Die Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie und einer Kundendatenbank zu den Bakterien Indigene auf eine einzigartige Höhle Umwelt (Kartchner Caverns, AZ, USA) Charakterisieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entwicklung, Anwendung und Demonstration eines detaillierten Verfahrens zur bibliotheksbasierten Bakterienidentifizierung mittels MALDI in der Massenspektrometrie. Dies wird erreicht, indem zunächst Massenspektren von Bakterien mit einem Maloff-Massenspektrometer erfasst werden. In dieser Studie werden Massenspektren von 15 Bakterien, die aus einer ätzenden Umgebung isoliert wurden, gesammelt: die resultierende Peakform, charakteristische Muster oder Fingerabdrücke der analysierten Bakterien.

Diese Massenspektren werden dann in eine Software importiert und eine Modelldatenbank erstellt. Anschließend werden die Referenzmassenspektren in der Modelldatenbank mittels Clusteranalyse, Peak-Matching und statistischer Analyse verarbeitet und analysiert. Schließlich werden Massenspektren von blind kodierten Bakterien, die zufällig aus diesen 15 Bakterien ausgewählt werden, erneut gesammelt und mit den Referenzspektren in der Modelldatenbank verglichen, um zu identifizieren, dass die Ergebnisse zeigen, dass Bakterien entweder anhand von Ähnlichkeitskoeffizienten oder potenziellen Biomarkern und Peakklassen korrekt identifiziert werden können.

Beginnen Sie diesen Vorgang mit der Abscheidung eines Mikroliters Proteinextrakts, der keine lebensfähigen Zellen enthält, auf eine Maldi-Zielplatte aus Edelstahl und lassen Sie ihn trocknen. Anschließend den getrockneten Proteinextrakt mit einem Mikroliter Matrixlösung überziehen und trocknen lassen. Nach dem Trocknen wird dann ein Mikroliter CBR-Standard auf die Zielplatte aufgetragen, der CBR mit einem Mikroliter Matrixlösung überlagert und trocknen gelassen.

Zum Schluss geben Sie zwei Mikroliter Matrixlösung als Negativkontrolle auf die Zielplatte. Verwenden Sie das Multi- bis Massenspektrometer, das mit dem Stickstofflaser ausgestattet ist und mit der Steuerungssoftware Bruker flex bedient wird. Erfassen Sie jedes Massenspektrum im positiven linearen Modus durch Akkumulation von 500 Laserschüssen in 100-Schuss-Schritten.

Stellen Sie die Ionenquelle um eine Spannung auf 20, die Kilovolt auf die Ionenquelle, zwei Spannungen auf 18,15 Kilovolt und die Linsenspannung auf 9,05 Kilovolt ein. Diese Parameter sind gerätespezifisch und müssen möglicherweise optimiert werden. Stellen Sie den Masse-Ladungs-Bereich für die automatische Spektrumauswertung von zwei bis 20 Kilodalton pro Ladung ein.

Legen Sie dann den minimalen Auflösungsschwellenwert auf 100 fest. Wählen Sie den OID-Peak-Erkennungsalgorithmus aus. Legen Sie den Schwellenwert für das Signal-Rausch-Verhältnis auf zwei und den minimalen Intensitätsschwellenwert auf 100 fest.

Legen Sie abschließend die Spitzenakkumulation für den Datenbankentwurf auf 500 fest. Erstellen Sie eine neue Datenbank in Bio Numerics 7.1 mit dem Assistenten für neue Datenbanken. Erstellen Sie dann einen Spektrum-Experimenttyp wie maldi, indem Sie die Befehle im Bereich "Experimenttypen" verwenden.

Erstellen Sie als Nächstes die Ebenen mit dem Datenbankdesign-Panel, navigieren Sie zum Datenbankmenü und fügen Sie neue Ebenen hinzu, indem Sie den Befehl "Ebene neue Ebene hinzufügen" verwenden. Erstellen Sie die Ebene der Spezies, der biologischen Replikationsebene und der technischen Ebene. Um die Rohmassenspektren zu importieren.

Exportieren Sie zunächst die rohen Massenspektren als Textdateien mit der Flex-Analyse, indem Sie im Dateimenü navigieren und auf den Befehl Massenspektrum exportieren klicken. Importieren Sie dann die Rohmassenspektren in die Datenbank auf der Ebene der technischen Replikate. Verarbeiten Sie die Rohmassenspektren durch Importieren und Resampling mit einem quadratischen Anpassungsalgorithmus.

Führen Sie dann eine Grundliniensubtraktion mit einer Rollscheibe mit einer Größe von 50 Punkten durch. Berechnen Sie das Rauschen mit der kontinuierlichen Wavelet-Transformation (CWT). Glätten Sie die Spektren mit einem Kaiser-Fenster mit einer Fenstergröße von 20 Punkten und einem Beta von 10 Punkten. Führen Sie dann eine zweite Grundliniensubtraktion mit einer Rollscheibe mit einer Größe von 200 Punkten durch.

