Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Diffusionsgesetz von Lipiden und Proteinen in lebenden Zellmembranen zu messen, um dies zu erreichen. Zunächst wird die Punktspreizungsfunktion des Mikroskops kalibriert, indem nanoskopische fluoreszierende Kügelchen abgebildet werden. Als nächstes werden Liposomen-basierte Vektoren, einschließlich eines fluoreszenzmarkierten Moleküls von Interesse, hergestellt und entweder durch Transfektion oder direkten Einbau in lebende Zellen eingeführt.

schnelle Bildgebung der Plasmamembran lebender Zellen erfolgt durch die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie. Abschließend wird die Korrelationsfunktion berechnet und das molekulare Diffusionsgesetz durch Gaußsche Anpassung extrahiert. Die resultierenden Daten.

Identifizieren Sie die Bewegungsart des untersuchten Lipids oder Proteins. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der konventionellen Fluoreszenzrückgewinnung nach dem Photobleaching-Ansatz oder der klassischen Einzelpunkt-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie besteht darin, dass sie die Messung des molekularen Diffusionsgesetzes ermöglicht. Wir wissen, dass die Kenntnis des Systems Priorität hat.

Auch im Gegensatz zu klassischen Methoden zur Verfolgung einzelner Partikel. Hier wird die mulare Verdrängung gemessen, ohne dass die Partikeltrajektorien extrahiert werden müssen. Infolgedessen kann dieses Metall leicht in Kombination mit relativ angenommenen und dichten Molekülen wie z.B. genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen verwendet werden.

Insgesamt kann diese Methode dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der zellulären Molekularbiologie zu beantworten, wie z.B. wie die Bewegung von Proteinen oder Lipiden die Plasmamembranstruktur und die funktionelle Organisation reguliert. Die Antwort auf diese und verwandte Fragen wird jedem zugänglich gemacht, und mit nur einem kommerziellen Mikroskop wird die Demonstration des gesamten Verfahrens durch Zo durchgeführt. ein Doktorand aus dem Labor. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Punktspreizungsfunktion des Bildgebungssystems kalibrieren. Beginnen Sie damit, 10 Mikroliter einer fluoreszierenden Bead-Lösung in 90 Mikrolitern destilliertem Wasser zu verdünnen, das zuvor in ein 500-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen gegeben wurde.

Beschallen Sie die Lösung 20 Minuten lang in einem Saunabad mit einem Skalpell, schneiden Sie ein ein Zentimeter großes Stück 3%AGA Rosengel ab und geben Sie es in eine Petrischale. Geben Sie 10 Mikroliter der verdünnten fluoreszierenden Bead-Lösung auf die Oberseite des Gels. Dann drehen Sie das Stück Gel mit einer Pinzette in einer zwei Zentimeter großen Petrischale aus Glas um.

Wieder mit einer Pinzette. Drücken Sie auf das Stück Gel, um den Tropfen zu verteilen. Schalten Sie als Nächstes den Erfassungsaufbau ein, der aus einem kommerziellen Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop besteht.

Ausgestattet mit einem Inkubator und einer schnellen E-M-C-C-D-Kamera, die an einen Computer angeschlossen ist, auf dem eine Anwendungssuite, eine fortschrittliche Fluoreszenzsoftware und/oder Solis-Bilderfassungssoftware ausgeführt wird. Legen Sie die Probe mit dem I-Stück und Durchlicht in die Halterung auf dem Mikroskoptisch. Konzentrieren Sie sich auf den Rand des Gels.

Zentrieren Sie dann das Gel über dem Objektiv und passen Sie den Fokus an, um den Laserausrichtungsvorgang zu starten. In der Leica Anwendungssuite wählt die fortschrittliche Fluoreszenzsoftware die automatische Ausrichtung aus und befolgen Sie die automatische Ausrichtung. Nachdem der Laser in der und/oder Solis-Erfassungssoftware ausgerichtet wurde, klicken Sie auf die Schaltfläche Einstellungen. Es öffnet sich ein Fenster.

Stellen Sie die Kamerabelichtung auf 100 Millisekunden, die gewonnene EM auf 1000 und die Wiederholung auf 100 ein und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für die Bildübertragung. Klicken Sie dann auf das Fenster zum automatischen Speichern und geben Sie den Namen des Experiments ein. Finden Sie ein Sichtfeld mit vereinzelten Einzelpunkten.

Fokussieren Sie sich auf einen hellen Punkt, der normalerweise ein Perlenaggregat darstellt. Erwerben Sie dann 100 Bilder. Wiederholen Sie diesen Schritt fünf- bis sechsmal, um Bilder von mehreren einzelnen Punkten aufzunehmen.

