Name: Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Anastasis in Säugetierzellen mit Live-Zell-Mikroskopie und Biosensoren nachweisen und verfolgen. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Umkehr von Apoptose und deren Folgen für die Zellbiologie.

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Wir danken Rev. Dr. Ralph Bohlmann und Rev. Dr. James Voelz für die Annahme, die das Wort &quot;Anastasis&quot;, um Umkehr der Apoptose zu beschreiben; Douglas R. Green für HeLa-Zellen, die Cytochrom-c--GFP; Charles M. Rudin und Eric E. Gardner für H446-Zellen; Heather Lamb für die Unterstützung bei Cartoon-Zeichnung auf dem Video; Yee Hui Yeo für wertvolle Diskussion des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von einem Sir Edward Youde Memorial Fellowship (HLT), die Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (HLT), Fulbright-Stipendium 007-2009 (HLT), Life Science Research Foundation Fellowship (HLT) unterstützt wird, gewährt NIH NS037402 (JMH) und NS083373 (JMH) und University Grants Committee der Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF). Ho Lam Tang ist ein Shurl und Kay Curci Foundation Fellow der Life Sciences Research Foundation.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Anastasis bezieht sich auf das Phänomen, bei dem Zellen, Zelltod aktiviert haben danach rückgängig den Sterbeprozess und zu überleben. Hier haben wir gezeigt, dass die Abbildung lebender Zellen verwendet werden, um zu bestätigen, dass die gleichen Einzelzellen in der Tat kann Apoptose-Prozess in einer späten Phase umkehren, und dann weiter überlebende und Wiedergabe werden. Unsere Protokolle beschreiben mehrere optimierte Zelltyp-spezifischen Behandlungsbedingungen, Apoptose zu induzieren und lassen einen großen Anteil ...

