Optogenetische Stimulation des Hörnervs

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, den Hörnerv von Tieren mit optogenetisch modifizierten Spiralganglienneuronen optisch zu stimulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst entweder ein blauer Mikro-LED-Stimulator oder eine optische Faser hergestellt wird, die mit einem blauen Laser gekoppelt ist. Der nächste Schritt des Eingriffs ist die Beurteilung der Cochlea mit einem retroaurikulären mikrochirurgischen Ansatz.

Der dritte Schritt besteht darin, den optischen Stimulator so zu positionieren, dass er optisch evozierte Hirnstammreaktionen aufzeichnet. Der letzte Schritt besteht darin, auf den unteren Colus zuzugreifen, um optisch evozierte Aktivität aufzuzeichnen. Letztendlich können die Ergebnisse eine erfolgreiche Stimulation des auditorischen Systems durch Aufzeichnungen von auditorischen Hirnstammreaktionen und lokalen Feldpotentialen zeigen.

Im Colliculus inferior Optogenetische Stimulation des Hörnervs. Als Alternative zu elektrischen Cochlea-Implantaten versprechen sie eine bessere Frequenz- und Intensitätsauflösung. Dies ist für die Prüferforschung von großem Interesse, aber die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf eine verbesserte Wiederherstellung des Gehörs bei Gehörlosen.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Hörforschung zu beantworten, wie z.B. die Rolle der Musteraktivität für die Verfeinerung der orthopädischen Entwicklung, die Notwendigkeit einer spektralen Integration bei der Zelllokalisierung und das Ausmaß der Interaktion zwischen frequenzspezifischen Rahmenprojektionen. Im zentralen auditorischen System ist die visuelle Demonstration des Verfahrens von entscheidender Bedeutung, da die richtige Positionierung und Ausrichtung der Mikro-LED oder der optischen Faser schwer zu erlernen ist. Der Micro-LED-Stimulator verwendet eine blaue LED mit einer aktiven Oberfläche von 200 Quadratmetern, die zuerst Drähte an die Mikro-LED lötet.

Verkapseln Sie anschließend die LED und ihren Anschluss mit einem Epoxidharz und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Nach dem Aushärten führen Sie die Drähte durch einen Außendurchmesser von einem Millimeter. Leihen Sie sich eine Silikatglaskapillare.

Das Glas sorgt für mechanische Stabilität und elektrische Isolierung. Versiegeln Sie die Verbindungsstelle zwischen der Kapillare und der epoxidbeschichteten LED mit mehr Epoxidharz und positionieren Sie die Kapillare so, dass sie an einem Manipulator montiert werden kann. Überprüfen Sie nun die elektrischen Anschlüsse.

Bereiten Sie zunächst drei Kupferdrähte vor. Tauchen Sie jeweils ein Ende in ein 0,9%iges Natriumchloridbad. Schließen Sie dann die anderen Enden an einen A BR-Verstärker an.

Überwachen Sie das Signal mit einem Oszilloskop. Verbinden Sie als Nächstes die Mikro-LED mit dem speziell angefertigten Stimulator für den Test. Tauchen Sie die mit dem Stimulator verbundene Micro-LED in das Bad und schalten Sie die LED mindestens 20 Minuten lang ein.

Während der Stimulation überwacht die LED das Oszilloskop auf Artefakte. Entsorgen Sie alle fehlerhaften LEDs. Betäuben Sie eine vier bis 10 Wochen alte Maus.

Diese Maus exprimiert Kanal Opsin zwei unter dem Oberschenkel 1,2 Promotor 10 Minuten. Überprüfen Sie nach der Injektion der Anästhetika den Entzugsreflex des Tieres, um eine chirurgische Anästhesieebene zu bestätigen. Tragen Sie dann Salbe auf die Augen auf und beginnen Sie mit der Operation.

Rasieren Sie zuerst vorsichtig den retro-aurikulären Bereich, um sich der Bullah, der luftgefüllten Mittelohrhöhle, zu nähern. Setzen Sie die Maus mit einer Mikrozange auf ein Heizkissen an der OP-Seite. Präparieren Sie vorsichtig die Nackenmuskulatur, nämlich das Platysma, den Sternocleidomastoide und die Schuppenmuskulatur.

Lege nun die Bulla frei. Es handelt sich um eine kugelförmige, knöcherne Struktur mit einem Ring auf der Oberfläche, an der sich das Trommelfell befindet. Stechen Sie mit einer Insulinnadel ein Loch direkt unter dem Ring aus dem Loch.

Entferne den Knochen, der die Bulla bedeckt. Verwenden Sie feine Rons und Mikrozangen, um das Pro-Auditorium der Cochlea freizulegen. Beginnen Sie als Nächstes mit der Cochlea. Stoma.

Rasieren Sie zunächst die knöcherne Kapsel ab, ohne das membranöse Labyrinth zu stören. Öffnen Sie nun ein kleines 500- bis 800-Mikrometer-Fenster an der zweiten Cochlea-Drehung, weit entfernt von der Staed-Arterie und der Apex-Öffnung. Die Spitze könnte die Cochlea reißen und die Modis brechen.

