Name: Optogenetische Stimulation des Hörnervs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Erfahren Sie die optogenetische Stimulation des Hörnervs in Mäusen mit blauen Mikro-LEDs oder Lasern. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle neuronaler Aktivität und verbessert die Frequenzauflösung für Hörforschung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung (Bernstein Fokus Neurotechnologie für 01GQ0810 gewähren, T. Moser, und MED-EL Deutschland) unterstützt; die Deutsche Forschungsgemeinschaft im Rahmen des Zentrums für Nanoscale Mikroskopie und Molekularphysiologie des Gehirns (FZT 103, T. Moser) und durch den SFB889, N. und T. Strenzke Moser).

Alle Versuche in dieser Arbeit vorgestellt wurden mit den ethischen Standards, die von der deutschen Gesetz zum Schutz von Versuchstieren durchgeführt definiert. Die Universität Göttingen Board für den Tierschutz und die Tierschutzstelle des Landes Niedersachsen hat den Experimenten. 1. Herstellung der μLED-Stimulator <ol><li> Für μLEDs zuerst die μLED-Stimulator vorzubereiten. Verwenden blauen LEDs mit 200 von 200 um aktive Oberfläche (μLED, siehe Materialien Tabelle). </li><li> Solder Drähte an der μLED. Dann kapseln die μLED und die Verbindungen mit Epoxid-Kleber. Lassen Sie das Gerät über Nacht, um die Epoxyhärtung lassen. </li><li> Für die mechanische Stabilität und die elektrische Isolierung der Drähte Trichter durch einen dünnen Glaskapillare Verwenden von 1 mm Außendurchmesser Borosilikatglas Kapillaren und Abdichtung der Verbindung mit Epoxy (1D), so daß die Kapillare an einem mechanischen Manipulator montiert werden. HINWEIS: Thier ist ein Trade-off der Herstellung der Kapsel dick genug, um einen guten elektrischen Isolierung (Vermeidung von Artefakten Stimulation) zu bekommen, aber dünn genug, um die LED frei bewegen innerhalb der Bulla und um es auf den Cochleostomie finden. Es ist eine gute Praxis, mehr als eine LED vorzubereiten. </li><li> Um eine gute elektrische Isolierung zu bestätigen, zunächst eine Petrischale mit 0,9% NaCl und Dip 3 blanken Kupferdrähten endete in die Flüssigkeit herzustellen. Dies dient dazu, ein Tier mit ABR Elektroden simulieren. Schließen Sie die Drähte an die ABR-Verstärker und von dort auf einem Oszilloskop. </li><li> Verbinden Sie dann das LED an den Stimulator und tauchen sie in die Lösung, bis es völlig bedeckt ist. Fahren Sie die LED mit Pulse (siehe Schritt 3.1.1) bei der maximal zulässige Strom für mehr als 20 min und kontrollieren Stimulation Artefakte. Wenn sie erscheinen, werfen Sie die LED und versuchen eine neue. </li></ol> 2. Operationsverfahren <ol><li> Verwenden Sie 4-10 Wochen alten transgenen Mäusen, die unter der ChR2 Thy1.2 Promotor (Linie 9in Wang et al. 13). , Um das Tier zu manipulieren und führen Sie die Operation, verwenden Sie immer sauber und gut identifizierten chirurgische Instrumente. </li><li> Betäuben Tiere mit einer ip Injektion einer Mischung von Urethan (1,32 mg / kg), Xylazin (5 mg / kg) und Buprenorphin 0,1 ug / g verdünnt in 0,9% steriler Kochsalzlösung und die Maus auf eine Heizplatte für die Aufrechterhaltung der Körper Temperatur bei 37 ° C aufweist. Mit dieser Dosis Anästhesie dauert typischerweise die gesamte Versuchsprotokoll. <ol><li> Ab 10 Minuten nach der ersten Narkose auf Anzeichen der Erregung durch das Zurückziehen der Pfote Reflex. Im Fall von Bewegungen anzuwenden Erhaltungsdosen von Urethan (0,66 mg / kg) und Buprenorphin (0,05 ug / g) in 0,9% steriler Kochsalzlösung verdünnt (ohne Xylazin). Wieder überprüfen Sie die Pfotenrückzugsreflex und gehen nur dann, wenn der Reflex fehlt. </li></ol></li><li> Die retroaurikulär sorgfältig rasieren in Vorbereitung des Einschnitts. Verwenden Sie ein retroaurikulärennähern, um die Bulla (lufthaltige Paukenhöhle) zu erreichen. <ol><li> Mit einer Mikropinzette sorgfältig sezieren und / oder zu entfernen Teil der Nackenmuskulatur, zB Platysma, sternocleidomastoideus und Skalenusmuskeln. </li><li> Finden und setzen die Bulla (Abbildung 1A). Identifizieren Sie die Bulla als knöcherne Struktur mit einer charakteristischen Kugelform mit einem Ring an der Bulla Oberfläche, die das Einführen des Trommelfells (Abbildung 1A) zeigt. Machen Sie ein Loch mit der Spitze eines Insulin-Nadel direkt unter diesem Ring. Starten Sie dort, entfernen Sie die Knochen, die die Bulla mit einem feinen Rongeur (gnawer) oder Mikropinzetten in einer Weise, dass die promontorium der Cochlea ausgesetzt ist (Abbildung 1B) abdeckt. </li></ol></li><li> Für die Cochleostomie, sanft abrasieren die knöcherne Kapsel ein kleines Fenster öffnen (Cochleostomie: ~ 500-800 um), kümmert sich um die häutige Labyrinth (Abbildung 1B) intakt zu lassen. Führen Sie die Cochleostomie auf der zweiten Cochlea-drehen, wie es ist weit genug von der Steigbügelarterie und von der Spitze. Öffnen der Spitze konnte Bruch der Cochlea mit einer Fraktur des modiolus produzieren. </li><li> Für ein rundes Fenster Einführen einer optischen Faser oder μLED-Implantat Paukentreppe, sorgfältig vergrößern die runde Fensternische durch Kratzen der knöchernen Nische mit der Spitze eines scharfen Skalpell (a Schaufelzahl 11 ist eine gute Option). Verwenden Sie immer eine neue Klinge oder Skalpell. Seien Sie sehr vorsichtig, da die Steigbügel Arterie verläuft ganz in der Nähe des runden Fensters (Abbildung 1B). </li></ol> 3. Optische Stimulation mit zwei Ansätze <ol><li> Für transcochlear Stimulation, Nutzung μLEDs oder einer fasergekoppelten Laser. <ol><li> Montieren Sie die Kapillare Tragen des