Name: Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in Ex Vivo Maus Intestinale Crypt Organoide Kulturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Lernen Sie die Echtzeit-Analyse des Stoffwechselprofils in primären Maus-Darmkrypt-Organoiden mit dem XF 24 Extracellular Flux Analyzer. Diese Methode ermöglicht präzise Messungen von Sauerstoffverbrauch und extrazellulärer Azidifizierung.

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Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse RO1 CA 135.561, R01 CA151494, R01 CA174432 und P3013330 von den National Institutes of Health. Wir möchten Michele Houston, Elena Dhima und Dr. Anna Velcich für ihre wertvollen Kommentare bei der Entwicklung der Krypta Isolierungsprotokoll danken. Wir danken auch den Diabetes-Schulungen und Forschungszentrum in der Albert Einstein College of Medicine vom NIH P60DK20541 unterstützt, und Dr. Michael Brownlee und Dr. Xue-G. Richter, der direkt und Betrieb der Seahorse Anlage verbunden.

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von dem Ausschuss für die Ethik der Tierversuche des Albert Einstein College of Medicine genehmigt. 1. Crypt Isolierung und Kultur <ol><li> Isolierung von Krypten aus dem Dünndarm: <ol><li> Isolieren Darmkrypten aus jedem Mausmodell von Interesse. Euthanize die Mäuse mit CO 2, gefolgt durch zervikale Dislokation. </li><li> Öffnen Sie den Bauch längs und füllen den Dünndarm (SI) mit eiskaltem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, PBS (-Ca 2+; -Mg 2+) mit 2x Antibiotika-Antimykotika (anti-anti). Rasch zu isolieren Dünndarm. </li><li> Gründlich sezieren frei von mesenterialen Fett mit einem Skalpell. Achten Sie darauf, um das Gewebe zu perforieren - jederzeit feucht mit eiskaltem PBS halten das Gewebe. Öffnen Sie inteStine längs und gründlich mit eiskaltem PBS. </li><li> Schneiden Sie Dünndarm in zwei Abschnitte und flach aus mit einem feuchten Wattestäbchen vorsichtig abkratzen Zotten mit einem vorgekühlten Rutsche. Kräftig in eiskaltem PBS mehrmals waschen. </li><li> Inkubieren 3 min in 20 ml 1x PBS pro 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) /0.5 mM Dithiothreitol (DTT) für nicht-enzymatische Dissoziation des Gewebes. </li><li> Geschnitten Gewebe in kleine Stücke (2-4 mm) mit einer Rasierklinge auf einem vorgekühlten Folie. Übertragen Sie die Stücke in einen 50-ml-Tube mit 20 ml eiskaltem PBS. </li><li> Pipette nach oben und unten vorsichtig 10x mit einem 10 ml sterile Einwegpipette. Lassen Gewebefragmente zu sedimentieren durch die Schwerkraft. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Wiederholen Sie drei weitere Male; stellen Sie sicher, Überstand klar ist. </li><li> 20 ml PBS pro 2 mM EDTA. Swirl und Inkubation bei 4 ° C für 30 min unter leichtem Schütteln. </li><li> Lassen Gewebe Sediment und Überstand verwerfen. 15 ml eiskaltem PBS und Pipettennach oben und unten 5x mit einer 10 ml Pipette. Lassen Sie die Gewebefragmente Sediment zu sammeln und das Überstand als Fraktion 1 (F1). Wiederholen Sammeln F2-F5, jede Fraktion getrennt gehalten. </li><li> 15 ml eiskaltem PBS und diesmal unter kräftigem Schütteln für 15 Sekunden. Sammeln Sie F6 und wiederholen Sie für F7, F8. Wenn Gewebestücke beginnen zu schweben, tippen, um ihnen helfen zu begleichen. </li><li> Untersuchen Sie ein Aliquot jeder Fraktion unter dem Mikroskop. Pool jene Fraktionen, die Krypten. </li><li> Übergeben Sie die gesammelten Fraktionen durch einen 70 &amp; mgr; m Nylon Zellsieb, Sammeln Krypten in einem 