Name: Die Soft-Agar Koloniebildungstest (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Erfahren Sie den Soft-Agar-Koloniebildungstest zur Quantifizierung ankerunabhängigen Zellwachstums. Diese Methode demonstriert das tumorigene Potenzial transformierter Zellen und die Wirkung von Tumorsuppressorproteinen.

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Diese Studie wurde durch einen Merit Award des U.S. Department of Veterans Affairs und einen NIH-Zuschuss unterstützt, der an RW R01CA1385282522717 wurde.

1. Herstellung von Materialien und Reagenzien <ol><li> Beschriften Sie jede Vertiefung einer Gewebekultur behandelt 6-Well-Platte passend für jede Zelllinie oder der Zustand untersucht. </li><li> Vorbereitung 2x Zellkulturmedium durch Auflösen von 1 g Pulver Medium und 0,2 g Natriumbicarbonat in entionisiertem Wasser auf ein Endvolumen von 50 ml. </li><li> Geben dieses Medium durch ein 0,2-um-Filter sterilisiert. </li><li> Hinzufügen zusätzlicher Komponenten für normale Kultur der Zelllinie von Interesse erforderlich ist. Zum Beispiel wachsen CMT 167 Zelllinie in RPMI 1640-Medium mit 10% FBS und 1% Penicillin / Streptomycin-Lösung ergänzt. Warme Medium auf 37 ° C in heißes Wasserbad vor der Verwendung. </li><li> Bereiten 1x Zellkulturmedium getrennt, wie Sie es für die normale Zellkultur der Zelllinie von Interesse. </li><li> Bereiten Sie 1% Edel Agar durch Zugabe von 1 g edlen Agar auf 100 ml VE-Wasser. HINWEIS: Edel-Agar nicht vollständig unter Rühren alleine lösen. </li><li> Vorbereiten0,6% edle Agar durch Zugabe von 0,6 g Edel Agar in 100 ml entionisiertem Wasser. Beide Lösungen können Agar in 100 ml Glasflaschen mit verschließbarem Deckel für Langzeitlagerung erfolgen. </li><li> Autoklaven wird das edle Agar Mischungen zu sterilisieren. Diese Gemische können im Voraus hergestellt werden und bei 4 ° C gelagert, sondern sollte zum Zeitpunkt des Experiments wieder erhitzt, bis Agar vollständig gelöst werden. </li><li> Vorbereitung Nitroblautetrazoliumchlorid Lösung durch Herstellung einer 1 mg / ml Stammlösung in 1x PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 und 0,24 g KH 2 PO 4 in H 2 O auf ein Endvolumen von 1000 ml ). Dies wird am Ende des Experiments werden die Kolonien zu färben. </li></ol> 2. Überzug der Bodenschicht aus Agar <ol><li> Lösen Sie die Schutzkappe auf der Flasche von 1% Edel Agar und Mikrowelle für ca. 1-2 min. Unter Erhitzen in einer Mikrowelle, überwachen die Lösung eng zu vermeiden Überkochen. Weiter Heizung, beim Mischen mit Unterbrechungen,bis Agar vollständig gelöst und die Lösung klar ist. HINWEIS: Verwenden Sie hitzebeständige Handschuhe, um Kolben nach dem Erhitzen zu behandeln. Geschieht dies nicht, kann Verbrennungen oder schweren Verletzungen führen. </li><li> Zeigen geschmolzen Agarlösung und vorgewärmten 2x Kulturmedium in einem Eiskübel mit heißem Leitungswasser (42 ° C) gefüllt. Legen auch eine 50 ml konischen Röhrchen in einem Rohrhalter im Eiskübel mit heißem Wasser. Übertragen Sie Eimer, um die Zellkultur Kapuze für nachfolgende Schritte. </li><li> Für die untere Schicht aus Agar, benötigen Sie 1,5 ml einer Mischung aus Agar und Medium pro Vertiefung einer 6-Well-Platte. </li><li> Um eine ausreichende Menge der Mischung zu gewährleisten, bereiten insgesamt 12 ml pro 6-Well-Platte. </li><li> Gestartet durch Zugabe von 6 ml Kulturmedium, zu dem 50 ml konischen Röhrchen und dann 6 ml der 1% Edel Agarlösung. </li><li> Kehren Sie die konischen Rohr mehrmals, um zu mischen. Arbeiten bei flottem Tempo wird ein vorzeitiges Aushärten des Soft-Agar zu verhindern. </li><li> Auszuarbeiten etwa 5,5 ml