Name: Isolation und Kultur der Dissoziierte sensorischen Neuronen aus Hühnerembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultur dissoziierter sensorischer Neuronen aus Hühnerembryonen. Diese zuverlässige Methode ermöglicht die Untersuchung neuronaler Zellbiologie und Axonführung in kontrollierter Umgebung.

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Wir möchten Alison Philbrook, Belinda Barbagallo und Michael Francis für aufschlussreiche Kommentare zu diesem Beitrag danken. Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet wurde von einem R15 Area Award 1R15NS070172-01A1 zu MLL ausgezeichnet unterstützt.

1. Deckglas Zubereitung: Acid-Waschung und Backen <ol><li> Mindestens 2 Tage vor der Dissektion (Schritt 2), beginnen die folgenden Schritte zur Deck vorzubereiten. Führen Sie den Säurewaschschritt, um Öle und gründlich sauber Deckgläser zu entfernen. </li><li> Ladedeck Porzellan Halter, die vertikal positioniert Deck und verhindert, dass sie sich berühren. Tauchen Halter und Deckglas in der Histologie Behälter mit 2 M Salzsäure (HCl) gefüllt. Alternativ, wenn Porzellan Halter nicht verfügbar ist, zu verbreiten ~ 20 Deckgläser horizontal, um den Boden von 100 mm Glaspetrischale abdecken und tauchen Deckgläser in 2 M HCl. </li><li> Zeigen Glasgefäß (mit Deckgläsern in Säure getaucht) auf Wippe Tabelle in Abzug und lassen sanfte Schaukel für mindestens 5 Stunden bei Raumtemperatur. Alternativ Deckgläser Säurewäsche über Nacht unter den gleichen Bedingungen. </li><li> Waschen Deckgläser mit destilliertem H 2 O (dH 2 O) durch Über Porzellan Halter geladenenmit Deckgläsern von 2 M HCl auf einen sauberen Glasbehälter mit der Histologie dH 2 O gefüllt Alternativ dekantieren 2 M HCl aus Glaspetrischale mit Deckgläsern und füllen dH 2 O. </li><li> Waschen durch Dekantieren dH 2 O wieder und Nachfüllen Glasgefäß mit frischem dH 2 O. Wiederholen Sie dies für insgesamt 3 schnelle Wäschen. </li><li> Beginnen Sie längere Wasch Regime durch Rücksendung Glasgefäß (mit Deckgläsern und dH 2 O) auf Rocker. Ermöglichen leichtem Schütteln für 10-30 min bei Raumtemperatur. Dann dekantieren dH 2 O und fügen Sie frisches dH 2 O. Wiederholen von insgesamt mindestens zehn Wäschen. Alternativ weiterhin Waschen über Nacht. </li><li> Platzieren gewaschen Deckgläser in den Ofen auf 350 ° C vorgewärmt. Bei der Verwendung von Porzellanhalter, entfernen Halter aus dH 2 O gefüllten Glasbehälter und legen Sie dann Halter mit Deckgläsern direkt in den Ofen. Bei Verwendung einer Glaspetrischale, dekantieren dH 2 O und legen Sie die Glasschale mit Deckgläsern in die furnace. </li><li> Bake Deckgläser für mindestens fünf Stunden oder über Nacht bei 350 ° C aufweist. </li><li> Nach der vollständigen Back ist, entfernen Deckgläser aus Porzellan Halter mit feinen Pinzette und legen in sterile 100 mm Glaspetrischale. Deckgläser lassen, die ursprünglich nicht in der Porzellanhalter in der Glaspetrischale wurden. </li></ol> 2. Küken Dissection und Isolierung von DRGs <ol><li> Entfernen fruchtbar, inszeniert White Leghorn-Küken Ei aus Inkubator (bei 37 bis 38,5 ° C auf dem Schüttler gehalten). HINWEIS: Frühere Studien haben embryonalen Tag 7-10 für die Isolierung von DRGs 2,8,11-13,16 verwendet. </li><li> Ort Ausgewählter Ei in Laminarströmungshaube. Führen alle unten unter aseptischen Bedingungen in der Sterilbank mit sterilen Lösungen und Instrumente aufgeführten Verfahren. Pre-warmen alle Lösungen in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Knacken Ei und Ort Inhalt in einem Kunststoff 100 mm Petrischale. Verwenden Sie Standard-Pinzette Embryo zu einem anderen 100 mm Petrischale übertragen. </li><li&gt; Mit einer Pasteur Pipette erwärmt 1x PBS auf Petrischale, um Gewebe feucht zu halten. Enthaupten Embryo durch Kneifen Hals mit feinen Pinzette. Übertragen auf einen anderen Körper sauber 100 mm Petrischale. </li><li> Mit warmem F12HS10 (Ham-F12, 10 mM HEPES, 100 Einheiten / ml Penicillin, 0,1 mg / ml Streptomycin, das 10% fetales Rinderserum) mit Pasteur-Pipette austeilen, um Gewebe feucht zu halten. Verwenden Pinzette Embryo auf seiner dorsalen Seite (1A) zu positionieren. </li><li> Zeigen 100 mm Kunststoff-Petrischale mit embryonalem Gewebe auf ein Fernglas Binokular Stereo in Laminarströmungshaube. Verwenden feinen Pinzette, um eine vertikale Mittellinienschnitt vom Schwanz bis zum Hals durch Kneifen den Entwicklungs Dermis, das Herz, Lunge und andere Organe aussetzen zu machen. Alternativ können Sie eine Reihe von kleinen Tränen in die inneren Organe aus. </li><li> Vorsichtig mit 2 Sets von sterilen feinen Pinzette zu: a) begreifen, die Hals und b) erfassen die Aorta oder anderes Gewebe unmittelbar über dem Herzen und ziehen in Richtung des Schwanzes,Ausnehmen des Tieres. </li><li> Werden, warmes