, Aktivierung von Caspasen, Chromatin-Kondensation, DNA-Schäden, Kernfragmentierung, Plasmamembran Blasenbildung, Zellschrumpfung, Zelloberflächenexposition bestanden haben Phosphatidylserin und Bildung von apoptotischen Körpern. Anastasis kann auftreten, wenn apoptotische Reize vor dem Tod entfernt, wodurch sterbenden Zellen zur Apoptose und möglicherweise anderen Todesmechanismen umzukehren. Daher erscheint anastasis physiologischen Heilungsprozesse, die auch beschädigte Zellen zu erhalten könnte unangemessen einzubeziehen. Die Funktionen und Mechanismen der Rekonvaleszenz sind noch unklar, zum Teil durch die begrenzte Tools zur Erkennung Ereignissen der Vergangenheit nach der Wiederherstellung der scheinbar gesunden Zellen behindert. Strategien zur Anasta erkennensis werden Studien über die physiologischen Mechanismen, die Gefahren von Untoten Zellen in Krankheitspathologie und potenziellen Therapeutika ermöglichen anastasis modulieren. Hier beschreiben wir effektive Strategien mit Lebendzellmikroskopie und eine Säugetier Caspase Biosensor zur Identifikation und Verfolgung anastasis in Säugerzellen.

Um die Auflösung der Apoptose zu untersuchen, werden Gewebekulturzellen zunächst auf einen Tod Reiz ausgesetzt, die Apoptose auslösen. Wenn die Zellen anzuzeigen Kennzeichen der Apoptose wird frisches Kulturmedium dann angewendet, um abzuwaschen den Reiz und bebrüten die sterbenden Zellen der Besserung (1A) zu ermöglichen. Hier ist die entscheidende Frage angesprochen, wie weit einzelne sterben kultivierten Zellen gegenüber Apoptose Fortschritt und noch anastasis eingehen können. Diese Frage lässt sich ...

Der Begriff Anastase bezieht sich auf das Phänomen, bei dem sterbende Zellen einen Zellselbstmordprozess in einem späten Stadium rückgängig machen, sich selbst reparieren und schließlich überleben. Hier demonstrieren wir Protokolle zum Nachweis und zur Verfolgung von Zellen, die einer Anastasierung unterzogen werden.

