Name: Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit Fracht Mapping Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Charakterisierung molekularer Motoren auf axonaler Fracht mittels Cargo-Mapping in primären hippocampalen Neuronen der Maus. Diese Methode korreliert Motorprotein-Zusammensetzung mit Transportrichtung.

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Wir danken Ge Yang, Gaudenz Danuser, Khuloud Jaqaman und Daniel Whisler für die Unterstützung bei der Anpassung und Entwicklung der Software zur Quantifizierung von Frachtkartierungsanalysen und Emily Niederst für die Hilfe bei der Herstellung der mikrofluidischen Geräte. Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH-NIA-Zuschüsse unterstützt, die an L.S.B.G. und das Howard Hughes Medical Institute AG032180 wurden. L.S. wurde teilweise durch ein NIH Bioinformatics Training Grant T32 GM008806 unterstützt, S.E.E. wurde durch ein Damon Runyon Cancer Research Foundation Fellowship, NIH Neuroplasticity Training Grant AG000216 und durch ein Stipendium der Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award unterstützt, G.E.C. wurde durch einen NIH/NCATS 1 TL1 Award TR001114 und durch die Achievement Rewards for College Scientists Foundation unterstützt.

Alle Experimente wurden folgende genehmigte Protokolle und gemäß gültiger Richtlinien für die humane Pflege von Versuchstieren durchgeführt. Neugeborene Mäuse wurden durch Enthauptung getötet. 1. Herstellung von Mikrofluidik-Geräte für die Zellkultur <ol><li> Bereiten Polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidischen Vorrichtungen für das Wachstum von Neuronen im Hippocampus, wie Harris und Kollegen 17-19 beschrieben. Im Folgenden sind einige Änderungen, die an der Ladung Mapping-Protokoll angepasst wurden. HINWEIS: Mikrofluidische Vorrichtungen sind auch im Handel erhältlich (Materialliste), um den Zugriff auf eine Herstellungsanlage nicht erforderlich ist. </li><li> Vorbereitung No. 1½ Deckgläser (24 x 40 mm) durch Waschen dreimal mit Aceton gewaschen, gefolgt von drei Wäschen mit 100% Ethanol und drei Wäschen mit Wasser. Store Deck in Wasser bei 4 ° C bis zur Verwendung. Diese Behandlungen helfen sicherzustellen, dass Deckgläser sind sauber von Ablagerungen, die mit Überzug von cel stören könntenls, Verunreinigungen und Überleben. HINWEIS: Aceton und Ethanol sind brennbar und im Falle von Hautkontakt (reizend), bei Augenkontakt (reizend) gefährliche, des Verschluckens, des Einatmens. Entsorgung gemäß den behördlichen Vorschriften. </li><li> Wenn Sie bereit sind zu verwenden, setzen Sie ein Deckglas in einem 60 mm Zellkulturschale pro Mikrofluidik-Vorrichtung, und lassen Sie sie trocknen für 45 Minuten unbedeckt in einer Biosicherheitswerkbank, um eine Kontamination zu vermeiden. </li><li> Nach Geräten werden von den Meistern geschnitten und Schläge wurden geschnitten, um die Stauseen zu erstellen (Abbildung 1A, B), legen Sie sie mit der mikrofluidischen Kanälen Seite nach oben in einer Biosicherheitswerkbank mit einer UV-Lampe ausgestattet für 45 Minuten für die Sterilisation. HINWEIS: Wenn Geräte, die unter UV-Behandlung für länger als 2 Stunden kann die Vollständigkeit der PDMS beeinträchtigt. </li><li> Montieren Sie die Geräte, indem ein Gerät auf jedes Deckglas im Inneren des 60 mm Kunststoff-Zellkulturschale, so dass die mikrofluidischen Kanälen nach unten zeigen. Drücken Sie vorsichtig an die Spitze of des Gerätes (nicht an der Mikrokanäle), eine nicht-dauerhafte Abdichtung des Geräts auf dem Deckglas bereitzustellen. Cover jede 60 mm Zellkulturschale mit einem Deckel. </li><li> Mit einer Mikropipette, Hydrat die Geräte durch Zugabe von Zellkulturreinem Wasser in den oberen zwei mikrofluidischen Reservoirs (1 und 2 in Abbildung 1A), damit Wasser ungehindert durchfließen. Wasser zu entfernen mit einer Mikropipette und fügen 1 mg / ml Poly-L-Lysin in mikrofluidische Reservoir 1 (200 ul) und 2 (100 ul). Der Volumendifferenz wird für die Poly-L-Lysin, durch die Mikrokanäle (1A, B) zu fließen. </li><li> Um sicherzustellen, dass die Geräte in den 60 mm Zellkulturschalen nicht umkippen in einem 37 ° C-Inkubator, legen drei 60 mm Zellkulturschalen die Geräte enthält, in einen 150 mm Kunststoff-Zellkulturschale und decken Sie die Schüssel mit einem Deckel. Inkubieren O / N in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2. Typischerweise mehr als 90% der Kanäle pro Gerät verwendbar und zu tunenthalten keine Luftblasen oder physische Blockade. </li><li> Am nächsten Tag, ersetzen Poly-L-Lysin mit Wasser und lassen Sie Gerät in Inkubator für mindestens 1 Std. Wiederholen Sie diese dreimaligem Waschen. Entfernen Sie Wasser und fügen Neurobasal-Wachstumsmedium (mit 2% B-27 Ergänzung und 500 uM GlutaMAX) zu jedem Gerät. Lassen O / N in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Tag, plattenHippocampusZellen, wie unten beschrieben. </li></ol> 2. Überzug der Maus Hippocampus primären Neuronen in Mikrofluidiksysteme HINWEIS: Die Herstellung von kultivierten hippocampalen Neuronen aus Neugeborene Ratten wurde zuvor in JoVE 25 veröffentlicht. Im Folgenden sind einige Änderungen, die an Platte Maus Hippocampus-Neuronen in mikrofluidischen Geräte angepasst wurden, und das optimal für Transfektionen wurden. <ol><li> Vor Maus Gehirnsezierung, vorwärmen Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), das 10% fötales Rinderserum(FBS; ohne Antibiotika), Mischung A (125 mg DL-Cystein, 125 mg Rinderserumalbumin (BSA) und 3,125 g D-Glucose in 500 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), Filter sterilisiert durch ein 0,22 um Filter) und Deoxyribonuclease I-Lösung (DNase I: 50 mg DNase I und 0,5 ml einer 1,2 M MgSO 4 -Lösung in 100 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), filtriert durch ein 0,22 um-Filter sterilisiert) in einem 37 ° C Wasserbad. <ol><li> Vorwärmen Neurobasal-A-Wachstumsmedium in einem 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2, um den pH-Wert äquilibriert. </li></ol></li><li> Sezieren hippocampi 1-3 Tage alten Neugeborenen Mäusen nach etablierten Protokollen 26. Halten Hippocampus in einem konischen 15 ml-Röhrchen mit 10 ml Dissektion Puffer (HBSS, das 10 mM HEPES pH 7,4, 50 mM Glucose, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin) versetzt, auf Eis. Setzen Sie bis zu 4 hippocampi pro 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Führen Sie die verbleibenden Protokoll ist unter sterilen Bedingungens innerhalb einer Biosicherheitswerkbank. </li><li> Verdünnte 45 Einheiten Papain in 5 ml der Mischung A, Vortex und Inkubation für 5 min bei 37 ° C bis Papainpulver gelöst. 1 ml DNase I-Lösung. Filtern der Mischung durch ein 0,22 &amp; mgr; m Spritzenfilter Einheit. </li><li> Saugen Sie vorsichtig HBSS &#39;von 15 ml konischen Röhrchen mit hippocampi. 