Name: Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 10 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie molekulare Diffusionsgesetze in lebenden Zellmembranen mit schneller Fluoreszenz-Bildgebung messen. Diese Methode nutzt TIRF-Mikroskopie und Gauß-Fitting für präzise Analysen.

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Diese Arbeit wird teilweise unterstützt durch NIH-P41 P41-RRO3155 und NIH P50-GM076516 (Zuschuss an EG) und Fondazione Monte dei Paschi di Siena (Zuschuss an FB).

1. Systemkalibrierung <ol><li> Point Spread Function (PSF) Kalibrierung <ol><li> Verdünne 10 ul 30 nm Fluoreszenz Wulst Lösung (etwa 5 um) in 90 ul destilliertem Wasser und dann beschallt die Lösung für 20 min. Schneiden Sie ein Quadrat (1 cm x 1 cm) Stück Agarose-Gel (3%) und beträgt 10 ul der Lösung auf die Oberseite des Gels. Drehen Sie das Stück Gel auf der unteren Glas einer 2 cm Petrischale und drücken Sie die Tropfen auf dem Glas. </li><li> Schalten Sie den Erwerb Setup, legen Sie die Probe in den Halter, stellen Sie die Kamera Belichtung und EMgain (100 ms und 1000 sind gute Parameter, sondern optimieren nach dem System) und warten Sie die Kamera abkühlen. </li><li> Stellen Sie die Kamera Belichtung bis 100 ms, Kamera EMgain bis 1000, Erfassungsmodus zu übertragen, Wiederholung und 100 Auto-Save-Einstellung Rahmen. </li><li> Mit Hilfe des Okulars und Durchlicht Fokus auf der Grenze des Gels und bewegen Sie dann das Ziel in der Mitte des Gels, stellen Sie den Fokus und start der Laserausrichtung Verfahren (LAS AF, wählen Sie &quot;TIRF-Setup&quot; und folgen Sie den Ausrichtungsvorgang auto). </li><li> Finden Sie ein Sichtfeld mit isolierten einzelnen Spots, genau konzentrieren sich auf die helleren Fleck (die in der Regel stellt Perlen Aggregat) als Referenz, zu erwerben 100 Bilder und wiederholen Sie den Schritt 5-6 mal um mehrere einzelne Spots zu erwerben. </li><li> Importieren Sie die erworbenen Serie mit einem Datenverarbeitungsprogramm und im Durchschnitt den Stapel in der Zeit (Abbildung 1A) und wählen Sie einen einzelnen isolierten Perle. Achten Sie darauf, um die Kleinsten zu wählen Partikelaggregate zu vermeiden. </li><li> Die gewählten Intensitätsverteilung (ein Beispiel für Einzelperlen Profil ist in 1B vorgelegt) mit einer Gauß-Funktion mit dem Befehl &quot;gaussfit&quot; (in den ICS-Matlab-Tools in den Materialien in Matlab). Überprüfen Sie, ob die Güte der Anpassung durch Einsicht in die erhaltenen Reste (ein Beispiel für Einbau Gauß-Profil mit den entsprechenden Residuen vorgestellt in Abbildung 1B). </li></ol></li><li> Kamerakalibrierung <ol><li> Schalten Sie die Kamera, und warten Sie die Kamera abkühlen. Stellen Sie die Kamera Erwerb Einstellung, (dh für die verwendete Kamera setzen wir die Exposition gegenüber 0,5 ms, Kamera EMgain bis 1000, Erfassungsmodus zu Gestellte Modus, der ROI Größe 32 x 128, 10.000 Wiederholungen) und starten Sie die Übernahme von der Kamera Hintergrund Signal. </li><li> Import erworben Rahmen Serie mit einem Datenverarbeitungsprogramm. Berechnen und überprüfen Sie die durchschnittliche Intensität in jedem Pixel, um zu überprüfen, dass die Kamera Hintergrund ist ungefähr Wohnung in der ausgewählten Region des Chips. In Freigestellte Modus, entfernen Sie den ersten und den letzten horizontalen Linien (3 bis 10, je nach der Größe der ROI) für jeden Rahmen, weil die Kamera Hintergrund wird in der Regel in den Grenzlinien vorgespannt ist. </li><li> Erstellen Sie ein Histogramm der Werte (auch definiert digitale Ebene, DL) in aufgenommenen Bildern Stack (mit dem Befehl &quot;hist&quot; in Matlab) und plotten den Logarithmusder resultierende Frequenz (unter Verwendung semilogy Befehl in Matlab). Ein Beispiel für DL Verteilung Kamera Hintergrund ist in Figur 2 dargestellt. HINWEIS: Wenn die Kamera gut funktioniert, wird das Grundstück eine etwa Gauß-Peak (ein Parabelprofil in Log-Skala), die die Verteilung der Werte auf Null Photon, gefolgt von einem exponentiellen Abfall (eine Linie mit negativer Steigung in Log-Skala zugeordnet zeigen ), die die Verteilung der Werte 1 Photon (Figur 2) zugeordnet sind, stellen. Insbesondere das Zentrum und die Varianz der Gaußschen Funktion zeigen die Kamera-Offset-Fehler und jeweils während der Zerfallskonstante des exponentiellen Teil stellt eine Schätzung des DL von der Kamera auf jedes einzelne Photon zugeordnet. In Matlab verwenden Sie den Abschnitt &quot;CalibrateCamera&quot; der Script in Hilfsmaterialien. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang für alle ausgewählten Kamera EMGain und Verstärkung. </li></ol></li></ol> 2. beschriftetZellpräparation <ol><li> Um die für die Lipid-Einbau 36 erforderlich Liposomen Man löst getrennt 1 mg DOPE (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin), 1 mg DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-trimethylammonium-propan), und 1 mg PPE-ATTO488 in 1 ml Chloroform. Mischen Sie 0,5 ml DOPE-Lösung, 0,5 ml DOTAP-Lösung und 25 ul PPE-ATTO488 Lösung und trocken unter Vakuum für 24 Stunden. 0,5 ml HEPES-Puffer, 20 mM, Vortex für 15 min mit Ultraschall 15 Minuten bei 40 ° C aufweist. </li><li> Um die Zelle zu bereiten, waschen Sie 3-mal mit PBS eine p100 Gericht konfluenter CHO-K1 (Chinese Hamster Ovar), 1 ml Trypsin und speichern in Inkubator für 5 min. Aussetzen abgelösten Zellen die Zugabe von 9 ml DMEM / F12-Medium mit 10% FBS und Saatgut 150 ul Zell-Lösung in eine Petrischale mit 800 ul des gleichen Mediums. </li><li> Lager im Brutschrank 24 h bei 37 ° C und 5% CO 2. Für die Lipid-Gründung, ersetzen Zellmedium mit 500ul serumfreiem Medium; nach 30 min, fügen 2 ul Liposomen-Lösung; nach 15 min mit Wasch PSB und neue DMEM / F12-Medium für die Bildgebung. </li><li> Für die Transfektion Transfektion Zellen nach Lipofectamin-Protokoll (Hersteller Anleitung) mit TfR-GFP-Plasmid und Speicher 24 h im Inkubator vor Bildgebung. </li></ol> 3. Datenerfassung <ol><li> Setup Vorbereitung <ol><li> Um das Mikroskop Thermostat 24 Stunden vor dem Experiment Einschalten des Inkubators. </li><li> Um die schnellsten erreichbaren Erfassungszeit gelten, die Arbeit in Freigestellte Sensor-Modus (siehe Einleitung) und verwenden Sie eine erste Kamera für die Bildgebung (Kamera 1) und zweiten Kamera, um die Zelle (Kamera 2) zu wählen. Ein Schema des Setup-Konfiguration ist in Abbildung S1 Ergänzende vorgestellt. Dann, um die zwei Kameras wiederum auf dem Mikroskop ausrichten und warten, bis die Kameras um sich abzukühlen. </li><li> Auf beiden Kameras die Parameter für Durchlicht-Bildgebung (dh </em&gt; 20 ms für Belichtungszeit, 1 für EM Gain) und legte das Mikroskop im Hellfeld-Modus. </li><li> Setzen Sie die Proben in der Halterung und konzentrieren sich mit Okular, senden Sie das Licht auf Kamera 1 und schieben Sie die Schlitze so dass das Licht nur auf der ROI für Cell Imaging (hier ein 32 x 32 Pixel ROI) verwendet. </li><li> Bewegen Sie eine Zelle in der ausgewählten Region und senden Sie das Licht an der Kamera 2 ist, dann ziehen Sie eine ROI in der Software, Kamera 2, um eine Referenz zu haben steuern. </li></ol></li><li> Abbildungs ​​(3A) <ol><li> Zunächst richten Sie den Laser TIRF nach dem Verfahren von Ihrem Setup. In unserem Setup, wählen Sie die &quot;TIRF-Setup&quot; und starten Sie die automatische Ausrichtungsverfahren. Wenn der Laser ausgerichtet Satz 70 nm Eindringtiefe (ca. 70 °). </li><li> Stellen Sie die Belichtungszeit auf 70 ms und 100 EMGain sowohl auf Kamera 1 und Kamera 2; Dann wählen Sie eine Zelle mit Kamera 1, dann schicken Sie das Licht auf Kamera 2 und genau fokussieren die Zellmembran. Stellen Sie die minimale Exposition auf camera 2, 1000 EMGain, Bolero Sensor-Modus, 10 5 Wiederholungen und stellen Autosave als FITS-Dateien (Flexible Image Transport System, ein Format, das leicht sein können verwaltet werden). </li><li> Starten Sie die Aufnahme, die Bildserien aufnehmen. Lassen Sie die Verstärkung und das zugeschnittene Mode auf Temperaturstabilisierung für den Erwerb eines neuen Zelle zu ermöglichen, dann wiederholen Sie die letzten beiden Schritte, um 8-10 Zellen zu erwerben. </li></ol></li></ol> 4. Berechnung der mittleren quadratischen Verlagerung von Imaging (i MSD) HINWEIS: Das folgende Protokoll kann direkt an Rohdaten angewendet werden. Zur gleichen Zeit ist die ganze Protokoll für Datenübernahmen simuliert sowohl in Matlab und in SimFCS. Der Link zu den entsprechenden Anleitungen finden Sie in der Rubrik &quot;Materialien&quot; gefunden werden. <ol><li> Berechnung von Matlab <ol><li> Importieren Sie die erworbenen Serie in Matlab mit ImportImageSeries Skript. Berechnen der durchschnittlichen Intensität von jedem Bild mit der Zeit zusammenmmand auf den ersten 2 Dimensionen bedeuten und benutzen Grundstück, um den resultierenden Vektor zu sehen. </li><li> Wenn mehr als 10% der Photobleaching vorhanden ist, entsorgen Sie die Serie oder entfernen Sie den ersten Teil von ihnen. Wenn sie niedriger ist, versuchen, die Auswirkungen auf die Korrelationsfunktion durch Subtraktion für jedes Bild seine mittlere Intensität zu korrigieren, wie früher 37 gezeigt. </li><li> Berechnen der