50-ml-Tube. </li><li> Zentrifuge bei 100 xg für 5 min bei 4 ° C, den Überstand verwerfen und Pellet in 10 ml eiskaltem PBS mit 2x Anti-Anti und Transfer Krypten in ein 15-ml-Tube. Wiederholen Sie den Wasch noch einmal. </li><li> 2x Anti-Anti - einmal mit 10 ml eiskaltem ADF, Advanced DMEM / F-12 (Dulbecco &quot;s Modified Eagle Medium / Ham&quot; s F-12) Waschen Sie die Krypten. </li><li> Waschen Sie die Krypten einmal mit 10 ml ADF - 1x Anti-Anti. </li><li> Zählen Sie die Krypten mit einer Zählkammer. Passen Sie die Krypta Lösungsvolumen und Transfer zu einem 1,5-ml-Röhrchen, so dass die endgültige Krypta Konzentration bei resuspendiert wird 100-500 Krypten pro 50 ul gallertartige Proteinmischung (Matrigel) sein. Zentrifuge bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C und resuspendieren Krypten im gelartigen Proteingemisch. </li><li> Platte 50 ul Krypta - gallertartig Proteingemisch Suspension pro Vertiefung in einer 24-Well-Platte (Wachstumsbereich: 2 cm 2), sorgfältig Platzierung der Aufhängungseinbruch in der Mitte jeder Vertiefung. Pflegen Sie die Platte in einem CO 2, 37 ° C Inkubator für ~ 30 min, bis die Suspension verfestigt. </li><li> In 500 ul eiskaltem komplette Kulturmedien (Advanced DMEM / F12 mit 1x Anti - Anti, 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 1x GlutaMAX, 1x B27 Supplement, 1x N2 Supplement, 1 mM N-Acetyl-L-Cystein (NAC), 50 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 100 ng / mlNoggin, 500 ng / ml R-Spondin). <ol><li> Rekonstitution Wachstumsfaktoren in 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS. </li></ol></li></ol></li><li> Crypt Organoide Kultur und Passage: <ol><li> Passage Krypta Organoiden 14-21 Tage nach der Aussaat (oder nach Bedarf) wie folgt: <ol><li> Ändern Medien jeden Freitag und Montag. Mittwochs, ersetzen die Hälfte der Medien mit frischem Medium. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium. Die Probe zweimal Waschen mit 500 ul PBS bei 5-Minuten-Intervallen. </li><li> Entfernen PBS und sanft brechen die gallertartige Proteinmischung mit einem sterilen P1000 Mikropipettenspitze. </li><li> 1 ml komplettes Kulturmedien auf ein einziges gut und resuspendieren Organoiden in 1 ml Medium. </li><li> Sanft stören die Organoiden mit einem P1000 durch Auf- und Abpipettieren 20-30x (Check unter dem Mikroskop für die ordnungsgemäße Organoid Dissoziation mit einer guten Ausbeute Krypta bis eine einheitliche Technik wird entwickelt). </li><li> Übertragen Sie die Krypten in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen;Zentrifuge bei 100 × g bei 4 ° C, 5 min. </li><li> Zweimal Waschen des Pellets mit 1 ml komplettem Kulturmedien. </li><li> Split in einem Verhältnis von 1: 3 oder 1: 6 wie erforderlich, Resuspendieren Krypten in 50 &amp; mgr; l Matrigel pro Vertiefung. Gehen Sie wie oben (Abschnitt 1.1.16-18) beschrieben. </li></ol></li><li> Crypt Organoide Freezing: <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium. Die Probe in 500 ul PBS waschen. </li><li> Verteilen das gallertartige Proteinmischung mit einem P1000 Pipettenspitze. </li><li> 1 ml Medium auf ein einziges gut und resuspendieren Organoiden in 1 ml Medium. </li><li> Vorsichtig brechen die Organoiden mit einem P1000 durch Auf- und Abpipettieren 20-30x. </li><li> Übertragen Sie die Organoiden in ein 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 100 × g bei 4 ° C, 5 min. </li><li> Zweimal Waschen des Pellets mit 1 ml komplettem Kulturmedien. </li><li> Resuspendieren Krypten in 500 ul gefrierenden