Mischung in eine 5 ml serologische piPette. </li><li> Lassen Sie die Luftblasen nach oben von Pipettensäule vor Hinterlegung 1,5 ml dieser Mischung in jedes Well steigen. Seien Sie vorsichtig, um die Ablagerung von Luftblasen in die Plattenvertiefungen zu vermeiden. </li><li> Die Platten abdecken und lassen Agar Gemisch bei Raumtemperatur verfestigt, in Zellkulturhaube, für 30 min. </li></ol> 3. Überzug der oberen Schicht der Agar enthaltenden Zellen <ol><li> Nachdem die untere Schicht aus Agar sich verfestigt hat, beginnen Herstellung der oberen Schicht. </li><li> Zuerst Ernte die Zellen durch Trypsinierung und verdünnte sie 1: 5 in Kulturmedium (zB 1 ml Trypsin, 4 ml Medium) in eine 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zählen von Zellen und die Berechnung der Anzahl der benötigten Zellen pro Vertiefung, um eine Zellsuspension zu dieser Zeit vorzubereiten. Diese Zahl wird je nach Zelltyp variieren. Verwenden 5.000 Zellen / Well als Ausgangspunkt und nach Bedarf anpassen. Aus diesem Zellzahl, können Sie eine Zellsuspension von 6667 Zellen / ml vorbereiten würde (dh jeden well werden 0,75 ml dieser Suspension und 0,75 ml des Agar mit einem Gesamtvolumen von 1,5 ml zu erhalten; 2 für eine endgültige Gesamtzellzahl von 5000): die Konzentration der Zellen wird auch 1 verdünnt werden. </li><li> Das Volumen, die pro Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen Zellsuspension wird erneut 1,5 ml betragen. Bereiten Sie zusätzliche Zellsuspension in Höhe von 12 ml pro 6-Well-Platte. </li><li> Schmelz 0,6% Agar-Lösung in einer Mikrowelle, wie oben und setzen in Eis Eimer mit heißem Wasser zusammen mit einem 50 ml konischen Röhrchen in einem Rohrhalter und der Zellsuspension aus Schritt 3.3. </li><li> Übertragen Sie die Eiskübel mit geschmolzenem 0,6% Agar, um die Zellkultur Kapuze für nachfolgende Schritte. </li><li> Mischungs 0,6% Agar und Zellsuspension in einem Verhältnis 1: 1, Herstellung eines Gesamtvolumens von 12 ml pro Platte mit 6 Vertiefungen. 1,5 ml pro Vertiefung wird erforderlich sein, aber Extra sollte wie oben durchgeführt werden. </li><li> Pipette 6 ml der Zellsuspension in 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Dann 6 ml 0,6% Agar in das Röhrchen. HINWEIS: Die Temperatur dieser Mischung mussgehalten etwa 42 ° C, um ein vorzeitiges Härten zu vermeiden und das Überleben der Zelle zu maximieren. </li><li> Schnell arbeiten, Pipetten diese Mischung 2-3x um Zellen zu verteilen, dann erarbeiten 5,5 ml Mischung in eine 5 ml serologische Pipette. </li><li> Lassen Sie eventuell vorhandene Luftblasen, um zum Anfang der Pipettensäule vor Hinterlegung 1,5 ml dieser Mischung in jedes Well steigen. Seien Sie vorsichtig, um die Ablagerung von Luftblasen in die Plattenvertiefungen zu vermeiden. </li><li> Erlauben Zelle / Agar Gemisch bei Raumtemperatur, bevor sie in eine 37 ° C befeuchteten Zellkulturbrutschrank zu verfestigen, in Zellkulturhaube, für 30 min. </li><li> Die angemessene Koloniebildung erforderliche Zeit variiert für jede Zelllinie, typischerweise etwa 21 Tage. </li><li> Eine Schicht aus Wachstumsmedium sollte über die obere Agar-Schicht, um ein Austrocknen zu verhindern, aufrechterhalten werden. 100 ul Medium zweimal wöchentlich hinzugefügt ist für diesen Zweck ausreichend. </li></ol> 4. Die Färbung der Platten und das Zählen der Kolonien <ol><li> Flecken Zellen durch Zugabe von 200 _6; l Nitroblau-Tetrazolium-Chlorid-Lösung pro Well über Nacht bei 37 ° C inkubiert Platten. </li><li> Sobald Kolonien gefärbt sind, fotografieren von Brunnen mit einem Imager und zählen Kolonien mit Bildanalyse-Software. </li></ol>