durchschnittlichen Intensität von jedem Pixel unter Verwendung Schnitts auf die dritte Dimension und sehen sich ergebende Bild. HINWEIS: Besondere Aufmerksamkeit ist erforderlich, um Artefakt Korrelationen zu vermeiden. In der Tat, wie zuvor für ähnliche Techniken 38, Zellgrenzen sowie unscharf Vesikel konnte gezeigt werden, eine starke Korrelation vor. Wenn die Kontrolle des Durchschnitts Bild deckt Zellgrenzen oder unscharf Vesikel, versuchen, die Region beteiligt ansonsten verwerfen die Übernahme auszuschließen. Um die Wirkung dieser unbeweglichen Strukturen korrigieren subtrahieren den durchschnittlichen zeitlichen Intensität von jedem Pixel 39. </li><li> Berechnen Sie ter räumlich-zeitliche Korrelation (G (ξ, χ, τ)) mit der Funktion CalculateSTICScorrfunc. Entfernen G (ξ, χ, 0), da die Korrelation aufgrund der Schrotrauschen bei schlechten Licht Regime dominiert G (0,0,0); die Korrelation durch den Detektor dominiert G (± 1,0,0) und Partikelbewegung während der Belichtungszeit kann G (ξ, χ, τ) für τ = 0 zu verformen, indem die gemessenen Taillen (dieser Effekt verschwindet τ &gt; 0) 34. </li><li> Durchschnittliche G (ξ, χ, τ&gt; 0) unter Verwendung einer logarithmischen Zeit-Bin, um das Rauschen mittels der Funktion &quot;LogBinStack&quot; in Hintergrundmaterial zu reduzieren und dann passen die resultierende G (ξ, χ, τ) mit der Funktion &quot;gaussfit&quot; von die ICS-Matlab-Tools in den Materialien, die ich MSD (in der zweiten Spalte der resultierenden Array) erholen. </li><li> Plotten der erhaltenen Taille σ (τ) 2 (i MSD) als Funktion der Zeit. Wenn die Daten zu laut, zu versuchen, die Anzahl der acqu erhöhenired Rahmen, erhöhen die Laserleistung, durchschnittlich mehr G (ξ, χ, τ) zusammen. </li></ol></li><li> Berechnung durch SimFCS <ol><li> Öffnen Sie die erworbenen Dateien mit ImageJ mit BioFormat Importeur Plugin und sparen erworben Serie als Tiff-Sequenz. </li><li> Öffnen SimFCS und wählen RICS-Tool und wählen Sie Datei&gt; Importieren mehrerer Bilder (Ergänzende Abbildung S2). </li><li> Wählen Fit, legen Sie die richtigen Aufnahmeparameter und schließen Sie das Fenster passen (Ergänzende Abbildung S3). </li><li> Wählen Sie Anzeige&gt; durchschnittliche Intensität&gt; CH1 und überprüfen Sie die Anwesenheit von Photobleaching (Ergänzende Abbildung S4). </li><li> Wenn mehr als 10% der Photobleaching vorhanden Entsorgen Sie die Serie oder wenn es möglich ist, Last wieder die Bildfolge Entfernen des ersten Teils der Serie. </li><li> Wenn Bleichen ist es weniger als 10% wählen Sie Extras&gt; i MSD&gt; Parameter einstellen, überprüfen &#39;Use gleitenden Durchschnitt&#39;, in der ROI-Panel auf der linken Seite ein gesetztumber des Rahmens für den gleitenden Durchschnitt zu achten, dass der Korrespondent Zeit höher ist als die charakteristische Diffusionszeit (für Teilchen, das sich in 1 um 2 s -1 eine Zeit von 10 s eine gute Bewegungsdurchschnitt) </li><li> Wählen Sie Extras&gt; IMSD&gt; Berechnen i MSD (Ergänzende Abbildung S5) und Passform und exportieren Sie die i MSD aus dem Notizblock (Ergänzende Abbildung S6). </li></ol></li></ol> 5. Berechnung des Diffusionsgesetz aus dem i MSD <ol><li> Setzen Sie die ersten paar Punkte, um den Achsenabschnitt (σ 0 2) extrapolieren (5 Punkte sind in der Regel genug, aber mehr Punkte eingepasst werden kann, wenn sie ein lineares Verhalten zeigen) und vergleichen Sie diesen Wert mit der zuvor gemessenen PSF 2. Wenn sie vergleichbar sind, wird die Dynamik des isolierten Fluorophore verfolgt. Im Gegensatz dazu, wenn σ 0 2 2 &gt;&gt; PSF versuchen schneller zu erwerben, um zu gewährleisten, dasskeine versteckten Dynamik vorhanden sind 34. </li><li> Berechnen Sie den scheinbaren Diffusionskoeffizienten (D app) und die durchschnittliche Verschiebung (R) unter Verwendung der Gleichungen 3 und 4 (siehe Einleitung). </li><li> Grundstück D App als Funktion der R, eine Diffusionsgesetz vergleichbar mit dem, was mit Spot-Variation auf der Basis FCS 12 (3D) gemessen zu erhalten. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Einzelpartikelverfolgung (SPT) ist eine der häufigsten Strategien zur Molekulardynamik zu studieren, und es hat den großen Vorteil der Messung Partikelbahnen. Dies wiederum ermöglicht Sondieren das Verhalten noch wenige markierten Partikel in einem komplexen System. Um jedoch diesen Vorteil SPT muss in der Regel eine geringe Dichte der Sonde und sehr hell Etiketten zu erreichen. In diesem Fall ein komplexes Verfahren der Produktion, die Kennzeichnung und das Einsetzen in das System notwendig ist: insbesondere auf hohe z...