F12HS10 mit Pasteur-Pipette, um Gewebe. Verwenden einer Pinzette, um alle verbleibenden Herz-Kreislauf, Atemwege oder Verdauungsorgane entfernen, um die Entwicklung von Rippen, Wirbelsäule und DRGs (1B-1D) aus. </li><li> Unter dem Binokular, verwenden feinen Pinzette die Organe weiter zu entfernen und sammeln DRGs auf beiden Seiten der Lendenwirbelsäule, schlechter als die Rippen. Sammeln DRGs durch Zupfen intakt DRGs aus dem Embryo. Kneifen und durchtrennen die Wurzeln, die von der DRG in Richtung des Rückenmarks zu erreichen und das Greifen der Entwicklungs Nerv, der von der DRG in Richtung der Peripherie oder umgekehrt erreicht. </li><li> Zeigen intakt DRGs in eine 35 mm Kulturschale mit warmem F12HS10 gefüllt. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, wie die dorsale oder ventrale Wurzeln, die DRGs festgesetzt haben, von den intakten DRGs in 35 mm-Schale durch Kneifen mit feinen Pinzette. </li><li> Um DRGs überlegen Lendenbereich zu erhalten, entfernen Sie die ventrale Hälfte des Brustraums und Cervical Wirbelsäule. Dies wird durch einen Schnitt in der Entwicklungs Wirbelsäule senkrecht zur Achse der Wirbelsäule im oberen Halsbereich und einem anderen Schnitt im oberen Lendenwirbelbereich erfolgen. Dann stellen Schnitte parallel zum Rückenmark-Achse entlang der rechten und der linken Seite der Wirbelsäule. Heben Sie die ventrale Hälfte der Wirbelsäule aus dem Embryo, der das macht die Rückenmark (1E-1F) aussetzt. </li><li> Einen einfachen Zugang zu ermöglichen DRGs, entfernen Sie die Brust-und Halsmark durch Ergreifen des Rückenmarks mit einer feinen Pinzette. Verwenden Sie die Pinzette, um das Rückenmark aus der Wirbelsäule zu heben. Näherungsweise ist die thorakale Wirbelsäule in der Ebene der Rippen und der Halsbereich ist besser als die Rippen. </li><li> Sammeln intakten Brust-und Gebärmutterhalskrebs DRGs mit feinen Pinzette und legen Sie sie in den warmen F12HS10 mit anderen DRGs. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, das DRGs haften kann. </li><li> Spülen Innere eines neuen Glaspasteurpipette mit F12HS10 zu helfenDRGs verhindern das Anhaften von Wänden der Pipette. Verwenden gespült Pipette, um alle DRGs und F12HS10 von kleinen Petrischale in ein steriles 15 ml konischen Röhrchen übertragen und sofort mit Schritt 3 fort. HINWEIS: Zusätzliche Embryonen können zerlegt werden um die Anzahl der DRGs zu erhöhen. DRGs sollte in F12HS10 bei 37 ° C, bis sie für Schritt 3 gehalten werden. </li></ol> 3. Dissoziation, Anreicherung und Züchtung DRG-Neuronen - Teil 1 <ol><li> Ort konischen Rohr mit intakten DRGs in Zentrifugen und sanft drehen (200 × g) für 2-3 min. Bestätigen Sie, dass DRGs haben den Boden des Röhrchens versenkt. Wenn nicht, drehen Sie es erneut. </li><li> Mit einer Pipette vorsichtig entfernen F12HS10, so dass DRG-Pellet ungestört. 2 ml 1x Calcium und Magnesium kostenlos (CMF) PBS, verdrängen das Pellet der DRGs. Spin wieder entfernen und CMF PBS während das DRG-Pellet intakt. Dieser Waschschritt wiederholt für insgesamt drei Waschungen fötalen Rinderserum in F12HS10, die mit Trypsin Verdauung im nächsten Schritt stören würde entfernen. </li><li> 2 ml Trypsin, erwärmt auf 15 ml-Röhrchen mit 2 ml PBS-CMF und DRGs. Das Röhrchen in 37 ° C Wasserbad für 10-15 min auf DRGs in dissoziierten Zellen zu verdauen. </li><li> Während der Inkubation machen F12H + Ergänzung mit Medium (Ham-F12, 10 mM HEPES 100 Einheiten / ml Penicillin, 0,1 mg / ml Streptomycin, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mM L-Glutamin und N2) und Warm in 37 ° C Wasserbad. Typischerweise ist 10 ml Gesamt Medien reicht für 4-5 35 mm Gerichte der primären sensorischen Neuronen. Auch beginnen Auftauen Laminin-1 für die Beschichtung von Deckgläsern (Schritt 4). </li><li> Sanft verreiben DRGs in Trypsin-Lösung mit p1000 Pipette und einer Sichtprüfung auf Abwesenheit von intakten DRGs. Weiterhin intakt, bis Verreiben DRGs werden nicht mehr von Auge gesehen und / oder erlauben mehr Trypsin Inkubation in 37 ° C warmes Wasserbad, bis intakt DRGs dissoziiert sind. DRG-Neuronen vor Schäden zu schützen, vermeiden Sie Luftblasen beim Verreiben und Trypsin Verdauung auf &lt;30 min zu begrenzen. </li><li> Centrifuge Röhrchen mit dissoziiert DRGs und Trypsin bei 200 g für 3-5 min zu Pellets zu bilden. Mehr drehen, wenn nötig, bis Pellet gebildet. </li><li> Sorgfältig absaugen Trypsin ohne Unterbrechung Pellets. 