μLED auf einem mechanischen Manipulator und sorgfältig positionieren Sie den μLED auf die Cochleostomie. Verwendung oABR von 3-10 ms lang Stimulation von einer Stromquelle (typischerweise 5-40 mA bei 2,7 V) bei 1-5 Hz hervorgerufen, als ein Mittel, um die Position und oder zu optimierenientation der μLED. </li><li> Für Laserstimulation, verwenden Sie eine 473 nm Dauerstrichlaser und eine optische Faser 250 um (siehe Materialien). Paar die optische Faser zu einem blauen Laserquelle, die im Idealfall bietet schnelle analoge Steuerung der Leistung (aber mit einer akustisch-optischen Gerät oder eine kurze Verschluss, um den optischen Reiz zu definieren). Mit einem Mikromanipulator, suchen Sie die Spitze der Faser direkt auf die Cochleostomie und fixieren Sie sie mit Zahnzement (transcochlear Stimulation). </li></ol></li><li> Für intracochleären Stimulation, legen Sie die Faser durch das runde Fenster in die Scala tympani. Dann nutzen Sie 3-10 ms Laserpulse von 10-30 mW (Macht der Faserausgang) bei 1-5 Hz bis oABR zu entlocken. Die große Amplitude oABR ermöglicht dem Experimentator oABR durch einzelne Impulse auf dem Oszilloskop evozierten zur Optimierung der Position und Ausrichtung des Emitters (μLED oder Faser) mit oABR Amplitude als Auslese beobachten. </li><li> Nach gut oABR erreicht wurden, fixieren Sie die Faser mit cyanoacrcarboxylat Leim oder Zahnzement und warten, bis der Kleber fest ist. HINWEIS: Es ist normal, etwas Flüssigkeit aus der Cochlea herauskommen beobachten. Jedoch zu Problemen bei der Polymerisation des Zements zu vermeiden, empfiehlt es sich, den Bereich mit feinen Dochte austrocknen. </li></ol> 4. Aufnahmen von oABR <ol><li> Legen Nadelelektroden unter der Ohrmuschel, auf dem Scheitel und auf der Rückseite in der Nähe der Beine und schließen diese an den Verstärker. </li><li> Verstärken den Unterschied Potential zwischen Scheitel und des Warzenfortsatzes Subdermalnadeln. Probe bei einer Rate von 50 kHz und der Filter (1-10.000 Hz). Visualisieren Sie die Potentialdifferenz auf einem Oszilloskop ideal in der Nähe der Aufnahmeeinstellungen für die Optimierung der Position des optischen Stimulator. Verwenden Sie die Signalmittelung (50-1,000x) und die Daten auf einem Computer für die Offline-Analyse. </li></ol> 5. Aufnahmen von optisch evozierte Lokale Feldpotentiale <ol><li> Legen Sie das Tier in einen stereotaktischen Rahmen. Mit einer Pinzette CentRallye ziehen Sie die Haut über den Schädel und führen Sie einen Medianschnitt mit einer Schere, die sich von etwa zwischen den Augen bis zu dem Punkt, wo die Nackenmuskulatur zu befestigen, um den Schädel. <ol><li> Spiegeln die Haut seitlich. Schneiden Sie die Knochenhaut der Länge nach entlang der Pfeilnaht und entfernen Sie sie seitwärts durch sanftes Reiben der freiliegenden Schädelknochen mit einem Wattestäbchen. </li></ol></li><li> Positionieren Sie eine maßgeschneiderte Metallplatte auf den freiliegenden Schädel ca. 1 mm Platz zwischen dem Schwanzende der Platte und Lambda verlassen. Mit einem 0,7 mm Durchmesser bohren sorgfältig bohren ein Loch in den Scheitelbein. </li><li> Sanft Schraube in einem Schneckendurchmesser von 0,85 mm - als Referenz für Potenziale aus dem Colliculus inferior aufgezeichnet dienen (IC) - Halten Sie die Schraube mit einer Zange so lange wie die Schraube nicht sicher befestigt sind. Stellen Sie sicher, einen guten Kontakt zwischen Schraube und Dura ohne ins Gehirn eindringen. Kleben Sie die Schraube und die Metallplatte auf den Schädel mit Sekundenkleber. </li><li> Lösen Sie die neck Muskeln vorsichtig aus dem Schädel. Ziehen Sie die Nackenmuskulatur kaudal für circa 1-2 mm. Identifizieren Sie den Schnittpunkt der Sinus sagittalis superior (SSS) und der Quer Sinus (TS). Falls erforderlich, die Transparenz des Schädels durch Befeuchten des Knochens mit physiologischer NaCl-Lösung. <ol><li> Identifizieren Sie die IC in Mäusen als direkt kaudal der SSS und TS Schnittpunkt liegt. Nach der Identifizierung der Lage der IC langsam und vorsichtig durchführen Trepanation verlauf ca. 0,5 mm bis 1,5 mm rostral nach caudal zum TS und etwa 3 mm seitlich. </li><li> Vermeiden Sie Verletzungen des SSS und TS da diese eine erfolgreiche Experiment nicht entgegen. Hier testen, ob das Knochen trepanned hat sich gelöst von sanft eingedrückt wird. Mit einer Pinzette heben langsam vom Knochen. </li></ol></li><li> Mit einem entsprechenden Adapter befestigen einer Mehrkanal-Array und heads auf einem Mikromanipulator. Um die Zerstörung der Mehrkanal-Aufnahme-Array beim Einführen in die IC zu verhindern, entfernen Sie vorsichtig die Duramit einem gebogenen Spitze einer kleinen Injektionsnadel ab der Nähe einer Knochenrand. <ol><li> Entfernen Sie das Tier aus der stereotaktischen Rahmen. Befestigen Sie die Metallplatte in eine Bar, um stereotaktische Fixierung bleiben. Positionieren Sie den Aufnahme-Sonde über die IC und setzen Sie sie unter mikroskopischer Kontrolle, so dass der oberste Kanal ist nur an der Oberfläche sichtbar. </li></ol></li><li> Verstärken der Potentialdifferenz zwischen den einzelnen Kanälen des Aufzeichnungsanordnung und der Referenzschraube im Scheitelbein, Probe mit einer Rate von 32 kHz Tiefpassfilter (300 Hz) und Speicher auf einem Computer für die Offline-Analyse. </li><li> Alle Tiere sollten artgerecht am Ende des Verfahrens vor dem Aufwachraum in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien Euthanasie eingeschläfert werden. Geeignete Methoden der Euthanasie kann Genickbruch oder CO 2 Inhalation umfassen. </li></ol>