10 ml kaltem (4 ° C) HBSS zu hippocampi und ließ sie auf den Boden des Röhrchens zu begleichen. Vorsichtig absaugen HBSS von 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> 1 ml Papain / DNase I auf bis zu 4 hippocampi mischen und Inkubation für 20-30 min bei 37 ° C. Schwenk konischen Rohr alle 5 min zu hippocampi mit Mischung baden. Alternativ platzieren hippocampi in einem 37 ° C warmen Wasserbad Schüttler unter leichtem Schütteln (~ 100 rpm). </li><li> Saugen Papain / DNase I mischen und waschen hippocampi zweimal mit vorgewärmten DMEM (37 ° C) mit 10% FBS. </li><li> Nach zweiten Wasch, 2 ml vorgewärmten DMEM, das 10% FBS auf hippocampi und manuell Triturat hippocampi durch Pipettierennach oben und unten ~ 10-12 mal mit einer 1 ml Pipettenspitze zu Neuronen zu distanzieren. </li><li> Lassen Triturat für ~ 1 min absetzen da dies ermöglicht nichtdissoziierten Neuronen auf den Grund des konischen Rohrs begleichen. Überstand enthält dissoziierten Neuronen auf ein neues 15 ml konischen Röhrchen Vermeidung einer Übertragung von größeren Gewebe, die am Boden des Rohres angesiedelt hat. </li><li> Spin-Zellen bei 1.000 × g für 2 min und Überstand vorsichtig entfernen, ohne das Zellpellet zu stören. Zellen in 80 ul Neurobasal-Wachstumsmedium durch Pipettieren vorsichtig. </li><li> Entfernen Medium von mikrofluidischen Reservoir 1 und 1 &#39;. Anwendung 20 ul Zellen (~ 275.000), um mikrofluidische Behälter 1, und ihnen erlauben, hindurchfließen. Setzvorrichtung in 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 für 20 min. </li><li> Schauen Sie unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen wurden dem Deckglas geklebt. In Neurobasal-Wachstumsmedium nach oben aus alle Stauseen. Rückstellvorrichtung mit Zellen auf eine 37 ° C-Inkubator mit 5% CO <sub&gt; 2. </li><li> Überprüfen Geräte jeden ~ 2-3 Tage und runden Behältern mit Neurobasal-A mit 2% B-27 Ergänzung (ohne GlutaMAX) zu vermeiden Verdunstung. Neuronen beginnen, ihre Axone durch mikrofluidische Kanäle 2-3 Tage nach der Plattierung erstrecken ~. Betreff Neuronen normalerweise 7-10 Tage nach der Plattierung Transfektion. </li></ol> 3. Die Transfektion von Neuronen im Hippocampus Mikrofluidikvorrichtung Grown <ol><li> Pro Gerät, Vorbereitung einer Mischung von 1,2 &amp; mgr; l Lipofectamin 2000 30 ul Neurobasal-A und eine Mischung von 0,5 ug Fluoreszenzfrachtfusions Plasmid in 30 ul Neurobasal-A und inkubiere 5 min bei RT. In Lipofectamin-Mix, um DNA-Mix und Inkubation für 20 min bei RT. In 60 ul Neurobasal-A, die 4% B-27 Ergänzung zur DNA / Lipofectamine mischen und mischen durch Schwenken des Rohres. </li><li> Entfernen Sie alle Medien aus mikrofluidischen Reservoir 2 und 2 &#39;und vorsichtig füllen Wells mit Neurobasal-A mit 2% B-27 Ergänzung ohne Verschütten auf mittlere into den anderen Fächern. </li><li> Entfernen Sie das Medium aus mikrofluidischen Reservoir 1 und 1 &#39;. In 120 ul DNA / Lipofectamine mischen, um mikrofluidische Reservoir 1 und lass es fließen. Rückstellvorrichtung auf 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2 für 3-4 Std. </li><li> Entfernen Sie alle Medien aus mikrofluidischen Reservoir 1 und 1 &#39;und ersetzen Neurobasal-A mit 2% B-27 Ergänzung für 24 Stunden (oder bis bereit zu Bild). Typischerweise werden 5-7 Axone, die durch Mikrokanäle wachsen unter diesen Bedingungen, die etwa 1-3% Transfektionseffizienz Einklang mit Wirkungsgrade für Hippocampus-kultivierten Zellen 26 veröffentlicht repräsentieren transfiziert. </li></ol> 4. &quot;Fracht Mapping&quot; Analysen <ol><li> Live-Imaging von Fracht Bewegung <ol><li> Führen die Abbildung auf einem umgekehrten Licht Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem 37 ° C Inkubator und einem CO 2 Steuerkammer ausgestattet. </li><li> Montieren Sie das Deckglas mit Hippocampus-Neuronen in einem MICR gewachsenofluidic Gerät auf dem Mikroskoptisch. Um neuronalen Tod zu vermeiden, arbeiten zügig, um die Proben am Mikroskop nicht länger als 1 Stunde zu halten. </li><li> Verwendung eines hochauflösenden Objektiv (100X), finden Axone von transfizierten Zellen, die durch die Kanäle des Mikrofluidkammern erstrecken, und Aufzeichnen der Anzahl der Kanäle in dem die transfizierten Axon gefunden. Zählen Sie die Anzahl der Kanäle mit einer Handstückzähler. <ol><li> Für eine optimale Aufzeichnung der Live-Bewegung und anschließende Kolokalisationsanalyse Wählen Axone, die relativ flach durch die Kanäle, so dass Abbildungs ​​der meisten Vesikel im Fokus durchgeführt werden wachsen. </li></ol></li><li> Entfernt die meisten Mediums von Reservoirs 2 und 2 &#39;mit einer 1 ml Kunststofftransferpipette. Nachfolgende Ausrichtung der fixierten Bilder mit Bewegungsbahnen auf Kymographen erleichtern, richten die rechte Kante der Mikrokanäle mit dem Sichtfeld während der Bildgebung (1B, C). </li><li> Um fixin erleichterng der Proben während der Bildgebung, Sie live Bildgebung mit zwei Personen. Alternativ, wenn die Live-Darstellung wird von einer einzelnen Person durchgeführt wird, verwenden Sie ein Mikroskopsystem mit Driftkorrektur ausgestattet. </li><li> Starten Sie Echtzeit-Bildgebung Frachtbewegung mit Zeitraffer-Spezifikationen in der Verkehrsdynamik der Ladung analysiert (Mikroskop Spezifikationen und Einstellungen zur Abbildung YFP-PrP C sind in der Legende von Abbildung 2 und Materialliste angegeben). </li><li> Nach ausreichender Live Bewegungsdaten gesammelt worden sind, haben eine Person füllen Reservoirs 2 und 2 &#39;mit vorgewärmter 4% Paraformaldehyd in PBS, die 0,04 g / ml Saccharose, um die Zellen zu fixieren. Berühren Sie nicht die Mikrofluidik-Vorrichtung, da dies den Fokus der Live-Bildgebung stören. Haben die andere Person stellen Sie den Fokus während der Fixiermittel zugesetzt. Fixation ist erfolgreich, wenn sofortigen Stopp der Bewegung wird beobachtet. In Fixiermittel danach Reservoir 1 und 1 &#39;. HINWEIS: Temporäre photobleaChing des Fracht Fluoreszenz kann auch beobachtet werden, aber die Fluoreszenz besteht, nachdem IF Färbung für Motorproteine ​​abgeschlossen ist (nächster Schritt). HINWEIS: Paraformaldehyd ist gesundheitsschädlich beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Reizt die Augen, Atmungsorgane und die Haut. Entsorgung gemäß den behördlichen Vorschriften. </li></ol></li><li> IF-Färbung von Motorproteinen für Kolokalisationsanalyse HINWEIS: Für die Quantifizierung der relativen Pegel der Motor-Proteine ​​(wie durch Antikörperfärbung bestimmt), um einzelne bewegliche Ladungen zugeordnet sind, zu validieren und zu titrieren Antikörpern, um sicherzustellen, daß der Antikörper-Antigen-Bindung ist gesättigt. Dies wird durch die Bestimmung