2 ml F12HS10 zu pelletieren. Sanft verreiben DRGs mit einem P1000 Pipettenspitze. </li><li> Übertragen Sie alle Inhalte aus 15 ml konischen Röhrchen in 100 mm Kulturschale. Spülen des Röhrchens mit 8 ml F12HS10 und übertragen sie in die Kulturschale, 2 ml in einer Zeit von insgesamt 10 ml auf. Dieser Schritt hilft Spülen sammeln Zellen, blieb an den Wänden der Röhre eingehalten haben. </li><li> Platzieren 100 mm Kulturschale (10 ml F12HS10 und dissoziierten DRG Zellen) in einem befeuchteten Inkubator 37 ° C für 3 Stunden. HINWEIS: CO 2 nicht in den Inkubator erforderlich, da HEPES-Puffer pH Medien in Abwesenheit von CO 2. Während der Inkubation binden an Gliazellen Oberfläche der Gewebekulturkunststoff und Neuronen dazu neigen, lose an Gliazellen Bett einzuhalten. </li></ol> 4. Beschichtung Acid WashedGebackene und Deckgläser mit Laminin-1 <ol><li> Auftauen sterile Aliquots von gefrorenen Laminin-1 auf Eis. </li><li> Unter sterilen Bedingungen, 1 ml steriler PBS 1x 50 ul Aliquot von Laminin-1. </li><li> Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um einen Absorptionswert von Laminin-1 bei 280 nm zu erhalten. Verwenden Sie diesen Wert in der folgenden Gleichung, um die Konzentration von Laminin-1 zu bestimmen. </li></ol> ABS = 280 (Konzentration mg / ml) * (Extinktionskoeffizient von Protein) Der Extinktionskoeffizient für Laminin-1 ist 0,86. <ol start="4"><li> Unter sterilen Bedingungen verdünnter Laminin-1 mit 1X PBS, um die Konzentrationen von 1 mg / ml und 20 mg / ml zu erhalten. Mit diesen beiden Anwendungskonzentrationen von Laminin-1, um eine zehnfache Differenz der Laminin-1 an das Deckglas (30 ng / cm 2 und 300 ng / cm 2, bzw.) nach Inkubation 7,8,10 gebunden zu erzielen. </li><li> In einer Steril, feinen Pinzette verwenden, um eine Säure gewaschen und gebacken c legenoverslip in den Boden einer 35 mm Petrischale. Bei Bedarf wiederholen, um die Anzahl der Gerichte erforderlich zu erhalten. </li><li> Unterwerfen die Deckgläser mit UV-Licht für 20-30 min, um weiter sicherzustellen Sterilisation. Schalendeckel halten während dieser Schritt. </li><li> Fügen Sie 400 ul bereit Laminin-1 zu jedem Deckglas. Verwenden Pipettenspitze an Laminin-1 verteilt, um eine vollständige Abdeckung der Deckglas zu gewährleisten. Oberflächenspannung ermöglicht Laminin-1 auf Deckglas bleiben und nicht auf Boden der Kulturschale, die erforderlich ist, zu verbreiten. </li><li> Platzieren Deckelschale auf und lassen Laminin-1, für 2-3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert (3 h ist optimal). </li><li> Nach Laminin-1 Inkubation spülen Deckgläser unter aseptischen Bedingungen mit sterilem PBS in Laminarströmungshaube. Entfernen Lösung auf Deckglas und fügen Sie 400 ul PBS. Warten 5-10 min. Wiederholen Sie für insgesamt 3 Spülgänge. </li><li> Verlassen PBS auf Deckglas nach der letzten Spülung. Nicht die Oberflächenspannung beim Spülen zu brechen und nicht zulassen Deck austrocknen. Leave Deckel auf, bis Sie sie auf den coverlip dissoziiert Neuronen Platte. </li></ol> 5. Dissoziation, Anreicherung und Züchtung DRG-Neuronen - Teil 2 <ol><li> Nach der Inkubation mit einem 10 ml sterile Pipette vorsichtig spülen Sie den Boden der Schale mit 100 mm dissoziiert DRG-Zellen. Halten Schale bei ~ 45 ° Winkel, ziehen ~ 7 ml mit Pipette F12HS10 Hilfe, dann sanft zu vertreiben 7 ml auf etwa ein Drittel der Schale. Wiederholen 5x, sanft verdrängen Neuronen. </li><li> Drehen Teller und wiederholen Spülvorgang, für weitere sechs Spülungen, auf einem anderen ein Drittel der Schale. Wiederholen Sie die Prozedur erneut Rest 3.1 von Gericht. Auf diese Weise sanft spülen Sie den gesamten Boden der Schale mit F12HS10 Neuronen zu entfernen. </li><li> Mit derselben Pipette F12HS10 enthält Neuronen aus 100-mm-Schale bis 15 konischen Rohr. Zentrifuge für 5-10 min bei 200 g Zellen zu pelletieren. </li><li> F12HS10 entfernen, so Pellet ungestört. Pellet mit 2 ml erwärmt F12H + Ergänzungsmittel. </li><li&gt; Mit einer Zählkammer die Zelldichte zu bestimmen. </li><li> Verdünnte Zellen nach Bedarf mit F12H + Ergänzungen gewünschten Beschichtungskonzentration (120.000 Zellen / ml für die Deckgläser mit 1 ug / ml Laminin-1 und 40.000 Zellen / ml für die Deckgläser mit 20 ug / ml Laminin-1 8,16 beschichtet ist) zu erhalten. </li><li> Entfernen PBS von Laminin beschichteten Deckgläschen und sofort setzen 400 ul Zellen auf Deckgläsern. Schüssel vorsichtig in einer feuchten, 37 ° C Zellkulturbrutschrank. Lassen Sie für mindestens 1 h und bis zu 3 Stunden inkubiert, damit Neuronen an Laminin-1 zu halten. </li><li> Unter sterilen Bedingungen vorsichtig schwemmen 35 mm Schalen mit Neuronen mit 1,6 ml F12H + Ergänzungsmittel. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt Oberflächenspannung auf Deckglas gebrochen werden kann. Neuronen angemessen auf Laminin-1 auf Deckglas geklebt. </li><li> Zurück Zellen Inkubator beimpft und über Nacht. Experimente durchführen, wie Immunzytochemie am folgenden Tag. </li></ol> 6. Ichmmunocytochemistry <ol><li> Vor Immunzytochemie, warm Fixierlösung (4% Paraformaldehyd, 30% Saccharose 2X PBS) in 37 ° C Wasserbad. HINWEIS: Vor der Befestigung Zellen, Behandlung mit verschiedenen Reagenzien, wie Netrin-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, semaphorin und Ephrin 16,29-31. </li><li> Entfernen Sie langsam 1 ml der 2 ml F12H + Ergänzungen aus Kulturschale. Vorsichtig 1 ml Fixierungslösung erwärmt. Lassen Sie bei Raumtemperatur für 10-15 min inkubiert. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Fixierungslösung und 2 ml PBS. Bewerben Lösung in Richtung Rand der Schale, die Vermeidung von möglichen Herauslösen fixierten Zellen aufgrund der Anwendung von PBS. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Wiederholen PBS waschen für insgesamt 5 Wäschen. Erlauben keine Zellen, die während jeder Schritt der Immunzytochemie trocknen. </li><li> PBS zu entfernen. Wenden Sie 1 ml Blocking-Lösung (0,1% Triton-X 1X PBS, 5% normalem Ziegenserum). Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. Alternativ zu Oberflächenmoleküle Fleck, Verwenden Triton-X in Blockierlösung 8 nicht. </li><li> Verdünnen primären Antikörper in Blockierungslösung pro Empfehlung Herstellers. Verwenden Sie 1: 500 für Antikörper gegen NCAM und aktiviert β1 Integrine 16. Entfernen Blockierlösung, 1 ml der primären Antikörperlösung und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Entfernen primären Antikörperlösung und 2 ml 1X PBS. Inkubation für 5-10 min bei Raumtemperatur. Wiederholen für insgesamt 4 Waschungen mit PBS. Waschungen kann verlängert werden, wenn nötig. </li><li> Verdünnen sekundären Antikörper 1: 1000 in Blockierlösung. Entfernen PBS, 1 ml Sekundärantikörperlösung und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. HINWEIS: Sekundärantikörper sind lichtempfindlich. Halten Sie Lösungen und Zellen in der Dunkelheit so viel wie möglich von diesem Punkt an. </li><li> Entfernen sekundären Antikörperlösung und spülen Sie 5x mit PBS 1x, wie bisher. </li><li> Gelten ~ 60-80 ul FluoromountG auf einen Objektträger. Mit feinen Pinzette vorsichtig anheben Deckglas von Gericht und unteren Deckglas in Fluoromount G auf Objektträger. Luftblasen vermeiden. </li><li> Laden horizontal gleitet bei 4 ° C im Dunkeln. Nach 12-24 h wird Fluormount G polymerisieren und Deckglas wird fest mit Mikroskop-Objektträger befestigt werden. Bildzellen nach diesem Polymerisationsschritt beendet ist. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier präsentieren wir Ihnen ausführliche Protokolle zur Isolierung und Kultivierung dissoziiert sensorischen Neuronen aus einem Hühnerembryo. Dieses Verfahren erzeugt eine angereicherte Population der stark wachsenden Nervenzellen in vitro 7,8,10,16. Zahlreiche zelluläre und molekulare Techniken können auf diese Nervenzellen in Kultur, einschließlich Immunzytochemie, die hier beschrieben wird, angewendet werden. Dieses Protokoll wurde vor kurzem zur quantitativen Bewertung der Intensität der immun ak...

Neuronen sind komplexe Zellen, die wesentlichen Informationen für eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Sensation, Vision, Motorbewegung, Lernen und Gedächtnis zu tragen. Einzigartig von anderen Zelltypen, Neuronen erstrecken Arm-wie Prozesse, die so genannte Axone, um wesentliche neuronale Autobahnen für die Kommunikation zu bilden. Während der Entwicklung spezialisiert Fächer an den Spitzen der wachsenden Axone, dem sogenannten Wachstumskegel, navigieren durch ein Konzert der extrazelluläre Signale, die Axon seine entsprechenden Ziel führen. Die komplizierten molekularen Mechanismen, die Wachstumskegel Navigation zugrunde liegen, sind nicht vollständig verstanden. Um diese Mechanismen besser zu verstehen, haben Forscher Zellkulturmodelle verwendet werden, um Nervenzellen in einem definierten und vereinfacht in vitro-Umgebung zu studieren. Neuronalen Differenzierung 2, Zytoskelett-Dynamik, Endozytose und Menschenhandel, Dendriten: Studieren Neuronen in Kultur 1 hat zu erheblichen Fortschritte in unserem Verständnis der neuronalen Zellbiologie einschließlich geführtRegulation 3,4, axonale Regeneration 5 und klinischen Zuständen, wie Neuropathien 6. Außerdem sind kultivierten Neuronen sehr gut für einen weiten Bereich von Forschungstechniken einschließlich Immunzytochemie Zelloberfläche co-Immunpräzipitation, Western Blot, Transfektion, RNAi, und die Bildgebung wie Zeitraffer Analyse der Wachstumskegel Motilität. So Kultivierung primären Neuronen ist ein leistungsfähiges Konzept für zahlreiche Aspekte der Zellbiologie von Neuronen aufzuklären. Die Zellkultur-Modell bietet die Ermittler mit detaillierten Kontrolle über Umweltbedingungen und Variablen. Zum Beispiel kann der Substrate, auf denen Neuronen beschichtet (und wachsen auf) leicht manipuliert werden. Hier bieten wir detaillierte Anweisungen zur Erzeugung zwei unterschiedliche Substrate, eines mit einem niedrigen Laminin-1-Konzentration und das andere mit