Bereiten Sie sich darauf vor, optogenetische auditorische Hirnstammreaktionen oder OABR zu messen. Führen Sie zunächst Nadelelektroden an den folgenden Stellen unter der Ohrmuschel, am Scheitel und am Rücken in der Nähe der Beine ein, wobei die Elektroden an einen Verstärker angeschlossen sind. Verstärken Sie das Differenzpotenzial zwischen der Vertex- und der Mastoid-Subdermalnadel.

Messen Sie bei 50 Kilohertz und filtern Sie die Reaktionen zwischen einem und 10.000 Hertz für die Transcochlea-Stimulation. Montieren Sie eine Mikro-LED oder Faser, gekoppelt mit der Mikro-LED, die von einem mechanischen Manipulator erfasst wird. Positionieren Sie es vorsichtig an seinem Platz.

Visualisieren Sie das Differenzpotenzial auf einem Oszilloskop. Platzieren Sie es in der Nähe des Aufnahmeaufbaus, so dass die Position des optischen Stimulators leicht optimiert werden kann. Verwenden Sie die Signalmittelung und speichern Sie die Daten auf einem Computer für die Offline-Analyse.

Optimieren Sie nun die Position und Ausrichtung der Mikro-LED durch Reaktionen auf drei bis 10 Millisekunden lange Stromimpulse bei einem bis fünf Hertz. Eine weitere Option ist die Laserstimulation mit einem 473-Nanometer-Dauerstrichlaser, der an einer 250-Mikrometer-Glasfaser befestigt ist. Dies erfordert eine schnelle analoge Steuerung der Laserleistung oder eines optischen Geräts.

Mit einem Schnellverschluss positionieren Sie die Faser mit einem Mikromanipulator direkt auf dem Cochlea-Stoma und fixieren Sie sie mit Zahnzement für die intracochleäre Stimulation. Führen Sie die Faser durch das runde Fenster in den s Scala.Tempe ein. Optimieren Sie die Position und Ausrichtung der Faser, indem Sie Reaktionen mit drei bis 10 Millisekunden langen Impulsen von 10 bis 30 Milliwatt bei einem bis fünf Hertz auslösen.

Die Positionierung des Stimulators ist der wichtigste Schritt des Protokolls. Die Mikro-ED oder die optische Faser sollte geduldig verlegt werden, bis die OABR offensichtlich ist. Sobald gute optogenetische, auditive Hirnstammreaktionen gegeben sind, fixieren Sie die Faser mit Cyanacrylatkleber oder mit Zahnzement.

Verwenden Sie für dieses Protokoll einen stereotaktischen Rahmen und bereiten Sie eine Maus vor, indem Sie den Schädel über dem Colus inferior öffnen. Positionieren Sie mit einem Mikroskop eine Aufzeichnungssonde über dem Colus inferior und führen Sie sie so ein, dass der oberste Kanal gerade noch an der Oberfläche sichtbar ist. Verstärken Sie nun das Differenzpotential zwischen den einzelnen Kanälen des Aufnahmearrays und der Referenzschraube und dem Parietalknochen.

Verwenden Sie eine Abtastrate von 32 Kilohertz, einen 300 Hertz Tiefpassfilter und speichern Sie die Daten. Ein optimales Cochlea-Stoma ist entscheidend und erhöht die Wahrscheinlichkeit eines erfolgreichen Experiments. Das bedeutet, dass das Fenster normal klein ist und es keine Verletzungen der inneren Cochlea-Strukturen gibt.

Zum Beispiel deutet eine Blutung auf eine Schädigung der STR ssis unter Verwendung des Kanals Rodin zwei transgene Mäuse hin. Kanal Rodin zwei wird in den Neuronen der Spiralgang innerhalb der Cochlea exprimiert; die Blaulichtbeleuchtung entweder durch Mikro-LED oder durch Laser löst große optogenetische A BR aus, die sich von akustischen A BR in Amplitude und Wellenform optogenetisch unterscheiden. Ein BR hat größere Amplituden als akustische A BR optogenetisch.

Ein BR ist somit eher vergleichbar mit einem elektrischen A BR. Sie können beide mehr Neuronen aus Spiralganglien rekrutieren oder eine stärker synchronisierte Aktivierung der Neuronen der Spiralganglien hervorrufen. Die Ausbreitung der Aktivität über die auditorische Bahn wurde durch extrazelluläre Ableitungen im zentralen auditorischen System verifiziert. Zum Beispiel löste die optogenetische Stimulation der Cochlea neuronale Aktivität im auditorischen Mittelhirn aus.

Die mechanische Stabilität und die sichere elektrische Isolierung von Mikro-LED-Stimulatoren sowie die Vermeidung eines übermäßigen Kohlenstoffflusses sind entscheidende Faktoren für den erfolgreichen Einsatz der Cochlea-Optogenetik. Wenn Sie diesen Profi versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, eine Verletzung der Distroarterie bei Ebola zu vermeiden. Einmal gemastert, können Aufnahmen vom Colliculus inferior in etwa drei Stunden gemacht werden, wenn sie richtig ausgeführt werden.

Nach diesem Verfahren kann eine Methode wie z.B. Einzelaufnahmen im Colliculus inferior durchgeführt werden. Die optogenetische Stimulation der Hörbahn wird der Forschung in den auditorischen Neurowissenschaften den Weg ebnen, Fragen zu stellen, die bisher nicht mit akustischer oder elektrischer Stimulation beantwortet werden konnten. Wir hoffen auch, dass diese Technik in die klinische Rehabilitation von Hörschäden übertragen wird.