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Umkehrung des apoptotischen Zelltodprozesses und kultivierter Zellen durch Lebendzellmikroskopie zu erkennen und zu verfolgen. Gesunde Zellen breiten sich auf dem Substrat aus und enthalten röhrenförmige filamentöse Mitochondrien um den Zellkern. Wenn Zellen jedoch durch Apoptose Selbstmord begehen, weisen die sterbenden Zellen einzigartige morphologische Merkmale auf, um die Umkehrung der Apoptose zu erkennen und zu verfolgen.Die Zellen werden in Zellkulturschalen mit Glasboden plattiert. Der nächste Schritt besteht darin, eine Lebendzellfärbung durchzuführen, um Mitochondrien und Zellkerne zu markieren. Dies ermöglicht die Detektion morphologischer Merkmale gesunder und apoptotischer Zellen.Mittels Lebendzellmikroskopie werden die markierten gesunden Zellen dann einem Todesreiz ausgesetzt, um die Apoptose zu induzieren. Wenn Apoptose nachgewiesen wird, werden die sterbenden Zellen gewaschen und dann mit frischem Zellkulturmedium inkubiert, um die Zellwiederherstellung zu ermöglichen. Lebendzellbildgebung wird verwendet, um die Umkehrung der Apoptose und ihre Folgen wie Zellreparatur und Überleben zu erkennen und zu verfolgen, wie z. B. die morphologische Wiederherstellung bzw. Migration der Zellen. Apoptose ist eine Art des programmierten Zelltods, der eine wesentliche Rolle bei der Beseitigung unerwünschter oder gefährlicher Zellen in unserem Körper spielt.Es wird allgemein angenommen, dass dieser zellsynthetisierte Prozess irreversibel ist, denn sobald er begonnen hat, stirbt die Zelle sicherlich danach, wir haben jedoch entdeckt, dass sterbende Zellen den Zelltodprozess umkehren und dann überleben und sogar ableiten können. Sie haben mögliche kritische Schritte, die gezwungen waren, der Punkt mit geringer Rendite zu sein, wie z.B. Cyto C, Freisetzung, fallbasierte Aktivierung, Kernfragmentierung und apoptotische Körperbildung. Nach Rücksprache mit griechischen Experten nehmen wir einen Begriff an, einen Stillstand, der bedeutet, sich zum Leben zu erheben.Um das Phänomen der Umkehrung der Apoptose und anderer Zelltodprozesse zu beschreiben, ist die Anthese schwer zu erkennen, da die Zelle, die die Apoptose umkehrt, wie normale schwere Zellen aussieht. Durch kontinuierliche Mikroskopie von lebenden Zellen können wir jedoch feststellen, dass eine Anastasis in einem großen Teil der Zellen auftritt. Die Beherrschung dieser Technik ist wichtig, da sie es uns ermöglicht, die Nachbildung der Anthese zu studieren.Wir schlugen vor, dass diese Anthese das Gewebe schädigen könnte, aber auch schädigenden Zellen das Überleben und die Bildung von Krebs ermöglichen könnte. Daher könnte uns die Identifizierung von Mechanismen, die Anästhesien steuern, neue Ansätze zur Behandlung von injizierbaren Krankheiten wie Krebs, Herzinsuffizienz und Degeneration bieten, indem sie den Zelltod und das Überleben vermitteln, um Anastasen zu erkennen und zu verfolgen. Nach apoptotischen Ereignissen wird eine Zeitraffer-Lebendzellmikroskopie durchgeführt, um zu verfolgen, welche Zellen die Apoptose nach einer vorübergehenden Zelltodinduktion umkehren können.Geben Sie zunächst einen Milliliter Poly-de-Lycine-Lösung in eine 35-Millimeter-Zellkulturschale mit dünnerem Glasboden. Nach einer einminütigen Inkubation zur Beschichtung der Glasoberfläche aspirieren Sie die Lösung und waschen das Glas mit zwei Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung Zur Vorbereitung der Zellen zuerst Trypsin Augen, Ferse Zellen bei 80 bis 90% Konfluenz Nachdem sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie 10 Milliliter 37 Grad Celsius Medium hinzu, um die Zellen zu suspendieren. Übertragen Sie dann die Zellsuspensionslösung in ein steriles 10-Milliliter-Röhrchen, um sie ein bis zwei Minuten lang bei 160-fachem G zu zentrifugieren.Nach dem Schleudern das Medium vorsichtig ansaugen. Stören Sie nicht das Küvettenpellet am Boden des Rohrs. Fahren Sie fort, die Zellen mit 10 Millilitern Zellkulturmedium