Medien. </li><li> Transfer Krypten zu einem Kryoröhrchen, den Schlauch in einem Gefrierbehälter und Speicher in einem -80 ° C Gefrierschrank overnight. </li><li> Übertragen Krypten zu flüssigem N 2 Tank. <ol><li> Recover gefrorenen Krypta Organoiden durch schnelles Auftauen in einem 37 ° C Wasserbad. Waschen mit 500 ul komplettem Kulturmedium einmal, Zentrifuge bei 100 × g, 5 min und resuspendieren in gelatinösen Proteingemisch, und die Kultur wie oben beschrieben. Für bessere Erholung, fügen ROCK-Inhibitor (Y-27632) mit dem gefrierenden Medien. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Crypt Organoide Stoffwechsel Assay <ol><li> 24-Well-Platte Zubereitung: <ol><li> Isolieren und zählen Krypten nach dem Protokoll (siehe Abschnitt 1.1 für crypt Isolation und Abschnitt 1.2 für crypt Durchgang). </li><li> Resuspendieren Krypten in gallertartigen Proteinmischung (100-200 Krypten pro 20 ul). </li><li> Platte Krypta-gallertartige Proteingemisch Suspension in einem 24-Well-Assayplatte (stellen Sie sicher, es gibt mindestens dreifacher Ausführung für jede Probe) und lassen Sie die Suspension bei 37 ° C in einem CO 2 zu verfestigenInkubator; fügen Sie dann 500 ul komplette Kulturmedien. </li><li> Kultur Krypten (wie in Abschnitt 1.1 beschrieben) und beobachten unter dem Mikroskop bis Krypten in voll entwickelten Organoiden wachsen. </li></ol></li><li> Extracellular Flux Assay: <ol><li> Hydrat Patrone über Nacht in einem Nicht-CO 2 (0% CO 2), 37 ° C Inkubator. </li><li> Entfernen des Kulturmediums und waschen Organoiden zweimal mit 500 &amp; mgr; l DMEM (ohne: Glucose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat, und mit: Phenolrot). Warten Sie 5 min. </li><li> Gib 675 &amp; mgr; l pro Vertiefung Testmedium (DMEM mit 2 mM L-Glutamin und 5 mM D-Glucose) in jede Vertiefung. </li><li> Überprüfen Krypta Organoiden mikroskopische Morphologie, um sicherzustellen, dass Organoiden und die gallertartige Proteinmischung intakt nach den Wäschen sind. Inkubieren für 1 Stunde in einer nicht-CO 2, 37 ° C Inkubator. </li><li> Herstellung von 10 &amp; mgr; M injizierbaren Verbindungen (Oligomycin, Carbonylcyanid-p-Trifluor-methoxy-phenyl-Hydrazon (FCCP), rotenone) in Testmedium. </li><li> Set-up die Patrone durch das Laden 75 ul 10 uM injizierbaren Verbindungen in die Häfen der Kartusche nacheinander: Port A - Oligomycin; Port B - FCCP; und Port C - Rotenon (Die Endkonzentrationen während des Assays wird 1 &amp; mgr; M). </li><li> Inkubieren Kassette 30 min - 1 h bei 37 ° C in einer nicht-CO 2 -Inkubator. </li><li> Gleichzeitig schalten Sie den XF Analyzer und erstellen Sie die Assay-Protokoll-Vorlage. </li><li> Zeigen Patrone und Gebrauchsplatte in XF Analyzer und führen Sie &quot;Kalibrieren&quot; Patrone. </li><li> Überprüfen Krypta Organoiden mikroskopisch sicherstellen, dass sie auf die gallertartige Proteingemisch gebunden sind. </li><li> Lastzellkulturplatte in Instrument und führen Testprotokoll. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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Wir testeten die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und die extrazelluläre Ansäuerung Rate (ECAR) der Krypten von 8 Monate alten Mäusen isoliert und in Organoiden ex vivo gewachsen. Nach Messung der Basalrate wurde Krypta Stoffwechsel durch Zugabe Oligomycin, Carbonylcyanid bewertet -p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) und Rotenon, nacheinander. 29 min (2A und 2B) - basale OCR und basalen ECAR wurden aus 0 aufgezeichnet. Am 29. min, Olig...