<ol><li>Puck, T. T., Marcus, P. I., Cieciura, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+growth+of+mammalian+cells+in+vitro%3B+growth+characteristics+of+colonies+from+single+HeLa+cells+with+and+without+a+feeder+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal growth of mammalian cells in vitro; growth characteristics of colonies from single HeLa cells with and without a feeder layer.</a> J Exp Med. 103, 273-283 (1956).</li>
<li>Taddei, M. L., Giannoni, E., Fiaschi, T., Chiarugi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoikis%3A+an+emerging+hallmark+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Anoikis: an emerging hallmark in health and diseases.</a> The Journal of pathology. 226, 380-393 (2012).</li>
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<li>Tennis, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty-4+inhibits+transformed+cell+growth%2C+migration+and+invasion%2C+and+epithelial-mesenchymal+transition%2C+and+is+regulated+by+Wnt7A+through+PPARgamma+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Sprouty-4 inhibits transformed cell growth, migration and invasion, and epithelial-mesenchymal transition, and is regulated by Wnt7A through PPARgamma in non-small cell lung cancer.</a> Mol Cancer Res. 8, 833-843 (2010).</li>
<li>Steele, J. G., Rowlatt, C., Sandall, J. K., Franks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+properties+of+high-+and+low-metastatic+cell+lines+selected+from+a+spontaneous+mouse+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell surface properties of high- and low-metastatic cell lines selected from a spontaneous mouse lung carcinoma.</a> Int J Cancer. 32, 769-779 (1983).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

In vitro Bestätigung tumorsuppressive Funktion von Signalproteinen, ist schwierig. Eine der härtesten Tests zur Verfügung, um diese Eigenschaft zu untersuchen ist die Soft-Agar Koloniebildungstest. Hier haben wir die Koloniebildung in Weichagar-Assay unter Verwendung eines Maus-Lungenkarzinom-Zelllinie stabil überexprimieren Wnt7a und FZD9 Vergleich zu seinem Eltern CMT167 Zelllinie dargestellt. Es gibt mehrere wichtige Punkte zu berücksichtigen hinsichtlich der Soft-Agar-Assays. De...

