Die stereotaktische Operation bei Nagetieren

Die stereotaktische Operation ist eine mächtige Technik, die verwendet wird, um das Gehirn in lebenden Tieren zu manipulieren. Die Zielregionen tief im intakten Gehirn stellen ein einzigartiges Problem dar da in der Regel das chirurgische Ziel nicht visuell lokalisiert werden kann. Die Stereotaxie oder stereotaktische Operation wurde entwickelt, um einzelne Bereiche des Gehirns durch die Kenntnis der räumlichen Beziehungen zu sichtbaren Orientierungspunkten zu erreichen. Mit der Verwendung eines dreidimensionalen Koordinatensystems können die Instrumente auf bestimmte Stellen gezielt werden, um die Gehirnaktivität zu messen, eine Läsion zu erstellen oder um genetische Manipulationen durchzuführen. Dieses Video zeigt die Grundlagen der stereotaktischen Operation, wesentliche Schritte des Verfahrens und diskutiert verschiedene Anwendungen der Technik.

Bevor wir die Einzelheiten des Verfahrens besprechen, wollen wir die Grundlagen und Instrumente der Technik einsehen. Zu beginn, die Stereotaxie ist auf das Auffinden der Zielregion des Gehirns auf einer dreidimensionalen Achse angewiesen. Zu diesem Zweck wird ein stereotaktischer Atlas verwendet. Dieses Dokument ist eine 3D-Rekonstruktion des Gehirns, das von Serienschnitten des gefärbten Gehirns erstellt wurde.

In diesem Referenzrahmen werden die räumlichen Beziehungen unter Verwendung eines Sets von 3-Achsen wiedergegeben: Anterior-posterior, medial-lateral und dorsal-ventral. Um die Position einer Region von Interesse zu bestimmen, muss die entsprechende Gehirnregion im Atlas gefunden werden und das Gitter wird verwendet um die dazugehörige mediolaterale und dorsoventrale Koordinaten zu berechnen. Die Antero-posteriore Koordinate wird auf der Unter- oder Oberseite erhalten. Diese Koordinate wird mit den Orientierungspunkten der Schnittpunkte der Knochenplatten am Schädel die als Schädelnaht bekannt ist gemessen. Der bekannteste Orientierungspunkt, Bregma, ist als Schnittpunkt der sagittalen Schädelnaht mit der koronalen Schädelnaht festgelegt. Der als Lambda bekannte Punkt ist mehr posterior; dort schneidet die Sagittalnaht die Lambdanaht.

Für eine genaue Ausrichtung der berechneten Lage während der Operation wird ein Gerät verwendet bekannt als stereotaktischer Rahmen. Der Rahmen besteht aus dem Hauptrahmen, dem Mikromanipulator und dem Probenhalter, der an der Aufhängungsklammer befestigt ist. Die Schneidezahnschiene und die Ohrschiene stellen Kontakt mit dem Tier her, um den Kopf in einer festen Position zu halten. Der Mikromanipulator dient zur präzisen Bewegung der chirurgischen Sonden zu vorbestimmten Koordinaten innerhalb des Gehirns und ist mit einer verschiebbaren Vernierskala ausgestattet für die genaue Entfernungsmessung in alle drei Dimensionen.

Um die Vernierskala lesen zu können, wird zuerst die Position der 0-Linie, die in Bezug zu den Markierungen auf der rechten Seite der Skala sind, identifiziert. Diese Seite der Skala ist in 10-Millimeter-Schritten markiert, so dass 1 10 und 2 20 ist. Die Lage der Nullmarkierung zeigt hier, dass der Messwert zwischen 10 und 11 mm ist. Um die erste Zahl rechts nach dem Komma zu ermitteln, suchen wir die Linie auf der linken Skala, die sich am besten mit einer Markierung auf der rechten Seite einreiht. Nun verwenden wir die linke Skala, um den Wert dieser Markierung zu identifizieren, welcher in diesem Fall 9 ist, dass den Endwert 10,9 mm ergibt.

Da wir nun mit den Grundprinzipien der Stereotaxie vertraut sind, wollen wir überprüfen, wie der chirurgische Eingriff durchgeführt wird. Bevor der Operation wird die Kopfhaut eines betäubten Tieres rasiert und desinfiziert. Um das Tier an Ort und Stelle des stereotaktischen Rahmens zu halten, werden die Ohrschienen sanft in den Ohren platziert und die vorderen Zähne werden in die Schneidezahnschiene gelegt. Eine Augensalbe wird verwendet, um eine Hornhautaustrocknung während der Operation zu verhindern.

