Name: Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Lernen Sie die Aufbereitung komplexer tierassoziierter Proben wie Mukoviszidose-Sputum für Metagenom- und Metatranskriptom-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht die Analyse viraler und mikrobieller Gemeinschaften auf DNA- und RNA-Ebene.

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Diese Arbeit wurde von der National Institute of Health (1 R01 GM095384-01) Forest Rohwer ausgezeichnet unterstützt. Wir danken Epicentre, ein Illumina Unternehmen für die Bereitstellung frühzeitigen Zugang zu Ribo-Zero Epidemiologie Kits. Wir danken Mark Hatay für das Design und die Herstellung der Ultrazentrifuge Rohrhalter. Wir danken Andreas Haas und Benjamin Knowles für kritische Lesungen und Diskussionen des Manuskripts und Paul Lauren zur Unterstützung der Dreharbeiten.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Viral Metagenomics Viruspartikel konzentriert werden unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) Fällung oder kleinvolumigen Konzentratoren. In einigen Fällen kann die Konzentration nicht benötigt werden, aber pre-Filtration oder langsame Zentrifugation Schritte werden verwendet, um eukaryontische mikrobielle Zellen zu entfernen. Viral Lysate weiter angereichert und mit Dichtegradientenzentrifugation 9,41 oder kleiner Größe Filter (zB 0,45 um) zu eukaryotischen und großen mikrobiellen Zellen 25 zu entfernen. Gereinigt werden Dichtegradientenzentrifugation wird typischerweise mit dichten aber inerten Lösungen, wie Saccharose oder Cäsiumchlorid zur Isolierung und Konzentration viraler Partikel 41 durchgeführt. Physikalische Trennung wird von der Größe und Auftriebsdichte von viralen Partikel. Daher richtige Wahl der Filterfeinheit und der strengen Vorbereitung der Gradienten sind unerlässlich, um spezifische virale Isolation der Gemeinden, wie der Erfolg der physischen WiederherstellungVLPs bestimmt die Gemeinschaft isoliert 41 (dh Viruspartikel, die nicht durch den Filter oder fallen in den Entnahmedichte bestehen, werden nicht in der Metagenom erkannt werden). Nach virale Isolation und Konzentration kann es sein kontaminierenden in der Probe sowohl in Form von freien Nukleinsäuren und mikrobielle und eukaryotischen Zellen nicht-viralen vorliegenden genomischen Materials. Daher ist es wichtig, die Reinheit des Viruspartikeln in Proben (1A und 1B) zu verifizieren. Eine Chloroform-Behandlung wird üblicherweise verwendet, um die verbleibenden Zellen, gefolgt von Nukleasebehandlung um freie Nucleinsäuren vor der Extraktion von Nukleinsäuren abbauen lysieren. Eine Einschränkung auf die dargestellte Arbeitsablauf war der Einsatz von Dichtegradiententrennung, um virale Partikel zu isolieren, wie es umhüllten Viruspartikeln, die zu Auftriebs die CsCl Gradienten betreten können, auszuschließen. Eine Alternative &quot;Catch-all&quot; Verfahren ist es, den Dichtegradienten getr weglassenation und zu isolieren, die Community-DNA aus den 0,45 um - Filtrate mit Chloroform und DNase I. Dieser Ansatz behandelt wird, ist es angezeigt, einen kleinen Probenvolumina, wie sie aus Abstrichen oder Blutplasma unterzubringen. Jedoch kann dies in Chloroform-resistenten bakteriellen Kontamination und höhere Menge an DNase I beständigen extrazelluläre DNA führen. Aktuelle Sequenzierungsprotokolle erfordern 1 ng bis 1 ug von Nukleinsäuren zur Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung wodurch höhere DNA-Ausbeuten eine größere Auswahl an Optionen Sequenzierung. Die DNA-Konzentration der erzeugten viromes oft im Bereich von unterhalb der Nachweisgrenze von mehr als 200 ng / &amp; mgr; l. Die Höhe der viralen Nukleinsäuren erholt reicht möglicherweise nicht zur direkten Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung sein. In solchen Fällen ist die Nukleinsäure-Amplifikation von wesentlicher Bedeutung. Linker Verstärkung Schrotflinte-Bibliotheken (LASLs) 2,42,43 und Amplifikation des gesamten Genoms auf der Basis mehrerer Displacement Amplification (MDA) sind die beidenVerfahren am häufigsten verwendet werden, um ausreichende DNA für die Sequenzierung zu erzeugen. MDA Verfahren, wie sie anhand von Phi29 DNA-Polymerase ist bekannt, dass aus der Amplifikation spannt leiden und können bevorzugt amplifizieren ssDNA und kreisförmige DNA, was zu einer nicht quantitativen taxonomischen und funktionelle Charakterisierung 44,45. Eine optimierte Version des LASLs Ansatz hat sich gezeigt, dass nur minimale Verzerrungen einführen, fördert die höhere Empfindlichkeit (für kleine Mengen an Ausgangsmaterial), und ist leicht für verschiedene Sequenzierplattformen 43 angepasst. Jedoch weist der Ansatz viele Schritte, erfordert spezielle Ausrüstung, um DNA Verlust zu minimieren, und ist auf dsDNA Vorlagen. In unserem Labor wurde dieser Ansatz erfolgreich eingerichtet ist, nachweisbar und nicht nachweisbaren Menge von bronchoalveolären lavage-, Korallen-und seewasser abgeleitete VLPs (unveröffentlicht und Hurwitz et al. 46) extrahierte DNA zu amplifizieren. Entwicklung von Datenanalyse-Pipelines hat classically einer der schwierigsten Aspekte der Virus Metagenom-Analyse aufgrund der sehr unterschiedlichen und weitgehend unbekannten Natur der viralen Gemeinden. Zwar gibt es schätzungsweise 10 8 viralen Genotypen in der Biosphäre bis heute aktuellen Virendatenbanken enthalten ~ 4.000 viralen Genomen, die etwa 1 / 100.000 dieser ungefähren Gesamt virale Vielfalt ist. Daher Ähnlichkeit basierte Suchen (wie BLAST 47) für taxonomische und funktionelle Zuordnung der Virus Metagenomen besitzen inhärente Herausforderungen. Viele Sequenzen nicht zu signifikanten Ähnlichkeiten mit Genomen in der Datenbank haben, und deshalb werden als unbekannt eingestuft. Obwohl Homologie-basierte Suchanfragen sind die wichtigsten Anwendungen für die Zuordnung von Taxonomie und funktionieren, um Daten zu sequenzieren, wurden alternative Ansätze, die auf datenbankunabhängige Analyse entwickelt 48- 50. Fancello et al. 51 eine vollständige Überprüfung des Rechentools und Algorithmen in Vira verwendetl Metagenomik. Mikrobielle Metagenomics Typischerweise liegt die Gesamtmenge an DNA aus hypotonische Lyse behandelt Mikroorganismengemeinschaften (HL-DNA) extrahiert im Bereich von 20 ng bis 5 ug. Die Ausbeute ist stark abhängig von den Gesundheitszustand und die Menge der Sputumprobe gesammelt, welche die Variationen in der Gesamtausbeute in dieser Studie (Tabelle 2) extrahiert HL-DNA gesehen erklärt des Patienten. Die entscheidenden Schritte zur Erzeugung guter Qualität Sequenzdaten verlassen sich auf die Qualität der Sequenzierungsbibliotheken generiert. Abbildung 2 zeigt eine typische Größenbereich für die Sequenzierungsbibliotheken von CF Sputum abgeleitete mikrobielle DNA, die unter Verwendung eines enzymatischen-basierte DNA-Fragmentierung Verfahren. Die optimale Größe der Bibliothek ist abhängig von der Wahl des Sequenzierungsplattform und der Anwendung, und daher kann das Fragmentierungsverfahren optimiert werden, falls erforderlich, durch alternative Methoden wie Ultraschallbehandlung und Vernebelung. Zusätzlich zudie dargestellten repräsentativen Ergebnissen, der Erfolg des vorgestellten Verfahrens auf CF Sputum von mehreren Patienten über mehrere Zeitpunkte erfasst werden auch in Lim et al (2012). 