Name: Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Erfahren Sie, wie Peptid-Array-Screening zur Kartierung von Protein-Protein-Interaktionen zwischen still und CHFR eingesetzt wird. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung spezifischer Bindungsstellen für Krebsforschung.

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AF wurde durch einen Starting Grant des Europäischen Forschungsrates des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Gemeinschaft unterstützt (FP7 / 2007-2013) / ERC Finanzhilfevereinbarung Nr 203.413 und von der Minerva-Zentrum für Bio-Hybridkomplex systems.HA und AI werden unterstützt durch das Dalia und Dan Maydan Fellowship für fortgeschrittene Studierende an der Hebräischen Universität von Jerusalem.

1. Entwerfen einer Peptidarray <ol><li> Teilen die Sequenz des Zielproteins in teilweise überlappenden Peptiden 10-20 Resten. Variieren Sie die Größe der Überlappung von der spezifischen Experiment und die Ressourcen der Durchführung Labor, aber im Prinzip, je länger die Überlappung, desto besser. Bei der Gestaltung der Peptide Berücksichtigung bekannter Sekundärstrukturelemente in das Protein, das für die Interaktion verantwortlich sein kann dauern. </li><li> Bestellen Sie die entworfen Peptidarray durch kommerzielle Anbieter. Hierbei kann die Verwendung Peptide kovalent an die Anordnung durch den C-Terminus gebunden ist. </li></ol> 2. Blockieren nicht-spezifischer Bindung <ol><li> Einen 50 mM Tris oder Phosphat-Pufferlösung, enthaltend 0,05% Tween 20 (TBST / PBST) und Anpassung an den gewünschten pH-Wert mit einer abgemessenen Menge von HCl oder NaOH (um die exakte Ionenstärke weiß) und die gewünschte Ionenstärke mit NaCl . Hier verwenden einen pH-Wert von 7,5 und eine Ionenstärke von 150 mM. </li><li> Machen Sie eine Blockierungslösung von2,5% (w / v) Magermilchpulver in TBST / PBST. </li><li> Um unspezifische Bindung zu vermeiden, tauchen Sie das Array in 5 ml Blockierungslösung. Inkubieren des Arrays für 2-4 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ºC auf einem Schüttler. </li></ol> 3. Inkubation mit dem Protein <ol><li> Zuerst mit 5 ml Blockierungslösung für 30 Sekunden und dann zweimal mit 5 ml TBST / PBST für 5 min auf einem Schüttler bei Raumtemperatur Waschen des Arrays. </li><li> Inkubieren der gewaschenen Array mit 5 ml His-tagged Protein-Lösung, die 2,5% (w / v) Magermilchpulver zu verhindern, nicht-spezifische Bindung. Hier verwenden 4,5 &amp; mgr; M-Protein-Lösung (STIL 500-650) in der beschriebenen Blockierungslösung gelöst. HINWEIS: In der Regel 5-10 &amp; mgr; M-Protein für das Screening verwendet werden, aber die Proteinkonzentration kann sogar so niedrig wie 2-3 &amp; mgr; M, abhängig von der Bindungsaffinität und die lokalen Konzentrationen der Peptide, die auf dem Array gebunden (Effizienz der Synthese). Der Puffer, in dem das Proteinaufgelöst wird, kann variieren, ist aber üblich, die Protein verdünnt unter Verwendung des gleichen oben beschriebenen Blockierungslösung. </li><li> Inkubieren der Anordnung in der Proteinlösung für 3-8 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ºC. </li></ol> 4. Inkubation mit dem Antikörper <ol><li> Dreimal mit 5 ml TBST / PBST waschen Array. Die erste Wäsche wird für 30 sec, gefolgt von zwei Wäschen 5 min am Schüttler bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubieren der gewaschenen Array mit 5 ml der verdünnten HRP-konjugiertem Antikörper (1: 1500) in einem Inkubationspuffer, der die gleichen Bestandteile enthält, in den gleichen Konzentrationen als Blockierungslösung für 1 Stunde auf einem Schüttler bei Raumtemperatur. Der Antikörper kann entweder das Zielprotein oder den Tag bindet. </li><li> Kontrollexperimente durchzuführen Testen der Wechselwirkung des Antikörpers mit Peptiden, die auf der Anordnung, insbesondere dann, wenn das Array Peptide von dem Zielprotein (zB zur Oligomerisierung Studien) durch Wiederholung des gleichen Protokoll ohne step 3, Inkubation mit dem Protein. </li><li> Dreimal mit 5 ml TBST / PBST waschen Array. Die erste Wäsche wird für 30 sec, gefolgt von zwei Wäschen 5 min am Schüttler bei Raumtemperatur. </li></ol> 5. Lesen Sie den Array <ol><li> Führen Sie Chemilumineszenz Entwicklung mit einer ECL-Western-Blot-Substrat-Kit. </li><li> Führen Sie die Erkennung mit einem Leucht Bildanalysators. </li><li> Analysieren Sie die Ergebnisse. Stellen Sie sicher, dass beide Duplikate auf dem Array zeigen die gleichen Signale, so dass die Ergebnisse zuverlässig sind. Wenn die Struktur der Proteinpartner bekannt ist, suchen auf der Struktur um die Bindungspeptide und nach den Bindungsstellen. Auch Peptide, die weit in der Sequenz sind nahe beieinander in der Tertiärstruktur und schaffen eine Bindungsstelle. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Peptidarray-Screening ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Identifizierung der Bindungsstellen eines Zielproteins in seine Partner. Dieser Test ist schnell und einfach durchzuführen und die Ergebnisse können in einem oder zwei Tagen erhalten werden. Peptidarray Screening ist vielseitig und kann für viele Zwecke verwendet werden. Es kann für die Charakterisierung von Übersetzungs- Modifikationen wie Phosphorylierung und Identifizieren Substrate von Kinasen eingesetzt werden. Zum Beispiel: der FLT3-Kinase, die verwand...

Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln die meisten Prozesse in der lebenden Zelle. Impaired Protein-Interaktionen können in Krankheit führen, was Protein-Interaktionen wichtige Angriffspunkte für Arzneimittel. Es ist daher sehr wichtig, diese Interaktionen auf molekularer Ebene zu verstehen. Protein-Wechselwirkungen sind mit einer Vielzahl von Techniken, von der zellulären und biochemischen Tests, quantitative biophysikalische Assays untersucht, und diese können mit vollständigen Proteine ​​durchgeführt werden, entweder mit Proteindomänen oder mit Peptiden. Peptide dienen als ausgezeichnete Werkzeuge, um Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen. Dies ist, weil Peptide können leicht synthetisiert werden und ermöglichen die Fokussierung auf einen bestimmten Interaktionsstelle einerseits und auf mehreren Protein-Targets in einem Hochdurch Weise auf der anderen Seite 1,2. Peptidarray Screening ist eine schnelle, einfache Verfahren zur Gewinnung einer großen Menge von Daten über die Wechselwirkungen eines Zielproteins mit zahlreichen Partnern in einer kurzen Zeit durchzuführen 3. Im Gegensatz zu anderen biochemischen oder biophysikalischen Methoden zur Detektion und Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkungen, Peptid-Array-Screening erfordert eine sehr geringe Konzentration an Protein und sehr schwache Bindung zu detektieren. Peptid-Arrays können für viele Anwendungen in der Peptid-Protein-Wechselwirkungen, wie Mapping von Protein-Protein oder Rezeptor-Ligand-Interaktionsstellen 4, Homo- oder Hetero-Oligomerisierung Schnittstellen verwendet werden, kennzeichn Antikörper Epitope 5, studiert Enzymaktivitäten 6 und hohen Durchsatz struktur Aktivitäts-Beziehung (SAR) studiert 7. Für eine eingehende Bewertung Peptidarray Screening siehe Katz et al. 4 Verschiedene Arten von Peptidarrays existieren derzeit. Es gibt zwei Hauptstrategien für die Herstellung von synthetischen Peptidarrays: Synthese der Peptide vor der Befestigung an dem festen Träger oder der Synthese von Peptiden direkt an den festen Träger, vor allem mit Hilfe der SPOT-Technik 4,8. DiePeptide auf dem festen Träger in der Regel von 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Chemie 8 synthetisiert. Unter den gemeinsamen Syntheseschemata sind Peptid Befestigung durch den N-Terminus (zB JPT Pepstar Arrays 9) und Peptid-Anlage durch den C-Terminus (zB PEPSCAN pepchip Arrays 10, JPT pepspot Arrays 9 und INTAVIS celluspot Arrays 11) 4. Der feste Träger kann variieren und damit auch die Chemie der Peptidkupplung zu. Cys-terminierten Peptide können über die Thiolgruppe 12 auf Glasobjektträgern befestigt werden. Der N-Terminus eines Peptids kovalent an eine Hydroxylgruppe an der Cellulose-Membran, durch Veresterung der Aminosäure gebunden befestigt 8. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für das Screening von Peptid-Arrays als ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Das Array verwendeten wir die Celluspots Array, das ein Mikroarray mit großen amo istunt von Flecken (Duplikate bis 384 Spots) auf einer kleinen Cellulosemembran durch einen Glasträger unterstützt. Dies ermöglicht das Arbeiten mit geringen Mengen an Protein und Antikörper und erhalten erhebliche Menge an Daten pro einzigen Experiment. Dieses Array enthält auch eine hohe Dichte, die Peptid-Detektion mit geringer Affinität bindenden ermöglicht. Das Array wurde zur Kartierung des STIL-CHFR Interaktion, die sehr wichtig für die normale Zellproliferation 13 Steuerung verwendet wird. Unkontrollierte Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen zur Entwicklung von Krebs. Durch die Abbildung dieser Wechselwirkung fanden wir die spezifische Bindungsstelle und Bindungsreste 14. Dies ebnet den Weg für die Entwicklung rationeller Inhibitoren, die diese Protein-Protein-Wechselwirkung hemmen.