durch vorsichtiges Pipettieren zu resuspendieren.Dann sehen Sie zwei Milliliter der suspendierten Zellen auf 35 Millimeter vorbeschichtetem Glas. Zellkulturschalen am Boden. Inkubieren Sie die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid für einen Tag.Eine Anpassung der Zellzahl kann erforderlich sein, damit die Zellen zum Zeitpunkt der Bildgebung eine Co-Flüssigkeit von 80 % erreichen können. Mitochondriale und nukleäre Fragmentierung sind die morphologischen Kennzeichen der Apoptose. Um Mitochondrien und Zellkerne sichtbar zu machen, führen Sie die Färbung kurz vor der Bildgebung von lebenden Zellen durch.Beginnen Sie das Färbeprotokoll, indem Sie zunächst zwei Mikroliter mitochondriale Färbung hinzufügen. MIT tracker red 50 mikromolare Stammlösung und zwei Mikroliter DNA-Fleck mit 3 3 3 4 2 10 Milligramm pro Milliliter Stammlösung in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen geben, einen Milliliter des konditionierten Kulturmediums aus der Zellkulturschale in das Mikrozentrifugenröhrchen geben und durch Pipettieren gut mit den Flecken vermischen. Gib die Mischung dann zurück in die Kulturschale.Nachdem Sie die Schale 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubiert haben, aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die gefärbten Zellen dreimal mit einem Milliliter warmer Zellkultur, Medium oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Dann inkubieren Sie die Zellen mit Zellkulturmedium bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für weitere fünf Minuten. Vermeiden Sie eine längere Färbezeit, da das unspezifische Hintergrundsignal der Färbezellen aufgrund einer Überfärbung zunehmen könnte.Nach der Inkubation aspirieren Sie das Medium, waschen die Zellen erneut und inkubieren die Zellen dann weiter mit zwei Millilitern Zellkulturmedium bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Die Mikroskopkomponenten müssen ein thermisches Gleichgewicht erreichen, um die Drift des Fokus und die Verschiebung der XY-Ebene aufgrund der thermischen Ausdehnung und Kontraktion der Komponenten zu vermeiden. Um sicherzustellen, dass ein thermisches Gleichgewicht erreicht wird, schalten Sie die Klimakontrollkammer und den Tischinkubator ein, um das Mikroskop mindestens zwei Stunden vor Beginn der Bildgebung auf 37 Grad Celsius vorzuwärmen.Schalten Sie dann den Kohlendioxidregler ein, um 5 % Kohlendioxid in die Klimakontrollkammer zu leiten. Wenn die Kohlendioxidversorgung nicht verfügbar ist, kann ein kohlendioxidunabhängiges Medium zur Unterstützung des Zellwachstums verwendet werden. Geben Sie vor der Bildgebung einen Tropfen Immersionsöl direkt auf ein 40-fach-Objektiv mit einer numerischen Apertur von 1,4.Positionieren Sie dann die Kulturschale mit den gefärbten Zellen vorsichtig auf dem 37 Grad Celsius warmen Tischinkubator. Decken Sie die Schale mit transparenter Kaltfolie ab, um Wasserverlust durch Verdunstung und Kontamination der Probe zu verhindern und eine differentielle Interferenzkontrastmikroskopie durchzuführen. Verwenden Sie nicht die Abdeckung der Kulturschale aus Kunststoff, da Kunststoff die Polarität des Lichts stören kann.Lokalisieren und fokussieren Sie sich als Nächstes auf eine Gruppe gesunder Zellen, die sich auf der Glasoberfläche mit röhrenförmigen Mitochondrien und runden Kernen ausbreiten. Wählen Sie die Zellen in oder in der Nähe der Mitte der Kulturschale aus, um sicherzustellen, dass sich die Zellen in derselben Fokusebene befinden, sobald sie an Ort und Stelle sind, und nehmen Sie eine schnelle Belichtung durch konfokale Mikroskopie vor, um die minimale Laserintensität und Belichtungszeit zu bestimmen und klare Bilder der Zellen und ihrer Organellen zu erhalten. Dieser Schritt ist entscheidend.Da Laserlicht für die Zellen phototoxisch ist, sind Optimierung und Anpassung erforderlich Um die Fokusdrift zu eliminieren, verwenden Sie ein kontinuierliches automatisches Fokusdrift-Kompensationsgerät, das eine Infrarotlichtdiode verwendet. Alternativ kann die Fokusebene auch manuell korrigiert werden. Wenn die Zellen und die Brennebene identifiziert sind, optimieren Sie alle Parameter und nehmen Sie ein Testbild auf, bevor Sie mit der Bildgebung lebender Zellen beginnen.Starten Sie dann die Live-Bildgebung, um die gesunden Zellen in Intervallen von einer Minute für 10 Zyklen abzubilden, um die Apoptose zu induzieren. Entfernen Sie das Zellmedium mit einer transparenten Pipette. Tragen Sie einen Zelltod-Stimulus auf, der mit einem 37 Grad Celsius heißen Zellkulturmedium vorgemischt ist.Decken Sie die Schale weiter mit transparenter Kultfolie ab. Während der Zeitrafferbildgebung nach Anwendung des Zelltodstimulus passen Sie das Zeitintervall an, um die behandelten Zellen abzubilden, um Apoptose zu erkennen, indem morphologische Merkmale der Apoptose wie Plasmamembran-Blobbing, mitochondriale Fragmentierung, Kernkondensation und -fragmentierung, zytoplasmatische Kondensation, Zellschrumpfung und apoptotische Körperbildung erfasst werden. Wenn Apoptose beobachtet wird, entfernen Sie das Medium mit dem Zelltodreiz und tragen Sie zwei Milliliter frisches Zellkulturmedium auf, um die Zellen zu inkubieren.Setzen Sie die Zeitraffer-Bildgebung fort, um die morphologische Erholung der Zellen und die Folgen der Anastasierung zu beobachten. Nach Entfernung eines Zelltod-Stimulus, der den menschlichen Lungenkrebs stirbt, können H4-46-Zellen die Apoptose umkehren. Obwohl die Zellen Merkmale der Apoptose aufweisen, wie z. B. Zellschrumpfung, Membranblasen, mitochondriale Fragmentierung, Kernkondensation sowie Fragmentierung und Apoptose, kann die Körperbildung nach der Anastasiszellteilung abnormal sein.In diesem Beispiel werden nach der Zellteilung anstelle von zwei Dotter-Kernen drei Hauptkerne gebildet, wobei sich Mikrokerne bilden, was auf genetische Veränderungen in den Dotter-Zellen hinweist. Dies deutet darauf hin, dass die Anastase mutagen sein könnte, nachdem eine Zelle einem Zelltodreiz ausgesetzt wurde. Pro-apoptotische Faktoren translozieren in die Mitochondrien, um die Freisetzung von Cytochrom C auszulösen, was zur Assemblierung eines Protosoms und einer gussbasierten Aktivierung für die Zellzerstörung und dann zum Zelltod führt.Hier sind HELOC-Zellen, die GFP-markiertes Cytochrom C exprimieren, das nach Induktion der Apoptose in den Mitochondrien lokalisiert ist. Cytochrom C wird in das Zytosol abgegeben. Nachdem die Zellen jedoch gewaschen und dann mit frischem Medium Cytosol inkubiert wurden, sinkt ex Cytochrom C wieder auf das normale Niveau, was darauf hindeutet, dass eine Anastasierung nach der Freisetzung von Cytochrom C auftreten kann.Hier sind Helazellen zu sehen, die den CA-basierten Biosensor N-E-S-D-E-V-D-Y-F-P-N-L-S exprimieren, der nach Apoptose-Induktion wie erwartet zuerst im Zytosol lokalisiert ist. Y-F-P-N-L-S transloziert in den Zellkern aufgrund der Spaltung von DEVD durch aktivierte gegossene Basen. Nachdem jedoch der Todesreiz abgewaschen und die Zellen mit frischem Medium inkubiert wurden, verbleibt Y-F-P-N-L-S im Zellkern, während die Zellen wieder ihre normale Morphologie annehmen, was darauf hindeutet, dass eine Umkehr-VA-Ptosis nach Aktivierung der gegossenen Base auftreten kann.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Bildgebung lebender Zellen verwenden können, um Anthesen und ihre Folgen zu erkennen. In dieser Demonstration verwenden wir Ethanol als ATO-Induktor. Gleichzeitig kann die Zelle den Zelltodprozess umkehren, der durch andere Todesreize wie Teso DMSO und Sporin induziert wird. Fluoreszierendes Licht ist phototoisch für die Zellen, so dass es entscheidend ist, die Nächte zu minimieren, in denen eine Probe während der Bildgebung lebender Zellen erhitzt wird.Der Prozess der Apoptose und der nächtlichen Anastase hängt von temperaturempfindlichen und sematischen Aktivitäten ab. Daher ist es wichtig, die Zellen während des Experiments auf der gleichen Temperatur zu halten, um wiederholbare Ergebnisse zu gewährleisten.