<ol><li>Rubinstein, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paediatric+cochlear+implantation%3A+prosthetic+hearing+and+language+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Paediatric cochlear implantation: prosthetic hearing and language development.</a> Lancet. 360 (9331), 483-485 (2002).</li>
<li>Middlebrooks, J. C., Bierer, J. A., Snyder, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+implants%3A+the+view+from+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cochlear implants: the view from the brain.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (4), 488-493 (2005).</li>
<li>Clark, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiple-channel+cochlear+implant%3A+the+interface+between+sound+and+the+central+nervous+system+for+hearing%2C+speech%2C+and+language+in+deaf+people-a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+sciences%22%5BJournal%5D)">The multiple-channel cochlear implant: the interface between sound and the central nervous system for hearing, speech, and language in deaf people-a personal perspective.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1469), 791-810 (2006).</li>
<li>Zeng, F. G., Rebscher, S., Harrison, W., Sun, X., Feng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+implants%3A+system+design%2C+integration%2C+and+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+reviews+in+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Cochlear implants: system design, integration, and evaluation.</a> IEEE reviews in biomedical engineering. 1, 115-142 (2008).</li>
<li>Wilson, B. S., Dorman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+implants%3A+a+remarkable+past+and+a+brilliant+future%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Cochlear implants: a remarkable past and a brilliant future.</a> Hearing research. 242 (1-2), 3-21 (2008).</li>
<li>Moore, D. R., Shannon, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+cochlear+implants%3A+awakening+the+deafened+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Beyond cochlear implants: awakening the deafened brain.</a> Nature neuroscience. 12 (6), 686-691 (2009).</li>
<li>Shannon, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+electrical+stimulation+of+the+auditory+nerve+in+man.+II.+Channel+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Multichannel electrical stimulation of the auditory nerve in man. II. Channel interaction.</a> Hearing research. 12 (1), 1-16 (1983).</li>
<li>Fishman, K. E., Shannon, R. V., Slattery, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+recognition+as+a+function+of+the+number+of+electrodes+used+in+the+SPEAK+cochlear+implant+speech+processor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+speech%2C+language%2C+and+hearing+research%3A+JSLHR%22%5BJournal%5D)">Speech recognition as a function of the number of electrodes used in the SPEAK cochlear implant speech processor.</a> Journal of speech, language, and hearing research: JSLHR. 40 (5), 1201-1215 (1997).</li>
<li>Kral, A., Hartmann, R., Mortazavi, D., Klinke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+resolution+of+cochlear+implants%3A+the+electrical+field+and+excitation+of+auditory+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Spatial resolution of cochlear implants: the electrical field and excitation of auditory afferents.</a> Hearing research. 121 (1-2), 11-28 (1998).</li>
<li>Izzo, A. D., Suh, E., Pathria, J., Walsh, J. T., Whitlon, D. S., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectivity+of+neural+stimulation+in+the+auditory+system%3A+a+comparison+of+optic+and+electric+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical%22%5BJournal%5D)">Selectivity of neural stimulation in the auditory system: a comparison of optic and electric stimuli.</a> Journal of biomedical. 12 (2), 021008(2007).</li>
<li>Richter, C. P., Rajguru, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spread+of+cochlear+excitation+during+stimulation+with+pulsed+infrared+radiation%3A+inferior+colliculus+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neural+engineering%22%5BJournal%5D)">Spread of cochlear excitation during stimulation with pulsed infrared radiation: inferior colliculus measurements.</a> Journal of neural engineering. 8 (5), 056006(2011).</li>
<li>Teudt, I. U., Maier, H., Richter, C. P., Kral, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+events+and+%E2%80%9Coptophonic%E2%80%9D+cochlear+responses+induced+by+pulsed+near-infrared+laser%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+bio-medical+engineering%22%5BJournal%5D)">Acoustic events and “optophonic” cochlear responses induced by pulsed near-infrared laser.</a> IEEE transactions on bio-medical engineering. 58 (6), 1648-1655 (2011).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li>
<li>Kleinlogel, S., Feldbauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+light-sensitive+and+fast+neuronal+activation+with+the+Ca2%2B-permeable+channelrhodopsin+CatCh%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh.</a> Nature neuroscience. 14 (4), 513-518 (2011).</li>
<li>Friesen, L. M., Shannon, R. V., Baskent, D., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+recognition+in+noise+as+a+function+of+the+number+of+spectral+channels%3A+comparison+of+acoustic+hearing+and+cochlear+implants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Speech recognition in noise as a function of the number of spectral channels: comparison of acoustic hearing and cochlear implants.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 110 (2), 1150-1163 (2001).</li>
<li>Donaldson, G. S., Kreft, H. A., Litvak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place-pitch+discrimination+of+single-+versus+dual-electrode+stimuli+by+cochlear+implant+users+%28L%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Place-pitch discrimination of single- versus dual-electrode stimuli by cochlear implant users (L).</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 118 (2), 623-626 (2005).</li>
<li>Srinivasan, A. G., Shannon, R. V., Landsberger, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+virtual+channel+discrimination+in+a+multi-channel+context%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Improving virtual channel discrimination in a multi-channel context.</a> Hearing research. 286 (1-2), 19-29 (2012).</li>
<li>Zeng, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speech+dynamic+range+and+its+effect+on+cochlear+implant+performance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Speech dynamic range and its effect on cochlear implant performance.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 111 (1 Pt 1), 377-386 (2002).</li>
<li>Matic, A. I., Walsh, J. T., Richter, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+extent+of+cochlear+infrared+neural+stimulation+determined+by+tone-on-light+masking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical%22%5BJournal%5D)">Spatial extent of cochlear infrared neural stimulation determined by tone-on-light masking.</a> Journal of biomedical. 16 (11), 118002(2011).</li>
<li>Verma, R., Guex, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+responses+to+electric+and+infrared+neural+stimulation+of+the+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Auditory responses to electric and infrared neural stimulation of the rat cochlear nucleus.</a> Hearing research. 310, 69-75 (2014).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annual review of neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Hegemann, P., Nagel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+channelrhodopsins+to+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">From channelrhodopsins to optogenetics.</a> EMBO molecular medicine. 5 (2), 173-176 (2013).</li>
<li>Packer, A. M., Roska, B., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Nagel, G., Szellas, T., Kateriya, S., Adeishvili, N., Hegemann, P., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsins%3A+directly+light-gated+cation+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsins: directly light-gated cation channels.</a> Biochemical Society transactions. 33 (Pt 4), 863-866 (2005).</li>
<li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Current biology: CB. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Bamann, C., Kirsch, T., Nagel, G., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+characteristics+of+the+photocycle+of+channelrhodopsin-2+and+its+implication+for+channel+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Spectral characteristics of the photocycle of channelrhodopsin-2 and its implication for channel function.</a> Journal of molecular biology. 375 (3), 686-694 (2008).</li>
<li>Ritter, E., Stehfest, K., Berndt, A., Hegemann, P., Bartl, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+light-induced+structural+changes+of+Channelrhodopsin-2+by+UV-visible+and+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Monitoring light-induced structural changes of Channelrhodopsin-2 by UV-visible and Fourier transform infrared spectroscopy.</a> The Journal of biological chemistry. 283 (50), 35033-35041 (2008).</li>
<li>Berndt, A., Prigge, M., Gradmann, D., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+open+states+with+progressive+proton+selectivities+in+the+branched+channelrhodopsin-2+photocycle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Two open states with progressive proton selectivities in the branched channelrhodopsin-2 photocycle.</a> Biophysical journal. 98 (5), 753-761 (2010).</li>
<li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482 (7385), 369-374 (2012).</li>
<li>Hegemann, P., Möglich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin+engineering+and+exploration+of+new+optogenetic+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin engineering and exploration of new optogenetic tools.</a> Nature methods. 8 (1), 39-42 (2011).</li>
<li>Mattis, J., Tye, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nature methods. 9 (2), 159-172 (2012).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Peca, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Transgenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Transgenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).</li>
<li>Tomita, H., Sugano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+Properties+of+Transgenic+Rats+Harboring+the+Channelrhodopsin-2+Gene+Regulated+by+the+Thy-1.2+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter.</a> PLoS ONE. 4 (11), e7679(2009).</li>
<li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li>
<li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nature Neuroscience. 15 (5), 793-802 (2012).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Hernandez, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+the+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of the auditory pathway.</a> The Journal of clinical investigation. 124 (3), 1114-1129 (2014).</li>
<li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., Berndt, A., Sohal, V. S., Deisseroth, K., Hegemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nature neuroscience. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
<li>Klapoetke, N. C., Murata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die beschriebenen Experimente zeigen die optogenetische Stimulation der SGNS und kann im Prinzip auch für die inneren und / oder äußeren Haarzellen stimulieren, sofern die Expression Opsinen. Diese Experimente erfordern viel Geduld und Sorgfalt. Wie bereits erwähnt, sind die wichtigsten Schritte eine gute Cochleostomie / Rundfenster Einsetzen sowie eine entsprechende Position und Ausrichtung der Lichtquelle. Es gibt Einschränkungen mit optogenetische Stimulation bei der Verwendung von ChR2. ...