Apoptose (griechisch für &quot;fallen in den Tod&quot;) wird im Allgemeinen angenommen, dass ein einseitiger Prozess endet in Zelle Selbstmord 1-7 sein. Genetische Störung der pro-Tod Gene Ergebnisse in der Überlebensrate von zusätzlichen Zellen, die sonst in ganzen Tieren sterben würde, einschließlich Zellen, die bereits die Apoptoseweg 8,9 eingeleitet haben. Auch genetische Manipulationen ermöglichen gesunden Säugetierzellen, die künstlich Anzeige &quot;essen mich&quot; Signale oder die Haftfähigkeit zu verlieren, ihre extrazellulären Matrix zum Tod durch Ganzzell-Phagozytose oder entosis bzw. 10,11 entkommen. Jedoch haben wir und andere gezeigt, dass ohne genetische Manipulation normalen gesunden Säugetierzellen und Zelllinien, können auch aus den frühen Stadien der Apoptose 12-15 erholen. Mit Werkzeugen, einzelne Zellen zu verfolgen, haben wir weiter gezeigt, sich nach späten Stadien der Apoptose 12,13, nachdem Zellen wichtige Kontrollpunkte, dass typische gebenly markieren den &quot;point of no return&quot; 2-6. Diese Checkpoints Stufe Apoptose spät schließen mitochondrialen Freisetzung von Cytochrom c, Aktivierung von Caspasen, eine Kernfragmentierung und Bildung von apoptotischen Körpern. Wir nahm eine griechische gesetztes Wort &quot;Anastasis&quot;, das bedeutet &quot;stieg auf Leben&quot;, um diese Umkehrung der Apoptose am Rande der Zelltod 2-6 beschreiben. Es sei denn, die gesamte Sterbe-Recovery-Prozess wird von lebenden Zellen beobachtet wird, wird es eine Herausforderung, Zellen, die anastasis aus Zellen, die nie apoptotischen Ereignisse erlebt unterzogen haben zu unterscheiden. Die jahrzehntelange Arbeit haben gezeigt, dass die morphologischen Merkmale der Zelltod durch Apoptose durch evolutionär konservierte biochemischen und molekularen Ereignisse 16-19 angetrieben. Diese Veranstaltungen fördern die Selbstzerstörung der Zellen, Entwicklungs- und homöostatischen Prozesse in einzelligen und mehrzelligen Organismen durch die Beseitigung beschädigter oder d zu regelnangerous Zellen 16-19. Während apoptotischen Zellen können leicht durch standardisierte morphologischen, biochemischen und molekularen Manifestationen Apoptose 1,5,6,16,20 unterschieden werden, gibt es bisher keine bekannte Marker spezifisch anastasis 12,13. Wichtig ist, dass Zellen, die anastasis laufen haben scheinen normale gesunde Zellen und Zellen, die gerade beginnen Umkehr Apoptose erscheinen als apoptotische sterbenden Zellen 12,13 sein. Damit neue Werkzeuge erforderlich sind, um mit Gewissheit, dass ein bestimmter überlebenden Zellen zuvor erlebt aktiven apoptotischen Prozessen abzuschließen. Apoptose ist im Allgemeinen als eine irreversible Kaskade angenommen, weil es eine schnelle und massive Zerstörungsprozess. Man könnte zwar Minuten bis Tage dauern für einige Zellen, die Apoptose auslösen, sobald Mitochondrien apoptogene Faktoren wie Cytochrom c in das Cytosol freigesetzt 21,22 kann Caspasen innerhalb von 5 Minuten 23,24 aktiviert werden, gefolgt von cytoplasmatischen undKernkondensation innerhalb von 10 Minuten 25 bis 27, und Zelltod kurz danach 25-27. Aktivierte Caspasen dirigieren Apoptose durch Spaltung und Inaktivierung wichtigsten strukturellen und funktionellen Komponenten für die Zwecke der zellulären Abbruch 2,28, wie die Endonuklease-Inhibitor DFF45 / ICAD 29,30. Caspasen aktiviert auch pro-apoptotischen Faktoren wie BCL-2-Familienmitglied BID, die Mitochondrien transloziert mitochondriale Freisetzung von Cytochrom c 31,32 fördern. Caspase-Aktivität führt auch zu Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin als &quot;essen mich&quot; Signal für die Förderung der Phagozytose von sterbenden Zellen durch Makrophagen oder Nachbarzellen durch Phagozytose 33. Außerdem apoptotische Vorgänge machen Mitochondrien dysfunktional, Störung zellulärer Bioenergetik und Stoffwechsel 34,35,36. So scheint Erholung von solchen Zerstörung intuitiv unwahrscheinlich. Entgegen der ursprünglichen erwartentionen können Zellen die Apoptose Prozess noch in einem späten Stadium umzukehren. Durch die kontinuierliche Überwachung das Schicksal der sterbenden Zellen in Kultur, beobachteten wir die Reversibilität der Bühne Apoptose spät in einem Spektrum von primären Zellen und Zelllinien 12,13. Die Entfernung der Tod Reizes Erholung von den offenkundigen Eigenschaften der Apoptose, wie mitochondriale Fragmentierung, Chromatin-Kondensation, DNA-Schäden, Plasmamembran Blasenbildung, Zelloberflächenexposition von Phosphatidylserin, Freigabe der mitochondrialen Cytochrom C, Caspase-Aktivierung, Kernfragmentierung, Zellschrumpfung, und Bildung von apoptotischen Körpern. Diese Beobachtungen werfen unbeantwortete Fragen zu den Funktionen, Folgen und Mechanismen der Rekonvaleszenz. Um diese Fragen anzugehen, ist eine Voraussetzung, um zuverlässig zu identifizieren Zellen, anastasis unterzogen wurden. Hier beschreiben wir Live-Mikroskopieverfahren und eine Caspase Biosensor zum Nachweis von Zellen, die zuvor rückgängig gemacht haben, spät Apoptose und then überlebt.

<table><tbody><tr><td>LSM780 Konfokalmikroskopie</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasbodenkulturschale</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Transparent CultFoi</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1116-084</td><td></td></tr><tr><td>CO2 unabhängiges Medium</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker</td><td>Life Technologies</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Rot CMXRos</td><td>Life Technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmarkiertes Annexin V</td><td>Biovision</td><td>K201</td><td></td></tr></tbody></table>

strategien für die spurhaltung anastasis, einer zelle Überleben phänomen, das apoptose kehrt