9 dargestellt, und Lim et al. (2014) 10. Frühere Studien deuten darauf hin, 9,10, dass jeder Patient birgt eine einzigartige Reihe von mikrobiellen Gemeinschaft, die im Laufe der Zeit verschiebt, wodurch das Fortbestehen der Hauptakteure in der Gemeinschaft widerspiegelt, während Schwankungen dürften wegen Störungen wie Antibiotika. Ob diese Schwankungen auftreten, täglich auch ohne äußere Störungen oder aufgrund von Stichprobenverfahren und Probenverarbeitung, ist immer noch in Frage. Basierend auf der HL-DNA metagenomic und 16S rDNA Amplikon Analyse zeigt die 7-Tage-Längs Abtastung, dass die tägliche Schwankung des mikrobiellen Profile ohne Antibiotikum Perturbation (Tag 1, 2 und 3) war minimal (3A und 3B). Nach IntroHerstellung von oralen Antibiotika unmittelbar nach dem 3. Tag Probenahme wurde Änderungen in der Community-Profil offensichtlich an Tag 4. Während das Antibiotikum Ciprofloxacin zielt auf ein breites Spektrum an bekannten bakteriellen Erreger wie P. aeruginosa, Staphylococcus aureus und Streptococcus pneumoniae, erhöhte die Behandlung der relativen Häufigkeit von P. aeruginosa während die Verringerung der Streptococcus spp. und P. melaninogenica. Mit dem 6. Tag, die Gemeinschaft wieder langsam in die Anfangsstartgemeinschaftsstruktur. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Schwankungen der mikrobiellen Profile innerhalb eines einzelnen Patienten mit größerer Wahrscheinlichkeit aufgrund Community Störungen in den Atemwegen. Angesichts der Kohärenz zwischen den mikrobiellen Profile der 16S rDNA Bibliotheken und Metagenomen von HL-abgeleitete DNA, auszuschließen wir die Vorurteile von den in dieser Studie verwendeten 16S-rRNA-Primer Ursprung. Eine mögliche Erklärung für die Unterschiede zwischen den 16S rDNA taxonomische gesehenal Profile Gesamt-DNA und HL-abgeleiteten DNA (3B) erzeugt wird, kann die Anwesenheit von hohen Mengen von Pseudomonas spp. extrazelluläre DNA nach der Behandlung mit Antibiotika. Dies wird durch die Ergebnisse gestützt, dass diese Unterschiede wurden am Tag 7 am deutlichsten, drei Tage nach der Behandlung mit Antibiotika, die Pseudomonas spp abzielt. neben anderen. Ciprofloxacin ist allgemein als First-Line-Behandlung bei Patienten mit CF und chronischer P. verwendet aeruginosa-Infektion, obwohl seine Wirkungsspektrum umfasst die meisten CF-assoziierter Krankheitserreger. Wir nahmen an, dass die Behandlung mit Antibiotika rottet anfälliger Gemeinschaften einschließlich Streptococcus spp. und damit die Schaffung einer Nische durch resistente P. gefüllt aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa kann Widerstand durch Erhöhung der Biofilmgemeinschaften zu gewinnen und die extrazelluläre DNA wurde gezeigt, daß die wichtigsten strukturellen Unterstützung seiner Biofilmarchitektur 52 sein. Schon als ter Gemeinschaftsstruktur wiederhergestellt, extrazelluläre DNA kann auf der CF-Sputum geblieben. Deshalb lassen diese Daten vermuten, dass hypotonische Lyse und die Waschschritte in diesem Arbeitsablauf dargestellt potentiell nicht nur das Entfernen des vom Menschen stammenden DNA zu profitieren, sondern auch auf Basis mikrobieller extrazellulären DNA, die die tatsächliche mikrobielle Profile verdrehen kann. Metatranscriptomics Eine hochwertige metatranscriptome sollte relativ wenige ribosomale RNA (rRNA) Sequenzen enthalten und stellen eine unvoreingenommene Probenahme der Gemeinschaft Transkripte (mRNA). Aufgrund der kurzen Halbwertszeit und begrenzte Menge an mRNA, ist es entscheidend, dass das Protokoll, wie es hier dargestellt, minimiert Probenhandhabung, die Anzahl von Transkripten gewonnen maximieren. In den letzten Jahren verschiedene Ansätze für rRNA Depletion wurden entwickelt und im Handel erhältlichen Kits geeignet. Dazu gehören Microb Enrich, Ribo-Zero und probenspezifische subtraktiven hybridizations 53, die auf Oligonukleotid-Hybridisierung und der mRNA-ONLY-Kit, das auf Exonuklease enzymatische Aktivität Ziel RNA eine 5&#39;-Monophosphat enthält, basiert beruhen. Außerdem sind auch verschiedene Ansätze