Bodenproben und Isolierung von Nematoden (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Methoden und Techniken zu demonstrieren, die üblicherweise für die Bodenprobenahme und Isolierung von enteropathogenen Nematoden verwendet werden. Dies wird erreicht, indem zunächst Bodenproben durch einen Transektansatz oder, wie gezeigt, durch einen Zufallsprobenansatz entnommen werden. Als nächstes wurden die Bodenproben mit Insekten abgestuft, um selektiv enteropathogene Nematoden zu gewinnen.

Der letzte Schritt besteht darin, die Nematoden von infizierten Insekten mit einer modifizierten weißen Falle zu sammeln. Letztendlich stellen diese Techniken einen wichtigen Schritt für die erfolgreiche Etablierung enteropathogener Nematodenkulturen im Labor dar und bilden die Grundlage für nachgelagerte Bioassays. Der Vorteil der Bodenprobenahmetechnik besteht darin, dass wir auf das Feld gehen und reife Stadien von pathogenen Nematoden sammeln können.

Ich suche lieber nach Insekten, die mit diesen Nematoden infiziert sind, was selten vorkommt. Die von uns angewandte Zufallsstichprobenstrategie wird häufig verwendet, um die Diversität pathogener Nematoden aus einer großen geografischen Region oder einem großen Gebiet zu bewerten. Diese Technik wurde erstmals 1975 durch Wetten in Accur beschrieben.

Es handelt sich um ein selektives Verfahren, das auf der Prämisse basiert, dass freie Lebensstadien von Insektenwirten angezogen werden und diese parasitieren. Die Demonstration der Verfahren wird von Rue Orozco, Doktorand und Ming Mingle, Forschungstechniker in meinem Labor, durchgeführt. Labor. Der Ort für die Probenentnahme sollte eine Mindestfläche von zwei Quadratmetern haben und wenn möglich mehr als vier Quadratmeter groß sein.

Für jede Bodenprobe sind mindestens drei kleinere Teilproben innerhalb des Probenbereichs DM a C zu entnehmen. Die Teilstichproben können kombiniert werden, wenn sie den Zielen der Studie entsprechen. Sammeln Sie die Bodenproben in einer Tiefe von null bis 15 Zentimetern.

Jede Probe sollte 250 Gramm bis ein Kilogramm wiegen. Verwenden Sie Boden-CORAs-Trows, Handschaufeln oder ähnliche Werkzeuge und sammeln Sie an mindestens fünf zufälligen Stellen innerhalb jedes ausgewählten Probenahmebereichs. Jede Probe sollte doppelt verpackt und mit einem wasserfesten Marker beschriftet werden.

Das Etikett sollte Informationen über den Standort, den Standort, die Höhe, das Datum und Umweltvariablen wie die Beschreibung des Lebensraums mit der zugehörigen Vegetation und der Temperatur am Standort enthalten. Notieren Sie sich die heimischen Insekten und andere wirbellose Arten. Sammeln Sie Arten, die nicht sofort identifiziert werden können, um sie später im Labor zu identifizieren, zwischen den Sammelstellen, waschen Sie die Sammelwerkzeuge gründlich mit Wasser und desinfizieren Sie sie dann mit 70 % Ethanol oder 0,5 % Bleichmittel.

Lagern Sie die Bodenproben für den Transport in einem Kühler bei acht bis 15 Grad Celsius. CES trennt einen Teil der Probe, um die groben Eigenschaften des Bodens wie Zusammensetzung, Textur, Leitfähigkeit usw. zu analysieren. Entfernen Sie von jeder Bodenprobe die Ablagerungen, die zu einer Kontamination mit seimischen Mikroben führen könnten.

Befeuchten Sie dann die Erde mit Wasser, damit sich die Nematoden darin leicht bewegen können. Laden Sie 200 bis 250 Gramm der feuchten Erde in einen Kunststoffbehälter mit Deckel. Fügen Sie dann Insektenköder hinzu.