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Forschung

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Biology

Biologie

Wir stellen eine einfache Protokoll zu Bereichen programmierten Zelltod (PCD) in Mausembryonen und Differenzieren embryonalen Stamm (ES)-Zellkulturen unter Verwendung eines gut löslichen Farbstoff genannt LysoTracker visualisieren.

Verwendung LysoTracker zum programmierten Zelltod in Embryonen Erkennen und Differenzieren embryonalen Stammzellen

Beitrag des ACF Chromatin-Remodeling Faktor E4orf4-induzierten Zelltod wurde gemessen. Das Protokoll umfasst Selektion von Zellklonen, in denen Doxycyclin Behandlung induziert bedingten Knockdown des ACF-Untereinheiten und Acf1 SNF2h, und die Verwendung des Assay E4orf4 DAPI-induzierten Zelltod in den induzierbaren Zelllinien messen.

Vorbereitung der Cell-Linien für Conditional Knockdown der Genexpression und Messung der Knockdown Auswirkungen auf E4orf4-induzierten Zelltod

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU) -Aufnahme, die zeitliche Verfolgung von Zellen, die in der S-Phase auf einen bestimmten Zeitpunkt waren ermöglichen. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und Antikörpermarkierung erleichtert die detaillierte Analyse des Schicksals der S-Phasen-Zellen zu späteren Zeitpunkten.

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

Hier beschreiben wir eine Methode der Langzeit-Zeitraffermikroskopie, um einzelne Zellen als Reaktion auf Anti-Krebs-Therapeutika longitudinal zu verfolgen.

Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren

Anastasis ist technisch anspruchsvoll, um in Vivo zu erkennen, da die Zellen, die der Zelle Todesprozess umgekehrt haben morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen sein können. Hier beschreiben wir Protokolle für die Erkennung und Verfolgung von Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen, durch den Einsatz unserer neu entwickelten in Vivo -CaspaseTracker-Biosensor-System.

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bestimmung intrazellulärer Signalereignisse, die in lebensfähigen Zellen durch physikalische Interaktion mit benachbarten toten oder sterbenden Zellen induziert werden. Das Protokoll konzentriert sich auf Signalereignisse, die durch Rezeptor-vermittelte Erkennung der toten Zellen induziert werden, im Gegensatz zu ihrer phagozytären Aufnahme oder Freisetzung löslicher Mediatoren.

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Live Cell Imaging bietet eine Fülle von Informationen über einzelne Zellen oder ganze Bevölkerungen, die unerreichbar ist von festen Cell imaging allein. Hier werden live-Cell imaging Protokolle Zelle Schicksal Entscheidungen nach der Behandlung mit Anti-mitotische Droge Paclitaxel bewerten beschrieben.

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur isolieren Apoptotic Brustkrebszellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und weiter den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen zu Brustkrebs-Stammzellen-ähnliche Zellen nach Apoptose Umkehr zu erkennen, indem Durchflusszytometrie.

Flow durchflusszytometrischen Erkennung von neu gebildeten Stammzellen-wie Brustkrebszellen nach Apoptose Umkehr

Die vorgestellte Methode kombiniert die quantitative Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusverteilung und Apoptose, um eine zellzyklusspezifische Auswertung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers zu ermöglichen.

Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse durch Fluoreszenz-Imaging. Das Verfahren nutzt ein zirkular permutiert YFP-basierte Dual-Anregung ratiometrische Calcium-Sensor (ratiometrisch PERICAM-mt) selektiv in den Mitochondrien zum Ausdruck gebracht.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Erfahren Sie, wie Sie Anastasis in Säugetierzellen mit Live-Zell-Mikroskopie und Biosensoren nachweisen und verfolgen. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Umkehr von Apoptose und deren Folgen für die Zellbiologie.

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