Herstellung von Mica Unterstützte Lipiddoppelschichten für Hochauflösende Optische Mikroskopie Imaging

Das hier vorgestellte Verfahren zeigt eine einfache Methode zur Herstellung von MICA-gestützten Lipiden durch Schichten, die für hochauflösende Bildgebung, wie z.B. Tur-Einzelmolekül-Tracking-Studien, geeignet sind. Die MICA-Oberfläche wird vorbereitet, indem ein Sandwich aus einer einzelnen MICA-Folie, die zwischen dem Glasobjektträger und dem Deckglas geklebt ist, mit optischem Klebstoff abgespalten wird, der eine flache und extrem dünne frische Glimmeroberfläche freilegt. Durch die Montage einer kleinen Kunststoffkammer aus einem eineinhalb Milliliter großen Fläschchenbecher kann das Volumen der Lipidvesikel, das für die Bildung von Doppelschichten benötigt wird, nur 30 Mikroliter betragen.

Nehmen Sie im ersten Schritt die mehrlagige Platte von MICA, wie sie vom Lieferanten stammt und schneiden Sie sie mit einer Schere in kleinere Stücke. Al Leaflet mit einer frischen Messerklinge in zwei oder drei dünnere Leaflets zerlegen. Reinigen Sie nun den Bezug schläft gründlich.

Dabei wird eine 0,17 Millimeter dicke Abdeckung platziert. Schläft in ein gläsernes Trainingsglas mit jeweils Deckel. Schlafen Sie in einem separaten Schlitz und beschallen Sie es 30 Minuten lang mit Waschmittel bei 60 Grad Celsius.

Waschen Sie den Bezug. Schlaft 10 bis 20 Mal mit Mini-Key-Wasser und föhnt es mit einem Luft- oder Stickstoffstrahl. Nehmen Sie einen Objektträger aus Mikroskopglas und reinigen Sie ihn mit Platz.

Ein kleiner Tropfen von etwa 15 Mikrolitern niedriger Viskosität liegt zuvor auf dem Mikroskopstrahl und dem Globus. Schneiden Sie die Packungsbeilage einige Minuten lang auf einen UV-Lichtkasten. Verwenden Sie Klebeband, um einige Schichten Glimmer abzuziehen.

Die ersten Schichten werden fragmentiert, also tun Sie es, bis Sie sehen, dass die Schichten mit dem Scotch verbunden sind. Das Klebeband ist gleichmäßig und vollständig. Decken Sie das Klebeband ab.

Geben Sie einen Tropfen hochviskosen optischen Klebstoffs auf die Micah-Oberfläche. Stellen Sie sicher, dass sich dort keine Luftblasen befinden. Legen Sie den sauberen Abdeckschlaf vorsichtig auf das anstößige Tröpfchen.

Klopfen Sie mit einer Pinzette vorsichtig auf das Glas, um das Glas zu verteilen. Auch hier härten Sie den Kleber einige Minuten lang mit UV-Licht aus. Mit einem Messer das Sandwich aus Glas teilen.

Schieben Sie MICA und decken Sie den Schlaf ab. In den meisten Fällen bleibt nur eine sehr dünne Schicht MICA auf dem Schlafbezug kleben. Verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um Ihre MICA-Oberfläche zu inspizieren, indem Sie mit der Spitze einer Nadel oder Pinzette kleine Kratzer machen.

Sie können leicht sagen, ob es sich bei der Oberfläche tatsächlich um Glimmer handelt, wo die Oberfläche gleichmäßig zerkratzt ist, wie hier oder auf dem optischen Klebstoff, wie hier, wo die Oberfläche glüht. Nehmen Sie einen Becher aus einem Eineinhalb-Milliliter-Glasfläschchen, entfernen Sie den Gascant und kleben Sie die Kappe mit Nagellack auf die MICA-Oberfläche. Lassen Sie es einige Minuten trocknen.

Jetzt können Sie hier eine Lipid-Doppelschicht herstellen, die Lipid für Schicht mit einem Standardprotokoll repariert. Ein 30-Mikroliter-Tropfen Lipidvesikel wird in die Kappenkammer des Fläschchens gegeben und 60 Minuten lang inkubiert, bevor der Puffer gewaschen wird. Nach dem Waschen ist die Probe bereit für die Bildgebung.

In diesem Fall wird es in einen speziell angefertigten Probenhalter eingebaut. Einzelne Moleküle können auf einer solchen präparierten MICA-Oberfläche leicht beobachtet werden. Hier vergleichen wir A-D-O-P-C nach Schicht, die auf Glas und Glimmer getragen wird.

Beachten Sie, dass sich die Art der Bewegung zwischen diesen beiden Oberflächen erheblich unterscheidet. Der Weg einzelner Moleküle, die in den rechten Panels farbig nachgezeichnet sind, zeigt deutlich, dass sich das Diffusionsverhalten auf MICA von dem auf Glas unterscheidet. Es gibt jedoch keinen signifikanten Unterschied in der Bildqualität.

Die durchschnittliche Webart der geraden Funktion bei halber maximaler Intensität für 20 Spots ist für beide Substrate nahezu gleich, was darauf hindeutet, dass die MICA-Oberfläche vollständig durch Licht durchdrungen werden kann, ohne dass es zu auffälligen optischen Aberrationen kommt. Insgesamt zeigt das Sicherheitsdatenblatt einen deutlichen Unterschied im Diffusionsverhalten. In jedem Fall können jedoch zwei Populationen von Partikeln beobachtet werden, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten diffundieren.

Zwei verschiedene Diffusionskoeffizienten, schnell und langsam, wurden aus der doppelten exponentiellen Einspeisung zur kumulativen Wahrscheinlichkeit der quadratischen Verschiebung extrahiert. Bei dieser DOPC-Doppelschicht sind beide Diffusionskomponenten auf der MICA-Oberfläche schneller, die sich langsam bewegenden Partikel auf MICA sind etwa 10 bis 20 Mal langsamer als die schnellen. Die langsame Besiedlung von Glas ist hier jedoch fast unbeweglich.

Wir haben gezeigt, dass die Art der Oberfläche einen Unterschied im Diffusionsverhalten von Lipiddoppelschichten machen kann. Daher muss man vorsichtig sein, wenn man die Ergebnisse zwischen Studien über Doppelschichten, die auf verschiedenen Substraten wie MICA getragen sind, und den Glas-Imaging-Doppelschichten auf MICA vergleicht, ist es in der Regel recht schwierig, da die Präparation kompliziert ist. Wir haben jedoch gezeigt, dass die Herstellung von Oberflächen von hoher Qualität einfach und dennoch effektiv ist.