Charakterisierung der Zusammensetzung der molekulare Motoren auf Umzug Axonal Fracht Mit "Fracht Mapping" Analysis

Das übergeordnete Ziel der Ladungskartierung ist es, die relative Menge und Art der molekularen Motorproteine zu bestimmen, die mit vesikulären Frachten assoziiert sind und diese Bewegung bewegen, und diese Zusammensetzung der Motoren mit der Richtungsbewegung der lebenden Fracht zu korrelieren. Dies wird erreicht, indem zunächst primäre Hippocampus-Neuronen der Maus in mikrofluidischen Geräten gezüchtet werden, so dass Axone relativ gerade wachsen, und indem die intrazelluläre Live-Bewegung von fluoreszenzmarkierten Frachtproteinen in den Axonen von transient transfizierten Neuronen aufgezeichnet wird. Der zweite Schritt besteht darin, Neuronen im Zuge der Live-Cargo-Bildgebung zu fixieren und anschließend die Axone mit Antikörpern gegen molekulare Motorproteine wie Kinesin und Dins zu färben, gefolgt von einer Immunfluoreszenzmikroskopie.

Als nächstes werden die Bilder der festen Ladung und des Motors mit den Plots der Frachtbewegung über die Zeit, auch Kräfte genannt, ausgerichtet, um die Bewegung der lebenden Ladung mit den gefärbten zugehörigen Motoren zu korrelieren, wie sie durch die Immunfluoreszenzfärbung bestimmt werden. Der letzte Schritt besteht darin, die Positionen der Subpixel von Fracht- und Motorproteinen mit Hilfe eines eigens entwickelten MATLAB-Softwarepakets namens motorische Kolokalisation zu bestimmen. Diese Software liefert die genauen XY-Koordinaten jeder Fracht- und Motorposition sowie die relative Menge der Fluoreszenzintensitäten, die mit Ladungen und Motoren verbunden sind.

Letztendlich liefert die Korrelation der Fluoreszenzmikroskopie von lebenden und festen Ladungen und Motoren auf dem Niveau der Subpixelauflösung Informationen über die Arten von Motoren, die mit bestimmten Ladungen verbunden sind, für die die Bewegungsrichtung bekannt ist. Diese Methode gibt also Einblick in den Mechanismus des Exon-Transports. Es kann auf andere Studien angewendet werden, die die Lebensmikroskopie mit der Immunfluoreszenzfärbung korrelieren, wie z. B. die Assoziation von Proteinen mit Mikrotubialen während der Mikrot-Eileiterdynamik oder die Rekrutierung von Proteinen während der Endozytose.

visuelle Demonstration dieser Methode hilft bei der Durchführung der bildgebenden Fixierungs- und Analyseschritte, die sonst möglicherweise schwer zu erlernen wären, da sie eine spezielle Einrichtung erfordern. Die primären Neuronen des Hippocampus der Maus für dieses Verfahren werden wie im Protokolltext beschrieben vorbereitet und im neurobasalen Eiwachstum resuspendiert. Medium, um die Neuronen in dem mikrofluidischen Gerät zu plattieren.

Entfernen Sie das Medium aus dem mikrofluidischen Reservoir eins und einer Prime. Geben Sie 20 Mikroliter Zellen auf das mikrofluidische Reservoir eins und lassen Sie sie durchströmen. Stellen Sie das Gerät für 20 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5% CO2.

Schauen Sie unter das Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen an dem abgedeckten Glas haften. Fügen Sie Neurobasal hinzu, ein Wachstumsmedium, um alle Reservoirs aufzufüllen. Legen Sie das Gerät mit den Zellen bis zum neunten Tag wieder in den Inkubator.

In Kultur verlängern die Neuronen Axone durch die Mikrokanäle und sind bereit für die Transfektion für die Expression fluoreszierender Proteine. Die Live-Bildgebung der transfizierten primären Hippocampus-Neuronen der Maus erfolgt an einem inversen Epi-Fluoreszenzlichtmikroskop, das mit einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator und einer CO2-Kontrollkammer ausgestattet ist. Um diesen Vorgang zu starten, wählen Sie das 100-fach-Ölobjektiv aus.