Die Koloniebildung in Weichagar-Assay ist eine Technik häufig verwendet, um Zelltransformation in vitro zu bewerten. Historisch weiterer Assay, der klonogenen Assay von Puck et al. 1956 wurde verwendet, um die Fähigkeit der Zellen, um Kolonien zu bilden, 1 auszuwerten. In dieser Technik wurden die Zellen auf eine Kulturplatte verteilt und in Gegenwart von &quot;Feeder&quot; Zellen oder konditioniertes Medium die notwendigen Wachstumsfaktoren bereitzustellen gewachsen. Die Einschränkung dieser Technik war, dass es nur zur Verfügung gestellten Informationen über die Koloniebildung. Normale Zellen werden von verankerungsunabhängiges Wachstum gehindert, aufgrund einer bestimmten Art von apoptotischen Tod rief anoikis 2. Jedoch haben transformierten Zellen die Fähigkeit zu wachsen und sich zu teilen, ohne die Bindung an ein Substrat. Um auf diesem Konzept profitieren, entwickelten Forscher die Soft-Agar Koloniebildungstest. Die Koloniebildung in Weichagar-Assay seit modifiziert wurden, in den letzten Jahren zu sp adressierenecific Bedürfnisse. Eine Variante beinhaltet Einbau von fluorimetrischen Farbstoff für Hochdurchsatz-Koloniezählung zu ermöglichen. Eine weitere Variation ist die Verwendung von spezialisierten Agar-Lösung, um abgerufen zu der lebensfähigen Zellen nach der Koloniebildung zu ermöglichen, wenn Protein oder DNA-Proben notwendig. Im herkömmlichen Koloniebildung in Weichagar-Assay werden die Zellen in einer Schicht von weichem Agar mit Zellkulturmedium, das auf einer anderen Schicht aus weichem Agar, auch mit Zellkulturmedium gemischt aufliegt gemischt angebaut, aber mit einer höheren Konzentration von Agar. Dies verhindert, dass Zellen aus dem Kulturplatte haften, noch erlaubt transformierten Zellen zu sichtbaren Kolonien zu bilden. Das Grundprinzip hinter dieser Technik ist, dass normale Zellen abhängen Zelle an extrazelluläre Matrixkontakt in der Lage, zu wachsen und zu verteilen. Umgekehrt transformierten Zellen die Fähigkeit haben, zu wachsen und sich zu teilen, unabhängig von ihrer Umgebung. Daher Zellen in der Lage, Kolonien in einer Verankerung unabhängig bilden waren considered transformiert und krebserregend. Das Gesamtziel dieses Verfahrens ist es, diese Funktion in Zellen in einem semi-quantitative und strenge Weise zu messen. Der Wnt-Signalweg ist entscheidend in der Embryogenese und in der Tumorgenese 3-6 häufig dereguliert. Es gibt verschiedene Wege mit Wnt-Signalweg verbunden. Die kanonische Weg beinhaltet Wnt-Signalisierung und die Regulierung der Transkription stromabwärts über ihre Auswirkungen auf die transkriptionale Koaktivator beta-catenin. Wnts Signal auch durch einige nicht-kanonische Wege, beispielsweise die planare Zellpolarität Weg, die Elemente in Zytoskelettstruktur 7 beteiligt regelt, und der Wnt-Signalweg Calcium, die Freisetzung von Calcium aus dem endoplasmatischen Retikulum 8 regelt. Wnt-Liganden üben ihre Wirkung durch Bindung Frizzled-Rezeptoren. Obwohl mehrere Wnts wurde gezeigt, dass bei Lungenkrebs hochreguliert werden, hat sich gezeigt, Wnt7a in nicht-Smal herunterreguliert werden,l kleinzelligem Lungenkrebs durch Promotormethylierung 9. Wnt7a bindet FZD9 und wirkt als Tumorsuppressor durch eine nicht-kanonische Weg. Wiederherstellung der Wnt-7a und Frizzled-9 hemmt das Wachstum von nicht-kleinzelligen Lungenkrebszellen 10. Die Wirkungen von Wnt7a / FZD9 werden durch die Aktivierung von ERK-5, die wiederum aktiviert Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptor γ (PPAR) 11,12 vermittelt. Hier zeigen wir, dass die Überexpression von Wnt7a und FZD9 resultiert in der Unterdrückung des verankerungsunabhängigen Wachstums von einem murinen Lungenkarzinom-Zelllinie. Murine CMT167 Zellen wurden aus einem Lungenkarzinom in C57BL / lcrf Mäusen 13 abgeleitet und wurden stabil mit Wnt7a und FZD9 transfiziert. Eine Überexpression von Wnt7a und FZD9 wurden durch quantitative-PCR (Q-PCR) und der Funktionalität Wnt7a und FZD9 Expression bestätigt wurde durch nachgeschaltete Aktivierung von PPAR &amp; ggr bestätigt.