zur mRNA Anreicherungen wie MessageAmp II-Bakterien Kit, das vorzugsweise polyadenylates und verstärkt linearen RNA vorhanden. Einige dieser Verfahren (beispielsweise mRNA-ONLY, Microb E Xpress und MessageAmp) gleichzeitig für eine optimale Effizienz verwendet. Allerdings ist die Wirksamkeit aller dieser Ansätze begrenzt sind, besonders beim Arbeiten mit teilabgebauten rRNA, wie oft in Gesamt-RNA aus CF Proben extrahiert beobachtet. Polyadenylierungs-abhängigen RNA-Amplifikation kann nicht zur metatranscriptomes bestehend sowohl eukaryontische als auch prokaryontische mRNA zu erzeugen. Darüber hinaus ist die Poly (A) -Schwanz hinzugefügt, um die Sequenzen kann die Menge an nützlichen Sequenzdaten reduziert. Regionen mit Homo Strecken tendenziell niedrigere Qualität Partituren haben, cAStarten eine bedeutende Anzahl von Lesevorgängen, die von Sequenzierung und Post-Sequenzer-Software, und die durchschnittliche Nutzungsleselänge nach dem Schneiden aus Poly gefiltert werden (A) Schwanz deutlich 54 reduziert werden. Der Umgang mit komplexen CF mikrobieller Gemeinschaften und teilweise abgebauten RNA (4A und 4C), unsere frühere Studie zeigte, dass die Hybridisierungs-Capture-Methode durch die Ribo-Zero Gold-Kits war wirksamer bei der Entfernung von Mensch und Mikroben rRNA im Vergleich zu den zu kombinieren Behandlungen mit anderen Kits 9 (Tabelle 3). Die sich ergebenden Daten ermöglicht die gleichzeitige Analyse von sowohl menschlichen Wirt und mikrobielle Transkripte. In Abhängigkeit von der Ausbeute und Qualität der RNA sowie ultimative Wahl für Sequenzierungsplattform, können viele dieser Prozesse einschließlich der cDNA-Synthese mit Schritt Sequenzierung Bibliothek Generation gestrafft werden. Beispielsweise kann Ribo-Zero behandelten RNA verwendet werden, um metatranscriptome Sequenzierung Waage machenries mit ScriptSeq RNA-Seq Bibliothek Vorbereitung Kit. Metagenom-Analyse von Tier-assoziierten Gemeinden bietet eine umfassende Darstellung des Gesamtfunktionseinheit, die den Host und die zugehörigen Gemeinden umfasst. Die hier vorgestellte Arbeitsablauf ist an eine Vielzahl von komplexen Tierassoziierten Proben, insbesondere solche, zähen Schleim, große Mengen von Zelltrümmern, extrazellulären DNA, Protein und Glycoprotein-Komplexe, sowie Wirtszellen neben dem gewünschten viralen und mikrobiellen enthalten Partikel. Obwohl virale und mikrobielle Partikel können bei jedem Schritt verloren werden Partikel der Isolierung und Reinigung sind für die Menge der Wirts-DNA zu minimieren. Während die Metagenomik Daten bietet metabolische Potentiale der untersuchten Gemeinden metatranscriptomics diese ergänzen durch die Enthüllung der differentiellen Expression von codierten Funktionen 9. Eine umfassende Beurteilung der Genomik und Transkripte Daten neu ins ergabüge auf die Dynamik der Gemeinschaft Interaktionen und erleichtert die Entwicklung von Therapien verbessern 9,10,55.

<html> Virus- und Bakteriengemeinschaften mit dem menschlichen Körper verbunden sind ausführlich in den letzten zehn Jahren durch den Einsatz von 1,2-Sequenzierungstechnologien untersucht. Die Ergebnisse wurden auf die Anerkennung der Bedeutung Mikroben im menschlichen Gesundheit und Krankheit geführt. Die große Initiative kam von der Normalflora-Projekt, das die Bakterien beschrieben (und einigen Archaeen), die sich auf der menschlichen Haut und in Mundhöhle, Atemwege, des Urogenitaltraktes und Magen-Darm-3. Weitere microbiome Studien von gesunden menschlichen Atemwege durch bronchoalveoläre Lavage (BAL) 4,5 und Nasen-Rachen-Abstrichen 4 haben gezeigt, dass die Lunge als Umweltprobenahmevorrichtung, führt zu transienten mikrobiellen Besiedlung der Atemwege dienen. Allerdings können die Auswirkungen der mikrobiellen Besiedlung in