sättigenden Konzentrationen von Laminin-1. Überraschenderweise können unterschiedliche Konzentrationen des gleichen Moleküls dramatische Effekteauf dem internen Zustand der Neuronen sowie ihre Zelloberflächenzusammensetzung. Zum Beispiel sind intrazelluläre Niveaus von cAMP und der Oberflächenpegel der Integrine in Neuronen auf diesen beiden Substraten 7,8 plattiert signifikant unterschiedlich. Weitere Studien haben gezeigt, dass auch andere Moleküle, einschließlich Fibronektin und Chondroitinsulfatproteoglycane, Auswirkungen der Expression von Zelloberflächenmolekülen und neuronale Motilität 7-11. Weiterhin lassen sich lösliche Moleküle wie Neurotrophine und Neurotropine auch Auswirkungen Zellmembran Zusammensetzung und neuronalen Motilität 12-16 und kann in einem Zellkulturmodell leicht und genau bearbeitet werden. Hier beschreiben wir Methoden zur Isolierung und Kultur dissoziiert sensorischen Neuronen von Hühnerembryonen. Dieses Verfahren wurde verwendet, um bedeutende Durchbrüche in der Neurobiologie, einschließlich Axon Auswuchs 5,7,8,10,11,16-21 machen und wurde von einem Verfahren entwickelt, um Ganglienzellen zu isolieren, 22 modifiziert. Es gibtmehrere Vorteile dieses Ansatzes. Zunächst werden viele Funktionen von Küken Hinterwurzelganglien (DRG) Entwicklung gut charakterisiert, einschließlich der Zeitrahmen für die Geburt, Axon Verlängerung und Proteinexpressionsprofile 2,23-28 und dadurch eine Grundlage, auf der lehr zu bauen informativ in-vitro-Experimenten. Zweitens, dissoziiert neuronalen Kulturen ermöglichen die Ermittler mehr direkt zu Nervenzellen zu untersuchen, verglichen mit alternativen Ansätzen mit intaktem DRG-Explantaten (die Neuronen und nicht-neuronalen Zellen enthalten) und / oder Mischkulturen, die sowohl dissoziierten Neuronen und nicht-neuronalen Zellen. Drittens ist das hier beschriebene Verfahren unkompliziert, kostengünstig und zugänglich für Studenten. Daher kann diese Technik für die Forschung als auch für Lehrzwecke verwendet werden. Außerdem sollten kleinere Variationen dieses Protokoll schnell, hohe Ausbeute Reinigung von Neuronen aus anderen Quellen als DRGs zu ermöglichen. Zum Beispiel könnte das Verfahren modifiziert, um neuronal bereitzustellen ENRiched Kulturen aus anderen Geweben, wie embryonalen Vorderhirns und des Rückenmarks. Immunzytochemie Protokolle für diese dissoziierten neuronalen Kulturen optimiert und werden im Detail hier beschrieben. Das Verfahren für die Doppel Immunzytochemie gegen neuronale Zelladhäsionsmolekül (NCAM) und β1 Integrine ist. Aus diesen immunzytochemische Methoden erzeugten Daten werden verwendet, um die räumliche Musterung und Intensität von mehreren Molekülen in kultivierten Neuronen 8,16 untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Sterile kleine Kulturschalen (35 mm)</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Sterile große Kulturschalen (100 mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Sterile große Petrischalen (100 mm)</td><td>VWR</td><td>89000-302</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale aus Glas (100 mm)</td><td>VWR</td><td>D108962</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>1100-12</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser (22 x 22 mm)</td><td>Fisher</td><td>12 518 105K</td><td>0,13-0,17 mm Dicke ist optimal für die Mikroskopie</td></tr><tr><td>Porcelin Deckglashalter</td><td>Thomas scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>verwenden Sie 50 ml Aliquots pro 500 ml Ham's F12 Medium</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>VW3204-1</td><td>bei 2 M verwenden, kann vor dem Verwerfen zweimal verwendet werden</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>5 M NaCl-Lösung für Laminin-1 Stammlösung</td></tr><tr><td>verwenden Laminin-1</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>Add 72 &micro; l steriler 5 M NaCl und aliquot in 50 &μ; l</td></tr><tr><td>15 ml Konisches Röhrchen-Zellen-Treatment</td><td></td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>PBS CMF 10x</td><td>Gibco</td><td>14200</td><td>bei 1x, verdünnt mit sterilem Millipore-gefiltertem Wasser</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Gibco</td><td>14080</td><td>bei 1x, verdünnt mit sterilem Millipore-gefiltertem Wasser</td></tr><tr><td>Ham's F12</td><td>Lonza</td><td>12-615F</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Gibco</td><td>10438</td><td>Verwendung in F12HS20 bei 10 %</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Herstellung einer sterilen 1 M Lösung in destilliertem Wasser, Verdünnung in F12 Medien, um eine Endkonzentration von 10 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomyocin</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td>zu erhalten Verwendung von 5 ml in 500 ml F12 