der Spezifität des Antikörpers unter Verwendung von Neuronen in dem das Protein von Interesse wurde entweder herausgeschlagenen bzw. zerlegt geführt, und durch Ausführen IF Analyse mit steigender Antikörperkonzentrationen. Für Negativkontrollen sind Neuronen mit Sekundärantikörper in Abwesenheit von primären Antikörpern gefärbt. DetailliertereBeschreibung der Antikörpervalidierung kann in Encalada et al. 16, und Szpankowski et al. 20 gefunden werden. <ol><li> Entfernen Sie das Deckglas mit Hippocampus-Neuronen in Mikrofluidik-Vorrichtung aus dem Mikroskoptisch gewachsen. Mikrofluidik-Vorrichtung nicht abmontieren, aus dem Deckglas, wie die Mikrokanäle benötigen, um die lebenden und fixierten Bilder einzublenden intakt bleiben. Führen Sie die folgenden Schritte in einer feuchten Kammer. </li><li> Um die Strömung von Lösungen in die Mikrokanäle zu gewährleisten, halten ein Puffervolumen Differenz zwischen Behälter 1, 1 &#39;und 2, 2&#39; von mindestens 30 &amp; mgr; l. in allen nachfolgenden Schritten. Fügen Sie beispielsweise 100 ul Mediavolumen zur mikrofluidischen Reservoir 2, 2 &#39;, und 70 ul Mediavolumen zur mikrofluidischen Reservoir 1, 1&#39;. </li><li> Entfernen Fixiermittel aus den Kammern der Mikrofluidikvorrichtung und wasche die Zellen dreimal mit PBS wartet 10 min zwischen den Waschgängen. </li><li> Durchdringbar Zellen durch Zugabe von 0,1% Triton X-100 Diluted in PBS für 5 min auf allen Reservoiren. </li><li> Entfernen Lösung aus allen Stauseen und waschen mit PBS. Wiederholen dreimaligem Waschen warten Sie 10 min zwischen Wäschen. </li><li> Entfernen Lösung aus allen Behältern und gelten Blockierungspuffer mit 10% normalem Eselserum und 3% Protease frei und Immunglobulin G (IgG) -freie BSA in PBS und Inkubation für mindestens 30 min bei RT. </li><li> Spin primären Antikörper-Stammlösung bei 20.000 × g für 5 min, um Niederschläge zu entfernen. Verdünnte Antikörper auf eine geeignete Konzentration in Blockierungspuffer. Ersetzen Sie den Blockierungspuffer von Mikrofluidik-Vorrichtung mit Antikörperlösung. Proben inkubieren für 2 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Lösung aus allen Stauseen und dreimal mit PBS, warten Sie 10 min zwischen Wäschen. </li><li> Spin sekundären Antikörper-Stammlösung bei 20.000 × g für 5 min, um Niederschläge zu entfernen. Verdünnte Antikörper auf eine geeignete Konzentration in Blockierungspuffer. Ersetzen PBS mit sekundären Antikörperlösung. BebrütenProben für 1 Stunde bei RT. </li><li> Entfernen Lösung aus allen Stauseen und dreimal mit PBS, warten Sie 10 min zwischen Wäschen. </li><li> Ersetzen PBS mit ~ 10-20 ul Eindeckmediums durch direktes Pipettieren Eindeckmediums in die Öffnung der Kanäle, welche die Reservoire. Lassen Eindeckmedien trocken ~ 20 min - 1 h bei RT. </li><li> Speicher-Geräte bei 4 ° C lichtgeschützt zu vermeiden Bleichen und Bild Axone innerhalb von zwei Tagen (maximal eine Woche) der Färbung. </li><li> Nach der Färbung abgeschlossen ist, montieren Deckglas mit Hippocampus-Neuronen in Mikrofluidik-Vorrichtung auf den Mikroskoptisch gewachsen. Suchen Sie den Bereich der transfizierten Axon in Schritt 4.1.1-4.1.7 abgebildet. </li><li> Erwerben Z-Stapel-Bildern (300 nm-Schritten) für jeden der drei Kanäle: Ladung, Motor 1, Motor 2 mit einem hochauflösenden Objektiv (zB eine hohe numerische Apertur Öl oder Wasser Ziel). HINWEIS: Übernahme von Z-Stapel ist wichtig, da Axone häufig nicht perfekt flach wachsenin Mikrokanälen deshalb werden nicht alle fluoreszierenden Pünktchen in der gleichen Brennebene. </li></ol></li><li> Fracht Mapping <ol><li> Generieren Sie eine kymograph Frachtbewegung mittels Bildanalyse-Software. Die ImageJ Plugin von Rietdorf und Seitz (EMBL) entwickelt wird zur Erzeugung Kymographen empfohlen (zum Download finden Materialliste). HINWEIS: ImageJ ist ein public domain, Java-basierte Bildverarbeitung an den National Institutes of Health 27,28 entwickelte Programm (zum Download siehe Materialliste). </li><li> Ausrichten der fixierten Bilder des fluoreszierenden Ladung (in Schritt 4.2.14 generiert) manuell durch Überlagerung davon auf die Lage der Bahnen in der kymograph am Fixierungspunkt (2A, B), mit einem handelsüblichen Graphiksoftwareprogramm (Material List). Durch Überlagern des ersten festen Bild Fracht auf dem kymograph und manuellen Wahl der Ladung Tränenpunkte, die einer bestimmten Bewegungsbahn auf entspricht manuell ausrichtendie kymograph. Für beste Ausrichtung Ergebnisse, verwenden Sie die Z-Schnitt, die in besten Fokus für die Ladung zugeordnet ist. Mehrere Z-Scheiben verwendet werden. </li><li> Für jedes Bild in der Z-Stapel (Ladung, Motor 1 und Motor 2 im Schritt 4.2.14 erzeugt) die XY-Koordinaten und Intensität Amplituden für jedes Fluoreszenzpünktchen Verwendung eines Algorithmus festgelegt, um 2D-Gauß an die Punktverteilungsfunktion, die repräsentiert passen Jede Punktquelle in jedem der drei Kanäle 16,20,21 (Figur 2D). HINWEIS: Um die XY-Koordinaten, einen speziell angefertigten MATLAB Software-Paket namens &quot;Motor Kolokalisation&quot; wurde 16,20 entwickelt, die eine Gaußsche Anpassungsalgorithmus von Jaqaman, Danuser und Kollegen 21-23 entwickelt beinhaltet erhalten. Das Software-Paket und detaillierte Anweisungen für ihre Verwendung ist auf Anfrage erhältlich. </li><li> Für jedes der einzeln Frachtpünktchen, die auf die mobile oder stationäre Trajektorien auf der kymograph kartiert wurden, wählen Sie ter XY-Koordinaten und Intensität Amplituden aus den Ergebnissen der &quot;Motor Kolokalisation&quot; Programm (diese Ladungen werden einzeln in 2B beschriftet). Verwenden Sie mehrere Z-Stapel-Bildern in Schritt 4.2.14 erworben), um mehr Güter, die auf unterschiedlichen Fokusebenen zu finden sind abzubilden. </li><li> Vergleichen Sie die einzelnen XY-Koordinaten für das zugeordnete Fracht denen für jede der Motorkanäle in der entsprechenden Z-Schnitt (2D) erhalten. Bestimmen Sie und wählen Sie die XY Motor Koordinaten, innerhalb eines 300 nm Radius der Fracht sind. Für Ladungen und Motoren, die Signal innerhalb der gleichen Brennebene haben, verwenden Sie den &quot;Motor Kolokalisation&quot; Software-Paket, um den Tränenpünktchen, die innerhalb eines 300 nm Radius befinden bestimmen. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Korrelation der Direktionalität der Bewegung der einzelnen fluoreszierenden Mikrotubuli-basierte Bewegen der Fracht Teilchen mit der relativen Art und Menge der zugeordnete Motor-Proteine ​​in lebenden Neuronen. Zuvor wurde die Gesamtmotor Zusammensetzung des axonalen vesikulären Ladungen auf heterogene Populationen von biochemisch gereinigt Vesikeln und Organellen 9,15 getestet. Jedoch Charakterisierung Motorzusammensetzung für einen einzig...