Importieren Sie die erfassten Reihen in ein Datenverarbeitungsprogramm wie MATLAB und mitteln Sie den Zeitwert des Stapels. Zeigen Sie dann das Bild der gemessenen durchschnittlichen Intensität an. Zoomen Sie auf einen hellen, kleinen fluoreszierenden Fleck und identifizieren Sie grob die Mitte als das hellste Pixel des Flecks.

Wählen Sie abschließend die Größe des interessierenden Bereichs aus, den Sie um das Partikel herum zeichnen möchten, in der Regel ein Mikrometer daneben, um die ausgewählte Intensitätsverteilung mit einer Gaußschen Funktion anzupassen. Wählen Sie den Befehl gause fit. Überprüfen Sie die erhaltenen Rückstände, um die Güte der Passung zu überprüfen.

Kalibrieren Sie abschließend die Kamera wie im Begleitdokument beschrieben. Sobald das System kalibriert ist, ist es an der Zeit, die Zellen für die Bildaufnahme zu markieren. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der für den Lipideinbau erforderlichen Liposomen, indem Sie jeweils ein Milligramm DOPE, ein Milligramm D-O-T-A-P und ein Milligramm PSA ADO 4 88 in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen auflösen, das einen Milliliter Chloroform enthält.

Mischen Sie anschließend je 0,5 Milliliter der DOPE- und D-O-T-A-P-Lösungen mit 25 Mikrolitern PSA ATO 4 88-Lösung. Legen Sie das Röhrchen in einen Zentrifugalverdampfer und initiieren Sie die Drehung bei 280 gs. Starten Sie die Vakuumpumpe und lassen Sie sie 24 Stunden lang rotieren.

Geben Sie am nächsten Tag 0,5 Milliliter 20 Millimolar Heis-Puffer in das Röhrchen und wirbeln Sie es 15 Minuten lang. Legen Sie dann das Rohr in ein Schallbad und beschallen Sie es 15 Minuten lang bei 40 Grad Celsius. Zur Vorbereitung der Zellen waschen Sie eine P 100-Schale aus konfluentem Chinesischem Hamster-Eierstock oder CHOK eine Zelle dreimal mit 10 Millilitern PBS.

Dann einen Milliliter Trypsin hinzufügen und bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid fünf Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation fügen Sie neun Milliliter D-M-E-M-F 12 hinzu, die mit 10 % FBS ergänzt sind, um die Zellen zu suspendieren und 150 Mikroliter dieser zellhaltigen Lösung auszusäen. In einer 22 Millimeter großen Petrischale mit Glasboden, in der sich 800 Mikroliter des gleichen Mediums befinden.

Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Für den Lipideinbau ersetzen Sie das Zellmedium durch 500 Mikroliter freies Serummedium und inkubieren Sie es 30 Minuten lang. Nach der Inkubation zwei Mikroliter Liposomenlösung hinzufügen und weitere 15 Minuten inkubieren.

Waschen Sie dann die Zellen mit PBS und fügen Sie neues DM EMF 12 hinzu. Schalten Sie vor der Bildgebung mindestens 12 Stunden vor dem Experiment den Inkubator des Mikroskops ein, um den Mikroskoptisch und die optischen Komponenten auf experimentelle Temperatur zu bringen. Der schwierigste Schritt dieses Verfahrens ist die Akquise.

Um den Erfolg zu gewährleisten, sollten Sie jeden Erfassungsparameter für das System optimieren. In Untersuchung. Schalten Sie am Tag des Experiments das Mikroskop ein und warten Sie, bis die Kameras die Arbeitstemperatur erreicht haben.

Um das Experiment durchzuführen, werden wir zwei Kameras verwenden. Kamera eins wird für die Bildgebung verwendet, und Kamera zwei wird verwendet, um die Zelle auszuwählen. Diese Konfiguration ermöglicht die schnellste erreichbare Erfassungszeit in der Software.

Zum Einstellen der Parameter für die Durchlichtbildgebung. Geben Sie 20 Millisekunden ein Geben Sie als Belichtungszeit eins für die EM-Verstärkung für beide Kameras ein. Öffnen Sie dann das Kontrastmodus-Fenster in der Software und verlassen Sie.

Klicken Sie auf BF, um die Hellfeldoption auszuwählen. Legen Sie die Proben in den Halter, während Sie die Probe durch die Okulare betrachten. Bringen Sie die Probe in den Fokus.

Senden Sie dann das Licht manuell an Kamera eins und drücken Sie vorsichtig auf die Schlitze, so dass nur der abzubildende ROI beleuchtet wird. Verschieben Sie als Nächstes eine Zelle in den ausgewählten Bereich und senden Sie das Licht mit der Software an Kamera zwei. Zeichnen Sie dann in der Software einen ROI, um eine Referenz zu generieren.