Ausgehend von der ursprünglichen "fluid mosaic"-Modell von Singer und Nicolson, das Bild der zellulären Plasmamembran kontinuierlich in den letzten Jahrzehnten um die Rolle der Schwellen Zytoskelett-und Lipid-Domänen enthalten 1,2 aktualisiert. Die ersten Beobachtungen wurden durch Fluoreszenzerholung nach Photobleichen (FRAP) enthüllt, dass ein signifikanter Anteil von Membranproteinen unbeweglich 3-5 erhalten. Diese bahnbrechenden Studien, wenn auch sehr informativ, von der relativ schlechte Auflösung im Raum (Mikrometer) und die Zeit (in Sekunden) von FRAP-Setups gelitten. Auch als ein Ensemble Mittelung Messung, fehlt in FRAP mit Informationen über Einzelmolekülverhalten. In diesem Zusammenhang ist die Möglichkeit, spezifisch zu markieren ein einzelnes Molekül mit sehr hellen Tags (die die Untersuchung des Diffusionsprozesses ein Molekül zu einem Zeitpunkt) ist sehr erfolgreich gewesen. Besonders, indem Sie dieZeitauflösung der Single Particle Tracking (SPT) Ansatz für die Mikrosekunden-Zeitskala, Kusumi et erhielten Zugang zu unbekannten Funktionen von Lipid-und Proteindynamik, die sich stark auf die Anerkennung der Rolle der Aktin-basierten Membranskelett in Membranphysiologie 6 beigetragen al. , 7. Diese Ergebnisse erzeugt die so genannte die "Lattenzaun und" Modell, in dem Lipid-und Proteindiffusion durch Aktin-Skelett-basierte geregelt. , Um den Zugriff auf die riesige Menge von Informationen, die von SPT viele experimentelle Fragen gestellt haben müssen jedoch angesprochen werden. Insbesondere wird das Markierungsverfahren typischerweise durch viele Schritte wie Herstellung, Reinigung und die Einführung der markierten Spezies in das System besteht. Weiterhin großen Labels, wie Quantenpunkte oder Metall-Nanopartikel, sind oft erforderlich, um die Sub-Millisekunden-Zeitskala und die Vernetzung der Zielmoleküle durch das Label nicht in vielen Fällen vermieden werden, zu erreichen. Schließlich sind viele Bahnenhaben aufzuzeichnenden statistischen Kriterien passen und damit eine niedrige Dichte des Etiketts erforderlich ist, um Tracking zu ermöglichen. Im Vergleich zu SPT, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS), die Überwindung viele dieser Nachteile stellt einen vielversprechenden Ansatz, um Molekulardynamik zu studieren. Tatsächlich funktioniert FCS gut auch mit dim und dichte Etiketten, so dass die Dynamik des fluoreszierenden Protein-markierte Moleküle in transient transfizierten Zellen zu studieren. Außerdem ermöglicht es erreichte hohe Statistiken in einem begrenzten Zeitraum. Schließlich trotz der "hohen" Dichte von Etiketten FCS bietet einzelne Moleküle Informationen. Dank all dieser Eigenschaften stellt FCS einen sehr einfachen Ansatz und wurde ausgiebig angewendet, um Lipid und Proteindynamik sowohl in Modellmembranen und im Live-Zellen 8-10 studieren. Viele verschiedene Ansätze vorgeschlagen worden, um die Fähigkeit von FCS auf die Details der molekularen Diffusion zeigen erhöhen. Zum Beispiel war es sheigenen, die durch Ausführen FCS auf unterschiedlich großen Beobachtungsgebiete kann man ein "FCS Diffusionsgesetz" aufschlussreich versteckt Merkmale des Molekularbewegung 11,12 definieren. Neben der Verwendung in der Größe variiert wurde die Schwerpunktbereich auch dupliziert 13, bewegt im Raum entlang der Linien 14-20 bzw. konjugiert mit schnellen Kameras 21,22. Mit Hilfe dieser "Raum-Zeit-'Korrelation Ansätze wurden relevante biologische Parameter von mehreren Membrankomponenten quantitativ auf beiden Modellmembranen und der tatsächlichen biologischen diejenigen, wodurch man einen Einblick in die räumliche Organisation Membran beschrieben. Jedoch in aller FRAP und FCS Anwendungen bisher beschriebenen die Größe der Fokusfläche eine Grenze der räumlichen Auflösung, die nicht überwunden werden können. Mehrere Super-Resolution-bildgebenden Verfahren wurden kürzlich entwickelt, um diese Grenze zu umgehen. Einige sind auf Lokalisierungsgenauigkeit basiert, wie stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie (STORM) &lt;sup&gt; 23,24, Photoaktivierung Lokalisationsmikroskopie (PALM) 25, Fluoreszenz PALM (FPALM) 26 und single-particle tracking PALM (sptPALM) 27: Die relativ große Menge an Photonen bei jeder Momentaufnahme erforderlich ist, begrenzt jedoch die Zeitauflösung Diese Verfahren, um mindestens einige Millisekunden, wodurch ihre Anwendbarkeit in vivo hemmt. Im Gegensatz dazu haben eine vielversprechende Alternative zur Super-Resolution Imaging von räumlichen Modulation der Fluoreszenzemission mit Stimulated Emission Depletion-Methoden (STED oder reversible optische Sättigungsfluoreszenzübergänge (RESOLFT)) 28,29 geöffnet. Diese Ansätze kombinieren die Gestaltung der Beobachtungsvolumen deutlich unter der Beugungsgrenze mit der Möglichkeit, schnelle Scan-Mikroskope und Detektionssysteme zu verwenden. In Kombination mit Fluoreszenzfluktuationsanalyse, erlaubt der STED-Mikroskopie, um direkt Sonde die raumzeitliche Dynamik von nanoskaligen Lipide und proteins live Zellmembranen 30,31. Die gleichen physikalischen Größen STED-Mikroskopie anhand kann durch eine modifizierte raumzeitlichen Bildkorrelationsspektroskopie (Stics 32,33) Verfahren, die für die Untersuchung der Dynamik von fluoreszenzmarkierten Membranproteine ​​und / oder Lipiden in lebenden Zellen erhalten werden und von einem kommerziellen Mikroskop. Das experimentelle Protokoll hier präsentiert wird nur von wenigen Schritten zusammen. Die erste erfordert eine schnelle Abbildung des Bereichs von Interesse auf der Membran. Dann wird der resultierende Stapel von Bildern verwendet, um die durchschnittlichen räumlichen-zeitlichen Korrelationsfunktionen zu berechnen. Vs -Mittlere Verschiebung Grundstück - von der Montage der Serie von Korrelationsfunktionen, die molekulare 'Diffusionsgesetz "kann direkt von der Bildgebung in Form einer scheinbaren Diffusionskoeffizienten (D app) erhalten