beeinträchtigt Atemwegsoberflächen zu schweren und chronischen Infektionen der Lunge, wie sie bei zystischer Fibrose (CF) Patienten gesehen führen. t &quot;&gt; CF ist eine tödliche Krankheit, die durch genetische Mutation in Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR) -Gen 6 verursacht wird. Diese Mutationen führen zu fehlerhaften CFTR-Proteine, die sich ihrerseits auf den transepithelialen Ionentransport durch die apikale Oberfläche des Epithels. Die Krankheit betrifft mehrere Organsysteme, aber die Mehrheit der Mortalität und Morbidität ist auf CF Lungenerkrankung 7. Der CF Lunge bietet ein einzigartiges Ökosystem für mikrobielle Besiedlung. Der Defekt in Ionentransport verursacht Schleim in den Atemwegen CF aufzubauen, wodurch Mikroumgebungen bestehend aus Aerobic- , mikroaerophilen und anaeroben Abteile durch eine statische nährstoffreichen Schleimhautoberfläche verankert. Diese Umgebung ermöglicht die Ansiedlung und Vermehrung von Mikroben, wie Viren, Bakterien und Pilze. Akute und chronische Lungen mikrobiellen Infektionen führen zu konstant, aber unwirksam Immunantworten, was zu umfangreiche Umbau der Atemwege, Verlust der Lungenkapazität und letztlich Pulmonary Versagen. Bakteriengemeinschaften mit der CF-Lunge verbunden sind gut beschrieben mit beiden Kultur-abhängigen und kulturunabhängige Ansätze, die mit 16S ribosomale RNA (rRNA) Gensequenzierung 8 und Schrotflinte Metagenomik 9,10 umfassen. Das 16S-rRNA-basierten Ansatz in der Lage, eine breite Palette von Mikrobenarten zu charakterisieren und zu erfassen breiten Verschiebungen Community Vielfalt. Es wird jedoch in seiner Entschließung bei der Festlegung der Gemeinschaften begrenzt (in Claesson et al zusammengefasst. 2010 11) und die Vorhersagen von Stoffwechselpotentiale zu diesen allgemeinen Funktionen für die Taxa identifiziert bekannte begrenzt. Daher sind 16S-rRNA-Gen-Sequenzierungsverfahren nicht ausreichend für die notwendige taxonomische und funktionelle analytische Genauigkeit der verschiedenen Mikroben in CF Lunge vorhanden Gemeinden. Die hier beschriebene Metagenom-Ansatz ergänzt die 16S-rRNA-basierten Ansatz, überwindet seine Grenzen, und ermöglicht eine relativ effektive Artum sowohl die mikrobielle Gemeinschaft Taxonomie und genetische Inhalte in CF Lungen analysieren. Mikrobielle DNA aus Tierassoziierte Proben isoliert enthält häufig eine große Menge an Wirts-DNA. CF Sputum oder Lungengewebeproben enthalten üblicherweise eine große Menge von Human-DNA durch Neutrophile bei der Immunreaktion freigesetzt wird, häufig mehr als 99% der Gesamt-DNA von 12 bis 14. Obwohl einige intakte humane Zellen vorhanden sein können, die meisten dieser DNA frei in Lösung oder an der Oberfläche der Keime adsorbieren. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von außerordentlich viskose Schleimpfropfen, Zelltrümmern und anderen unbekannten Verunreinigungen weiter zu komplizieren Isolierung von mikrobiellen Zellen. Mehrere Verfahren wurden zur Abreicherung diese Proben menschlicher DNA, einschließlich Percoll Gradienten verschiedener menschlicher aus mikrobiellen Zellen 15, die Behandlung mit DNase I, Ethidiumbromid Monoazid um selektiv menschliche DNA 16 und die MolYsis Kit, alle mit begrenztem Erfolg verschlechtern getestet.<html> Um eine möglichst wirkungsvolle mikrobiellen DNA Reinigungsverfahren für CF Sputum Termin wurde eine Modifikation der von Breitenstein et al beschriebenen Verfahren (1995). 