<table><tbody><tr><td>Cancer Cell Line of Interest</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10032302</td><td>CMT-167 Zellen</td></tr><tr><td>Pulverisiertes RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td>Wird zur Herstellung von 2x Zellkulturmedium verwendet.</td></tr><tr><td>Flüssiges RPMI 1650 Medium</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>Wird als 1x Zellkulturmedium bezeichnet.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td>Wird zur Ergänzung des Zellkulturmediums verwendet.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>CellGro</td><td>30-002-Cl</td><td>Zur Verwendung in Zellkulturmedium.</td></tr><tr><td>Difco Noble Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214230</td><td>Wird zur Herstellung von 1,0% und 0,6% Agar verwendet.</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Fisher</td><td>BP-328-1</td><td>Wird in 2x Zellkulturmedium verwendet.</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Cellgro</td><td>25-050-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Sterilfilter mit Flaschenaufsatz</td><td>Fisher</td><td>09-761-126</td><td>Zum Sterilfiltrieren von 2x Medium.</td></tr><tr><td>Lipofectamine Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>18324-020</td><td>Wird im PPAR-RE Luciferase-Assay verwendet.</td></tr><tr><td>6-Well-Platten mit Gewebekultur behandelt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &#176; C/5% CO2 Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemi-Doc Imager</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Wird zum Fotografieren von Bienenvölkern verwendet.</td></tr><tr><td>Quantity One Software</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Wird zur Zählung von Zellkolonien verwendet.</td></tr><tr><td>15 ml konische Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische Röhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml Erlenmeyerkolben</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml serologische Pipetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenhilfe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer mit Deckel Slip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverses Lichtmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hitzebeständige Handschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saran Wrap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

die soft-agar koloniebildungstest

The Soft Agar Colony Formation Assay

Verankerungsunabhängiges Wachstum ist die Fähigkeit transformierter Zellen, unabhängig von einer festen Oberfläche zu wachsen, und ist ein Kennzeichen der Krebsentstehung. Der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien ist eine etablierte Methode zur Charakterisierung dieser Fähigkeit in vitro und gilt als einer der strengsten Tests für die maligne Transformation in Zellen. Dieser Assay ermöglicht auch eine semiquantitative Bewertung dieser Fähigkeit als Reaktion auf verschiedene Behandlungsbedingungen. In dieser Arbeit werden wir den Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien anhand einer murinen Lungenkarzinom-Zelllinie, CMT167, demonstrieren, um die tumorsuppressive Wirkung von zwei Mitgliedern des Wnt-Signalwegs, Wnt7A und Frizzled-9 (Fzd-9), zu demonstrieren. Die gleichzeitige Überexpression von Wnt7a und Fzd-9 führte zu einer Hemmung der Koloniebildung in CMT167-Zellen. Dies zeigt, dass die Expression des Wnt7a-Liganden und seines Frizzled-9-Rezeptors ausreicht, um das Tumorwachstum in einem murinen Lungenkarzinommodell zu unterdrücken.

Der Ausdruck Wnt7a und FZD9 in CMT167 Zellen wirksam ist Tumorsuppression wie unsere Koloniebildung in Weichagar-Assay veranschaulicht. Vorbereitend, Q-PCR verwendeten wir zu zeigen, dass Wnt7a und FZD9 mRNA sind in geringen Mengen in CMT167 Zellen exprimiert. CMT167 Zellen zeigten geringe endogene Wnt7a und FZD9 Vergleich zu MLE-12-Zellen, eine SV40-transformierte murine Lungen-Epithel-Zelllinie (1). Dann transfiziert CMT167 Zellen mit zwei retroviralen Vektoren, die Überexpression menschlichen Konstru...

Der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien ist eine Methode, die verwendet wird, um zelluläres Verankerungsunabhängiges Wachstum in vitro zu bestätigen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine stringente Methode zum Nachweis des tumorigenen Potenzials transformierter Zellen und der tumorsuppressiven Wirkung von Proteinen auf transformierte Zellen zu veranschaulichen.