werden. Dieses Grundstück kritisch hängt von der Umgebung durch die Moleküle erforscht und ermöglicht direkt die Anerkennung der tatsächlichen Diffusionsartender Lipid / Protein von Interesse. In mehr Details, wie zuvor gezeigt, 34, die räumlich-zeitliche Autokorrelationsfunktion des erworbenen Bild-Serie hängt entscheidend von der Dynamik der Moleküle sich in den gesammelten Bild-Serie (bitte beachten Sie, dass die gleiche Argumentation kann in einer Linie Erwerb angewendet werden wo nur eine Dimension im Raum wird berücksichtigt). Insbesondere definieren wir die Korrelationsfunktion als: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230"> (1) wo <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50"> die gemessene Fluoreszenzintensität an der Position x, y, und zum Zeitpunkt t, <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8"> und <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10"> stellt den Abstand in der x-undy-Richtung jeweils <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10"> repräsentiert die Zeitverzögerung, und <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20"> stellt den Mittelwert. Diese Funktion kann wie folgt ausgedrückt werden: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230"> (2) wobei 'n' die durchschnittliche Anzahl der Moleküle in dem Überwachungsbereich, <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10"> stellt die Faltungsoperation im Raum, und <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50"> stellt die Autokorrelation der Instrumental Taille. Diese letztere kann als Maß dafür, wie die Photonen eines einzelnen Emitter sind verstreut im Raum aufgrund der optischen / Recording Setup interpretiert werden (die so genannte Point Spread Function, PSF, Gen-Kundgebung gut durch eine Gauß-Funktion angenähert). Schließlich <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50"> die Wahrscheinlichkeit, ein Teilchen in einem Abstand zu finden <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10"> und <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10"> nach einer Zeitverzögerung <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10"> . Wenn wir ein Diffusionsdynamik, in denen Teilchen bewegen sich zufällig in alle Richtungen und Nettoflüsse vorhanden sind nicht der Ansicht, diese Funktion ist auch gut mit einer Gauß-Funktion, bei der die Varianz kann als der mittlere quadratische Verschiebung (MSD) des beweglichen Teilchen identifiziert werden angenähert . Somit ist die Taille der Korrelationsfunktion (auch bezeichnet als <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30"> ), Kann als die Summe der Partikel MSDS und Instrumental Taille festgelegt und kann durch eine Gaußsche Form gemessen werdenlung der Korrelationsfunktion für jede Zeitverzögerung. Die gemessene I MSD verwendet, um eine scheinbare Diffusivität der beweglichen Moleküle zu berechnen <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40"> und einen mittleren Verschiebungs <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40"> Beispiel: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170"> (3) <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170"> (4) Paar Überlegungen über die verwendeten Versuchsaufbau können die Leser in den folgenden Abschnitten zu führen. Um die Fluorophore auf der Basalmembran von lebenden Zellen werden wir eine Totalreflexion (TIR) ​​Beleuchtung zu verwenden, mit einem handelsüblichen TIR Fluoreszenz selektiv anzuregen (TIRF)-Mikroskop (Details finden Sie in der Materialabschnitt zu finden). Darüber hinaus, um zu sammeln the Fluoreszenz wir eine hohe Vergrößerung Ziel verwenden und ein EMCCD Kamera (physikalische Größe der Pixel auf dem Chip 16 um) (100X NA 1,47, wird eine hohe numerische Apertur für TIRF-Beleuchtung erforderlich). Um eine Pixelgröße von 100 nm zu erreichen wenden wir eine zusätzliche Vergrößerungslinse von 1.6X. Wie nachstehend erörtert, würde eine Zeitauflösung von weniger als 1 msec benötigt, um richtig beschreiben die Dynamik schneller Membranlipide unter 100 nm ist. Um diese zeitliche Auflösung zu erreichen müssen wir eine Region of Interest (ROI) wählen kleiner als der ganze Chip der Kamera (512 x 512). Auf diese Weise wird die Kamera eine verringerte Anzahl von Leitungen die Erhöhung der zeitlichen Auflösung zu lesen. Jedoch wird in diesem Auslese Regime die Rahmenzeit würde durch die erforderliche Zeit, um die Ladungen von dem Kontakt mit dem Auslesechip der Kamera zu verschieben und in der Regel in der Größenordnung von Millisekunden für 512 x 512 Pixel EMCCD- begrenzt. Um diese Grenze zu schlagen, ermöglicht eine neue Technologie Verschieben der den gesamten Rahmen ROI-Linien nur statt, wit einem praktischen effektive Reduktion des freigelegten Chipgröße (genannt Gestellte Sensor-Modus in unserem EM-CCD). Für diese Konfiguration wirksam zu sein, muss der Chip außerhalb der ROI von einem Paar von Schlitzen in dem optischen Weg angeordnet abgedeckt werden. Dank dieser Einrichtung eine Zeitauflösung von bis zu 10 -4 Sekunden erreicht werden kann. Bitte beachten Sie jedoch, dass dieser Ansatz mit vielen verschiedenen Versuchsanordnungen gekoppelt werden, wie im Abschnitt "Diskussion", erklärte. Demonstration des Verfahrens wird in lebenden Zellen bereitgestellt werden, indem sowohl ein ATTO488 Bezeichnung 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (ATTO488-PPE) und ein GFP-markierten Variante des Transferrinrezeptors (GFP TFR). Im Fall von ATTO488-PPE kann dieser Ansatz erfolgreich eine nahezu konstante D app als Funktion der durchschnittlichen Verschiebung angibt, dass sie eine freie Diffusion zu erholen, wie zuvor berichtet 30,35. Dagegen TfR-GFP zeigt eine abnehmende D 6. Darüber hinaus wird in dem letzteren Fall ist es möglich, das lokale Diffusionskonstante und der mittleren Einschlussbereich über viele Mikrometer auf der Membranebene zu quantifizieren.

