Verfahren zum Screening und Validierung von Beständig Mutationen Vor-Inhibitoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, arzneimittelresistente Mutationen zu identifizieren und zu validieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine zufällige Mutationsbibliothek des Zielonkogens erstellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, ein In-vitro-Screening auf das Auftreten resistenter Klone durchzuführen.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die resistenten Klone zu sequenzieren, um resistente Mutationen zu identifizieren. Der letzte Schritt besteht darin, die resistenten Mutationen zu validieren, indem die Mutationen mittels ortsgerichteter Mutagenese nachgebildet werden, gefolgt von in vitro- und in vivo-Assays. Letztendlich können klinisch relevante arzneimittelresistente Mutationen gegen ein gegebenes Wirkstoffzielpaar identifiziert werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie ENU oder PCR-basierten Methoden besteht darin, dass sie unvoreingenommen ist und im Gegensatz zu PCR-basierten METAGENE-SSIS nicht auf die Größe des Onkogens oder den GC-Gehalt eines Gens beschränkt ist. Im Allgemeinen werden diejenigen, die neu in dieser Technik sind, aufgrund mangelnder Kenntnisse in der Molekular- und Zellbiologie Schwierigkeiten haben. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung.

Da Neogenese und Screening-Schritte schwer zu erlernen sind. Das liegt daran, dass es vielen Menschen an Erfahrung in der Virusproduktion, in der Zellkultur und in halbzelligen Medien mangelt. Dieses Verfahren beginnt mit der Transformation von XL one red e coli Zellen mit einem Plasmid mit JAK two V 617 f, einer onkogenen Isoform von JAK two XL one red e coli Zellen, die in DNA-Reparaturmechanismen defekt sind, so dass sie während der Replikation zufällige Mutationen einbauen können.

Mischen Sie 50 bis 100 Nanogramm Plasmid-DNA mit 100 Mikrolitern kompetenter Zellen in einem vorgekühlten Polypropylen-Röhrchen. Verwenden Sie nicht mehr als 100 Nanogramm DNA, da dies die Transformationseffizienz verringert. Inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis und schwenken Sie sie alle fünf Minuten sanft, um eine gute Bibliotheksabdeckung zu gewährleisten.

Verwenden Sie vier bis sechs Röhrchen mit kompetenten Zellen. Tauchen Sie die Polypropylen-Röhrchen für einen Hitzeschock von 45 Sekunden in ein Wasserbad bei 42 Grad Celsius und inkubieren Sie dann zwei Minuten lang auf Eis. Geben Sie als Nächstes einen Milliliter SOC-Medium in jedes Röhrchen.

Inkubieren Sie die Röhrchen bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie 90 Minuten lang bei 225 bis 250 U/min. Plattenzellen auf vier 10 Zentimeter großen LB-Schneckenplatten, die 100 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin enthalten. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für 16 bis 24 Stunden.

Sobald die Kolonien sichtbar sind, sammeln Sie sie, indem Sie die Platten mit einem sterilen Plattenschaber abkratzen. Fassen Sie die Zellen von jeder Platte zusammen. Anschließend wird die Plasmid-DNA mit einem kommerziellen Plasmid-Extraktionskit isoliert und die Heterogenität der Mutationen in der Bibliothek wird bewertet, indem einen Tag vor der Transfektionsplatte vier mal 10 bis zu den sechsten HEK 2 93 T-Zellen auf 100-Millimeter-Schalen in DM EM sequenziert werden, die 10%FCS, Penicillin, Streptomycin und zwei Millimolare L-Glutamin enthalten.

Bereiten Sie am nächsten Tag die Transfektionsreagenzien für jede 100-Millimeter-Schale vor. Mischen Sie fünf Mikrogramm der Plasmidbibliothek, fünf Mikrogramm eines retroviralen Verpackungsplasmids und 40 Mikroliter FU-Gen zu einem Gesamtvolumen von 400 Mikrolitern unter Verwendung von serumfreien DM E EM-Medien. Inkubieren Sie die DNA-Lipid-Mischung 20 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Ersetzen Sie anschließend das Medium der HEK 2 93 T-Zellen durch frisches Medium und geben Sie den DNA-Lipidkomplex tropfenweise auf die Zellen. Inkubieren Sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Ersetzen Sie nach sechs Stunden das Transfektionsmedium durch ein frisches Medium und inkubieren Sie die Platten 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius pro Virusproduktion.

Nach 48 Stunden Inkubation sammeln Sie virale Überstände, die durch einen 0,45-Mikrometer-Acro-Scheibenfilter gefiltert wurden, um das Verfahren zum Screening und zur Identifizierung arzneimittelresistenter JAK-zwei V 607 F-Mutanten zu beginnen, die BAF-3-Zellen mit den retroviralen Überständen transduzieren. Mischen Sie 100 Millionen BAF-Dreizellen mit 100 Millilitern Virusüberstand zu einem Gesamtvolumen von 300 Millilitern unter Verwendung von RPMI-Medien, die 10 % Serum und Polyhirn enthalten. Verteilen Sie diese Zell- und Virus-Supernat-Mischung auf mehrere Platten mit je sechs Vertiefungen, die jeweils mit vier bis fünf Millilitern gefüllt sind.

