Die Soft-Agar Koloniebildungstest

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Wachstum unabhängig von der zellulären Verankerung zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Schicht Agar auf die Zellkulturplatte aufgebracht und diese aushärten gelassen wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Mischung von Zellen in Agar über die vorherige Agarschicht zu schichten.

Anschließend lassen wir die Zellen über einen Zeitraum von einigen Wochen Kolonien bilden. Der letzte Schritt ist das Färben der Kolonien zur Visualisierung und Quantifizierung. Letztendlich wird der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien verwendet, um das unabhängige Wachstum von Anchorage als Hinweis auf die zelluläre Transformation zu zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z.B. dem genetischen Assay, besteht darin, dass der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien erfordert, dass die Zellen Kolonien auf eine Anchorage-unabhängige Weise bilden. Beginnen Sie den Eingriff, indem Sie jede Vertiefung einer behandelten Gewebekultur markieren. Sechs-Well-Platte passend für jede zu untersuchende Zelllinie oder Erkrankung.

Bereiten Sie anschließend zwei Xcel-Nährmedien vor, indem Sie ein Gramm Pulvermedium und 0,2 Gramm Natriumbicarbonat im deionisierten Wasser auf ein Endvolumen von 50 Millilitern auflösen. Lassen Sie dieses Medium durch einen 0,2-Mikron-Filter. Fügen Sie zusätzliche Komponenten hinzu, die für die normale Kultivierung der interessierenden Zelllinie benötigt werden.

Züchten Sie beispielsweise die CMT 1 67-Zelllinie in RPMI 1640 Medium, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung ergänzt wird. Vor Gebrauch das Medium im heißen Wasserbad auf 37 Grad Celsius erwärmen. Bereiten Sie nun ein Xcel-Kulturmedium vor.

Bereiten Sie dann 1%Edel-Agar zu, indem Sie ein Gramm Edel-Agar zu 100 Millilitern deionisiertem Wasser hinzufügen. Bereiten Sie danach 0,6% Edelagar vor, indem Sie 0,6 Gramm Edelagar zu 100 Millilitern deionisiertem Wasser hinzufügen. Als nächstes werden die Edel-Agar-Mischungen autoklaviert.

Anschließend wird eine 1 Milligramm pro Milliliter Nitroblau-Tetraoleumchlorid-Stammlösung in einem XPBS zum Zwecke der Färbung der Kolonien hergestellt. Bei diesem Verfahren wird die Flasche mit 1%Edel-Agar etwa ein bis zwei Minuten lang in der Mikrowelle erhitzt. Überwachen Sie die Lösung genau, um ein Überkochen zu vermeiden.

Erhitzen und mischen Sie dann intermittierend weiter, bis sich der Agar vollständig aufgelöst hat und die Lösung klar ist. Danach geben Sie die geschmolzene Agarlösung und das Vorwärmen von zwei x Kulturmedium in einen mit 42 Grad Celsius gefüllten Eiskübel. Leitungswasser.

Legen Sie zusätzlich ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen in einen Röhrchenhalter in den Eiskübel mit heißem Wasser. Übertragen Sie dann den Eimer in die Zellkulturhaube. Geben Sie dann sechs Milliliter Nährmedium und sechs Milliliter der 1%igen Edelagarlösung in das konische 50-Milliliter-Röhrchen.

Pipettieren Sie zum Mischen mehrmals auf und ab. Ein zügiges Arbeiten verhindert ein vorzeitiges Aushärten des weichen Agars. Ziehen Sie anschließend mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette etwa 5,5 Milliliter Mischung auf.

Lassen Sie die Luftblasen bis zum oberen Rand der Pipettensäule aufsteigen. Geben Sie dann 1,5 Milliliter der Mischung in jede Vertiefung und vermeiden Sie die Ablagerung von Luftblasen. Decken Sie die Platte ab und lassen Sie die Agarmischung in der Zellkulturhaube bei Raumtemperatur 30 Minuten lang erstarren.

Zuerst werden Zellen mit Trypsin geerntet und in Kultur ein bis fünf Mal in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen verdünnt. Zählen Sie die Zellen und berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die pro Vertiefung benötigt werden, um zu diesem Zeitpunkt eine endgültige Zellsuspension vorzubereiten. Als nächstes schmelzen Sie 0,6%ige Agarlösung in der Mikrowelle.

Legen Sie es zusammen mit einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen in einem Röhrchenhalter und der endgültigen Zellsuspension in einen Eiskübel mit heißem Wasser. Übertragen Sie dann den Eiskübel mit geschmolzenem 0,6%-Agar für die nachfolgenden Schritte in die Zellkulturhaube. Um ein Gesamtvolumen von 12 Millilitern Zellsuspension für eine Sechs-Well-Platte herzustellen, pipettieren Sie zunächst sechs Milliliter Zellsuspension in das konische 50-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie dann sechs Milliliter 0,6%Agar in das Röhrchen. Halten Sie die Mischung bei 42 Grad Celsius, um eine vorzeitige Aushärtung zu vermeiden und das Überleben der Zellen zu maximieren. Pipettieren Sie die Mischung anschließend zwei- bis dreimal schnell, um die Zellen zu verteilen.

Ziehen Sie 5,5 Milliliter Mischung mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette und lassen Sie alle Luftblasen an die Oberseite der Pipettensäule aufsteigen. Gib dann jeweils 1,5 Milliliter der Mischung hinein. Lassen Sie die Zellagarmischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Zellkulturhaube erstarren, bevor Sie sie in einen 37 Grad Celsius befeuchteten Zellkultur-Inkubator legen.

Geben Sie zweimal pro Woche 100 Mikroliter Wachstumsmedium über die obere Schicht des Agars, um Austrocknung zu verhindern, und lassen Sie etwa 21 Tage für eine ausreichende Koloniebildung warten. Um die Zellen zu färben, geben Sie 200 Mikroliter Nitroblau-Tetraoleumchlorid-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Sobald die Kolonien gefärbt sind, machen Sie Fotos von den Vertiefungen mit dem Imager und zählen Sie die Kolonien mit der Bildanalysesoftware.

Hier ist der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien von Vektor-exprimierenden CMT 1 67 LNCX LPC X-Zellen und CMT 1 67 LL zu sieben zu neun über exprimierende Zellen gegangen. Der Vektor, der CMT 1 67 L und CXL PC X Zellen und CMT 1 67 LL exprimiert, ging um sieben a f zerzaust. Neun überexprimierende Zellen wurden in einem Soft-Agar-Koloniebildungsassay CMT 1 67 LL plattiert, sieben kräuselte neun Zellen zeigten eine deutliche Abnahme der Koloniebildung Nach ihrer Entwicklung.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Krebsforschung den Weg, die zelluläre Transformation in vitro zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen auf unabhängiges Wachstum in Anchorage bewertet.