<table><tbody><tr><td>Peptid-Array</td><td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>His-Sonde Antikörper (H-3) HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8036 HRP</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ECL Kit</td><td>Biologische Industrie</td><td>20-500-120</td><td></td></tr><tr><td>Magermilch</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>LAS-3000 Kamera</td><td>FUJI-Film</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ermittlung von protein-protein-interaktionsstellen unter verwendung von peptid-arrays

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln die meisten Prozesse in lebenden Zellen und die Kontrolle der Homöostase des Organismus. Impaired Protein-Interaktionen können in Krankheit führen, was Protein-Interaktionen wichtige Angriffspunkte für Arzneimittel. Es ist daher sehr wichtig, diese Interaktionen auf molekularer Ebene zu verstehen. Protein-Wechselwirkungen sind mit einer Vielzahl von Techniken, von der zellulären und biochemischen Tests, quantitative biophysikalische Assays untersucht, und diese können mit vollständigen Proteine ​​durchgeführt werden, entweder mit Proteindomänen oder mit Peptiden. Peptide dienen als ausgezeichnete Werkzeuge, um Protein-Wechselwirkungen zu studieren, da Peptide können leicht synthetisiert werden und ermöglichen die Konzentration auf bestimmte Interaktionsstellen. Peptidarrays ermöglichen die Identifizierung der Interaktionsstellen zwischen zwei Proteinen sowie Screening nach Peptiden, die das Zielprotein für therapeutische Zwecke binden. Sie erlauben auch einen hohen Durchsatz SAR-Studien. Zur Identifizierung der Bindungsstellen, eine typical Peptidanordnung enthält in der Regel teilweise überlappenden Peptiden 10-20 Resten der vollen Sequenzen von einem oder mehreren Partnerproteine ​​der gewünschten Zielprotein. Screenen des Arrays zur Bindung des Zielproteins zeigt die Bindungspeptide, die den Bindungsstellen in den Partnerproteine, in einer einfachen und schnellen Verfahren mit nur geringen Menge an Protein. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll für das Screening von Peptidarrays für die Abbildung der Interaktionsstellen zwischen einem Zielprotein und seine Partner. Die Peptidanordnung ist auf der Basis der Sequenzen der Partnerproteine ​​unter Berücksichtigung ihrer Sekundärstruktur ausgebildet. Die in diesem Protokoll verwendeten Arrays waren Celluspots Arrays INTAVIS Bioanalytische Instrumente vorbereitet. Das Array wird blockiert, um unspezifische Bindung zu verhindern und anschließend mit dem untersuchten Protein inkubiert. Nachweis unter Verwendung eines Antikörpers offenbart die Bindungspeptide, die den spezifischen Wechselwirkungsstellen zwischen den Proteinen.