<table><tbody><tr><td>iXon Ultra 897</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0</td><td></td></tr><tr><td>Solis</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>ATTO 488 gelabelt PPE</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-151</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td></td><td></td>850725</tr><tr><td>DOTAP</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicillin-Streptomycin-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-106&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>SimFCS 3.0</td><td>Globals Software</td><td></td><td>Die Software kann hier heruntergeladen werden: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td></tr> <tr><td>DMI6000 mit TIRF-Modul</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Lipofectamine</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWork</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>C-terminales GFP getaggt mit Tranferrin Receptor</td><td>OriGene</td><td>RG200980</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>528730</td><td></td></tr><tr><td>Latexkügelchen, fluoreszierend gelb-grün, 30 nm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5155</td><td></td></tr><tr><td>SONICA Ultraschallreiniger</td><td>SOLTEC</td><td>ETH S3</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Willco</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>Bioformat-Importer für Matlab</td><td></td><td></td><td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td></tr> <tr><td>ICS-MatLab Tools</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td></tr><tr><td>Simulation durch Matlab Tutorial</td><td></td><td></td><td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td></tr><tr><td>Simulation durch SimFCS Tutorial</td><td></td><td></td><td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td></tr></tbody></table>

von fast fluoreszenz-imaging, um molekulare diffusion gesetz über live cell membrane in einem kommerziellen mikroskop

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Es wurde zunehmend klar, daß die räumliche Verteilung und die Bewegung der Membran-Komponenten wie Lipide und Proteine ​​sind Schlüsselfaktoren bei der Regulation vieler zellulärer Funktionen. Aufgrund der schnellen Dynamik und die winzigen Strukturen beteiligt sind, wird eine sehr hohe Raum-Zeit-Auflösung erforderlich ist, um das reale Verhalten von Molekülen zu fangen. Hier präsentieren wir die Versuchsprotokoll für die Untersuchung der Dynamik von fluoreszenzmarkierten Plasma-Membran-Proteine ​​und Lipide in lebenden Zellen mit hoher örtlicher und zeitlicher Auflösung. Bemerkenswerterweise ist dieser Ansatz nicht jedes Molekül zu verfolgen, aber es Population Verhalten unter Verwendung aller Moleküle in einer bestimmten Region der Membran berechnet. Der Ausgangspunkt ist eine schnelle Bebilderung einer bestimmten Region auf der Membran. Danach wird eine komplette räumlich-zeitlichen Autokorrelationsfunktion korreliert erfassten Bilder mit zunehmender Zeitverzögerungen, beispielsweise alle 2, 3, n Wiederholungen berechnet. Es ist möglich zu zeigen, dass die Breiteder Peak der räumlichen Autokorrelationsfunktion nimmt bei zunehmender Zeitverzögerung in Abhängigkeit von der Partikelbewegung aufgrund von Diffusion. Daher, passend der Serie von Autokorrelationsfunktionen ermöglicht, extrahieren die tatsächliche Protein mittlere quadratische Verschiebung von Bildgebung (IMSD), hier in der Form des scheinbaren Diffusions vs mittlere Verschiebung vorgestellt. Dies ergibt eine quantitative Blick auf die durchschnittliche Dynamik einzelner Moleküle mit Nanometer-Genauigkeit. Durch die Verwendung eines GFP-markierten Variante des Transferrinrezeptors (TfR) und einer ATTO488 Bezeichnung 1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (PPE) ist es möglich, die Raumzeit-Regulierung von Protein-und Lipid-Diffusion beobachten um große Membranregionen der Mikro zu-Milli zweiten Zeitbereich.

Um die Taille Instrumental kalibrieren kann das Bild eines einzelnen fluoreszierenden Nano Wulst Maßnahme im Sinne des Protokolls Schritt 1.1 beschrieben. Ein typisches Fluoreszenzbild dieser Perlen ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Montage Intensitätsverteilung durch eine 2D-Gauß-Funktion gibt zurück gute Residuen und ermöglicht die Messung der Taillen instrumental bei 270 nm auf. Dieser Wert ist in guter Übereinstimmung mit der von der Rayleigh-Gleichung geschätzt erwarteten Beugungsgrenze. Diese Ka...

Die räumliche Verteilung und zeitliche Dynamik von Plasmamembranproteinen und Lipiden ist ein heißes Thema in der Biologie. Hier wird dieses Problem durch eine räumlich-zeitliche Bildfluktuationsanalyse gelöst, die konzeptionell die gleichen physikalischen Größen der Einzelpartikelverfolgung liefert, jedoch kleine molekulare Markierungen und Standardmikroskopie-Setups verwendet.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Diffusionsgesetz von Lipiden und Proteinen in lebenden Zellmembranen zu messen, um dies zu erreichen. Zunächst wird die Punktspreizungsfunktion des Mikroskops kalibriert, indem nanoskopische fluoreszierende Kügelchen abgebildet werden. Als nächstes werden Liposomen-basierte Vektoren, einschließlich eines fluoreszenzmarkierten Moleküls von Interesse, hergestellt und entweder durch Transfektion oder direkten Einbau in lebende Zellen eingeführt.Die schnelle Bildgebung der Plasmamembran lebender Zellen erfolgt durch die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie. Abschließend wird die Korrelationsfunktion berechnet und das molekulare Diffusionsgesetz durch Gaußsche Anpassung extrahiert. Die resultierenden Daten.Identifizieren Sie die Bewegungsart des untersuchten Lipids oder Proteins. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der konventionellen Fluoreszenzrückgewinnung nach dem Photobleaching-Ansatz oder der klassischen Einzelpunkt-Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie besteht darin, dass sie die Messung des molekularen Diffusionsgesetzes ermöglicht. Wir wissen, dass die Kenntnis des Systems Priorität hat.Auch im Gegensatz zu klassischen Methoden zur Verfolgung einzelner Partikel. Hier wird die mulare Verdrängung gemessen, ohne dass die Partikeltrajektorien extrahiert werden müssen. Infolgedessen kann dieses Metall leicht in Kombination mit relativ angenommenen und dichten Molekülen wie z.B. genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen verwendet werden.Insgesamt kann diese Methode dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der zellulären Molekularbiologie zu beantworten, wie z.B. wie die Bewegung von Proteinen oder Lipiden die Plasmamembranstruktur und die funktionelle Organisation reguliert. Die Antwort auf diese und verwandte Fragen wird jedem zugänglich gemacht, und mit nur einem kommerziellen Mikroskop wird die Demonstration des gesamten Verfahrens durch Zo durchgeführt. ein Doktorand aus dem Labor. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Punktspreizungsfunktion des Bildgebungssystems kalibrieren. Beginnen Sie damit, 10 Mikroliter einer fluoreszierenden Bead-Lösung in 90 Mikrolitern destilliertem Wasser zu verdünnen, das zuvor in ein 500-Mikroliter-Zentrifugenröhrchen gegeben wurde.Beschallen Sie die Lösung 20 Minuten lang in einem Saunabad mit einem Skalpell, schneiden Sie ein ein Zentimeter großes Stück 3%AGA Rosengel ab und geben Sie es in eine Petrischale. Geben Sie 10 Mikroliter der verdünnten fluoreszierenden Bead-Lösung auf die Oberseite des Gels. Dann drehen Sie das Stück Gel mit einer Pinzette in einer zwei Zentimeter großen Petrischale aus Glas um.Wieder mit einer Pinzette. Drücken Sie auf das Stück Gel, um den Tropfen zu verteilen. Schalten Sie als Nächstes den Erfassungsaufbau ein, der aus einem kommerziellen Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskop besteht.Ausgestattet mit einem Inkubator und einer schnellen E-M-C-C-D-Kamera, die an einen Computer angeschlossen ist, auf dem eine Anwendungssuite, eine fortschrittliche Fluoreszenzsoftware und/oder Solis-Bilderfassungssoftware ausgeführt wird. Legen Sie die Probe mit dem I-Stück und Durchlicht in die Halterung auf dem Mikroskoptisch. Konzentrieren Sie sich auf den Rand des Gels.Zentrieren Sie dann das Gel über dem Objektiv und passen Sie den Fokus an, um den Laserausrichtungsvorgang zu starten. In der Leica Anwendungssuite wählt die fortschrittliche Fluoreszenzsoftware die automatische Ausrichtung aus und befolgen Sie die automatische Ausrichtung. Nachdem der Laser in der und/oder Solis-Erfassungssoftware ausgerichtet wurde, klicken Sie auf die Schaltfläche Einstellungen. Es öffnet sich ein Fenster.Stellen Sie die Kamerabelichtung auf 100 Millisekunden, die gewonnene EM auf 1000 und die Wiederholung auf 100 ein und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für die Bildübertragung. Klicken Sie dann auf das Fenster zum automatischen Speichern und geben Sie den Namen des Experiments ein. Finden Sie ein Sichtfeld mit vereinzelten Einzelpunkten.Fokussieren Sie sich auf einen hellen Punkt, der normalerweise ein Perlenaggregat darstellt. Erwerben Sie dann 100 Bilder. Wiederholen Sie diesen Schritt fünf- bis sechsmal, um Bilder von mehreren einzelnen Punkten aufzunehmen.Importieren Sie die erfassten Reihen in ein Datenverarbeitungsprogramm wie MATLAB und mitteln Sie den Zeitwert des Stapels. Zeigen Sie dann das Bild der gemessenen durchschnittlichen Intensität an. Zoomen Sie auf einen hellen, kleinen fluoreszierenden Fleck und identifizieren Sie grob die Mitte als das hellste Pixel des Flecks.Wählen Sie abschließend die Größe des interessierenden Bereichs aus, den Sie um das Partikel herum zeichnen möchten, in der Regel ein Mikrometer daneben, um die ausgewählte Intensitätsverteilung mit einer Gaußschen Funktion anzupassen. Wählen Sie den Befehl gause fit. Überprüfen Sie die erhaltenen Rückstände, um die Güte der Passung zu überprüfen.Kalibrieren Sie abschließend die Kamera wie im Begleitdokument beschrieben. Sobald das System kalibriert ist, ist es an der Zeit, die Zellen für die Bildaufnahme zu markieren. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der für den Lipideinbau erforderlichen Liposomen, indem Sie jeweils ein Milligramm DOPE, ein Milligramm D-O-T-A-P und ein Milligramm PSA ADO 4 88 in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen auflösen, das einen Milliliter Chloroform enthält.Mischen Sie anschließend je 0,5 Milliliter der DOPE- und D-O-T-A-P-Lösungen mit 25 Mikrolitern PSA ATO 4 88-Lösung. Legen Sie das Röhrchen in einen Zentrifugalverdampfer und initiieren Sie die Drehung bei 280 gs. Starten Sie die Vakuumpumpe und lassen Sie sie 24 Stunden lang rotieren.Geben Sie am nächsten Tag 0,5 Milliliter 20 Millimolar Heis-Puffer in das Röhrchen und wirbeln Sie es 15 Minuten lang. Legen Sie dann das Rohr in ein Schallbad und beschallen Sie es 15 Minuten lang bei 40 Grad Celsius. Zur Vorbereitung der Zellen waschen Sie eine P 100-Schale aus konfluentem Chinesischem Hamster-Eierstock oder CHOK eine Zelle dreimal mit 10 Millilitern PBS.Dann einen Milliliter Trypsin hinzufügen und bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid fünf Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation fügen Sie neun Milliliter D-M-E-M-F 12 hinzu, die mit 10 % FBS ergänzt sind, um die Zellen zu suspendieren und 150 Mikroliter dieser zellhaltigen Lösung auszusäen. In einer 22 Millimeter großen Petrischale mit Glasboden, in der sich 800 Mikroliter des gleichen Mediums befinden.Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Für den Lipideinbau ersetzen Sie das Zellmedium durch 500 Mikroliter freies Serummedium und inkubieren Sie es 30 Minuten lang. Nach der Inkubation zwei Mikroliter Liposomenlösung hinzufügen und weitere 15 Minuten inkubieren.Waschen Sie dann die Zellen mit PBS und fügen Sie neues DM EMF 12 hinzu. Schalten Sie vor der Bildgebung mindestens 12 Stunden vor dem Experiment den Inkubator des Mikroskops ein, um den Mikroskoptisch und die optischen Komponenten auf experimentelle Temperatur zu bringen. Der schwierigste Schritt dieses Verfahrens ist die Akquise.Um den Erfolg zu gewährleisten, sollten Sie jeden Erfassungsparameter für das System optimieren. In Untersuchung. Schalten Sie am Tag des Experiments das Mikroskop ein und warten Sie, bis die Kameras die Arbeitstemperatur erreicht haben.Um das Experiment durchzuführen, werden wir zwei Kameras verwenden. Kamera eins wird für die Bildgebung verwendet, und Kamera zwei wird verwendet, um die Zelle auszuwählen. Diese Konfiguration ermöglicht die schnellste erreichbare Erfassungszeit in der Software.Zum Einstellen der Parameter für die Durchlichtbildgebung. Geben Sie 20 Millisekunden ein Geben Sie als Belichtungszeit eins für die EM-Verstärkung für beide Kameras ein. Öffnen Sie dann das Kontrastmodus-Fenster