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation, 360 Millionen Menschen weltweit leiden unter Hörverlust. In taub Themen, direkte elektrische Stimulation der SGNS von CIs ermöglichen offenen Sprachverständnis in den meisten von ihnen 1,2,4,5. Auch wenn CIs wurden in mehr als 200.000 Menschen eingepflanzt worden, daher das erfolgreichste Neuroprothese, Sound-Kodierung durch die aktuellen Cochlea-Implantate angetrieben begrenzt. CIs auf elektrische Stimulation durch eine bestimmte Anzahl von Elektroden, wobei jede eine tonotopen Bereich des Gehörnervs unter Umgehung der dysfunktionellen sensorischen Corti-Organ in die Cochlea aktiviert basiert. Normalhörenden kann mehr als 2.000 Frequenzen zu unterscheiden, aber die heutigen CIs nur bis zu 12-22 4 Frequenzkanäle. Dies ist aufgrund der weit verbreiteten Stromfluß von jeder Stimulationselektrode 7,9, Aktivierung einer großen Anzahl von SGNS, die viele verschiedene Schallfrequenzen 8,15 repräsentieren. DiesBegrenzung kann mit multipolaren Stimulation, aber auf Kosten einer höheren Leistungsaufnahme 16,17 verbessert werden. Ihre Ausgangsdynamikbereich für Schallintensität ist auch begrenzt, in der Regel 6-20 dB unter 4,18. Aus diesen Gründen, die Verbesserung der Häufigkeit und Intensität Auflösung sind wichtige Ziele für die Erhöhung CI Leistung der Spracherkennung in lauten Umgebungen, Prosodie Verständnis und Musikwahrnehmung zu verbessern. Eine andere Möglichkeit, den Hörnerv stimulieren ist die optische Stimulation. Licht kann bequem ausgerichtet werden, um eine kleine SGN Bevölkerung zielen, und versprach bessere räumliche Begrenzung, die Erhöhung Frequenzauflösung und auch Dynamikbereich erweitert, was zu einer besseren Intensitätsauflösung. Tatsächlich hat Cochlea-Stimulation mit Infrarotlicht hervorragende Frequenzauflösung in Tiermodellen gezeigt, 10,11,19. Ein Nachteil dieser Art der Stimulation ist, dass es höhere Energie als elektrische Stimulation erfordert <sup&gt; 10,11. Darüber hinaus Bedenken über die Fähigkeit des Verfahrens, um direkt zu stimulieren akustischen Neuronen sind angehoben worden 12,20. Als Alternative zu Infrarot-Stimulation, beschäftigen wir Optogenetik zu machen SGNS lichtempfindlich. Optogenetik ist ein neuartiger Ansatz, der genetische und optische Techniken kombiniert, um nicht-invasiv und gezielt zu steuern Zellen mit hoher zeitlicher Genauigkeit (21-23 Bewertungen). Die derzeit am häufigsten verwendete Modalität verwendet, die Expression der mikrobiellen Kanalrhodopsin 2 (ChR2) Gen von Chlamydomonas reinhardtii und Varianten davon, ein lichtgesteuerter Kationenkanal 24 kodiert. ChR2 ist ein 7-Trans-Helix-Protein, das, wenn es in Neuronen transduziert und durch blaues Licht aktiviert wird, wirkt als nicht-selektiven Kationenkanal, wodurch die Zellen depolarisierende 24 27. ChR2 ist gut charakterisiert worden 24,28- 31 und vielen Varianten wurden entwickelt, um actio ändernn-Spektrum, Gate und Durchlässigkeitseigenschaften 32,33. Das Ziel unserer Arbeit ist es, Cochlea-Optogenetik für die Aktivierung der Hörbahn zu etablieren. Wir stellen fest, dass die optogenetischen Ansatz für den Hörnerv stimulieren erfordert genetische Manipulation der Spiralganglien für die Expression von Kanalrhodopsin. Arbeiten mit Mäusen und Ratten erlaubt die Verwendung der verfügbaren transgenen Tiere 13,34,35, welche die Expression des Kanalrhodopsin mit wenig Variabilität entlang der Achse und quer tonotopen Tiere 36 bereitzustellen. Kombination bedingte Allele 37 mit entsprechenden Cre-Linien sorgt für zellspezifische Expression. Gentransfer in die Spiralganglien von anderen Tieren erfordert die Verwendung von Viren wie Adeno-assoziierten Virus, das ein Standard-Ansatz in der Optogenetik 38 ist, und dass wir zeigten in Mäusen 36 gut zu funktionieren. Genetische Manipulation und Expression von Transgenen kodieren Proteine ​​Alien Bär Risiken für Nebenwirkungen wie IMMUne Reaktionen und / oder Proliferation, beeinträchtigt Zustand oder sogar zum Tod von genetisch manipulierten Zellen. Für den Zweck dieser Demonstration verwenden wir transgenen Mäusen, die ChR2 in Spiralganglienneuronen unter der Thy-1-Promotor 13 optisch stimulieren die Hörbahn. Wir stellen fest, dass andere Kanalrhodopsin Varianten können für den gleichen Zweck verwendet werden, wie wir mit Virus-vermittelte Übertragung der Variante Catch 14 in SGNS 39 demonstriert. Während Cochlea-Optogenetik erfordert genetische Manipulation, bietet es molekulare Tuning für optimierte SGN Stimulation und verspricht verbesserte Häufigkeit und Intensität Auflösung im Vergleich zu elektrischen Stimulation. Optogenetische Stimulation der Hörbahn ist für Gehörforschung von großer Bedeutung. Beispielsweise verspricht Verbesserungen in Studien des aktivitätsabhängigen Ausgestaltung Tonotopie während der Entwicklung in der Analyse der Anforderung für die spektrale Integration in Schall localizatIonen und des Ausmaßes der Wechselwirkung zwischen frequenzspezifischen afferenten Vorsprünge im zentralen auditorischen System.