Intrazellulären Transport ist kritisch bei allen Zelltypen für die Abgabe von Proteinen, Membranen, Organellen und Signalmolekülen zu verschiedenen zellulären Domänen 1. Neuronen sind hoch spezialisierte Zellen, die mit langen, polarisierten Projektionen, die sich kritisch auf den intrazellulären Transport von essentiellen Güter für ihre Langstrecken Lieferung an verschiedenen axonalen Mikrodomänen abhängen. Zwei große Familien von molekularen Motorproteinen - - Dieser Transport wird durch Kinesinen und Dyneine vermittelte, dass bind zu Ladungen und verfolgen zusammen polarisiert Mikrotubuli in anterograde und retrograder Richtung. Während Rückwärtsbewegung wird hauptsächlich durch Dynein vermittelt, wird die Bewegung in der anterograde Richtung von einem großen, funktionell vielfältige Familie von Kinesin-Motoren erleichtert. Folglich konnte anterograde Transport von axonalen Ladungen von verschiedenen Familienmitglieder der Kinesin-Superfamilie 1-5 vermittelt werden. Obwohl einige Ladungen bewegen beharrlich in jeder Richtung, most Ladungen bewegen bidirektional und Rückwärts häufig auf ihrem Weg zu ihrem endgültigen Ziel 1,5-13. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Motoren gleichzeitig gegenüberliegenden Richtungs assoziieren Ladungen, was die Frage aufwirft, wie geregelten Bewegung der Ladungen von entgegengesetzter Polarität Motoren 5-7 koordiniert. Gemeinsam ist den Transport von Axonen Ladungen eine abgestimmte Prozess, der von der Zusammensetzung der Motoren und ihrer spezifischen biochemischen Aktivitäten, die wiederum abhängig von verschiedenen Adaptern und regulatorische Bindungspartner 14 reguliert wird. Um beschreiben zuverlässig den Mechanismus der axonalen Transport für eine bestimmte Ladung und die zugrunde liegende Regelung dieser Transport aufzudecken, ist es von größter Bedeutung, um die Zusammensetzung der Motorproteine ​​und deren Regulierungsbindungspartner mit individuellen Ladungen bei ihren Live-Verkehr verbundenen bestimmen. Andere Methoden, zum Beispiel biochemische Ansätze liefern Schätzungen des durchschnittlichen motoder Zusammensetzungen auf gereinigten heterogenen Vesikelpopulationen, aber diese Schätzungen enthüllen nicht die Art oder die Menge der Motoren, um einzelne bewegenden Vesikeln assoziiert. Auch Rekonstitution Vesikeltransportstudien entlang vormontierten Mikrotubuli in vitro aktiviert Messen der Menge von einem Motortyp auf einem Vesikel Stufe 15. Jedoch haben diese Versuche nicht direkt korreliert die Menge der Motoren mit den Transporteigenschaften dieser Vesikel und gemessenen Verkehrs in Abwesenheit von zellulären regulatorischen Faktoren. Ein Protokoll wird hier vorgestellt, die den Motor Zusammensetzung (Art und relative Menge der Motoren) der einzelnen beweglichen Vesikel aus Immunfluoreszenz (IF) Datenmess endogen exprimierten Motorproteine ​​bestimmt, und korreliert diese Parameter, um die Live-Transport von der exakt gleichen Vesikel in Nervenzellen 16. Dieses Verfahren beinhaltet eine präzise Abbildung der IF-to-live Frachtbewegungsdaten. Dies wird bewerkstelligt Growing Hippocampus-Neuronen der Maus in mikrofluidischen Geräte folgen etablierten Protokollen 17-19. Diese Geräte ermöglichen die Identifizierung und Korrelation (&quot;Mapping&quot;) von Axonen und Einzel bewegten Ladungen in festen und Live-Lichtmikroskopie Modalitäten (Abbildung 1). Kultivierten Neuronen werden mit fluoreszenzmarkierten Fracht Proteine, deren Transport mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung abgebildet werden, um detaillierte Bewegungsinformationen, die in Kymographen aufgetragen wird erhalten transfiziert. Im Verlauf der Bilderzeugung werden Neuronen, die mit Paraformaldehyd fixiert und anschließend mit Antikörpern gegen endogene Motorproteine ​​angefärbt. Feste Fracht und Kraftbilder auf Live-Bewegung Kymographen lagert, um &quot;Karte&quot; (colokalisieren) sie an den Live-Fracht Bewegungstrajektorien 16. Um die Live-Bewegung der Ladungen mit dem Verband der Motorproteine ​​korrelieren, wird Kolokalisation mit einem maßgeschneiderten MATLAB Software-Paket namens &quot;Mo analysierttor Kolokalisation &quot;16,20. Fluoreszenzmarkierten Ladungen und Motoren erzeugen beugungsbegrenzten punktförmige Merkmale, die teilweise überlappen können. Um die Position des überlappenden puncta zu beheben, zuerst passt die Software automatisch Gauß-Funktionen zu jedem Punktverwaschungsfunktion, die einzelne fluoreszierende Pünktchen, um ihre genaue XY Subpixel-Positionskoordinaten und Intensität Amplituden 21-23. Die Positionen der Motoren und der Ladungen sind anschließend miteinander verglichen, um zu bestimmen Kolokalisation 16,20. Daher wird dieses Verfahren genauer ordnet Kolokalisation von Fluoreszenzpünktchen im Vergleich zu anderen Verfahren 24. Die Stärke dieser Methode ist die Möglichkeit, die Kolokalisation von Motoren mit einzelnen Lade in fixierten Zellen zu beurteilen, für die Live-Bewegungsbahnen (beispielsweise die Richtung, in der sie zum Zeitpunkt der Fixierung bewegt) wurden recorded. Mit diesem Verfahren wurden kinesins und Dyneine Ergebnis gleichzeitig an Vesikeln, die die normale Prionprotein tragen (PrP C -cellular), eine neuronal angereicherten Ladung, die in zwei Richtungen bewegt oder stationär bleibt in Axonen 16 zuzuordnen. Diese Analyse erlaubt die Formulierung eines Arbeitsmodells für die Regulierung von PrP C Vesikel Bewegung, in der anterograde (Kinesin) und retrograde (Dynein) Motoren koordinieren ihre Aktivitäten, um die Vesikel in jeder Richtung bewegen oder stationär zu bleiben, während auf die Ware zusammen . Eine weitere Stärke dieser Methode ist, sein Potenzial breite Anwendbarkeit zur Charakterisierung Kolokalisation / Verband vieler fluoreszenzmarkierten Ladungen, die in praktisch jeder Zelltyp zu bewegen, mit einem anderen Protein (e) von Interesse. Somit könnte live / feste Zuordnung potentiell für den Nachweis von transienten Protein-Interaktionen Ladung zu ermöglichen, können so viele einzelne fluoreszenzmarkierten bewegenden Teilchen über einen gewünschten p analysierendeEITRAUM der Zeit. Angesichts der breiten Anwendbarkeit und die Art der Fragen, die diese Methode ansprechen können, wird dieses Protokoll von Interesse für ein breites Publikum von Zellbiologen einschließlich derjenigen studieren Handel und Transport in Neuronen oder in anderen Zelltypen sein.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-Lysin</td><td>Sigma</td><td>P5899-20mg</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM (Dulbecco' s Modified Eagle Medium) Hoher Glukosegehalt, mit L-Glutamin, ohne Natriumpyruvat (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fötales Rinderserum)</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Serum Free Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>10888022</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I Supplement (100x)</td><td>Life Technologien</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x) (Hank' Life</td> <td>Technologies</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, kein Magnesium, kein Calcium (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Corning Cellgro Wasser für die Zellkultur&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT46000CM</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>USB Corporation</td><td>19925</td><td></td></tr><tr><td>DL-Cystein HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9768</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Rinderserumalbumin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I Grad II</td><td>Roche Applied Sciences</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; </td><td></td>11668027</tr><tr><td>Formaldehydlösung 16%</td> EM <td>Grade Fisher Scientific</td><td>50980487</td><td>Achtung: Gesundheitsschädlich durch Einatmen, bei Berührung mit der Haut und beim Verschlucken. Reizt Augen, Atemwege und Haut. Entsorgen Sie gemäß den behördlichen Vorschriften.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>Normales Eselserum</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-0121</td><td></td></tr><tr><td>BSA-Fettsäure- und IgG-frei</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2403-4</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifading-Reagenz</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas 1 1/2. 24 x 40 mm</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>Achse Mikrofluidik-Gerät, 450 & Mikro; m</td><td>Millipore</td><td>AX450</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coolsnap HQ Kamera&nbsp;</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm Zellkulturschale</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>150 mm Zellkulturschale</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-100</td><td></td></tr><tr><td>Verwendete Antikörper:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Kinesin-Leichtkette, V-17</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>sc-13362</td><td>Spezifität verifiziert mit KLC1-/- Neuronen (Ref. 16), empfohlene Verdünnung 1:100.</td></tr><tr><td>Anti Dynein Schwere Kette 1, R-325</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>sc-9115</td><td>Spezifität verifiziert mittels shRNA gegen DYN1HC1 (Ref. 16), empfohlene Verdünnung 1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td>&nbsp; Empfohlene Verdünnung 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td>&nbsp; Empfohlene Verdünnung 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Esel Anti-Ziege IgG (H+L) Antikörper IgG Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A11057</td><td>&nbsp; Empfohlene Verdünnung 1:200.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Esel Anti-Ziege IgG (H+L) Antikörper</td><td>Life Technologies</td><td>A21447</td><td>&nbsp; Empfohlene Verdünnung 1:200.</td></tr><tr><td colspan="4">Plugins und Makros</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/index.html">&nbsp; http://imagej.nih.gov/ij/index.html.&nbsp; </a></td></tr><tr><td>ImageJ Kymograph Plugin</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html">http://www.embl.de/eamnet/html/body_kymograph.html.</a></td></tr></tbody></table>