Zentrifugieren Sie die Platten bei 1.250 GS für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius. Nach der Zentrifugation inkubieren Sie die Platten am folgenden Tag 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und poolen die transduzierten Zellen für jede Wirkstoffkonzentration. Mischen Sie 10 Milliliter Zellen mit Ruxolitinib in einem 50-Milliliter-Röhrchen.

Die in diesem Beispiel getesteten Konzentrationen von Ruxolitinib betragen 1, 5, 2, 0,5 und 10 Mikromolar. Vergrößern Sie das Volumen auf 40 Milliliter mit RPMI, das 20% Serum enthält. Geben Sie 10 Milliliter 1,2%-Schnecke zu den Zellen und mischen Sie sie vorsichtig in sechs Well-Platten.

Abgabe von vier Millilitern pro Vertiefung. Inkubieren Sie die Platten zwei Wochen lang bei 37 Grad Celsius. Sobald resistente Kolonien sichtbar sind, verwenden Sie 0,2-Milliliter-Pipettenspitzen, um die Kolonien zu entnehmen und sie einzeln zu subkulturieren.

In 24-Well-Platten für drei bis vier Tage ernten Sie die resistenten BAF-drei Zellen durch Zentrifugation bei 450 GS für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Isolierung der genomischen DNA mit einem kommerziellen genomischen DNA-Extraktionskit amplifizieren Sie das JAK zwei CDNA in voller Länge aus der genomischen DNA mittels PCR. Die PCR-Produkte werden dann durch die Gelelektrophorese von Agar Rose und die 3,4 KILOBASE DNA-Bande getrennt.

Stellvertretend für den JAK-Zweischichtrahmen wird er mit einem handelsüblichen Gel-Extraktionskit isoliert. Sequenzieren Sie schließlich die CDNA in voller Länge mit acht internen Primern, die die kodierende Sequenz überspannen, und analysieren Sie die Sequenzen mit kommerzieller Software, um arzneimittelresistente Mutationen zu validieren. In vitro werden ausgewählte Varianten durch ortsgerichtete Mutagenese der JAK two V 617 F-Sequenz erzeugt und in BAF 3-Zellen wieder eingeführt.

Geben Sie 50 Mikroliter Medien mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ruxolitinib separat in die Vertiefungen über die Platte, Platte 10 bis zum vierten der BAF drei JAK zwei V 617 F-Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte, inkubieren Sie die Platten 60 Stunden lang bei 37 Grad Celsius Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen, fügen Sie 10 Mikroliter WST ein Reagenz zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie zwei bis vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Zeichnen Sie die Extinktion bei 450 mit einem Plattenleser auf. Führen Sie alle Assays in dreifacher Ausführung durch und stellen Sie die durchschnittliche Extinktion im Vergleich zu den Ruxolitinib-Konzentrationen dar.

Führen Sie eine am besten angepasste sigmoidale Kurve mit einem nichtlinearen Kurvenanpassungsalgorithmus durch. Die Wirkstoffkonzentration, die zu einer 50%igen Zellviabilität führt, da das zelluläre IC 50 anschließend in vivo validiert wird, erfolgt wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Da die durch zufällige Mutagenese erzeugten resistenten Zellklone mehr als eine Mutation tragen können, müssen diese Mutationen isoliert sowohl durch in vitro als auch durch in vivo Assays validiert werden.

Im in vitro Assay wurden ausgewählte Varianten durch ortsgerichtete Mutagenese der JAK two V 607 F-Sequenz erzeugt und wieder in BAF drei Zellen eingeführt, die dann auf ihre Zellproliferationsfähigkeit bei unterschiedlichen Dosierungen von Ruxolitinib gemessen wurden, um die IC 50-Werte zu bewerten. Darüber hinaus wurde ein Immuno-Blotting für Phosphotyrosin oder Phospho STAT five an Proteinlysaten von BF-3-Zellen durchgeführt, die mit steigenden Dosen von Ruxolitinib inkubiert wurden, um eine Off-Target-vermittelte Resistenz auszuschließen. Mutanten mit erhöhten IC 50-Werten und persistenter Autophosphorylierung bei höheren Ruxolitinib-Konzentrationen werden somit als arzneimittelresistente Varianten bestätigt, um die in vivo-Resistenz zu validieren.

BF, drei Zellen, die zur Expression von JAK, zwei V, sechs 17 F-Varianten und Luciferase-Kirsche entwickelt wurden, wurden Mäusen injiziert, die anschließend zwei Wochen lang mit Ruxolitinib injiziert wurden. Nach zwei Wochen. Die Mäuse wurden auf Luciferase-katalysierte Biolumineszenz abgebildet, BAF 3-Chimärismus im Knochenmark und peripherer Blutfluss wurden durch Messung der Fluoreszenz von kirschpositiven Zellen bewertet.

Die Ergebnisse zeigen, dass Mäuse, die JAK 2 V 607 F exprimieren, zu Ruxolitinib werden, während resistente Varianten über den Behandlungszeitraum progressive Zuwächse in der Biolumineszenz zeigen. Einmal gemeistert, kann die zufällige Neogenese in vier bis fünf Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine zufällig isierte Plasmid-DNA-Bibliothek für das In-vitro-Screening gegen jedes Wirkstoffzielpaar entwickelt.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Retroviren äußerst gefährlich sein kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sind stets Vorsichtsmaßnahmen zu treffen.