<table><tbody><tr><td>Urethan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U2500-100G</td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Xylazin HCl</td><td>RXV</td><td></td><td>Beruhigungsmittel und Analgetikum</td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td>Analgetikum</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Es wird verwendet, um hartes Gewebe, z.B. Knochen oder Materialien, zu halten. Verwenden Sie sie niemals, um weiches, empfindliches Taschentuch zu halten.</td></tr><tr><td>Dumont #5 - Feine Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Nur zum Halten von Weichgewebe</td></tr> verwenden <tr><td>Feine Schere - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>Zum Öffnen der Haut und zur Unterstützung der Muskeldissektion</td></tr><tr><td>Lempert Rongeurs&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>16004-16</td><td>Sie sind sehr nützlich, um den Knochen einfach aus dem Bulla</td></tr><tr><td>473 nm Laser zu entfernen&nbsp;</td><td>Changchun New Industries</td><td>MLL-III473</td><td>100 mW Festkörperlaser 473 nm</td></tr><tr><td>Lasertreiber</td><td>Changchun New Industries</td><td>DPSSL MLL 100 mW</td><td>TTL-betriebener Lasertreiber</td></tr><tr><td>250 & Mikro; m optische Faser</td><td>Alle kommerziellen Fasern, z. B. Thorlabs</td><td>M42L05</td><td></td></tr><tr><td>Akusto-optischer Modulator</td><td>Crystal Technology, Inc.</td><td>PCAOM VIS</td><td>Steuern Sie die Lichtmenge, die vom Laser in die Faser eingekoppelt</td></tr> wird <tr><td>Controller für den akusto-optischen Modulator</td><td>Crystal Technology, Inc.</td><td>160T1-8SAR-24-0.8</td><td>Steuerung des akusto-optischen Modulators</td></tr><tr><td>Solo2 Laserleistungs- und Energiemessgerät</td><td>Gentec-EO</td><td></td><td>Wird verwendet, um die Lichtintensität der LED und des fasergekoppelten Lasers zu messen</td></tr><tr><td>Blau & Mikro; LED</td><td>Cree</td><td>C470UT200</td><td>Es ist notwendig, mehrere &mu; LED-Geräte, weil sie leicht beschädigt werden können oder die Isolierung nicht gut genug ist</td></tr><tr><td>TDT-System&nbsp;</td><td>Tucker-Davis Technologies</td><td>RZ6-A-P1</td><td>Es kann jedes System zur Stimuluserzeugung&nbsp; Präsentation und Datenerfassung</td></tr> verwendet <tr><td>werdenEinschaft, 16-Kanal Siliziumsonde</td><td>Neuronexus</td><td>a1x16-5mm-100-177-CM16LP&nbsp;</td><td>Es handelt sich um zerbrechliche Geräte, die nach Gebrauch sorgfältig behandelt und gereinigt werden müssen</td></tr><tr><td>Omnidrill</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>Durchführung einer Kraniotomie für IC-Aufnahmen und die Implantation von Referenzschrauben</td></tr><tr><td>Micro Drill Steel Burrs</td><td>für kommerzielle Zwecke; z. B. Fine Science Tools</td><td>19007-07</td><td></td></tr><tr><td>Selbstschneidende Knochenschraube</td><td>für kommerzielle Zwecke; z. B. Fine Science Tools</td><td>19010-10</td><td>Referenzschraube</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>jede Werbung; z.B. Luigs+NeumannInVivo Unit Junior 4 Achsen</td><td></td><td>Positionierung der Aufnahmesonde</td></tr></tbody></table>