Darmkrebs (CRC) ist die dritthäufigste Ursache der durch Krebs Todesfälle in den Vereinigten Staaten. Sporadische Darmkrebs - das heißt, dass die sich später im Leben (&gt; 50 Jahre) und ohne klare prädisponierende genetische Faktoren - Konten für ~ 80% aller Fälle, mit Einfalls stark durch langfristige Ernährungsmuster 1,2 beeinflusst. Diese Tumoren weisen eine metabolische Verschiebung hin Abhängigkeit oxidative Glykolyse als Warburg-Effekt bekannt, das zum Teil machen können höhere Konzentrationen der Zellbausteine ​​und Energie zur Verfügung (über Glutaminolyse) zu hohen Raten der Tumorzellproliferation 3-5 gestatten und vielleicht fahren . Studien von Darmkrebs sowie anderen gastrointestinalen Tumoren einschließlich Dünndarm Krebsarten liefern wichtige Einblicke in die Ursache der Tumorbildung. Untersuchung der Stoffwechselunterschiede zwischen normalen, pro-tumor und tumorerzeugende Staaten von gastrointestinalen Organsysteme kann det unterstützenermination des relativen Risikos für die Tumorentwicklung sowie Früherkennung von Neoplasien. Darüber hinaus verstehen bioenergetischen Stoffwechsel mit mitochondriale Atmung und Glykolyse liefert grundlegende Einblicke in die Zellphysiologie, Altern und Krankheitszustand stört Darm Homöostase. Nutzung der Bioenergetik Assay-Technologie für extrazelluläre Flussanalyse können die Preise der mitochondrialen Atmung und Glykolyse gleichzeitig in wachsenden Zellen in Kultur in Echtzeit 6,7 bewerten. Bis vor kurzem wurden in vitro Untersuchungen von Dünndarmzelllinien entweder benigne oder maligne Tumoren 8,9 abgeleitet sind und nicht die Physiologie der normalen Darm Epithelien und den Einfluss der Mikroumgebung, in dem sie sich aufhalten darstellen. Im Jahr 2009, Sato et al. 10 führte eine ex vivo Kultursystem zur dreidimensionalen (3D) Maus Darmepithelzellen Organoiden wachsen oder epithElial &quot;Mini-Mumm&quot;, geeignet für experimentelle, diagnostische und therapeutische Untersuchungen 10,11. Außerdem Krypten von kalorisch eingeschränkt Mäusen isoliert behalten ihre veränderte Wachstumseigenschaften wie Organoiden in solchen Kulturen 12. Im Vergleich zu transformierten Zelllinien können Krypta organoide Kulturen verwendet, um physiologisch relevante Daten präsentiert ein weit besseres Modell für die in vivo-Zustand zu verstehen erzeugen. Wir angepasst Bioenergetik-Analyse-Technologie, um den Energiestoffwechsel der Darm Krypta Organoiden testen. Maus Darm Krypta Organoiden kultiviert wurden ex vivo zur Krypta Organoid Energiestoffwechsel Studien vorgestellt zu entwickeln. Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR) der Krypta Organoide wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von zwei unterschiedlichen Stoffwechselinhibitoren (Oligomycin, Rotenon) und ein Ionenträger (Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) gemessen. Die Krypta organoid metabolische Reaktion auf diese chemischen Verbindungen wurden erfolgreich durch wechselnde ECAR und OCR-Werte wider. Cellular bioenergetischen Untersuchungen werden die gegenseitigen Wechselwirkungen zwischen Stoffwechsellage und Krankheitsrisiko und Phänotyp bei Krebs, Fettleibigkeit, Diabetes, Stoffwechselstörungen und mitochondrialen Erkrankungen aufzuklären und helfen Voraus Screening-Methoden mit unmittelbaren Auswirkungen für translationale Medizin. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für kleine Darmkrypten isolieren und Kultur Krypta Organoiden. Darüber hinaus führen wir eine neuartige Methode zur Krypta Organoid Kulturen für metabolische Assays verwenden.