Tragen Sie Öl auf das Objektiv auf und montieren Sie das Deckglas mit den in einem mikrofluidischen Gerät gezüchteten Hippocampus-Neuronen auf den Mikroskoptisch. Um den neuronalen Tod zu vermeiden, sollten Sie die Proben zügig nicht länger als eine Stunde am Mikroskop aufbewahren. Finde Axone von transfizierten Zellen, die sich durch die Kanäle der mikrofluidischen Kammer erstrecken.

Notieren Sie die Anzahl der Kanäle, in denen das transfizierte Axon gefunden wurde. Zählen Sie die Anzahl der Kanäle mit einem Handzählzähler für eine optimale Aufzeichnung von Live-Bewegungen und eine anschließende Kolokalisierungsanalyse. Wählen Sie Axone, die relativ flach durch die Kanäle wachsen, damit die Bildgebung der meisten Vesikel scharf durchgeführt werden kann.

Zur Erleichterung des anschließenden Ausrichtens von fixierten Bildern mit Bewegungstrajektorien auf dem chm-Transplantat. Richten Sie den rechten Rand der Mikrokanäle während der Bildgebung am Sichtfeld aus. Um die Zellen während der Live-Bildgebung erfolgreich zu fixieren, wird der Eingriff am besten mit zwei Personen durchgeführt, einer Person, die das Fixiermittel hinzufügt, und einer weiteren Person, die den Fokus einstellt.

Es ist auch wichtig, alle Reagenzien griffbereit und griffbereit zu haben. Mit einer Ein-Milliliter-Transferpipette aus Kunststoff. Entfernen Sie den größten Teil des Mediums aus den Reservoirs zwei und zwei Prime Start Imaging Live-Frachtbewegungen mit Zeitrafferspezifikationen, die speziell auf die Transportdynamik der zu analysierenden Fracht zugeschnitten sind.

Nachdem ausreichend Live-Bewegungsdaten gesammelt wurden, lassen Sie eine Person die Reservoirs zwei auffüllen und zwei mit dem vorwärmten Fixiermittel befüllen. Vermeiden Sie es, das mikrofluidische Gerät zu berühren, da dies den Fokus der Live-Bildgebung stört. Lassen Sie die andere Person den Fokus anpassen, während das Fixativ hinzugefügt wird.

Auf die gleiche Weise ist das Auffüllen der Reservoire eins und eine Grundierung mit dem Fixiermittel erfolgreich, wenn eine sofortige Beendigung der Bewegung beobachtet wird. Anschließend werden die fixierten Neuronen mit Antikörpern gegen endogene Motorproteine angefärbt und wie im Protokolltext beschrieben abgebildet. Um mit der Ladungskartierung zu beginnen, erstellen Sie mit Hilfe einer Bildanalysesoftware ein Chromogramm der Ladungsbewegung.

Das von Rich Dorf Insights entwickelte Image J-Plugin wird für die Erzeugung von Kraft unter Verwendung kommerziell verfügbarer Grafiksoftware empfohlen, die das Immunfluoreszenzbild der Fracht manuell an dem CHM-Diagramm der Frachtbewegung ausrichtet und die Frachtpunkte mit der Position der Trajektorien im CHM-Graphen am Fixierungspunkt überlagert, so dass jede Frachtpunktzahl einer spezifischen Trajektorie auf dem CHM-Diagramm entspricht. Die besten Ausrichtungsergebnisse erzielen Sie, wenn Sie das Z-Slice verwenden, das für die gemappte Ladung am besten fokussiert ist. Für jedes Bild im Z-Stapel können mehrere Z-Slices verwendet werden.