Medium</td></tr><tr><td>NT3</td><td>Millipore</td><td>GF031</td><td>1 ml steriles Millipore-Wasser zugeben, unter sterilen Bedingungen aliquotieren, bei -20 ° C lagern; C, in einer Endkonzentration von 10 ng/ml in F12H-Medien verwenden, bei -20 &° halten; C nicht auftauender Gefrierschrank</td></tr><tr><td>NGF</td><td>RnD-Systeme</td><td>256-GF</td><td>1 ml steriles 1x PBS mit 0,1 % BSA zugeben, unter sterilen Bedingungen aliquotieren, bei -20 & Grad lagern; C, verwendet in einer Endkonzentration von 10 ng/ml in F12H-Medien</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>aliquot unter sterilen Bedingungen, lagern bei -20 &de; C, Verwendung bei einer Endkonzentration von 200 mM in F12H-Medien</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>aliquot unter sterilen Bedingungen, Lagerung bei -20 & Grad; C</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Gibco</td><td>15260<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Sonstige benötigte Artikel: allgemeine Sezierinstrumente, einschließlich Glaspasteurpipetten, fruchtbare weiße Leghorn-Hühnereier, Kontroll-Eier-Inkubator (befeuchtet, 37 &°; C), Zellinkubationskammer (befeuchtet, 37°; C), Laminar-Flow-Haube, binokulare Stereovision Dissektionsbereich</td></tr><tr><td colspan="4">Immunzytochemische Reagenzien Tabelle</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>in Fixierlösung (4 % Paraformaldehy, 30 % Saccharose, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>in Fixierlösung (4 % Paraformaldehy, 30 % Saccharose, 2x PBS)</td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Life technologies</td><td>PCN500</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>VWR</td><td>16004-430<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Primärer Antikörper Tabelle</td></tr><tr><td>Antikörper gegen NCAM</td><td>Millipore</td><td>AB5032</td><td>polyklonaler</td></tr><tr><td>Antikörper gegen aktiviert &beta; 1 Ingegrin</td><td>Millipore</td><td>MAB19294</td><td>monoklonal</td></tr><tr><td colspan="4">Sekundärer Antikörper Tabelle</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus IgG Alexa 488</td><td>Lebenstechnologien</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG Alexa 548</td><td>Lebenstechnologien</td><td>A11036</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation und kultur der dissoziierte sensorischen neuronen aus hühnerembryonen

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neuronen sind vielfältig Zellen, die wesentlichen Informationen für eine Vielzahl von Funktionen, einschließlich Sensation, Motorbewegung, Lernen und Gedächtnis zu tragen. Studium Neuronen in vivo kann eine Herausforderung sein aufgrund ihrer Komplexität, ihrer abwechslungsreichen und dynamischen Umgebungen und technische Grenzen. Aus diesen Gründen, Studium Neuronen in vitro kann von Vorteil sein, um die komplexen Geheimnisse von Neuronen zu entwirren. Die gut definierte Art der Zellkulturmodellen bietet detaillierte Kontrolle über Umweltbedingungen und Variablen. Hier beschreiben wir, wie zu isolieren, zu distanzieren und Kultur primären Neuronen aus Hühnerembryonen. Diese Technik ist schnell, billig und erzeugt ein robustes Wachstum sensorischen Neuronen. Das Verfahren konsequent produziert Kulturen hoch Neuronen angereichert sind und nur sehr wenige nicht-neuronale Zellen (weniger als 5%). Primären Neuronen nicht gut an unbehandeltem Glas oder Kunststoffgewebekultur, daher detaillierte Verfahren zu zwei Distin erstellenCT, gut definierte Laminin enthaltenden Substraten für neuronale Plattierung beschrieben. Kultivierten Neuronen sind sehr gut für mehrere zelluläre und molekulare Techniken, einschließlich Co-Immunopräzipitation, Live Cell Vorstellung, RNAi, und Immunzytochemie. Verfahren für die Doppel Immunzytochemie auf diesen kultivierten Neuronen wurden optimiert und hier beschrieben.

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht Ermittler Kultur eine angereicherte Population von dissoziierten embryonalen sensorischen Neuronen mit sehr wenigen (zB &lt;5%) nicht-neuronalen Zellen 7,8,10,16. Zahlreiche DRGs aus der lumbosakralen, des Brustraums und zervikalen Regionen erhalten werden. Je nach den Bedürfnissen des Forschers kann DRGs aus diesen unterschiedlichen anatomischen Regionen leicht isoliert werden. Zum Beispiel zeigt 1 Bilder des Hühnerembryos durch verschieden...

Zellkulturmodelle bieten detaillierte Kontrolle über Umweltbedingungen und damit eine leistungsfähige Plattform, um zahlreiche Aspekte neuronaler Zellbiologie aufzuklären. Wir beschreiben eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Methode, um von Hühnerembryonen zu isolieren, zu dissoziieren, und die Kultur sensorischen Neuronen. Details der Substrate Vorbereitung und Immunzytochemie sind ebenfalls vorhanden.