<table><tbody><tr><td>BD Matrigel Basalmembranmatrix, GFR, phenolrotfrei, LDEV-frei</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung), kein Magnesium, kein Kalzium, pH 7,2</td><td>Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12 (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s modifizierter Eagle&prime; s Medium ohne Glukose, L-Glutamin, Phenolrot, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>Phenolrotes Natriumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4758</td><td>Endkonzentration 15 mg/l in DMEM (D5030) - step 2.2.2</td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum, 100x, 100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>Endkonzentration 1x oder 2x</td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin, flüssig</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Endkonzentration 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; GlutaMAX&Handel; Zusatz</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>Endkonzentration 1x</td></tr><tr><td>Gibco&reg; HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure), 1 M</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Endkonzentration 10 mM</td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-Cystein, 25 g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-25G</td><td>Endkonzentration 1 mM</td></tr><tr><td>100x N-2 Supplement, flüssig</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Endkonzentration 1x</td></tr><tr><td>50x B-27&reg; Supplement minus Vitamin A, flüssig</td><td>Invitrogen</td><td>12587-010</td><td>Endkonzentration 1x</td></tr><tr><td>Rekombinante Maus R-Spondin 1, CF, 50 &mu; g</td><td>F& D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>Endkonzentration 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinant Maus EGF, 100 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Endkonzentration 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Rekombinantes murines Noggin, 20 &mu; g</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Endkonzentration 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Gibco&reg; L-Glutamin, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Endkonzentration 2 mM</td></tr><tr><td>Gibco&reg; Glukosepulver</td><td>Life Technologies</td><td>15023-021</td><td>Endkonzentration 5 mM</td></tr><tr><td>Ambion&reg; 0,5 M EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure), pH 8,0</td><td>Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td>Endkonzentration 3 mM für step 1.1.5; 2 mM für step 1.1.8</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol), 1M</td><td>Life Technologies</td><td>P2325</td><td>Endkonzentration 3 mM</td></tr><tr><td>Albumin aus Rinderserum (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td>0,1% in PBS</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>1% in PBS</td></tr><tr><td>Recovery&trade; Zellkultur Gefriermedium</td><td>Life Technologies</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>ROCK-Inhibitor (Y-27632)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Endkonzentration 10 &mu; M</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td>Endkonzentration 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Carbonylcyanid-p-trifluor-methoxy-phenylhydrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>Endkonzentration 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Endkonzentration 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Endkonzentration 0,1 N in PBS</td></tr><tr><td>XF24 Extrazellulärer Flussanalysator (XF-Analysator)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

echtzeit-analyse von stoffwechselprofil in ex vivo maus intestinale crypt organoide kulturen

Real Time Analysis of Metabolic Profile in Ex Vivo Mouse Intestinal Crypt Organoid Cultures

Die Dünndarmschleimhaut weist eine sich wiederholende Architektur in zwei Grundstrukturen organisiert: Zotten, in das Darmlumen vorspringende und reifer Enterozyten, Becherzellen und enteroendokrinen Zellen zusammengesetzt; und Krypten, wohnhaft proximal der Submukosa und Muskularis, Beherbergung adulten Stammzellen und Vorläuferzellen und reife Panethzellen sowie Stromazellen und Immunzellen der Krypta Mikroumgebung. Bis zu den letzten Jahren, in vitro Untersuchungen von Dünndarm wurde, um Zelllinien entweder benigne oder maligne Tumoren abgeleitet sind, und nicht die Physiologie der normalen Darm Epithelien und den Einfluss der Mikroumgebung, in dem sie sich aufhalten darstellen. Hier zeigen wir ein Verfahren von Sato et al angepasst. (2009) für die Kultivierung von primären Maus-Darm-Krypta Organoide von C57BL / 6-Mäusen abgeleitet sind. Darüber hinaus präsentieren wir die Verwendung von crypt Organoid Kulturen, um die Krypta metabolische Profil in Echtzeit von Maßnahme zu testenment der basalen Sauerstoffverbrauch, glykolytischen Rate, die ATP-Produktion und Atemkapazität. Organoiden aufrechtzuerhalten Eigenschaften durch ihre Quelle definiert und Aspekte ihrer metabolischen Anpassung durch den Sauerstoffverbrauch und die extrazelluläre Ansäuerung Raten wider behalten. Echtzeitstoffwechselstudien in dieser Krypta Organoid Kultursystem sind ein leistungsfähiges Werkzeug zur Krypta Organoid Energiestoffwechsel zu untersuchen, und wie sie durch Ernährungs- und pharmakologischen Faktoren moduliert werden.

Crypt Organoiden wurden 8 Monate alten C57BL / 6-Mäusen etabliert gereinigt Nagerfutter American Institute of Nutrition 76A (AIN76A). Intestinale Krypta Organoiden können in Kultur über einen längeren Zeitraum von einem einzigen crypt (1A, einzelne rote Pfeil) angebaut werden. Organoiden wachsen aus Krypta-ähnliche Strukturen in 18-20 Tagen in Kultur (1B, rote Pfeile). Krypten wurden alle 3 Wochen agiert und Organoiden effizient nach jedem Durchgang gewonnen. <p class="jove_content"...

Dünndarm Krypta Organoiden kultiviert ex vivo eine Gewebekultursystem, das Wachstum der Krypten abhängig Stammzellen und ihrer Nische rekapituliert. Wir haben eine Methode, um das metabolische Profil in Echtzeit in der primären Maus Krypta Organoiden testen. Wir fanden Organoiden aufrechtzuerhalten physiologischen Eigenschaften von ihrer Quelle definiert.

Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in Ex Vivo Maus Intestinale Crypt Organoide Kulturen

The small intestinal mucosa exhibits a repetitive architecture organized into two fundamental structures: villi, projecting into the intestinal lumen and ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, das metabolische Profil von primären Kryptenorganoiden der Maus in Echtzeit zu testen. Dies wird erreicht, indem zuerst der Dünndarm der Maus entnommen wird, gefolgt von der Isolierung der Darmkrypten, die Andre in Matrigel biegt. Der zweite Schritt besteht darin, die Krypten zu kultivieren, bis sie ausgewachsene Krypten-Organoide bilden.Der nächste Schritt ist die Vorbereitung eines Kartuschen-Assays für metabolische Studien. Der letzte Schritt besteht darin, die Kartusche und die Versorgungsplatte in den extrazellulären Flussanalysator XF 24 zu laden und eine extrazelluläre Flussanalyse durchzuführen, um die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Versauerungsrate von K-crypt-Organoiden zu messen. Letztendlich ermöglicht dieses Verfahren die Untersuchung des metabolischen Profils von primären Darm-Krypten-Organoiden der Maus in Echtzeit.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von Zellkulturen für Stoffwechselaufsätze besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, den Stoffwechsel von Kryptoorganen im Darm in Echtzeit zu beurteilen. Organoidkulturen ahmen den Immunzustand genauer nach, was dazu beiträgt, physiologisch relevantere Daten zu generieren. Die Technik kann auch auf die Analyse anderer XI 3D-Organoidkulturen ausgeweitet werden.Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich Krebs zu beantworten, wie z.B. die Charakterisierung von Stoffwechselveränderungen in den Dünndarm-Crips während der Tumorgenese und in der Diabetes- und Stoffwechselforschung, wie z.B. der Vergleich des Stoffwechsels von Normal- und Krankheitszuständen. Um diesen Vorgang zu starten, öffnen Sie den Bauch einer euthanasierten Maus in Längsrichtung. Füllen Sie den Dünndarm mit eiskaltem, kalzium- und magnesiumfreiem PBS und zwei x antibiotischen Antimykotikum.Isolieren Sie dann schnell den Dünndarm. Entfernen Sie das Mesenterialfett mit einem Skalpell. Achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu perforieren und halten Sie das Gewebe während des gesamten Eingriffs mit eiskaltem PBS feucht.Öffnen Sie den Darm und waschen Sie ihn gründlich mit eiskaltem PBS. Danach schneidest du den Dünndarm in zwei Teile. Glätte sie mit einem feuchten Wattestäbchen.Als nächstes kratzen Sie den VII vorsichtig mit einem Preco-Objektträger ab. Waschen Sie die Taschentücher mehrmals kräftig in eiskaltem PBS. Inkubieren Sie sie dann in 20 Millilitern eines XPBS mit drei Millimolaren EDTA und 0,5 Millimolar DTT für drei Minuten.Anschließend schneidest du die Taschentücher auf einem Preco-Objektträger in zwei bis vier Millimeter große Stücke. Übertragen Sie die Stücke mit einer Rasierklinge in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 20 Millilitern eiskaltem PBS. Pipettieren Sie dann vorsichtig 10 Mal mit einer sterilen 10-Milliliter-Einwegpipette auf und ab.Nachdem sich die Gewebefragmente durch die Schwerkraft abgesetzt haben, entfernen Sie das SUP Natum mit einer Pipette. Wiederholen Sie den Vorgang noch dreimal und stellen Sie sicher, dass der Überstand klar ist. Übertragen Sie nun die Gewebestücke in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 20 Millilitern PBS mit zwei Millimolaren EDTA SW und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Schaukeln.Lassen Sie danach das Gewebe absetzen und entsorgen Sie das Supinat. Fügen Sie 15 Milliliter Eiskohle PBS hinzu und pfeifen Sie fünfmal auf und ab. Lassen Sie die Gewebefragmente sich absetzen und sammeln Sie das Supinat als Fraktion eins.Wiederholen Sie die Verfahren, um die Fraktionen zwei bis fünf zu sammeln, und halten Sie die Fraktionen getrennt. Fügen Sie dann 15 Milliliter Eis namens PBS hinzu und schütteln Sie es 15 Sekunden lang kräftig mit der Hand. Sammeln Sie die sechste Fraktion und wiederholen Sie die Verfahren für die siebte und achte Fraktion.Wenn die Gewebestücke zu