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (griechisch für &quot;Rising to life&quot;) bezieht sich auf die Wiederherstellung von sterbenden Zellen. Bevor diese Zellen zu gewinnen, sie durch wichtige Kontrollpunkte der Apoptose, einschließlich mitochondriale Fragmentierung, Freigabe der mitochondrialen Cytochrom c in das Zytosol, Aktivierung von Caspasen, Chromatin-Kondensation, DNA-Schäden, Kernfragmentierung, Plasmamembran Blasenbildung, Zellschrumpfung, Zelloberflächenexposition bestanden haben Phosphatidylserin und Bildung von apoptotischen Körpern. Anastasis kann auftreten, wenn apoptotische Reize vor dem Tod entfernt, wodurch sterbenden Zellen zur Apoptose und möglicherweise anderen Todesmechanismen umzukehren. Daher erscheint anastasis physiologischen Heilungsprozesse, die auch beschädigte Zellen zu erhalten könnte unangemessen einzubeziehen. Die Funktionen und Mechanismen der Rekonvaleszenz sind noch unklar, zum Teil durch die begrenzte Tools zur Erkennung Ereignissen der Vergangenheit nach der Wiederherstellung der scheinbar gesunden Zellen behindert. Strategien zur Anasta erkennensis werden Studien über die physiologischen Mechanismen, die Gefahren von Untoten Zellen in Krankheitspathologie und potenziellen Therapeutika ermöglichen anastasis modulieren. Hier beschreiben wir effektive Strategien mit Lebendzellmikroskopie und eine Säugetier Caspase Biosensor zur Identifikation und Verfolgung anastasis in Säugerzellen.

Um die Auflösung der Apoptose zu untersuchen, werden Gewebekulturzellen zunächst auf einen Tod Reiz ausgesetzt, die Apoptose auslösen. Wenn die Zellen anzuzeigen Kennzeichen der Apoptose wird frisches Kulturmedium dann angewendet, um abzuwaschen den Reiz und bebrüten die sterbenden Zellen der Besserung (1A) zu ermöglichen. Hier ist die entscheidende Frage angesprochen, wie weit einzelne sterben kultivierten Zellen gegenüber Apoptose Fortschritt und noch anastasis eingehen können. Diese Frage lässt sich ...

Der Begriff Anastase bezieht sich auf das Phänomen, bei dem sterbende Zellen einen Zellselbstmordprozess in einem späten Stadium rückgängig machen, sich selbst reparieren und schließlich überleben. Hier demonstrieren wir Protokolle zum Nachweis und zur Verfolgung von Zellen, die einer Anastasierung unterzogen werden.

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Umkehrung des apoptotischen Zelltodprozesses und kultivierter Zellen durch Lebendzellmikroskopie zu erkennen und zu verfolgen. Gesunde Zellen breiten sich auf dem Substrat aus und enthalten röhrenförmige filamentöse Mitochondrien um den Zellkern. Wenn Zellen jedoch durch Apoptose Selbstmord begehen, weisen die sterbenden Zellen einzigartige morphologische Merkmale auf, um die Umkehrung der Apoptose zu erkennen und zu verfolgen.Die Zellen werden in Zellkulturschalen mit Glasboden plattiert. Der nächste Schritt besteht darin, eine Lebendzellfärbung durchzuführen, um Mitochondrien und Zellkerne zu markieren. Dies ermöglicht die Detektion morphologischer Merkmale gesunder und apoptotischer Zellen.Mittels Lebendzellmikroskopie werden die markierten gesunden Zellen dann einem Todesreiz ausgesetzt, um die Apoptose zu induzieren. Wenn Apoptose nachgewiesen wird, werden die sterbenden Zellen gewaschen und dann mit frischem Zellkulturmedium inkubiert, um die Zellwiederherstellung zu ermöglichen. Lebendzellbildgebung wird verwendet, um die Umkehrung der Apoptose und ihre Folgen wie Zellreparatur und Überleben zu erkennen und zu verfolgen, w

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Biology

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Wir stellen eine einfache Protokoll zu Bereichen programmierten Zelltod (PCD) in Mausembryonen und Differenzieren embryonalen Stamm (ES)-Zellkulturen unter Verwendung eines gut löslichen Farbstoff genannt LysoTracker visualisieren.

Verwendung LysoTracker zum programmierten Zelltod in Embryonen Erkennen und Differenzieren embryonalen Stammzellen

Beitrag des ACF Chromatin-Remodeling Faktor E4orf4-induzierten Zelltod wurde gemessen. Das Protokoll umfasst Selektion von Zellklonen, in denen Doxycyclin Behandlung induziert bedingten Knockdown des ACF-Untereinheiten und Acf1 SNF2h, und die Verwendung des Assay E4orf4 DAPI-induzierten Zelltod in den induzierbaren Zelllinien messen.