Isolation und Kultur der Dissoziierte sensorischen Neuronen aus Hühnerembryonen

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine angereicherte Population dissoziierter primärer sensorischer Neuronen aus Hühnerembryonen zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem intakte dorsale Wurzelganglien vom embryonalen Tag an, sieben bis 10 Hühnerembryonen in eine konische Röhre gesammelt und anschließend in ihre dissoziierte Zellsuspension zerlegt werden. In einem zweiten Schritt werden dissoziierte DRG-Zellen zur Inkubation auf einer Kulturschale plattiert.Danach wird die Kulturschale sanft gespült, um die Neuronen bevorzugt zu entfernen. Der letzte Schritt umfasst das Plattieren der dissoziierten sensorischen Neuronen auf den gut definierten Substraten, wie z. B. säuregewaschene und gebackene Deckgläser, die mit hohen oder niedrigen Lamininkonzentrationen vorcodiert sind. Eine Immun-Zytochemie wird verwendet, um das Vorhandensein von NCA und aktivierten Beta-One-Integrinen in den Zellkörpern, Neuriten und Wachstumskegeln der dissoziierten kultivierten embryonalen sensorischen Hühnerneuronen nachzuweisen.Diese Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um zahlreiche Aspekte der Neurobiologie aufzuklären, einschließlich der Mechanismen der Axonführung, der Wachstumskegel, der Dynamik des Zytoskeletts sowie der Zusammensetzung und Regulation der Zelloberfläche. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, schnell die Kulturen zu erhalten, die stark mit dissoziierten sensorischen Neuronen angereichert sind, die nur sehr wenige Gliazellen enthalten. Dies unterscheidet sich von den intakten dorsalen Gangling-Kulturen, die sowohl Neuronen als auch nicht-neuronale Zellen enthalten.Darüber hinaus sollten geringfügige Variationen dieses Protokolls eine hohe Ausbeute an neuronalen Kulturen aus anderen Quellen als den Spinalganglien, einschließlich des embryonalen Vorderhirns, ermöglichen. In einer Laminar-Flow-Haube knacken Sie ein inszeniertes fruchtbares weißes Leghorn-Küken-Ei und geben Sie seinen Inhalt in eine 100-Millimeter-Petrischale. Übertragen Sie den Embryo anschließend in eine weitere 100-Millimeter-Petrischale.Geben Sie erwärmtes XPBS in die Petrischale, um das Gewebe feucht zu halten. Der Embryo wird geköpft und der Körper in eine andere saubere Petrischale gebracht. Erwärmtes F 12 HS 10 wird dem Gewebe zugegeben.Platzieren Sie die Petrischale mit embryonalem Gewebe unter dem Präpariermikroskop in einer Laminar-Flow-Haube. Machen Sie danach einen vertikalen Mittellinienschnitt vom Schwanz bis zum Hals, indem Sie die sich entwickelnde Dermis einklemmen, um Herz, Lunge und andere Organe freizulegen. Fassen Sie mit der feinen Pinzette sanft den Hals und die Aorta oder ein anderes Gewebe unmittelbar oberhalb des Herzens und ziehen Sie es in Richtung Schwanz, um das Tier auszuweiden.Tragen Sie anschließend warmes F 12 HS 10 auf das Tuch auf, um das Präparat weiter zu reinigen und das Tuch feucht zu halten, und wiederholen Sie die Anwendungen von F 12 HS 10 während der gesamten Dissektion nach Bedarf. Entfernen Sie dann alle verbleibenden Herz-Kreislauf-, Atemwegs- oder Verdauungsorgane, um die sich entwickelnden Rippenwirbelsäule freizulegen, und DRGs, um die DRGs entlang beider Seiten der Lendenwirbelsäule zu sammeln, unterhalb der Rippen, und ziehen Sie die DRGs aus dem Embryo. Dies geschieht durch Einklemmen und Durchtrennen der Wurzeln, die vom Dr.G in Richtung Rückenmark reichen, und durch Greifen des sich entwickelnden Nervs vom DRG zur Peripherie oder umgekehrt.Anschließend legen Sie die intakten DRGs in eine 35 Millimeter große Kulturschale, die mit warmem F 12 HS 10 gefüllt ist. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe wie die dorsalen oder ventralen Wurzeln, das an DRGs haften könnte. Um DRGs oberhalb der Lendenwirbelsäule zu erhalten, entfernen Sie die ventrale Hälfte der Brust- und Halswirbelsäule.Dies geschieht durch einen Schnitt in der sich entwickelnden Wirbelsäule senkrecht zur Rückenmarksachse im oberen Lendenwirbelbereich und einen weiteren Schnitt im oberen Halsbereich. Machen Sie dann Schnitte entlang der rechten und linken Seite der Wirbelsäule. Zusammen lösen diese Schnitte die ventrale Hälfte der Wirbelsäule vom Embryo ab, und die Säule wird dann aus dem Embryo entfernt, um einen einfachen Zugang zu den DRGs zu ermöglichen.Entfernen Sie das thorakale und zervikale Rückenmark, indem Sie das Rückenmark mit einer feinen Zange greifen. Entnehmen Sie anschließend die intakten Thorax- und Gebärmutterhals-DRGs wie zuvor und legen Sie sie mit anderen DRGs in das warme F 12 HS 10. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, das an den DRGs haften könnte.Spülen Sie dann das Innere einer neuen Glaspasterpipette mit F 12 HS 10 aus, um zu verhindern, dass DRGs an der Wand der Pipette haften bleiben. Mit der gespülten Pipette werden alle DRGs und F 12 HS 10 aus der kleinen Petrischale in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen übertragen, es können weitere Embryonen präpariert werden, um die Anzahl der DRGs bei diesem Verfahren zu erhöhen. Legen Sie das konische Röhrchen mit intakten DRGs in die Zentrifuge und drehen Sie es zwei bis drei Minuten lang vorsichtig mit dem 200-fachen G.Vergewissern Sie sich, dass die DRGs auf den Boden des Rohrs gesunken sind. Anschließend F 12 HS 10 vorsichtig entfernen, dabei das DRG-Granulat ungestört lassen. Als nächstes fügst du zwei Milliliter eines X-C-M-F-P-B-S hinzu, um das Pellet der DRGs zu entfernen.Schleudern Sie erneut und entfernen Sie das C-M-F-P-B-S, während Sie die DRGs beibehalten. Wiederholen Sie diesen Waschschritt für insgesamt drei Wäschen. Nachdem die Waschgänge