optogenetische stimulation des hörnervs

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direkten elektrischen Stimulation von Spiralganglienneuronen (SGNS) von Cochlea-Implantaten (CI) ermöglicht offenen Sprachverständnis in der Mehrzahl der Probanden implantiert taub 1-6. Dennoch, Soundcodierung mit aktuellen CIs schlechte Frequenz und Intensität Auflösung durch breite aktuellen Verbreitung von jeder Elektrode Kontakt Aktivierung einer großen Anzahl von SGNS entlang der Achse tonotopen der Cochlea 7-9. Optische Stimulation wird als Alternative zur elektrischen Stimulation, die räumlich begrenzt verspricht Aktivierung SGNS und damit höhere Frequenzauflösung der Codierung vorgeschlagen. In den letzten Jahren direkte Infrarotbeleuchtung der Cochlea wurde verwendet, um Reaktionen in der Hörnerv 10 hervorrufen. Dennoch höheren Energien erfordert als elektrische Stimulation 10,11 und die Unsicherheit bleibt, wie auf den zugrunde liegenden Mechanismus 12. Hier eine Methode, die auf Optogenetik zu stimulieren SGNS beschreiben wirmit geringer Intensität blaues Licht, mit transgenen Mäusen, die mit neuronalen Ausdruck Kanalrhodopsin 2 (ChR2) 13 oder Virus-vermittelte Expression des ChR2-Variante Catch 14. Wir verwendeten Mikro Leuchtdioden (μLEDs) und fasergekoppelte Laser zu ChR2-exprimierenden SGNS durch eine kleine künstliche Öffnung (Cochleostomie) oder das runde Fenster zu stimulieren. Wir untersucht die Reaktionen von Kopfhaut-Aufnahmen von Licht-evozierte Potentiale (optogenetische Hirnstamm-Reaktion: oABR) oder durch Mikroelektroden-Aufnahmen aus der Hörbahn und verglichen sie mit akustischer und elektrischer Stimulation.

Eine optimale Cochleostomie kritisch ist und die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Versuchs. Das heißt, die Fenster regelmäßig ist, klein, und es gibt keine Schädigung der internen Strukturen der Cochlea. Zum Beispiel zeigt Blutungsschaden der Stria vascularis. Ein gutes Beispiel ist in 1B dargestellt. Mit ChR2-transgenen Mäusen wird ChR2 in den SGNS in der Cochlea (1C) ausgedrückt. Blaues Licht Beleuchtung entweder durch μLED oder Lase...

Cochlea-Implantate (CI) ermöglichen durch direkte elektrische Stimulation des Hörnervs zu hören. , Schlechte Frequenz und Intensität Auflösung begrenzt jedoch die Qualität der mit CIs zu hören. Hier beschreiben wir optogenetische Stimulation des Hörnervs bei Mäusen als alternative Strategie für auditive Forschung und Entwicklung künftiger CIs.