Bestimmen Sie die XY-Koordinaten und Intensitätsamplituden für jeden Fluoreszenzpunkt mit einem etablierten Algorithmus, um 2D-Gauß an die Punktspreizungsfunktion anzupassen, die die Punktquellen in jedem der drei Kanäle darstellt. Um die XY-Koordinaten zu erhalten, wurde ein speziell angefertigtes MATLAB-Softwarepaket namens Motor Colocalization entwickelt, das einen von Yakima DONA und Kollegen entwickelten Gaußschen Anpassungsalgorithmus für jedes der einzelnen Frachtpunkte enthält, die auf die mobilen oder stationären Trajektorien abgebildet wurden. Wählen Sie im Kog-Diagramm die XY-Koordinaten und Intensitätsamplituden aus den Ergebnissen des Motorkolokalisierungsprogramms aus.

Verwenden Sie mehrere Zack-Bilder, um mehr Ladungen zu kartieren, die sich in verschiedenen Fokusebenen befinden. Vergleichen Sie die einzelnen XY-Koordinaten für die zugeordnete Fracht mit denen, die für jeden der Motorkanäle in der entsprechenden Z-Schicht erhalten wurden. Bestimmen und wählen Sie die XY-Motorkoordinaten aus, die innerhalb eines Radius von 300 Nanometern um die Ladung für Ladungen und Motoren liegen, die innerhalb derselben Fokusebene signalisiert haben.

Verwenden Sie das Softwarepaket für die Motorkolokalisierung, um die Punkte zu bestimmen, die sich innerhalb des 300-Nanometer-Radius befinden. Die Cargo-Kartierung wurde verwendet, um den Transport von Vesikel, die normales Prionenprotein tragen, das mit gelb fluoreszierendem Protein oder Y-F-P-P-R-P-C markiert ist, mit relativen Mengen an Kinesin und Dine-Motoren in Axonen zu korrelieren. Dieses Diagramm zeigt die Vesikelbewegung von F-P-P-R-P-C und die gestrichelte Linie zeigt den Zeitpunkt der Fixierung während der Live-Bildgebung.

Fluoreszenzbilder von fixierten Y-F-P-P-R-P-C-Vesikeln sowie die entsprechenden Immunfluoreszenzbilder der Kinesin-Leichtkette eins und dine sind mit dem Chromographen ausgerichtet. Diese Vergrößerung zeigt immunfluoreszierende Signale jedes der drei Kanäle mit 2D-gian-Funktionszuweisungen. Dieses Diagramm stellt die Quantifizierung der Kolokalisation zwischen Y-F-P-P-R-P-C-Vesikel, Kinesin-Leichtkette eins und dine in Wildtyp-Neuronen und in Neuronen ohne KINESIN-Schwerkette dar.

Die relative Menge an Kinesin-Leichtketten, eins und dine, die mit Y-F-P-P-R-P-C-Vesikeln assoziiert sind, wird aus den Gaußschen Amplituden abgeleitet und aufgetragen, um mögliche Korrelationen zwischen den relativen motorischen Mengen und der Bewegungsrichtung zu untersuchen. Dieses Beispiel von Wildtyp-Neuronen zeigt, dass Y-F-P-P-R-P-C-Vesikel, die sich bewegen oder stationär sind, entweder mit KINESIN Light Chain One oder Dine oder mit beiden assoziieren. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden. Zusätzlich zu den etwa 10 Tagen der Vorbereitung der Bildgebung vor der EM der Mikrofillic-Geräte und des primären Neurons können Sie innerhalb von drei Tagen Live-Bildgebungsbilder von Immunfluoreszenzfärbungen und Datenanalysen durchführen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Live-Bewegungen von fluoreszenzmarkierten Ladungen und Neuronen aufzeichnet, die in mikrofluidischen Geräten gezüchtet wurden. Wie man C-Zellen während der Bildgebung fixiert, wie man die Kolokalisation als Subpixelauflösung analysiert und wie man die Kolokalisation von A-Ladungen und molekularen Motorproteinen mit der Frachtbewegung korreliert.