charakterisierung der zusammensetzung der molekulare motoren auf umzug axonal fracht mit &quot;fracht mapping&quot; analysis

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Das Verständnis der Mechanismen, mit denen molekulare Motoren koordinieren ihre Aktivitäten, um vesikuläre Ladungen innerhalb Neuronen transportieren erfordert die quantitative Analyse von Motor / Frachtverbände an der einzelnen Vesikel Ebene. Das Ziel dieses Protokolls ist es, quantitative Fluoreszenzmikroskopie, um die Zusammensetzung und die relativen Mengen von Motoren mit der gleichen Ware zusammen verwenden, um zu korrelieren (&quot;Karte&quot;) die Position und Ausrichtung der Verbringung von lebenden Fracht. &quot;Fracht Mapping&quot; besteht aus Live-Bildgebung von fluoreszenzmarkierten Ladungen bewegt sich in Axonen auf mikrofluidischen Systemen kultiviert, gefolgt von chemischen Fixierung während der Aufzeichnung von Live-Bewegung, und anschließende Immunfluoreszenz (IF) Färbung der exakt gleichen axonalen Regionen mit Antikörpern gegen Motoren. Kolokalisation von Ladungen und dazugehörigen Motoren wird durch Zuweisen Teilpixelposition beurteilt Koordinaten Motor und Ladekanäle, durch Einpassen Gauß-Funktionen, um den beugungs ligrenzten Punktbildfunktionen, die einzelne fluoreszierende Punktquellen. Feste Ladung und Motor Bilder werden anschließend auf Parzellen von Frachtbewegung überlagert, um &quot;Karte&quot;, dass sie ihr verfolgten Trajektorien. Die Stärke dieses Protokolls ist die Kombination von lebenden und IF-Daten, sowohl den Transport von vesikulären Ladungen in lebenden Zellen zu erfassen und um die Motoren zu diesen gleichen Vesikel assoziiert bestimmen. Diese Technik überwindet früheren Herausforderungen, die biochemischen Methoden verwenden, um die durchschnittliche Motor Zusammensetzung gereinigt heterogenen Groß Vesikelpopulationen bestimmen, wie diese Methoden nicht Kompositionen auf einzelnen, sich bewegenden Ladungen offenbaren. Ferner kann dieses Protokoll für die Analyse von anderen Transport- und / oder Transportwege in anderen Zelltypen geeignet ist, die Bewegung der einzelnen intrazelluläre Strukturen mit ihrer Proteinzusammensetzung zu korrelieren. Einschränkungen dieses Protokolls sind die relativ geringen Durchsatz aufgrund der geringen Transfektionseffizienz kultivierterprimären Neuronen und eine begrenzte Sichtfeld für hochauflösende Abbildungs ​​erhältlich. Zukünftige Anwendungen könnten Verfahren umfassen, die Anzahl der Neuronen, die fluoreszierend markierten Ladungen zu erhöhen.