Vorbereitung der Cell-Linien für Conditional Knockdown der Genexpression und Messung der Knockdown Auswirkungen auf E4orf4-induzierten Zelltod

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Bromdesoxyuridin (BrdU) -Aufnahme, die zeitliche Verfolgung von Zellen, die in der S-Phase auf einen bestimmten Zeitpunkt waren ermöglichen. Die Zugabe von DNA-Farbstoffen und Antikörpermarkierung erleichtert die detaillierte Analyse des Schicksals der S-Phasen-Zellen zu späteren Zeitpunkten.

Zeitliche Verfolgung von Zellzyklus mittels Durchflusszytometrie, ohne die Notwendigkeit für die Synchronisation

Anastasis ist technisch anspruchsvoll, um in Vivo zu erkennen, da die Zellen, die der Zelle Todesprozess umgekehrt haben morphologisch nicht zu unterscheiden von normalen gesunden Zellen sein können. Hier beschreiben wir Protokolle für die Erkennung und Verfolgung von Zellen, die Anastasis mit lebenden Tieren zu unterziehen, durch den Einsatz unserer neu entwickelten in Vivo -CaspaseTracker-Biosensor-System.

Erkennung von Anastasis In Vivo durch CaspaseTracker Biosensor

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Bestimmung intrazellulärer Signalereignisse, die in lebensfähigen Zellen durch physikalische Interaktion mit benachbarten toten oder sterbenden Zellen induziert werden. Das Protokoll konzentriert sich auf Signalereignisse, die durch Rezeptor-vermittelte Erkennung der toten Zellen induziert werden, im Gegensatz zu ihrer phagozytären Aufnahme oder Freisetzung löslicher Mediatoren.

Identifizierung von intrazellulärer Induzierte in lebenden Zellen durch Interaktion Signalisierung mit Benachbarte Zellen, die eine programmierten Zelltods

Live Cell Imaging bietet eine Fülle von Informationen über einzelne Zellen oder ganze Bevölkerungen, die unerreichbar ist von festen Cell imaging allein. Hier werden live-Cell imaging Protokolle Zelle Schicksal Entscheidungen nach der Behandlung mit Anti-mitotische Droge Paclitaxel bewerten beschrieben.

Langfristige Leben-Cell Imaging zu Zelle Schicksal als Reaktion auf Paclitaxel bewerten

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur isolieren Apoptotic Brustkrebszellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und weiter den Übergang von nicht-Stamm Brustkrebszellen zu Brustkrebs-Stammzellen-ähnliche Zellen nach Apoptose Umkehr zu erkennen, indem Durchflusszytometrie.

Flow durchflusszytometrischen Erkennung von neu gebildeten Stammzellen-wie Brustkrebszellen nach Apoptose Umkehr

Die vorgestellte Methode kombiniert die quantitative Analyse von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs), Zellzyklusverteilung und Apoptose, um eine zellzyklusspezifische Auswertung der DSB-Induktion und -Reparatur sowie die Folgen eines Reparaturfehlers zu ermöglichen.

Zellzyklusspezifische Messung von H2AX und Apoptose nach genotoxischem Stress durch Durchflusszytometrie

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse durch Fluoreszenz-Imaging. Das Verfahren nutzt ein zirkular permutiert YFP-basierte Dual-Anregung ratiometrische Calcium-Sensor (ratiometrisch PERICAM-mt) selektiv in den Mitochondrien zum Ausdruck gebracht.

Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor

Eine genaue Methode für die Beurteilung der Zelltod beschrieben. Das Protokoll verbessert die auf konventionellen Annexin V / Propidiumiodid (PI)-Protokolle, die up-Display zu 40% falsch-positive Ereignisse in Zelllinien und Primärzellen aus einer breiten Palette von Tiermodellen.

Geändert Annexin V / Propidiumiodid Apoptose Assay für eine genaue Beurteilung des Zelltods

Erfahren Sie, wie Sie Anastasis in Säugetierzellen mit Live-Zell-Mikroskopie und Biosensoren nachweisen und verfolgen. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Umkehr von Apoptose und deren Folgen für die Zellbiologie.

Strategien für die Spurhaltung Anastasis, einer Zelle Überleben Phänomen, das Apoptose Kehrt

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