Die Soft-Agar Koloniebildungstest

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das Wachstum unabhängig von der zellulären Verankerung zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Schicht Agar auf die Zellkulturplatte aufgebracht und diese aushärten gelassen wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Mischung von Zellen in Agar über die vorherige Agarschicht zu schichten.Anschließend lassen wir die Zellen über einen Zeitraum von einigen Wochen Kolonien bilden. Der letzte Schritt ist das Färben der Kolonien zur Visualisierung und Quantifizierung. Letztendlich wird der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien verwendet, um das unabhängige Wachstum von Anchorage als Hinweis auf die zelluläre Transformation zu zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden, wie z.B. dem genetischen Assay, besteht darin, dass der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien erfordert, dass die Zellen Kolonien auf eine Anchorage-unabhängige Weise bilden. Beginnen Sie den Eingriff, indem Sie jede Vertiefung einer behandelten Gewebekultur markieren. Sechs-Well-Platte passend für jede zu untersuchende Zelllinie oder Erkrankung.Bereiten Sie anschließend zwei Xcel-Nährmedien vor, indem Sie ein Gramm Pulvermedium und 0,2 Gramm Natriumbicarbonat im deionisierten Wasser auf ein Endvolumen von 50 Millilitern auflösen. Lassen Sie dieses Medium durch einen 0,2-Mikron-Filter. Fügen Sie zusätzliche Komponenten hinzu, die für die normale Kultivierung der interessierenden Zelllinie benötigt werden.Züchten Sie beispielsweise die CMT 1 67-Zelllinie in RPMI 1640 Medium, das mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung ergänzt wird. Vor Gebrauch das Medium im heißen Wasserbad auf 37 Grad Celsius erwärmen. Bereiten Sie nun ein Xcel-Kulturmedium vor.Bereiten Sie dann 1%Edel-Agar zu, indem Sie ein Gramm Edel-Agar zu 100 Millilitern deionisiertem Wasser hinzufügen. Bereiten Sie danach 0,6% Edelagar vor, indem Sie 0,6 Gramm Edelagar zu 100 Millilitern deionisiertem Wasser hinzufügen. Als nächstes werden die Edel-Agar-Mischungen autoklaviert.Anschließend wird eine 1 Milligramm pro Milliliter Nitroblau-Tetraoleumchlorid-Stammlösung in einem XPBS zum Zwecke der Färbung der Kolonien hergestellt. Bei diesem Verfahren wird die Flasche mit 1%Edel-Agar etwa ein bis zwei Minuten lang in der Mikrowelle erhitzt. Überwachen Sie die Lösung genau, um ein Überkochen zu vermeiden.Erhitzen und mischen Sie dann intermittierend weiter, bis sich der Agar vollständig aufgelöst hat und die Lösung klar ist. Danach geben Sie die geschmolzene Agarlösung und das Vorwärmen von zwei x Kulturmedium in einen mit 42 Grad Celsius gefüllten Eiskübel. Leitungswasser.Legen Sie zusätzlich ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen in einen Röhrchenhalter in den Eiskübel mit heißem Wasser. Übertragen Sie dann den Eimer in die Zellkulturhaube. Geben Sie dann sechs Milliliter Nährmedium und sechs Milliliter der 1%igen Edelagarlösung in das konische 50-Milliliter-Röhrchen.Pipettieren Sie zum Mischen mehrmals auf und ab. Ein zügiges Arbeiten verhindert ein vorzeitiges Aushärten des weichen Agars. Ziehen Sie anschließend mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette etwa 5,5 Milliliter Mischung auf.Lassen Sie die Luftblasen bis zum oberen Rand der Pipettensäule