Figur 1 zeigt eine Übersicht der mikrofluidischen Vorrichtung verwendet werden, um Neuronen des Hippocampus zu wachsen (1A, B). Neuronen werden in Behälter 1 plattiert Die Größe der Mikrokanäle verhindert die Diffusion der Zellkörper (Soma) in den axonalen Kompartiment, während die Länge der Kanäle verhindert dendritischen Vorsprünge der Kreuzung den ganzen Weg zu der axonalen Kompartiment. Nach ca. 2-3 Tagen in Kultur Neuronen beginnen verlauf ihre Axone über Mikrokanäle in den axonale...

Intrazellulärer Transport von Frachten, wie Vesikeln oder Organellen, wird von molekularen Motorproteinen durchgeführt, die auf polarisierten Mikrotubuli verfolgen. Dieses Protokoll beschreibt die Korrelation der Transportrichtung einzelner Frachtpartikel, die sich innerhalb von Neuronen bewegen, mit der relativen Menge und Art der assoziierten Motorproteine.

Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit &quot;Fracht Mapping&quot; Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Das übergeordnete Ziel der Ladungskartierung ist es, die relative Menge und Art der molekularen Motorproteine zu bestimmen, die mit vesikulären Frachten assoziiert sind und diese Bewegung bewegen, und diese Zusammensetzung der Motoren mit der Richtungsbewegung der lebenden Fracht zu korrelieren. Dies wird erreicht, indem zunächst primäre Hippocampus-Neuronen der Maus in mikrofluidischen Geräten gezüchtet werden, so dass Axone relativ gerade wachsen, und indem die intrazelluläre Live-Bewegung von fluoreszenzmarkierten Frachtproteinen in den Axonen von transient transfizierten Neuronen aufgezeichnet wird. Der zweite Schritt besteht darin, Neuronen im Zuge der Live-Cargo-Bildgebung zu fixieren und anschließend die Axone mit Antikörpern gegen molekulare Motorproteine wie Kinesin und Dins zu färben, gefolgt von einer Immunfluoreszenzmikroskopie.Als nächstes werden die Bilder der festen Ladung und des Motors mit den Plots der Frachtbewegung über die Zeit, auch Kräfte genannt, ausgerichtet, um die Bewegung der lebenden Ladung mit den gefärbten zugehörigen Motoren zu korrelieren, wie sie durch die Immunfluoreszenzfärbung bestimmt werden. Der letzte Schritt besteht darin, die Positionen der Subpixel von Fracht- und Motorproteinen mit Hilfe eines eigens entwickelten MATLAB-Softwarepakets namens motorische Kolokalisation zu bestimmen. Diese Software liefert die genauen XY-Koordinaten jeder Fracht- und Motorposition sowie die relative Menge der Fluoreszenzintensitäten, die mit Ladungen und Motoren verbunden sind.Letztendlich liefert die Korrelation der Fluoreszenzmikroskopie von lebenden und festen Ladungen und Motoren auf dem Niveau der Subpixelauflösung Informationen über die Arten von Motoren, die mit bestimmten Ladungen verbunden sind, für die die Bewegungsrichtung bekannt ist. Diese Methode gibt also Einblick in den Mechanismus des Exon-Transports. Es kann auf andere Studien angewendet werden, die die Lebensmikroskopie mit der Immunfluoreszenzfärbung korrelieren, wie z. B. die Assoziation von Proteinen mit Mikrotubialen während der Mikrot-Eileiterdynamik oder die Rekrutierung von Proteinen während der Endozytose.Die visuelle Demonstration dieser Methode hilft bei der Durchführung der bildgebenden Fixierungs- und Analyseschritte, die sonst möglicherweise schwer zu erlernen wären, da sie eine spezielle Einrichtung erfordern. Die primären Neuronen des Hippocampus der Maus für dieses Verfahren werden wie im Protokolltext beschrieben vorbereitet und im neurobasalen Eiwachstum resuspendiert. Medium, um die Neuronen in dem mikrofluidischen Gerät zu plattieren.Entfernen Sie das Medium aus dem mikrofluidischen Reservoir eins und einer Prime. Geben Sie 20 Mikroliter Zellen auf das mikrofluidische Reservoir eins und lassen Sie sie durchströmen. Stellen Sie das Gerät für 20 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5% CO2.Schauen Sie unter das Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen an dem abgedeckten Glas haften. Fügen Sie Neurobasal hinzu, ein Wachstumsmedium, um alle Reservoirs aufzufüllen. Legen Sie das Gerät mit den Zellen bis zum neunten Tag wieder in den Inkubator.In Kultur verlängern die Neuronen Axone durch die Mikrokanäle und sind bereit für die Transfektion für die Expression fluoreszierender Proteine. Die Live-Bildgebung der transfizierten primären Hippocampus-Neuronen der Maus erfolgt an einem inversen Epi-Fluoreszenzlichtmikroskop, das mit einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator und einer CO2-Kontrollkammer ausgestattet ist. Um diesen Vorgang zu starten, wählen Sie das 100-fach-Ölobjektiv aus.Tragen Sie Öl auf das Objektiv auf und montieren Sie das Deckglas mit den in einem mikrofluidischen Gerät gezüchteten Hippocampus-Neuronen auf den Mikroskoptisch. Um den neuronalen Tod zu vermeiden, sollten Sie die Proben zügig nicht länger als eine Stunde am Mikroskop aufbewahren. Finde Axone von transfizierten Zellen, die sich durch die Kanäle der mikrofluidischen Kammer erstrecken.Notieren Sie die Anzahl der Kanäle, in denen das transfizierte Axon gefunden wurde. Zählen Sie die Anzahl der Kanäle mit einem Handzählzähler für eine optimale Aufzeichnung von Live-Bewegungen und eine anschließende Kolokalisierungsanalyse. Wählen Sie Axone, die relativ flach durch die Kanäle wachsen, damit die Bildgebung der meisten Vesikel scharf durchgeführt werden kann.Zur Erleichterung des anschließenden Ausrichtens von fixierten Bildern mit Bewegungstrajektorien auf dem chm-Transplantat. Richten