Erkennen Sie schließlich die Peaks mit dem CWT mit einem minimalen Signal-Rausch-Verhältnis von 10 nach Vorverarbeitung sicherer charakteristischer Muster jedes Massenspektrums, wie z. B. Peaklisten, die Peakgrößen, Peakintensitäten und Signal-Rausch-Verhältnis enthalten. Erstellen Sie anschließend zusammengesetzte Massenspektren aus vorverarbeiteten Spektren mit dem Befehl summarized im Analysemenü. Wählen Sie biologisches Replikat als Zielstufe. Hier.

Kombinieren Sie Massenspektren von 10 technischen Replikaten derselben Kolonie, um ein zusammengesetztes Massenspektrum für diese Kolonie zu erhalten, was zu drei zusammengesetzten Massenspektren für dieses Isolat auf biologischer Replikatebene führt. Fassen Sie abschließend die drei zusammengesetzten Spektren zusammen, um ein zusammengesetztes Spektrum für dieses Isolat auf Speziesebene zu erstellen. Um eine auf Ähnlichkeit basierende Cluster-Analyse und mehrdimensionale Skalierung durchzuführen, erstellen Sie Gruppen mit Farben.

Wählen Sie zunächst die drei biologischen Komposit-Massenspektren aus und klicken Sie im Menü der Gruppe auf den Befehl Neue Gruppe aus Auswahl erstellen, um eine Gruppe für das entsprechende Isolat zu erstellen. Entwerfen Sie dann eine Farbe, die automatisch für diese drei Massenspektren verwendet wird. Führen Sie eine Cluster-Analyse durch, indem Sie im Menü "Clustering" navigieren und auf den Befehl "Cluster-Analyse berechnen" klicken.

Wählen Sie in den Vergleichseinstellungen auf Seite eins die Pearson-Korrelation aus, und behalten Sie die anderen Parameter als Standard bei. Wählen Sie auf Seite zwei die Methode der ungewichteten Paargruppe mit arithmetischem Mittel aus. Klicken Sie dann auf Fertig stellen.

Rufen Sie ein multidimensionales Skalierungsdiagramm mit dem Befehl "Multidimensionale Skalierung" im Statistikmenü ab, um den Peakabgleich durchzuführen. Klicken Sie auf den Spektraltyp maldi im Experimente-Fenster. Wählen Sie dann Layout aus.

Bild anzeigen, es werden einzelne Peaks der Spektren angezeigt. Führen Sie dann den Peak-Abgleich mit dem Befehl do peak matching im Spektrenmenü durch, um Peak-Klassen zu identifizieren. Führen Sie ein bidirektionales Clustering durch, indem Sie auf Statistikmatrix klicken. Bergbau. Die Intensität der Peaks, die den Peakklassen zugeordnet sind, wird als Heatmap dargestellt, um Bakterien mit der auf dem Ähnlichkeitskoeffizienten basierenden Methode zu identifizieren, einen Vergleich zu erstellen und ein Rogramm auf der Grundlage von Massenspektren auf der technischen Replikationsebene zu generieren, wie es für die Clusteranalyse durchgeführt wird, speichern Sie das Rogram für den Vergleich der Ähnlichkeit.

Wählen Sie ein unbekanntes Massenspektrum aus, und klicken Sie auf die Analyse. Identifizieren Sie ausgewählte Einträge. Das Dialogfeld zur Identifizierung wird angezeigt.

Wählen Sie den vergleichsbasierten Klassifizierungstyp aus, und klicken Sie auf Weiter. Wählen Sie auf der nächsten Seite das gespeicherte Gramm als Referenzvergleich aus, und klicken Sie dann auf Weiter. Wählen Sie die grundlegende Ähnlichkeit als Identifikationsmethode und klicken Sie erneut auf Weiter, um die maximale Ähnlichkeit als Bewertungsmethode auszuwählen.

Geben Sie für jeden Parameter die entsprechenden Schwellenwerte und die Werte für die minimale Differenz ein, und klicken Sie dann auf Weiter. Sobald die Berechnungen abgeschlossen sind, wird das Identifikationsfenster im Ergebnisbereich angezeigt. Die Mitglieder der Datenbank, die am besten mit dem Unbekannten übereinstimmen, werden aufgelistet.

Ein Rogramm, das auf einer Clustering-Analyse basiert, zeigt eine Ähnlichkeit zwischen den einzelnen Isolaten in der Datenbank. Der Datensatz enthält Spektren von 15 verschiedenen Spezies mit drei zusammengesetzten Spektren für jede Spezies. Die bidirektionale Clusteranalyse kann Forschern helfen, potenzielle Biomarker für eine Art oder Stämme innerhalb einer Art zu identifizieren.

Hier wird die Spitzenintensität durch Farben dargestellt, wobei Grün für niedrige Intensität und Rot für hohe Intensität steht. Basierend auf dieser Analyse kann schließlich das Massenspektrum einer Unbekannten mit dem Gramm verglichen und eine auf Ähnlichkeitskoeffizienten basierende Identifizierung erreicht werden.