Um den Laser per Software auszurichten, wählen Sie zunächst die Option Automatisch ausrichten. Um dann die automatische Ausrichtung zu starten, wählen Sie Kollimator aktivieren. Öffnen Sie dann den Inkubator an der Oberseite und kollimieren Sie den Laserstrahl.

Wenn der Laser in der unteren linken Ecke des Softwarefensters ausgerichtet ist, klicken Sie auf die Schaltfläche 70, um die Eindringtiefe auf 70 Nanometer einzustellen. Dies entspricht einem Einfallswinkel des Lasers auf das untere Glas von etwa 70 Grad in der Leica Application Suite. Textfeld für die erweiterte Belichtungszeit der Fluoreszenzsoftware.

Geben Sie 70 Millisekunden in das Textfeld EM-Verstärkung ein. Geben Sie 1000 ein, um dasselbe auf Kamera zwei zu tun. Öffnen Sie das Einstellungsfenster und geben Sie die gleichen Zahlen in die entsprechenden Textfelder ein.

Klicken Sie anschließend auf den Live-Button. Die Fluoreszenz wird an Kamera eins gesendet, und ein Bild der Probe wird auf dem Bildschirm angezeigt. Bewegen Sie die Probe, bis eine Fluoreszenzzelle den Referenzbereich von Interesse erreicht.

Drücken Sie dann den Knopf an der Vorderseite des Mikroskopgehäuses, um das Licht an Kamera zwei zu senden, und bewegen Sie das Z-Positionsrad genau, um auf die Zellmembran in der und/oder einzigen Software zu fokussieren. Öffnen Sie das Einstellungsfenster und stellen Sie die minimal erreichbare Belichtungszeit mit 1000 EM Verstärkung im beschnittenen Sensormodus 10 auf die fünfte Wiederholung ein und stellen Sie die Option "Automatisches Speichern" ein, um mit der Aufnahme der Bildserie zu beginnen. Klicken Sie auf das Kamerasymbol der Software und warten Sie, bis die Erfassung abgeschlossen ist.

Öffnen Sie dann das Einstellungsfenster, deaktivieren Sie die EM-Verstärkung und entfernen Sie das Häkchen bei der Option für den zugeschnittenen Modus. Während der Aufnahme steigt die Temperatur der Kamera in der Regel um etwa zwei bis drei Grad an. Warten Sie also, bevor Sie Bilder von einer neuen Zelle aufnehmen, bis die optimale Arbeitstemperatur erreicht ist.

Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, befolgen Sie erneut die Anweisungen im Begleitdokument, um die mittlere quadratische Verschiebung aus der Bildgebung zu berechnen und eine fluoreszenzmarkierte Variante des interessierenden Moleküls zu erhalten. CHOK-1-Zellen wurden entweder mit ADO 4 88 PPE markiert oder mit einem Transfer in Rezeptor oder T-F-R-G-F-P transfiziert und mit TIRF abgebildet, wie in diesem Video beschrieben. Wie hier zu sehen ist, ist das gemessene Diffusionsgesetz für ADO 4 88 PPE flach, was auf eine weitgehend freie Diffusion hinweist, wie zuvor durch stimulierte Emissionsverarmungsfluoreszenz, Korrelationsspektroskopie oder stationäre FCS-Messungen nach Transfektion mit dem T-F-R-G-F-P gezeigt wurde, ist das gemessene Diffusionsgesetz für T-F-R-G-F-P zunächst flach und bleibt unter 100 Nanometern mittlerer molekularer Verschiebung mit einem durchschnittlichen scheinbaren Diffusionskoeffizienten von etwa 0,7 μm im Quadrat pro Sekunde.

Darauf folgt eine rasche Abnahme der scheinbaren Diffusivität auf 0,2 Mikrometer pro Sekunde. Der Wert, der typischerweise mit beugungsbegrenztem FCS gemessen wird. Es ist interessant festzustellen, dass, wie dieses letzte Beispiel zeigt, der vorliegende Ansatz die durchschnittliche molekulare Verschiebung mit einer Auflösung von einigen Dutzend Nanometern messen kann, selbst wenn relativ schwache und dichte Markierungen wie GFP verwendet werden.

Darüber hinaus legt die räumliche Skala, bei der der scheinbare Diffusionskoeffizient zu sinken beginnt, die charakteristische Größe des partiellen Proteineinschlusses durch das Membranskelett auf etwa 120 Nanometer fest, was mit früheren Schätzungen übereinstimmt. Sobald Sie das Verfahren der Datenanalyse beherrschen, kann diese Erfassung in wenigen Minuten durchgeführt werden. Wir glauben, dass diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Zell- und Molekularbiologie den Weg ebnen wird, um die raumzeitliche Regulation der Protein- und Lipiddiffusion in lebenden Proben einfach und quantitativ zu erforschen.