Sie den rechten Rand der Mikrokanäle während der Bildgebung am Sichtfeld aus. Um die Zellen während der Live-Bildgebung erfolgreich zu fixieren, wird der Eingriff am besten mit zwei Personen durchgeführt, einer Person, die das Fixiermittel hinzufügt, und einer weiteren Person, die den Fokus einstellt.Es ist auch wichtig, alle Reagenzien griffbereit und griffbereit zu haben. Mit einer Ein-Milliliter-Transferpipette aus Kunststoff. Entfernen Sie den größten Teil des Mediums aus den Reservoirs zwei und zwei Prime Start Imaging Live-Frachtbewegungen mit Zeitrafferspezifikationen, die speziell auf die Transportdynamik der zu analysierenden Fracht zugeschnitten sind.Nachdem ausreichend Live-Bewegungsdaten gesammelt wurden, lassen Sie eine Person die Reservoirs zwei auffüllen und zwei mit dem vorwärmten Fixiermittel befüllen. Vermeiden Sie es, das mikrofluidische Gerät zu berühren, da dies den Fokus der Live-Bildgebung stört. Lassen Sie die andere Person den Fokus anpassen, während das Fixativ hinzugefügt wird.Auf die gleiche Weise ist das Auffüllen der Reservoire eins und eine Grundierung mit dem Fixiermittel erfolgreich, wenn eine sofortige Beendigung der Bewegung beobachtet wird. Anschließend werden die fixierten Neuronen mit Antikörpern gegen endogene Motorproteine angefärbt und wie im Protokolltext beschrieben abgebildet. Um mit der Ladungskartierung zu beginnen, erstellen Sie mit Hilfe einer Bildanalysesoftware ein Chromogramm der Ladungsbewegung.Das von Rich Dorf Insights entwickelte Image J-Plugin wird für die Erzeugung von Kraft unter Verwendung kommerziell verfügbarer Grafiksoftware empfohlen, die das Immunfluoreszenzbild der Fracht manuell an dem CHM-Diagramm der Frachtbewegung ausrichtet und die Frachtpunkte mit der Position der Trajektorien im CHM-Graphen am Fixierungspunkt überlagert, so dass jede Frachtpunktzahl einer spezifischen Trajektorie auf dem CHM-Diagramm entspricht. Die besten Ausrichtungsergebnisse erzielen Sie, wenn Sie das Z-Slice verwenden, das für die gemappte Ladung am besten fokussiert ist. Für jedes Bild im Z-Stapel können mehrere Z-Slices verwendet werden.Bestimmen Sie die XY-Koordinaten und Intensitätsamplituden für jeden Fluoreszenzpunkt mit einem etablierten Algorithmus, um 2D-Gauß an die Punktspreizungsfunktion anzupassen, die die Punktquellen in jedem der drei Kanäle darstellt. Um die XY-Koordinaten zu erhalten, wurde ein speziell angefertigtes MATLAB-Softwarepaket namens Motor Colocalization entwickelt, das einen von Yakima DONA und Kollegen entwickelten Gaußschen Anpassungsalgorithmus für jedes der einzelnen Frachtpunkte enthält, die auf die mobilen oder stationären Trajektorien abgebildet wurden. Wählen Sie im Kog-Diagramm die XY-Koordinaten und Intensitätsamplituden aus den Ergebnissen des Motorkolokalisierungsprogramms aus.Verwenden Sie mehrere Zack-Bilder, um mehr Ladungen zu kartieren, die sich in verschiedenen Fokusebenen befinden. Vergleichen Sie die einzelnen XY-Koordinaten für die zugeordnete Fracht mit denen, die für jeden der Motorkanäle in der entsprechenden Z-Schicht erhalten wurden. Bestimmen und wählen Sie die XY-Motorkoordinaten aus, die innerhalb eines Radius von 300 Nanometern um die Ladung für Ladungen und Motoren liegen, die innerhalb derselben Fokusebene signalisiert haben.Verwenden Sie das Softwarepaket für die Motorkolokalisierung, um die Punkte zu bestimmen, die sich innerhalb des 300-Nanometer-Radius befinden. Die Cargo-Kartierung wurde verwendet, um den Transport von Vesikel, die normales Prionenprotein tragen, das mit gelb fluoreszierendem Protein oder Y-F-P-P-R-P-C markiert ist, mit relativen Mengen an Kinesin und Dine-Motoren in Axonen zu korrelieren. Dieses Diagramm zeigt die Vesikelbewegung von F-P-P-R-P-C und die gestrichelte Linie zeigt den Zeitpunkt der Fixierung während der Live-Bildgebung.Fluoreszenzbilder von fixierten Y-F-P-P-R-P-C-Vesikeln sowie die entsprechenden Immunfluoreszenzbilder der Kinesin-Leichtkette eins und dine sind mit dem Chromographen ausgerichtet. Diese Vergrößerung zeigt immunfluoreszierende Signale jedes der drei Kanäle mit 2D-gian-Funktionszuweisungen. Dieses Diagramm stellt die Quantifizierung der Kolokalisation zwischen Y-F-P-P-R-P-C-Vesikel, Kinesin-Leichtkette eins und dine in Wildtyp-Neuronen und in Neuronen ohne KINESIN-Schwerkette dar.Die relative Menge an Kinesin-Leichtketten, eins und dine, die mit Y-F-P-P-R-P-C-Vesikeln assoziiert sind, wird aus den Gaußschen Amplituden abgeleitet und aufgetragen, um mögliche Korrelationen zwischen den relativen motorischen Mengen und der Bewegungsrichtung zu untersuchen. Dieses Beispiel von Wildtyp-Neuronen zeigt, dass Y-F-P-P-R-P-C-Vesikel, die sich bewegen oder stationär sind, entweder mit KINESIN Light Chain One oder Dine oder mit beiden assoziieren. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden. Zusätzlich zu den etwa 10 Tagen der Vorbereitung der Bildgebung vor der EM der Mikrofillic-Geräte und des primären Neurons können Sie innerhalb von drei Tagen Live-Bildgebungsbilder von Immunfluoreszenzfärbungen und Datenanalysen durchführen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Live-Bewegungen von fluoreszenzmarkierten Ladungen und Neuronen aufzeichnet, die in mikrofluidischen Geräten gezüchtet wurden. Wie man C-Zellen während der Bildgebung fixiert, wie man die Kolokalisation als Subpixelauflösung analysiert und wie man die Kolokalisation von A-Ladungen und molekularen Motorproteinen mit der Frachtbewegung korreliert.