abgeschlossen sind und C-M-F-P-B-S entfernt wurde, geben Sie zwei Milliliter erwärmtes Trypsin in das 15-Milliliter-Röhrchen und entfernen Sie vorsichtig die DRGs.Legen Sie das Röhrchen dann für 10 bis 15 Minuten in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad, um die DRGs in dissoziierte Zellen zu verdauen. Die DRGs vorsichtig in Trypsinlösung einfärben und visuell auf das Fehlen intakter DRGs prüfen. Die Behandlung fortsetzen, bis die intakten DRGs nicht mehr mit dem Auge zu sehen sind, und/oder längere Inkubationszeiten im 37 Grad Celsius warmen Wasserbad einplanen, bis die intakten DRGs dissoziiert sind.Anschließend zentrifugieren Sie die dissoziierten DRGs und das Trypsin bei 200 mal G für drei bis fünf Minuten, um ein Pellet zu bilden. Bei Bedarf länger schleudern, bis das Pellet gebildet ist. Saugen Sie dann das Trypsin vorsichtig an, ohne das Pellet zu stören.Geben Sie zwei Milliliter F 12 hs 10 zum Pellet und trichen Sie die DRGs vorsichtig. Übertragen Sie anschließend den gesamten Inhalt aus dem konischen Röhrchen in eine 100-Millimeter-Kulturschale. Spülen Sie das Röhrchen mit acht Millilitern F 12 HS 10 und geben Sie es jeweils zwei Milliliter in die Kulturschale, so dass insgesamt 10 Milliliter vorhanden sind.Stellen Sie danach die Kulturschale für drei Stunden in einen befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator. Fügen Sie nun 400 Mikroliter vorbereitetes Laminin hinzu, einen auf jeden säuregewaschenen und gebackenen Glasdeckglas, und verteilen Sie ihn mit einer Pipettenspitze, um eine vollständige Abdeckung zu gewährleisten. Die Oberflächenspannung sorgt dafür, dass Laminin One auf dem Deckglas verbleibt und sich nicht auf dem Boden der Kulturschale ausbreitet.Einen Deckel über die Schüssel legen und Lamin one zwei bis drei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren lassen. Spülen Sie anschließend die lamininbeschichteten Deckgläser dreimal mit sterilem PBS in einer Laminar-Flow-Haube ab. Lassen Sie das PBS nach dem letzten Spülen auf den Deckgläsern.Verlieren Sie während der Spülschritte nicht an Oberflächenspannung. Spülen Sie nach der Inkubation mit einer sterilen 10-Milliliter-Pipette den Boden der Schale mit dissoziierten DRG-Zellen vorsichtig ab. Halten Sie die Schüssel in einem 45-Grad-Winkel.Etwa sieben Milliliter F 12 HS 10 entnehmen. Stoße es dann vorsichtig auf ein Drittel der Schale aus, um die Neuronen zu entfernen. Wiederholen Sie dies noch fünfmal.Drehen Sie dann die Schüssel um ca. 120 Grad und wiederholen Sie den Spülvorgang für weitere sechs Spülgänge. Wiederholen Sie dann den Vorgang für das verbleibende Drittel des Gerichts. Nun mit der gleichen Pipette F 12 HS 10 mit Neuronen aus der Schale in ein konisches Röhrchen übertragen.Zentrifugieren Sie es fünf bis 10 Minuten lang bei 200 g zum Pelletieren. Anschließend entfernen die Zellen F 12 HS 10, so dass das Pellet ungestört bleibt. Dann resuspendieren Sie das Pellet mit zwei Millilitern erwärmtem F 12 H plus Zusätzen.Bestimmen Sie anschließend die Zelldichte mit einem Hämozytometer und verdünnen Sie die Zellen nach Bedarf mit F 12 H plus Nahrungsergänzungsmitteln, um die gewünschte Plattierungskonzentration zu erhalten. Entfernen Sie dann sofort PBS von den mit Laminin beschichteten Abdeckungsschlüpfen. Platzieren Sie 400 Mikroliter Zellen darauf.Schieben Sie die Schale vorsichtig in einen 37 Grad Celsius heißen Zellkultur-Inkubator und lassen Sie sie zwei bis drei Stunden unter sterilen Bedingungen inkubieren. Fluten Sie die 35-Millimeter-Schalen mit Neuronen vorsichtig mit 1,6 Millilitern F 12 H plus Nahrungsergänzungsmitteln. Anschließend stellen Sie die Zellen wieder in den Inkubator und inkubieren sie über Nacht.Diese Abbildung zeigt kultivierte dissoziierte primäre sensorische Neuronen, die immunmarkiert für NCA und aktivierte Beta-1-Integrine sind. Die embryonalen Hühnerneuronen wachsen robust auf hohen Konzentrationen von Laminin-eins-Neuronenzellkörpern. Neurite und Wachstumskegel sind immunpositiv für NCA und aktiviertes Beta-1-Integrin.Das zusammengeführte Bild der beiden Färbungen zeigt, dass die meisten Zellen sowohl für N cam als auch für aktiviertes Beta-Eins-Integrin positiv sind. Wie für embryonale sensorische Neuronen von Küken zu erwarten, sind weniger als 5% der Zellen, die mit dieser Technik entnommen werden, nicht-neuronal. In diesem Bild ist eine Zelle mit einer glialartigen Morphologie zu sehen, die NCA M-negativ und Beta-Eins-Integrin-positiv ist.Konsistent mit einer nicht-neuronalen Zelle. Eine höhere Vergrößerung eines kultivierten sensorischen Neurons zeigt deutlich die Neuriten, die sich vom Zellkörper aus erstrecken, und dieser Einsatz zeigt eine stärkere Vergrößerung des Wachstumskegels an der Spitze eines Neuriten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, intakte dorsale Wurzelganglien sorgfältig und vollständig zu dissoziieren und die Neuronen und die entsprechende Dichte auf dem definierten Substrat zu plattieren, wie z. B. säuregewaschene und gebackene bedeckte Träger, die mit bekannten Konzentrationen von Laminat kodiert sind. Nach dem Kulturverfahren.Live-Bildgebungsverfahren wie Zeitraffermikroskopie können durchgeführt werden, um das Wachstumskoon, den Motilitätsstamm, die POAL-Dynamik und andere Wachstumskegelverhaltensweisen auf definierten Substraten und als Reaktion auf Moleküle, die auf die Kulturmedien aufgebracht werden, zu bewerten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein solides Verständnis dafür haben, wie man eine robust wachsende Kultur produziert, die für primär dissoziierte Neuronen aus embryonalen Spinalganglien von Küken stark angereichert ist.

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