Optogenetische Stimulation des Hörnervs

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Hörnerv von Tieren mit optogenetisch modifizierten Spiralganglienneuronen optisch zu stimulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst entweder ein blauer Mikro-LED-Stimulator oder eine optische Faser hergestellt wird, die mit einem blauen Laser gekoppelt ist. Der nächste Schritt des Eingriffs ist die Beurteilung der Cochlea mit einem retroaurikulären mikrochirurgischen Ansatz.Der dritte Schritt besteht darin, den optischen Stimulator so zu positionieren, dass er optisch evozierte Hirnstammreaktionen aufzeichnet. Der letzte Schritt besteht darin, auf den unteren Colus zuzugreifen, um optisch evozierte Aktivität aufzuzeichnen. Letztendlich können die Ergebnisse eine erfolgreiche Stimulation des auditorischen Systems durch Aufzeichnungen von auditorischen Hirnstammreaktionen und lokalen Feldpotentialen zeigen.Im Colliculus inferior Optogenetische Stimulation des Hörnervs. Als Alternative zu elektrischen Cochlea-Implantaten versprechen sie eine bessere Frequenz- und Intensitätsauflösung. Dies ist für die Prüferforschung von großem Interesse, aber die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf eine verbesserte Wiederherstellung des Gehörs bei Gehörlosen.Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Hörforschung zu beantworten, wie z.B. die Rolle der Musteraktivität für die Verfeinerung der orthopädischen Entwicklung, die Notwendigkeit einer spektralen Integration bei der Zelllokalisierung und das Ausmaß der Interaktion zwischen frequenzspezifischen Rahmenprojektionen. Im zentralen auditorischen System ist die visuelle Demonstration des Verfahrens von entscheidender Bedeutung, da die richtige Positionierung und Ausrichtung der Mikro-LED oder der optischen Faser schwer zu erlernen ist. Der Micro-LED-Stimulator verwendet eine blaue LED mit einer aktiven Oberfläche von 200 Quadratmetern, die zuerst Drähte an die Mikro-LED lötet.Verkapseln Sie anschließend die LED und ihren Anschluss mit einem Epoxidharz und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Nach dem Aushärten führen Sie die Drähte durch einen Außendurchmesser von einem Millimeter. Leihen Sie sich eine Silikatglaskapillare.Das Glas sorgt für mechanische Stabilität und elektrische Isolierung. Versiegeln Sie die Verbindungsstelle zwischen der Kapillare und der epoxidbeschichteten LED mit mehr Epoxidharz und positionieren Sie die Kapillare so, dass sie an einem Manipulator montiert werden kann. Überprüfen Sie nun die elektrischen Anschlüsse.Bereiten Sie zunächst drei Kupferdrähte vor. Tauchen Sie jeweils ein Ende in ein 0,9%iges Natriumchloridbad. Schließen Sie dann die anderen Enden an einen A BR-Verstärker an.Überwachen Sie das Signal mit einem Oszilloskop. Verbinden Sie als Nächstes die Mikro-LED mit dem speziell angefertigten Stimulator für den Test. Tauchen Sie die mit dem Stimulator verbundene Micro-LED in das Bad und schalten Sie die LED mindestens 20 Minuten lang ein.Während der Stimulation überwacht die LED das Oszilloskop auf Artefakte. Entsorgen Sie alle fehlerhaften LEDs. Betäuben Sie eine vier bis 10 Wochen alte Maus.Diese Maus exprimiert Kanal Opsin zwei unter dem Oberschenkel 1,2 Promotor 10 Minuten. Überprüfen Sie nach der Injektion der Anästhetika den Entzugsreflex des Tieres, um eine chirurgische Anästhesieebene zu bestätigen. Tragen Sie dann Salbe auf die Augen auf und beginnen Sie mit der Operation.Rasieren Sie zuerst vorsichtig den retro-aurikulären Bereich, um sich der Bullah, der luftgefüllten Mittelohrhöhle, zu nähern. Setzen Sie die Maus mit einer Mikrozange auf ein Heizkissen an der OP-Seite. Präparieren Sie vorsichtig die Nackenmuskulatur, nämlich das Platysma, den Sternocleidomastoide und die Schuppenmuskulatur.Lege nun die Bulla frei. Es handelt sich um eine kugelförmige, knöcherne Struktur mit einem Ring auf der Oberfläche, an der sich das Trommelfell befindet. Stechen Sie mit einer Insulinnadel ein Loch direkt unter dem Ring aus dem Loch.Entferne den Knochen, der die Bulla bedeckt. Verwenden Sie feine Rons und Mikrozangen, um das Pro-Auditorium der Cochlea freizulegen. Beginnen Sie als Nächstes mit der Cochlea. Stoma.Rasieren Sie zunächst die knöcherne Kapsel ab, ohne das membranöse Labyrinth zu stören. Öffnen Sie nun ein kleines 500- bis 800-Mikrometer-Fenster an der zweiten Cochlea-Drehung, weit entfernt von der Staed-Arterie und der Apex-Öffnung. Die Spitze könnte die Cochlea reißen und die Modis brechen.Bereiten Sie sich darauf vor, optogenetische auditorische Hirnstammreaktionen oder OABR zu messen. Führen Sie zunächst Nadelelektroden an den folgenden Stellen unter der Ohrmuschel, am Scheitel und am Rücken in der Nähe der Beine ein, wobei die Elektroden an einen Verstärker angeschlossen sind. Verstärken Sie das Differenzpotenzial zwischen der Vertex- und der Mastoid-Subdermalnadel.Messen Sie bei 50 Kilohertz und filtern Sie die Reaktionen zwischen einem und 10.000 Hertz für die Transcochlea-Stimulation. Montieren Sie eine Mikro-LED oder Faser, gekoppelt mit der Mikro-LED, die von einem mechanischen Manipulator erfasst wird. Positionieren Sie es vorsichtig an seinem Platz.Visualisieren Sie das Differenzpotenzial auf einem Oszilloskop. Platzieren Sie es in der Nähe des Aufnahmeaufbaus, so dass die Position des optischen Stimulators leicht optimiert werden kann. Verwenden Sie die Signalmittelung und speichern Sie die Daten auf einem Computer für die Offline-Analyse.Optimieren Sie nun die Position und Ausrichtung der Mikro-LED durch Reaktionen auf drei bis 10 Millisekunden lange Stromimpulse bei einem bis fünf Hertz. Eine weitere Option ist die Laserstimulation mit einem 473-Nanometer-Dauerstrichlaser, der an einer 250-Mikrometer-Glasfaser befestigt ist. Dies erfordert eine schnelle analoge Steuerung der Laserleistung oder eines optischen Geräts.Mit einem Schnellverschluss positionieren Sie die Faser mit einem Mikromanipulator direkt auf dem Cochlea-Stoma und fixieren Sie sie mit Zahnzement für die intracochleäre Stimulation. Führen Sie die Faser durch das runde Fenster in den s Scala.Tempe ein. Optimieren Sie die Position und Ausrichtung der Faser, indem Sie Reaktionen mit drei bis 10 Millisekunden langen Impulsen von 10 bis 30 Milliwatt bei einem bis fünf Hertz auslösen.Die Positionierung des Stimulators ist der wichtigste Schritt des Protokolls. Die Mikro-ED oder die optische Faser sollte geduldig verlegt werden, bis die OABR offensichtlich ist. Sobald gute optogenetische, auditive Hirnstammreaktionen gegeben sind, fixieren Sie die Faser mit Cyanacrylatkleber oder mit Zahnzement.Verwenden Sie für dieses Protokoll einen stereotaktischen Rahmen und bereiten Sie eine Maus vor, indem Sie den Schädel über dem Colus inferior öffnen. Positionieren Sie mit einem Mikroskop eine Aufzeichnungssonde über dem Colus inferior und führen Sie sie so ein, dass der oberste Kanal gerade noch an der Oberfläche sichtbar ist. Verstärken Sie nun das Differenzpotential zwischen den einzelnen Kanälen des Aufnahmearrays und der Referenzschraube und dem Parietalknochen.Verwenden Sie eine Abtastrate von 32 Kilohertz, einen 300 Hertz Tiefpassfilter und speichern Sie die Daten. Ein optimales Cochlea-Stoma ist entscheidend und erhöht die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Experiments. Das bedeutet, dass das Fenster normal klein ist und es keine Verletzungen der inneren Cochlea-Strukturen gibt.Zum Beispiel deutet eine Blutung auf eine Schädigung der STR ssis unter Verwendung des Kanals Rodin zwei transgene Mäuse hin. Kanal Rodin zwei wird in den Neuronen der Spiralgang innerhalb der Cochlea exprimiert; die Blaulichtbeleuchtung entweder durch Mikro-LED oder durch Laser löst große optogenetische A BR aus, die sich von akustischen A BR in Amplitude und Wellenform optogenetisch unterscheiden. Ein BR hat größere Amplituden als akustische A BR optogenetisch.Ein BR ist somit eher vergleichbar mit einem elektrischen A BR. Sie können beide mehr Neuronen aus Spiralganglien rekrutieren oder eine stärker synchronisierte Aktivierung der Neuronen der Spiralganglien hervorrufen. Die Ausbreitung der Aktivität über die auditorische Bahn wurde durch extrazelluläre Ableitungen im zentralen auditorischen System verifiziert. Zum Beispiel löste die optogenetische Stimulation der Cochlea neuronale Aktivität im auditorischen Mittelhirn aus.Die mechanische Stabilität und die sichere elektrische Isolierung von Mikro-LED-Stimulatoren sowie die Vermeidung eines übermäßigen Kohlenstoffflusses sind entscheidende Faktoren für den erfolgreichen Einsatz der Cochlea-Optogenetik. Wenn Sie diesen Profi versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine Verletzung der Distroarterie bei Ebola zu vermeiden. Einmal gemastert, können Aufnahmen vom Colliculus inferior in etwa drei Stunden gemacht werden, wenn sie richtig ausgeführt werden.Nach diesem Verfahren kann eine Methode wie z.B. Einzelaufnahmen im Colliculus inferior durchgeführt werden. Die optogenetische Stimulation der Hörbahn wird der Forschung in den auditorischen Neurowissenschaften den Weg ebnen, Fragen zu stellen, die bisher nicht mit akustischer oder elektrischer Stimulation beantwortet werden konnten. Wir hoffen auch, dass diese Technik in die klinische Rehabilitation von Hörschäden übertragen wird.