characterizing-composition-molecular-motors-on-moving-axonal-cargo

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Molekulare Shuttles, bestehend aus funktionalisierten Mikrotubuli Gleiten auf der Oberfläche haften Kinesin Motorproteine ​​können als nanoskalige Nahverkehr dienen. Hier ist die Montage eines typischen Shuttle-System beschrieben.

Frachtladesysteme auf Kinesin Powered Molekulare Shuttles

Hier wird ein Protokoll vorgestellt Kinesin-1 Ladungen zu identifizieren. Ein motorlose Mutante des Kinesin-1 schweren Kette (KIF5B) Aggregate im Zytoplasma und induziert die Aggregation der Ladungen. Beide Aggregate werden unter Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen. Eine ähnliche Strategie Ladungen anderer Motor-Proteine ​​zu identifizieren, eingesetzt werden.

Identifikation von Kinesin-1 Cargos Mit Fluoreszenzmikroskopie

Hier beschreiben wir eine In-vitro-Live-Imaging-Methode zur Visualisierung des intrazellulären Transports von Organellen und des Handels mit Plasmamembranproteinen in murinen Astrozyten. Dieses Protokoll stellt auch eine Bildanalysemethodik zur Bestimmung von Frachttransportrouten und Kinetik dar.

Visualisierung und Analyse des intrazellulären Transports von Organellen und anderen Ladungen in Astrozyten

Ziel dieses Protokolls ist es, Ensembles molekularer Motoren auf DNA-Origami-Nanostrukturen zu bilden und die Ensemblemotilität mittels totaler interner Reflexionsfluoreszenzmikroskopie zu beobachten.

Produktion von Dynein und Kinesin Motor Ensembles auf DNA Origami Nanostrukturen für die Einzelmolekülbeobachtung

Beeinträchtigter mitochondrialer Transport und Morphologie sind an verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das vorgestellte Protokoll verwendet induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Vorhirn-Neuronen, um mitochondrialen Transport und Morphologie bei erblicher spastischer Paraplegie zu bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung des mitochondrialen Handels entlang von Axonen und die Analyse ihrer Morphologie, die das Studium neurodegenerativer Erkrankungen...

Analyse von mitochondrialem Transport und Morphologie bei humaninduzierten Pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen bei erblicher spastischer Paraplegie

Wir beschreiben Fluoreszenz-Photoaktivierungsmethoden zur Analyse des axonalen Transports von Neurofilamenten in einzelnen myelinierten Axonen peripherer Nerven von transgenen Mäusen, die ein photoaktivierbares Neurofilamentprotein exprimieren.

Bildgebung und Analyse des Neurofilamenttransports in verbraucheten Maus-Tibialnerv

Das bidirektionale mitotische Kinesin-5 Cin8 sammelt sich in Clustern an, die sich während ihrer Motilität teilen und verschmelzen. Die Akkumulation in Clustern verändert auch die Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit von Cin8. Hier wird ein Protokoll für Motilitätsassays mit gereinigtem Cin8-GFP und die Analyse der beweglichen Eigenschaften einzelner Moleküle und Cluster von Cin8 beschrieben.

Motilität einzelner Moleküle und Cluster von bidirektionalem Kinesin-5 Cin8, gereinigt aus S. cerevisiae-Zellen

Unter Verwendung transgener fluoreszierender Mäuse werden detaillierte Protokolle beschrieben, um den axonalen Transport von Signalendosomen und Mitochondrien innerhalb motorischer und sensorischer Axone des intakten Ischiasnervs bei lebenden Tieren in vivo zu beurteilen.

Erweiterung des Toolkits für die In-vivo-Bildgebung des axonalen Transports

Diese Studie beschreibt die Reinigung von KIF1A (1-393LZ), einem Mitglied der Kinesin-3-Familie, unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Expressionssystems. Die In-vitro-Einzelmolekül - und Multimotor-Gleitanalyse dieser gereinigten Motoren zeigte robuste Motilitätseigenschaften, die mit Motoren aus Säugetierzelllysat vergleichbar sind. Somit ist das Sf9-Baculovirus-System in der Lage, Motorprotein von Interesse zu exprimieren und zu reinigen.

Einzelmolekülanalyse von Sf9-gereinigten superprozessiven Motoren der Kinesin-3-Familie

Die Arbeit beschreibt die Optimierung von Fluoreszenzmikroskopie-Erfassungsparametern, um den axonalen Transport von endogenen markierten Frachten mit Einzelneuronenauflösung in einem lebenden Fadenwurm sichtbar zu machen.

Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports endogener Fracht durch Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Caenorhabditis elegans

Erfahren Sie die Charakterisierung molekularer Motoren auf axonaler Fracht mittels Cargo-Mapping in primären hippocampalen Neuronen der Maus. Diese Methode korreliert Motorprotein-Zusammensetzung mit Transportrichtung.

Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit "Fracht Mapping" Analysis

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