aufsteigen. Geben Sie dann 1,5 Milliliter der Mischung in jede Vertiefung und vermeiden Sie die Ablagerung von Luftblasen. Decken Sie die Platte ab und lassen Sie die Agarmischung in der Zellkulturhaube bei Raumtemperatur 30 Minuten lang erstarren.Zuerst werden Zellen mit Trypsin geerntet und in Kultur ein bis fünf Mal in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen verdünnt. Zählen Sie die Zellen und berechnen Sie die Anzahl der Zellen, die pro Vertiefung benötigt werden, um zu diesem Zeitpunkt eine endgültige Zellsuspension vorzubereiten. Als nächstes schmelzen Sie 0,6%ige Agarlösung in der Mikrowelle.Legen Sie es zusammen mit einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen in einem Röhrchenhalter und der endgültigen Zellsuspension in einen Eiskübel mit heißem Wasser. Übertragen Sie dann den Eiskübel mit geschmolzenem 0,6%-Agar für die nachfolgenden Schritte in die Zellkulturhaube. Um ein Gesamtvolumen von 12 Millilitern Zellsuspension für eine Sechs-Well-Platte herzustellen, pipettieren Sie zunächst sechs Milliliter Zellsuspension in das konische 50-Milliliter-Röhrchen.Geben Sie dann sechs Milliliter 0,6%Agar in das Röhrchen. Halten Sie die Mischung bei 42 Grad Celsius, um eine vorzeitige Aushärtung zu vermeiden und das Überleben der Zellen zu maximieren. Pipettieren Sie die Mischung anschließend zwei- bis dreimal schnell, um die Zellen zu verteilen.Ziehen Sie 5,5 Milliliter Mischung mit einer serologischen Fünf-Milliliter-Pipette und lassen Sie alle Luftblasen an die Oberseite der Pipettensäule aufsteigen. Gib dann jeweils 1,5 Milliliter der Mischung hinein. Lassen Sie die Zellagarmischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Zellkulturhaube erstarren, bevor Sie sie in einen 37 Grad Celsius befeuchteten Zellkultur-Inkubator legen.Geben Sie zweimal pro Woche 100 Mikroliter Wachstumsmedium über die obere Schicht des Agars, um Austrocknung zu verhindern, und lassen Sie etwa 21 Tage für eine ausreichende Koloniebildung warten. Um die Zellen zu färben, geben Sie 200 Mikroliter Nitroblau-Tetraoleumchlorid-Lösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius. Sobald die Kolonien gefärbt sind, machen Sie Fotos von den Vertiefungen mit dem Imager und zählen Sie die Kolonien mit der Bildanalysesoftware.Hier ist der Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien von Vektor-exprimierenden CMT 1 67 LNCX LPC X-Zellen und CMT 1 67 LL zu sieben zu neun über exprimierende Zellen gegangen. Der Vektor, der CMT 1 67 L und CXL PC X Zellen und CMT 1 67 LL exprimiert, ging um sieben a f zerzaust. Neun überexprimierende Zellen wurden in einem Soft-Agar-Koloniebildungsassay CMT 1 67 LL plattiert, sieben kräuselte neun Zellen zeigten eine deutliche Abnahme der Koloniebildung Nach ihrer Entwicklung.Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Krebsforschung den Weg, die zelluläre Transformation in vitro zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zellen auf unabhängiges Wachstum in Anchorage bewertet.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine qualitative Tests für Hefe Haftung und Agar-Invasion als Maß für die invasive und pseudohyphal Differenzierung. Dieser einfache Test kann verwendet werden, um den invasiven Phänotyp der verschiedenen Mutanten sowie die Auswirkungen Umweltreize zu bewerten und Signalwege auf Hefe Differenzierung.

Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

Die Anwendbarkeit des klonogene Test zur Bewertung der reproduktiven Überlebensfähigkeit seit mehr als 50 Jahren etabliert. Hier zeigen wir das allgemeine Verfahren für die Durchführung der klonogene Test mit adhärenten Zellen.

Klonogene Test: adhärenter Zellen

Beim Arbeiten mit und Reagenzien zur Kultur von Mikroorganismen, muss aseptischen Technik praktiziert, um sicherzustellen, Kontamination zu minimieren werden. Eine Vielzahl von Beschichtungsverfahren werden routinemäßig verwendet, um zu isolieren, verbreiten oder aufzuzählen Bakterien und Phagen, die alle Verfahren, die die Sterilität der experimentellen Materialien zu erhalten übernehmen.

Aseptische Labortechnik: Überzug Methoden

Eine dreidimensionale klonogene Test, dass Pankreas-like Vorläuferzellen in Insulin-exprimierenden Kolonien unterscheiden können beschrieben. Diese Methode nutzt die Vorteile von halbfesten Medien mit Methylcellulose, Matrigel und Wachstumsfaktoren, in denen einzelne Vorläuferzellen proliferieren und...

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

Dieses Video beschreibt einen Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien, um die Auswirkungen eines PADI-Enzyminhibitors und BB-Cl-Amidin auf die Tumorigenität von Brustkrebs in vitro zu testen. Dieser Assay ermöglicht auch die quantitative Beurteilung des Zelltransformationspotenzials im Rahmen genetischer Störungen.

Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien: Eine Methode zum Testen der Auswirkungen neuartiger Verbindungen auf die Proliferation von Krebszellen

Dieses Video beschreibt den Koloniebildungs-Assay, der hilft, die Fähigkeit von Lungenkrebszellen zu bestimmen, sich unbegrenzt zu vermehren und einzelne Kolonien zu bilden. Wir können die Wirkung eines Antikrebsmittels auf die koloniebildenden Zellen analysieren, indem wir die Veränderungen in der Anzahl und/oder Größe der resultierenden Kolonien analysieren.

Colony Formation Assay: Bewertung der Wirksamkeit von Antikrebsmitteln auf koloniebildende Lungenkrebszellen

In diesem Video führen wir einen klonogenen Assay von Keratinozyten durch, die von erwachsenen Mäusen entnommen wurden, um die Fähigkeit einzelner Zellen zu bestimmen, sich zu vermehren und Kolonien zu bilden. Diese Keratinozyten-Entnahmetechnik ist nützlich für die Untersuchung anderer nachgelagerter Aspekte der kutanen chemischen Karzinogenese und der Tumorförderung.

Keratinozyten-Koloniebildungs-Assay: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Fähigkeit von Keratinozyten, zu Kolonien zu wachsen

Quelle: Hockett, K. L. und Baltrus, D. A. Einsatz der Soft-Agar-Überlagerungstechnik zur Suche nach bakteriell produzierten inhibitorischen Verbindungen. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video demonstriert das Verfahren zur Erkennung von bakteriiocinvermitteltem Tötung, indem Supernatant aus einem antibiotikainduzierten Spenderstamm auf eine weiche Agarschicht mit einem Teststamm gespott wird. Freie Zonen, die nach der Inkubation entstehen, deuten auf bakterielle Hemmung hin.

Soft Agar Overlay Assay zur Erkennung bakteriiozinvermittelter Tötung bei Pseudomonas syringae

Hier dokumentieren wir die Verwendung des Soft-Agar-Koloniebildungsassays, um die Auswirkungen eines Peptidylarginin-Deiminase (PADI)-Enzyminhibitors, BB-Cl-amidin, auf die Tumorigenität von Brustkrebs in vitro zu testen.

Nutzung der Koloniebildung in Weichagar-Assay auf Inhibitoren der Tumorigenität in Brustkrebs-Zellen zu identifizieren

Wir beschreiben eine einfache Methode zum Screening von Bakterienkulturen auf die Produktion von Verbindungen, die gegenüber anderen Bakterien hemmend wirken.

Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert

Es wird ein Protokoll zur Erstellung eines einfachen Modellökosystems beschrieben, das den Methan-Sauerstoff-Gegengradienten im natürlichen Lebensraum von aeroben Methan-oxidierenden Bakterien nachbildet und so die Untersuchung ihrer Physiologie in einem räumlich aufgelösten Kontext ermöglicht. Modifikationen an gängigen biochemischen Assays für die Verwendung mit dem Agarose-basierten Modellökosystem werden ebenfalls beschrieben.

Agarose-basiertes Modellökosystem für die Kultivierung von Methanotrophen in einem Methan-Sauerstoff-Gegengradienten

Erfahren Sie den Soft-Agar-Koloniebildungstest zur Quantifizierung ankerunabhängigen Zellwachstums. Diese Methode demonstriert das tumorigene Potenzial transformierter Zellen und die Wirkung von Tumorsuppressorproteinen.

Die Soft-Agar Koloniebildungstest

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