Um den Schädel freizulegen, wird ein kleiner Schnitt mit einem Skalpell gemacht. Die Muskeln werden sanft getrennt und die Oberfläche des Schädels wird gereinigt. Dann wird der Mikromanipulator benutzt, um eine Sonde zum Bregma zu senken und die dorsoventrale Koordinate werden notiert. Anschließend hebt man die Sonde an und wiederholt den Vorgang bei Lambda. Falls die Lambda-Messung weniger als 0,1 mm von der dorsoventralen Koordinate beim Bregma ist, wird der Schädel als Ebene betrachtet und man ist bereit fortzufahren. Wenn nicht, wird die Schneidezahnschiene angehoben oder abgesenkt und die Messungen werden wiederholt.

Da das Gehirn nun auf einer Ebene ist, gehen wir zu Bregma zurück und notieren die mediolaterale und anterioposteriore Koordinate. Basierend auf den Zielkoordinaten des Gehirnatlasses, werden die erforderlichen Bewegungen berechnet, um diese Seite zu erreichen und man verschiebt die Sonde an die Zielposition. Diese Position wird auf dem Schädel markiert und mit einem Bohrer wird vorsichtig ein Loch in den Knochen gemacht. Genau unter dem Schädel befindet sich die Dura, eine dicke beständige Membran, die sanft mit der Spitze einer kleinen Nadel durchschnitten werden kann.

Als nächstes wird der Mikromanipulatorarm in Position gebracht, um die Sonde gezielt zu der dorsoventralen Koordinate zu senken, an diesem Punkt kann dann die gewünschte Manipulation durchgeführt werden.

Da wir nun die Grundschritte des Verfahrens verstehen, werfen wir einen Blick auf einige der vielen Möglichkeiten wie die Neurowissenschaftler die stereotaktische Operation verwenden, um Fragen im Labor zu beantworten.

Zu beginn, die Stereotaxie ist äußerst nützlich für die Bereitstellung von experimentellen Wirkstoffen in präzise Gehirnregionen. Diese Wirkstoffe können Tracer Farbstoffe, um neuronale Projektionen und Konnektivität zu visualisieren, chemische Verbindungen oder Reagenzien für genetische Manipulation von Neuronen enthalten. Beispielsweise führt die Injektion von genetisch manipulierten Viren zu der Einführung eines Gens von Interesse in infizierte Zellen. Hier wurde ein Virus in den Hippocampus injiziert, was zu einer GFP-Expression in einer kleinen Population von Neuronen resultierte.

Andererseits kann die virale Zuführung von small interfering RNAs die Expression des gewünschten Proteins verhindern. In diesem Beispiel wurde die Expression des Proteins SOD1 in den lateralen Ventrikeln nach stereotaktischer Injektion in verschiedenen Gehirnregionen unterdrückt.

Alternativ kann die stereotaktische Operation verwendet werden, um Elektroden in das Gehirn zu platzieren für die Aufnahme der elektrischen Signale, die die neurale Aktivität begleiten. Nachdem sich das Tier von dem operativen Verfahren erholt hat, können die Elektroden mit elektrophysiologischen Aufzeichnungssystemen verbunden werden, um die neuronale Aktivität zu beobachten während sich die Maus frei bewegen kann.

Neben der Messung der neuronalen Aktivität, ist die stereotaktische Operation hilfreich für die Mikrodialyse. Diese Technik erlaubt die kontinuierliche Überwachung von Medikamenten, Neurotransmittern oder Metabolitenkonzentrationen im Gehirngewebe von wachen Tieren. Zu diesem Zweck wird eine kleine, mit Flüssigkeit gefüllte Sonde mit einer halbdurchlässigen Membran an der Spitze in eine spezifische Region des Gehirns implantiert. Kleine gelöste Stoffe einschließlich Neurotransmitter, Hormone und Medikamente diffundieren in die Sonde, in der sie für die Analyse gesammelt werden können. In diesem Experiment wurde die Glucose-Konzentration im Hippocampus als eine Anzeige für die lokale neuronale Aktivität gemessen während Ratten eine Aufgabe erledigen mussten das die Verwendung des räumlichen Arbeitsgedächtnisses erfordert.

Das war das JoVE Video zur stereotaktischen Operation. Dieses Video enthält die Grundlagen und Methoden des Verfahrens sowie die vielen Anwendungen in den neurowissenschaftlichen Laboren. Danke für das Aufpassen!