Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen oder Proteindomänen abzubilden. In diesem Fall werden die krebsbezogenen Proteindomänen und die CHFR untersucht. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen oder Proteindomänen abzubilden.

In diesem Fall werden die krebsbezogenen Proteindomänen und die CHFR untersucht. Der zweite Schritt besteht darin, das CHFR-Peptidarray mit seinem Bindungspartner, dem stillen Protein, zu inkubieren. Als nächstes wird das Array gewaschen und mit Meerrettichperoxidase, einem konjugierten Antikörper, inkubiert.

Das Array wird dann einer chemischen Lumineszenzdetektion unterzogen, um die Bindung zu erkennen. Der letzte Schritt besteht darin, die Ergebnisse zu analysieren und die Bindungsstellen zwischen den Proteinen zu identifizieren. Diese Studie ebnet den Weg für die Entwicklung rationaler Inhibitoren der Trotz-CHFR-Bindung, deren unkontrolliertes Zusammenspiel zur Entstehung von Krebs führen kann.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Erforschung der Proteininteraktion zu beantworten, wie z. B. welche spezifischen Regionen meditieren Eine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen, Teilen Sie die Sequenz des Zielproteins in 10 bis 20 Restpeptide auf. Die sich teilweise überschneiden. Der Grad der Überlappung kann variiert werden, aber im Prinzip gilt: Je länger die Überlappung, desto besser.

Berücksichtigen Sie beim Design der Peptide bekannte Sekundärstrukturelemente im Protein, die für die Interaktion verantwortlich sein können. Das entworfene Peptid-Array kann über kommerzielle Anbieter bestellt werden. Für dieses Experiment werden Peptide aus den CHFR-Domänenresten 4 24 bis 6 62 über den C-Terminus kovalent an das Array gebunden.

Nachdem Sie das entworfene Array erhalten haben, bereiten Sie es für das Experiment vor, indem Sie es zuerst blockieren, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Stellen Sie eine Blocklösung von 2,5 % Gewicht pro Volumen her. Magermilchpulver in einer Tris-Pufferlösung mit 0,05 % Tween 20 oder TBST geben, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden.

Tauchen Sie das Array in fünf Milliliter Blocklösung. Inkubieren Sie das Array für zwei bis vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Shaker. Waschen Sie das Array zuerst 30 Sekunden lang mit fünf Millilitern Blockierungslösung.

Waschen Sie das Array dann zweimal mit fünf Millilitern TBST für fünf Minuten auf einem Shaker bei Raumtemperatur. Als nächstes inkubieren Sie das gewaschene Array mit fünf Millilitern Polyhistidin-markierter Proteinlösung mit 2,5 % Gewicht pro Volumen. Magermilchpulver abgeben, um unspezifische Bindungen zu vermeiden.

Hier wird eine 4,5 mikromolare Lösung der stillen Proteinreste 500 bis sechs 50 verwendet. Inkubieren Sie das Array dann drei bis acht Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius in der Proteinlösung. Nach der Inkubation in der Proteinlösung.

Waschen Sie das Array 30 Sekunden lang mit fünf Millilitern TBST auf einem Shaker bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei weiteren fünfminütigen Wäschen. Inkubieren Sie nun das gewaschene Array mit fünf Millilitern verdünntem Meerrettichperoxidase-konjugiertem Antikörper in einem Inkubationspuffer, der die gleichen Inhaltsstoffe in den gleichen Konzentrationen wie die Blockierungslösung enthält, eine Stunde lang auf einem Shaker bei Raumtemperatur, der Antikörper kann entweder das Zielprotein oder den Tag binden, Kontrollexperimente durchführen und die Wechselwirkung des Antikörpers mit Peptiden auf dem Array testen, indem das gleiche Protokoll auf einem separaten Array wiederholt wird Schieben Sie, ohne mit dem Protein zu inkubieren, bevor Sie die Arrays ablesen. Waschen Sie sie wie zuvor mit fünf Millilitern TBST.

Führen Sie die Chemilumineszenzentwicklung mit einem verbesserten Chemilumineszenz-Western-Blotting-Substratkit durch. Führen Sie die Erkennung mit einem lumineszierenden Bildanalysator durch, z. B. einer Fuji-Filmkamera LAS 3000. Analysieren Sie die Ergebnisse, und stellen Sie sicher, dass beide Duplikate im Array die gleichen Signale anzeigen, damit die Ergebnisse zuverlässig sind.

Wenn die Struktur des Proteinpartners bekannt ist, suchen Sie in der Struktur nach den Bindungspeptiden und suchen Sie nach den Bindungsstellen. Denken Sie daran, dass Peptide, die sich weit in der Sequenz befinden, zusammen in der Tertiärstruktur sein können und eine Bindungsstelle bilden. In unserem Beispiel ist Still ein sehr wichtiges Centro Somal-Protein, das die normale Zellteilung und die Zellproliferation steuert und über seine intrinsisch ungeordnete Region immer noch mit mehreren Proteinen interagiert.

Mit Hilfe des designten Peptidarrays wurden die noch vorhandenen Bindungsstellen im Tumorsuppressor CHFR aufgedeckt. Jeder schwarze Fleck im Array repräsentiert ein A-C-H-F-R-Peptid, das immer noch zu beachten ist, dass jedes Peptid zweimal vorkommt, da es in doppelter Form existiert, was die Zuverlässigkeit der Ergebnisse bestätigt. Das Peptid-Array-Screening ergab sieben CHFR-abgeleitete Peptide, die an die noch intrinsisch ungeordneten Regionsreste 500 bis sechs 50 gebunden sind.

Diese Ergebnisse ermöglichten es uns, die Bindungsstelle von noch auf CHFR zu kartieren. Trotz des Abstands dieser sieben Peptide auf der CHFR-Primärsequenz. Sie schaffen eine gut definierte Bindungsstelle für noch in der CHFR-Tertiärstruktur.

Diese Methode ist anwendbar für die Charakterisierung jeder Protein-Protein-Wechselwirkung Nach diesem Verfahren. Quantitative Methoden wie Fluoreszenz und Isotope oder ITC sollten verwendet werden, um die Peptideinbringung zu verifizieren, zu quantifizieren.