optogenetic-stimulation-of-the-auditory-nerve

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Die Anwendung einer klassischen Konditionierung Angst Verhaltensstörungen Paradigma für die auditive prothetischen Forschungen an Ratten beschrieben. Dieses Paradigma stellt einen Mechanismus zur Identifizierung sowohl Erkennung und Unterscheidung zwischen, deutliche akustische und elektrische Reize mittels Herzfrequenz als Zielparameter.

Behavioral Bestimmung des Stimulus-Pair-Diskriminierung von Auditory Akustische und elektrische Reize mit einem klassischen Konditionierung und Herzfrequenz-Ansatz

Quelle: Kozin, E. D., et.al. Direkte Visualisierung des dorsalen Cochlea-Kerns der Maus zur optogenetischen Stimulation der Hörbahn. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt den virusvermittelten Gentransfer in den dorsalen Cochlea-Kern (DCN) der Maus, um eine lichtinduzierte auditive Stimulation zu ermöglichen. Ein viraler Vektor, der für Opsin, einen lichtempfindlichen Ionenkanal, kodiert, wird nach einer Kraniotomie und Kleinhirnaspiration in das DCN injiziert, um einen direkten Zugang zu...

Virusvermittelter Gentransfer in den dorsalen Cochlea-Kern der Maus zur lichtinduzierten auditiven Stimulation

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Stimulation der auditorischen Nervenwurzel und zur Aufzeichnung postsynaptischer Ströme in medialen olivocochlären Neuronen in Keilschnitten des Mausgehirns.

Stimulation der auditorischen Nervenwurzel und postsynaptische Stromaufzeichnungen in einer Keilscheibe des Maus-Gehirns

Quelle: Badran, B. W., et al. Laborverabreichung der transkutanen Stimulation des Nervus aurikulärer Vagus (taVNS): Technik, Targeting und Überlegungen. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die transkutane aurikuläre Vagusnervstimulation (taVNS), eine nicht-invasive Methode zur Modulation der Gehirnaktivität. Die Elektroden werden an der vorderen Wand des äußeren Gehörgangs und des Tragus platziert und zielen auf den Ohrast des Vagusnervs (ABVN) ab. Bei Stimulation gelangt der resultierende...

Transkutane Stimulation des Nervus vagus aurikulär am menschlichen Ohr

Quelle: Akil, O., et al., Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Verabreichung eines therapeutischen Gens in das Innenohr eines Mauswelpen mit genetisch bedingtem Hörverlust. Unter Verwendung eines Adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektors wird das Gen durch die runde Fenstermembran injiziert, wodurch Viruspartikel in Haarzellen eindringen, die Produktion von...

Virale vektorbasierte Gentherapie zur Wiederherstellung des Gehörs im Mausmodell

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen chirurgischen Ansatz zu skizzieren, um einen direkten Zugang zum dorsalen Cochlea-Kern in einem Mausmodell zu ermöglichen.

Direkte Visualisierung der Murine Rücken Cochlear Nucleus für optogenetische Stimulation der Hörbahn

Das Hörorgan vermittelt das Hören. Hier stellen wir eine modifizierte In-Ovo-Mikroelektroporationsmethode vor, die für die Untersuchung der Proliferation und Differenzierung von Vorläuferzellen im sich entwickelnden Hühner-Hörorgan optimiert ist.

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Wir präsentieren Ihnen eine Technik für lokalisierte Verabreichung von Medikamenten durch die Trans-Trommelfells Route in die Cochlea. Drug-Delivery über diesen Weg würden die Anti-Krebs-Wirksamkeit von Chemotherapeutika wie Cisplatin nicht beeinträchtigen.

Trans-Trommelfells Drug-Delivery für die Behandlung von Ototoxizität

Tiermodelle der Cochlea-Implantate können Kenntnisse über die technologischen Grundlagen für die Behandlung von permanenten Schallempfindungs-Schwerhörigkeit mit elektrischer Stimulation voraus. Diese Studie bietet eine chirurgische Protokoll für akute ohrenbetäubend und Cochlea-Implantation von Elektroden-Array in Mäusen als auch die funktionale Bewertung mit auditory Brainstem Response.

Cochlea-Implantat-Chirurgie und elektrisch evozierten Auditory Brainstem Response Aufnahmen bei C57BL/6 Mäusen

Die Integration verschiedener synaptischer Inputs in Neuronen wird am besten in einer Zubereitung gemessen, die alle präsynaptischen Kerne für natürliches Timing und Schaltplastizität bewahrt, aber Gehirnscheiben trennen in der Regel viele Verbindungen. Wir entwickelten eine modifizierte Gehirnscheibe, um die In-vivo-Schaltungsaktivität nachzuahmen und gleichzeitig die In-vitro-Experimentierfähigkeit aufrechtzuerhalten.

In Vitro Wedge Slice Vorbereitung für Diemimitieren In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Die elektrisch-akustische Stimulation (EAS) mit längeren Elektroden kann eine breitere Cochlea-Abdeckung und verschiedene Arten von Karten bei hochfrequentem Hörverlust bieten. Die Kombination von weniger invasiver Chirurgie, flexiblen Seitenwandelektroden und Steroidverabreichung ermöglicht eine tiefere Einführung mit wenig oder keinem chirurgischen Trauma, was zu einer guten Erhaltung des Gehörs führt.

Verbesserte Cochlea-Abdeckung und Gehörerhaltung bei hochfrequentem Hörverlust durch elektrisch-akustische Stimulation mit längerer Elektrode

Erfahren Sie die optogenetische Stimulation des Hörnervs in Mäusen mit blauen Mikro-LEDs oder Lasern. Diese Methode ermöglicht präzise Kontrolle neuronaler Aktivität und verbessert die Frequenzauflösung für Hörforschung.

Optogenetische Stimulation des Hörnervs

Weitere Videos entdecken