STIL ist ein sehr wichtiger zentrosomalen Protein. Es steuert die normale Zellteilung und Zellproliferation 13,15 - 19. STIL interagiert mit mehreren Proteinen, 18,20,21, und die meisten Interaktionen durch seinen zentralen Teil, die ein intrinsisch ungeordneten Bereich (IDR) 14 auf. Wir haben eine Reihe von Peptiden aus dem STIL Bindungsprotein CHFR abgeleitet sind. CHFR ist ein Tumorsuppressor, der in Reaktion auf Stress induzierten mitotischen 22. Da die Struktur der Bindun...

Peptid-Array-Screening ist ein Hochdurchsatz-Assay zur Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionsstellen. Dies ermöglicht die Kartierung mehrerer Wechselwirkungen eines Zielproteins und kann als Methode zur Identifizierung von Stellen für Inhibitoren dienen, die auf ein Protein abzielen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Screening und zur Analyse von Peptidarrays.

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen oder Proteindomänen abzubilden. In diesem Fall werden die krebsbezogenen Proteindomänen und die CHFR untersucht. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen oder Proteindomänen abzubilden.In diesem Fall werden die krebsbezogenen Proteindomänen und die CHFR untersucht. Der zweite Schritt besteht darin, das CHFR-Peptidarray mit seinem Bindungspartner, dem stillen Protein, zu inkubieren. Als nächstes wird das Array gewaschen und mit Meerrettichperoxidase, einem konjugierten Antikörper, inkubiert.Das Array wird dann einer chemischen Lumineszenzdetektion unterzogen, um die Bindung zu erkennen. Der letzte Schritt besteht darin, die Ergebnisse zu analysieren und die Bindungsstellen zwischen den Proteinen zu identifizieren. Diese Studie ebnet den Weg für die Entwicklung rationaler Inhibitoren der Trotz-CHFR-Bindung, deren unkontrolliertes Zusammenspiel zur Entstehung von Krebs führen kann.Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Erforschung der Proteininteraktion zu beantworten, wie z. B. welche spezifischen Regionen meditieren Eine Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen, Teilen Sie die Sequenz des Zielproteins in 10 bis 20 Restpeptide auf. Die sich teilweise überschneiden. Der Grad der Überlappung kann variiert werden, aber im Prinzip gilt: Je länger die Überlappung, desto besser.Berücksichtigen Sie beim Design der Peptide bekannte Sekundärstrukturelemente im Protein, die für die Interaktion verantwortlich sein können. Das entworfene Peptid-Array kann über kommerzielle Anbieter bestellt werden. Für dieses Experiment werden Peptide aus den CHFR-Domänenresten 4 24 bis 6 62 über den C-Terminus kovalent an das Array gebunden.Nachdem Sie das entworfene Array erhalten haben, bereiten Sie es für das Experiment vor, indem Sie es zuerst blockieren, um eine unspezifische Bindung zu verhindern. Stellen Sie eine Blocklösung von 2,5 % Gewicht pro Volumen her. Magermilchpulver in einer Tris-Pufferlösung mit 0,05 % Tween 20 oder TBST geben, um eine unspezifische Bindung zu vermeiden.Tauchen Sie das Array in fünf Milliliter Blocklösung. Inkubieren Sie das Array für zwei bis vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Shaker. Waschen Sie das Array zuerst 30 Sekunden lang mit fünf Millilitern Blockierungslösung.Waschen Sie das Array dann zweimal mit fünf Millilitern TBST für fünf Minuten auf einem Shaker bei Raumtemperatur. Als nächstes inkubieren Sie das gewaschene Array mit fünf Millilitern Polyhistidin-markierter Proteinlösung mit 2,5 % Gewicht pro Volumen. Magermilchpulver abgeben, um unspezifische Bindungen zu vermeiden.Hier wird eine 4,5 mikromolare Lösung der stillen Proteinreste 500 bis sechs 50 verwendet. Inkubieren