in der Software und verlassen Sie.Klicken Sie auf BF, um die Hellfeldoption auszuwählen. Legen Sie die Proben in den Halter, während Sie die Probe durch die Okulare betrachten. Bringen Sie die Probe in den Fokus.Senden Sie dann das Licht manuell an Kamera eins und drücken Sie vorsichtig auf die Schlitze, so dass nur der abzubildende ROI beleuchtet wird. Verschieben Sie als Nächstes eine Zelle in den ausgewählten Bereich und senden Sie das Licht mit der Software an Kamera zwei. Zeichnen Sie dann in der Software einen ROI, um eine Referenz zu generieren.Um den Laser per Software auszurichten, wählen Sie zunächst die Option Automatisch ausrichten. Um dann die automatische Ausrichtung zu starten, wählen Sie Kollimator aktivieren. Öffnen Sie dann den Inkubator an der Oberseite und kollimieren Sie den Laserstrahl.Wenn der Laser in der unteren linken Ecke des Softwarefensters ausgerichtet ist, klicken Sie auf die Schaltfläche 70, um die Eindringtiefe auf 70 Nanometer einzustellen. Dies entspricht einem Einfallswinkel des Lasers auf das untere Glas von etwa 70 Grad in der Leica Application Suite. Textfeld für die erweiterte Belichtungszeit der Fluoreszenzsoftware.Geben Sie 70 Millisekunden in das Textfeld EM-Verstärkung ein. Geben Sie 1000 ein, um dasselbe auf Kamera zwei zu tun. Öffnen Sie das Einstellungsfenster und geben Sie die gleichen Zahlen in die entsprechenden Textfelder ein.Klicken Sie anschließend auf den Live-Button. Die Fluoreszenz wird an Kamera eins gesendet, und ein Bild der Probe wird auf dem Bildschirm angezeigt. Bewegen Sie die Probe, bis eine Fluoreszenzzelle den Referenzbereich von Interesse erreicht.Drücken Sie dann den Knopf an der Vorderseite des Mikroskopgehäuses, um das Licht an Kamera zwei zu senden, und bewegen Sie das Z-Positionsrad genau, um auf die Zellmembran in der und/oder einzigen Software zu fokussieren. Öffnen Sie das Einstellungsfenster und stellen Sie die minimal erreichbare Belichtungszeit mit 1000 EM Verstärkung im beschnittenen Sensormodus 10 auf die fünfte Wiederholung ein und stellen Sie die Option "Automatisches Speichern" ein, um mit der Aufnahme der Bildserie zu beginnen. Klicken Sie auf das Kamerasymbol der Software und warten Sie, bis die Erfassung abgeschlossen ist.Öffnen Sie dann das Einstellungsfenster, deaktivieren Sie die EM-Verstärkung und entfernen Sie das Häkchen bei der Option für den zugeschnittenen Modus. Während der Aufnahme steigt die Temperatur der Kamera in der Regel um etwa zwei bis drei Grad an. Warten Sie also, bevor Sie Bilder von einer neuen Zelle aufnehmen, bis die optimale Arbeitstemperatur erreicht ist.Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, befolgen Sie erneut die Anweisungen im Begleitdokument, um die mittlere quadratische Verschiebung aus der Bildgebung zu berechnen und eine fluoreszenzmarkierte Variante des interessierenden Moleküls zu erhalten. CHOK-1-Zellen wurden entweder mit ADO 4 88 PPE markiert oder mit einem Transfer in Rezeptor oder T-F-R-G-F-P transfiziert und mit TIRF abgebildet, wie in diesem Video beschrieben. Wie hier zu sehen ist, ist das gemessene Diffusionsgesetz für ADO 4 88 PPE flach, was auf eine weitgehend freie Diffusion hinweist, wie zuvor durch stimulierte Emissionsverarmungsfluoreszenz, Korrelationsspektroskopie oder stationäre FCS-Messungen nach Transfektion mit dem T-F-R-G-F-P gezeigt wurde, ist das gemessene Diffusionsgesetz für T-F-R-G-F-P zunächst flach und bleibt unter 100 Nanometern mittlerer molekularer Verschiebung mit einem durchschnittlichen scheinbaren Diffusionskoeffizienten von etwa 0,7 μm im Quadrat pro Sekunde.Darauf folgt eine rasche Abnahme der scheinbaren Diffusivität auf 0,2 Mikrometer pro Sekunde. Der Wert, der typischerweise mit beugungsbegrenztem FCS gemessen wird. Es ist interessant festzustellen, dass, wie dieses letzte Beispiel zeigt, der vorliegende Ansatz die durchschnittliche molekulare Verschiebung mit einer Auflösung von einigen Dutzend Nanometern messen kann, selbst wenn relativ schwache und dichte Markierungen wie GFP verwendet werden.Darüber hinaus legt die räumliche Skala, bei der der scheinbare Diffusionskoeffizient zu sinken beginnt, die charakteristische Größe des partiellen Proteineinschlusses durch das Membranskelett auf etwa 120 Nanometer fest, was mit früheren Schätzungen übereinstimmt. Sobald Sie das Verfahren der Datenanalyse beherrschen, kann diese Erfassung in wenigen Minuten durchgeführt werden. Wir glauben, dass diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Zell- und Molekularbiologie den Weg ebnen wird, um die raumzeitliche Regulation der Protein- und Lipiddiffusion in lebenden Proben einfach und quantitativ zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Hier zeigen wir die Protokolle für die Durchführung von Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Bakterienzellen, damit funktionale molekulare Komplexe detektiert werden, verfolgt und quantifiziert.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) wurden als wesentliche Technik, um Bild die Umwelt und die Interaktion bestimmter Proteine ​​und Farbstoffe, die in lebenden Zellen entstanden. FLIM fluoreszierender molekularer Rotoren ermöglicht die Zuordnung der Viskosität in lebenden Zellen.

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

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Bestimmung der Lipid Raft Partitionieren von Fluoreszenz-markierten Sonden in lebenden Zellen mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS)

Multiple-Target-Tracing ist ein Algorithmus für die Verfolgung von hausgemachten individuell markierten Moleküle in der Plasmamembran von lebenden Zellen entwickelt. Effiziente Erfassung, Abschätzung und Tracing-Moleküle im Laufe der Zeit bei hoher Dichte bieten eine benutzerfreundliche, umfassende Werkzeug, um nanoskalige Membran Dynamik zu untersuchen.

Mapping molekulare Diffusion in der Plasmamembran durch Multiple-Target Tracing (MTT)

Studien von Biomolekülen in vivo sind entscheidend für das Verständnis der molekularen Funktion in einem biologischen Kontext. Hier beschreiben wir eine neuartige Methode, die es ermöglicht, fluoreszierende Biomoleküle, wie DNA oder Proteine, in lebende Mikroorganismen zu internalisieren. Die Analyse von in vivo-Daten, die durch Fluoreszenzmikroskopie aufgenommen wurden, wird ebenfalls vorgestellt und diskutiert.

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