schwimmen beginnen, klopfen Sie auf die Röhre, damit sie sich absetzen können. Untersuchen Sie dann ein Aliquot jeder Fraktion unter dem Mikroskop auf Crips. Dies ist ein Beispiel für einen schlechten Bruch, und dies ist ein Beispiel für einen guten Bruch.Ziehe die Crips zusammen. Danach werden die gezogenen Fraktionen durch ein 70-Mikron-Zellsieb aus Nylon geleitet und die Crips in einem 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Anschließend zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 100 mal G und vier Grad Celsius, verwerfen Sie das Supinat und suspendieren Sie das PT in 10 Millilitern eiskaltem PBS mit zwei x antibiotischen Antimykotika.Gib dann die Crips in eine 15 Milliliter Tube und wiederhole den Waschgang noch einmal. Als nächstes waschen Sie die Krypten einmal mit 10 Millilitern eiskaltem, einem DF advanced D-M-E-M-F 12, das zwei x antibiotisches Antimykotikum enthält. Anschließend waschen Sie die Krypten einmal mit 10 Millilitern eines DF, das ein x Antibiotikum, Antimykotikum enthält.Zählen Sie danach die Krypten mit einem Hämozytometer. Passen Sie das Volumen der Kryptenlösung an und überführen Sie es in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen, so dass die endgültige Kryptenkonzentration beim Resuspendieren 100 bis 200 Krypten pro 20 Mikroliter gallertartiger Proteinmischung beträgt. Als nächstes zentrifugieren Sie die Kryptenlösung bei 100 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie die Senna und resuspendieren Sie die Krypten in der gallertartigen Proteinmischung. Anschließend werden 20 Mikroliter der Krypten-Gallertproteinmischungssuspension pro Vertiefung in eine 24-Well-Utility-Platte gegeben. Bewahren Sie die Platte 30 Minuten lang in einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius auf, bis die Suspension fest wird.Geben Sie dann 500 Mikroliter eiskaltes, vollständiges Nährmedium in jede Vertiefung und kultivieren Sie die Crips, bis sie zu den voll entwickelten Organoiden heranwachsen. Bei diesem Verfahren hydratisieren Sie die Kartusche über Nacht in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie dann das Nährmedium und waschen Sie die Organoide zweimal mit 500 Mikrolitern DMEM. Nach fünf Minuten fügen Sie jeweils 675 Mikroliter Testmedium hinzu.Nun, dann überprüfen Sie die mikroskopische Morphologie der Gruftorganoide, um sie in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für eine Stunde zu inkubieren. Bereiten Sie anschließend 10 mikromolare injizierbare Verbindungen im Testmedium vor. Richten Sie die Patrone ein, indem Sie nacheinander 75 Mikroliter mit 10 mikromolaren injizierbaren Verbindungen in die Anschlüsse der Patrone laden.Inkubieren Sie die Kartusche anschließend 30 Minuten bis eine Stunde lang in einem Nicht-Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius. Schalten Sie gleichzeitig den XF-Analysator ein und erstellen Sie die Assay-Protokollvorlage. Setzen Sie die Kartusche und die Utility-Platte in den XF-Analysator ein und kalibrieren Sie die Kartusche Danach legen Sie die Zellkulturplatte in das Gerät ein und führen Sie den Assay aus.Das hier gezeigte Protokoll sind die Krypten-Organoide, die von einer acht Monate alten C 57 black six Maus in zwei Tagen oder 18 Tagen abgeleitet wurden. Kultur. Diese Abbildung zeigt den metabolischen Assay mit Organoiden, die von den acht Monate alten C 57 schwarzen sechs Mäusen stammen, in denen die Sauerstoffverbrauchsrate und die extrazelluläre Ansäuerungsrate dargestellt sind. Krypten sind rot und das Steuerelement blau gekennzeichnet.Die in der Patrone vorgeladenen Reagenzien wurden nacheinander als Oligomycin, B-F-C-C-P und C-Rotenon injiziert. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet von Krebs und Stoffwechsel den Weg, um metabolische Veränderungen in von Patienten stammenden Krypten-Organoiden zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Darmkrypta und den Organoidstoffwechsel in Echtzeit messen können.Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Echtzeit-Analyse von Stoffwechselprofil in Ex Vivo Maus Intestinale Crypt Organoide Kulturen

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