Fünf bis 10 Insekten reichen aus. Setzen Sie den Deckel auf, drehen Sie den Behälter um und stellen Sie ihn in die Dunkelheit. Entfernen Sie alle zwei bis drei Tage bei Raumtemperatur die toten Insekten und ersetzen Sie sie bei Bedarf durch gesunde Insekten für eine zusätzliche Gewichtung.

Wenn der Insektenkadaver braun oder ockerfarben ist, deutet dies auf eine parasitierende Parit von Stein und Nema hin. Wenn der Leichnam hingegen ziegelrot bis dunkelviolett ist, sollte man mit Hetero rechnen. Verwenden Sie eine modifizierte weiße Falle, um die Nematoden zu sammeln, die die Insektenköder parasitiert haben.

Setzen Sie zunächst den Deckel einer 50- oder 60-Millimeter-Petrischale in den Boden einer 100-Millimeter-Schale ein. Legen Sie dann ein Blatt kreisförmiges Watman auf. Nummer eins des Filterpapiers in der kleineren Schale.

Spülen Sie die Insektenkadaver mit sterilisiertem Wasser ab und geben Sie sie auf das Filterpapier. Breiten Sie sich so aus, dass sie nicht miteinander in Berührung kommen. Füllen Sie nur die größere Schale mit etwa 20 Millilitern destilliertem Wasser und decken Sie die Montage mit den größeren Schalen ab. Deckel.

Beschriften Sie die Schalen mit dem Namen des Fadenwurms, dem Datum und dem Datum der Insektenköder. Die Falle ist aufgestellt. Bewahren Sie die Fallen bei Raumtemperatur auf und überwachen Sie sie auf infektiöse, juvenile Nematoden oder IJs, die aus den Insektenleichen austreten.

Dies kann 10 bis 25 Tage dauern und hängt von der Temperatur und dem Feuchtigkeitsgehalt des Ortes ab, an dem die Falle aufbewahrt wird. Wenn der Wasserstand in der Falle verdunstet ist, stellen Sie sicher, dass Sie sie auf Tellern mit IJs nachfüllen. Ernte das Wasser aus der größeren Schale, die Nematoden enthalten sollte.

Lassen Sie die Nematoden einige Minuten einsinken und dekantieren Sie dann das Wasser langsam. Sobald die Nematoden in einer kleinen Menge Wasser verbleiben, spülen Sie sie noch einige Male ab, indem Sie wieder Wasser hinzufügen und dann vorsichtig abgießen. Nehmen Sie dann serielle Verdünnungen vor, um die Nematodenpopulation zu schätzen.

In einem 250-Milliliter-Kulturkolben wird die Konzentration des Nematoden auf einen bis 3000 Nematoden pro Milliliter eingestellt. Lagern Sie diese Suspension zwischen 10 und 20 Grad Celsius. Generell sind die Chancen, Insekten zu finden, die von enteropathogenen Nematoden parasitiert werden, in der Natur sehr gering.

Daher wurde das skizzierte Protokoll, bei dem G-Melanomlarven als Köder verwendet wurden, verwendet, um solche Nematoden mit einer viel effizienteren Rate zu isolieren. Nach fünf Tagen waren die Insekten infiziert und hatten eine rote Färbung. Modifizierte weiße Fallen zeigten Nematodenspuren.

Nach 15 Tagen nach diesen Fallen sammelten sich die Nematoden im Wasser, hatten ein sauberes Aussehen und waren frei von Insektengewebe. Ein einziger Extraktionszyklus mit Gallium-Melania-Larven kann nicht ausreichen, um alle pathogenen Oma-Nematoden zu gewinnen, die sich in einer Bodenprobe befinden. Wir empfehlen daher, dies mehrmals zu tun.

Außerdem raten wir den Nutzern, andere Insekten anstelle von Galleria in Betracht zu ziehen, was die Heilungschancen ebenfalls verbessert. Die Debattierung von Bodenproben mit Insekten ist eine Technik, die auch für die Isolierung anderer Krankheitserreger wie Bakterien oder Pilze in Betracht gezogen werden kann.