Sie das Array dann drei bis acht Stunden lang bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius in der Proteinlösung. Nach der Inkubation in der Proteinlösung.Waschen Sie das Array 30 Sekunden lang mit fünf Millilitern TBST auf einem Shaker bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei weiteren fünfminütigen Wäschen. Inkubieren Sie nun das gewaschene Array mit fünf Millilitern verdünntem Meerrettichperoxidase-konjugiertem Antikörper in einem Inkubationspuffer, der die gleichen Inhaltsstoffe in den gleichen Konzentrationen wie die Blockierungslösung enthält, eine Stunde lang auf einem Shaker bei Raumtemperatur, der Antikörper kann entweder das Zielprotein oder den Tag binden, Kontrollexperimente durchführen und die Wechselwirkung des Antikörpers mit Peptiden auf dem Array testen, indem das gleiche Protokoll auf einem separaten Array wiederholt wird Schieben Sie, ohne mit dem Protein zu inkubieren, bevor Sie die Arrays ablesen. Waschen Sie sie wie zuvor mit fünf Millilitern TBST.Führen Sie die Chemilumineszenzentwicklung mit einem verbesserten Chemilumineszenz-Western-Blotting-Substratkit durch. Führen Sie die Erkennung mit einem lumineszierenden Bildanalysator durch, z. B. einer Fuji-Filmkamera LAS 3000. Analysieren Sie die Ergebnisse, und stellen Sie sicher, dass beide Duplikate im Array die gleichen Signale anzeigen, damit die Ergebnisse zuverlässig sind.Wenn die Struktur des Proteinpartners bekannt ist, suchen Sie in der Struktur nach den Bindungspeptiden und suchen Sie nach den Bindungsstellen. Denken Sie daran, dass Peptide, die sich weit in der Sequenz befinden, zusammen in der Tertiärstruktur sein können und eine Bindungsstelle bilden. In unserem Beispiel ist Still ein sehr wichtiges Centro Somal-Protein, das die normale Zellteilung und die Zellproliferation steuert und über seine intrinsisch ungeordnete Region immer noch mit mehreren Proteinen interagiert.Mit Hilfe des designten Peptidarrays wurden die noch vorhandenen Bindungsstellen im Tumorsuppressor CHFR aufgedeckt. Jeder schwarze Fleck im Array repräsentiert ein A-C-H-F-R-Peptid, das immer noch zu beachten ist, dass jedes Peptid zweimal vorkommt, da es in doppelter Form existiert, was die Zuverlässigkeit der Ergebnisse bestätigt. Das Peptid-Array-Screening ergab sieben CHFR-abgeleitete Peptide, die an die noch intrinsisch ungeordneten Regionsreste 500 bis sechs 50 gebunden sind.Diese Ergebnisse ermöglichten es uns, die Bindungsstelle von noch auf CHFR zu kartieren. Trotz des Abstands dieser sieben Peptide auf der CHFR-Primärsequenz. Sie schaffen eine gut definierte Bindungsstelle für noch in der CHFR-Tertiärstruktur.Diese Methode ist anwendbar für die Charakterisierung jeder Protein-Protein-Wechselwirkung Nach diesem Verfahren. Quantitative Methoden wie Fluoreszenz und Isotope oder ITC sollten verwendet werden, um die Peptideinbringung zu verifizieren, zu quantifizieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Tandem Affinitätsreinigung ist ein robustes Verfahren zur Identifizierung von Protein Bindungspartner. Als Proof of Concept wurde die Methode auch auf die gut charakterisierte Translationsinitiationsfaktors eIF4E zu Copräzipitat der Wirtszelle Faktoren in Initiation der Translation beteiligt angewendet. Dieses Verfahren ist einfach einem der zellulären oder viralen Proteins.

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Kartierung dysfunktionaler Protein-Protein-Wechselwirkungen bei Krankheiten

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Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

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