17. Dieser Ansatz, der hierin als hypotonische Lyse (HL) Verfahren bekannt ist, verwendet eine Kombination von β-Mercaptoethanol Mucin Disulfidbindungen hypotonische Lyse von eukaryotischen Zellen und DNase I-Behandlung von löslichen DNA 9 reduzieren. Trotz des Mangels an Alternativen der HL Verfahren Anlass zu Bedenken wegen (i) mögliche Verzerrungen von unerwünschten Lyse von Mikroben und (ii) resultierenden, ob die beobachteten Schwankungen der Gemeinschaft Zusammensetzung 9,10 sind ein Artefakt der Varianten mit der Probe assoziiert ist. Zusätzlich zu der Erzeugung von Shotgun metagenomes sprechen wir diese Probleme durch Vergleich der 16S-rRNA-Gen-Profile der gesamten DNA und der HL-Methode unter Verwendung des gleichen Satzes von Sputum-Proben von einem Patienten in sieben aufeinanderfolgenden Tagen gesammelt extrahierte mikrobielle DNA. ent &quot;&gt; Im Vergleich zu mikrobiellen Gemeinschaften, ist die Charakterisierung von viralen Gemeinden mit Tieren verbunden begrenzte 18,19 Die viralen Gemeinden in CF Atemwege haben nur minimal 20 gekennzeichnet worden -.. 22 Die erste Metagenom-Studie die Charakterisierung der DNA von viralen Gemeinden in CF Atemwege zeigten, dass die meisten Viren mit CF Lunge assoziiert sind Phagen 20. Die metabolische Potential des Phagen in CF und nicht-CF Individuen signifikant verschieden war. Insbesondere die Phage Gemeinschaften in Einzelpersonen CF geführt Gene reflektierende bakterieller Wirts Anpassungen an die Physiologie des CF Atemwege, und bakteriellen Virulenz 20. Im Anschluss Metagenom-Untersuchungen von Viren in CF Lungengewebe zeigten deutliche räumliche Heterogenität der Virus Gemeinden zwischen anatomischen Regionen 22. Darüber hinaus hegte CF Lungengewebe die niedrigste bisher in jedem Ökosystem 22 beobachtet virale Vielfalt. Die meisten Viren identifiziert wurden Phagenmit dem Potential, CF Pathogenen zu infizieren. Jedoch wurden eukaryotischen Viren, wie Herpes-Viren, Adenoviren und menschlichen Papilloma-Viren (HPV) erkannt. In einem Fall, wo Zysten im Lungengewebe wurden bei der Präparation beobachtet wurde, wurde mehr als 99% eines menschlichen Papillomavirus-Genom gewonnen, obwohl der Patient noch nie mit einem Lungen Papillom oder Karzinom diagnostiziert. Dies zeigt, dass die Virus bestehenden Vielfalt spiegelt nicht nur die Schwere der Gewebeschädigung, kann aber auch aussetzen und zu erklären, eine zugrunde liegende nicht charakterisierte Krankheit. Die hier beschriebenen Protokolle bieten eine einfache, aber leistungsfähige Methode, um Virusähnlichen Partikeln (VLPs) von Proben, die von großen Mengen zähen Schleim, Host und mikrobiellen Zellen, freie DNA sowie Zelltrümmer aus isolieren. Ergänzend Metagenomik ist metatranscriptomics verwendet, um die Dynamik in der Genexpression in der mikrobiellen Gemeinschaft und dem Host 9,23 überwachen. In diesem Fall werden sowohl mikrobielle und Host mRNA müssen bevorzugt ausgewählt werden. Da bakterielle mRNAs nicht polyadenyliert kann ein Oligo-dT-basierten mRNA-Pulldown-Verfahren nicht genutzt werden. Polyadenylierungs-abhängigen RNA-Amplifikation nicht in Host-assoziierte Proben verwendet werden, wenn die Proben bekannt, große Mengen von eukaryotischen mRNA enthält. Viele Tierassoziierte Proben, einschließlich CF Sputum, enthalten eine hohe Dichte der Zellen zusätzlich zu hohe Mengen von Zelltrümmern und Nukleasen, die RNasen einschließen. Daher ist eine weitere Herausforderung umfangreiche RNA-Abbau während der Verarbeitung zu verhindern metatranscriptome. In den meisten Fällen ist der Gesamt-RNA aus CF Sputum extrahiert teilabgebauten, Begrenzen der nachfolgenden Anwendungen und Nutzen des abgeleiteten RNA. In den letzten Jahren verschiedene Ansätze für rRNA Depletion wurden entwickelt und im Handel erhältlichen Kits geeignet. Die Wirksamkeit dieser Ansätze ist jedoch begrenzt, vor allem bei der Arbeit mit teilweise abgebaut rRNA 9,24. Die hier eingesetzten Verfahren erlaubened für das Abfragen von partiell abgebaute Gesamt-RNA für eine effiziente nachgeschaltete Gesamt rRNA Entfernung. Direkter Vergleich der Effizienz in rRNA Entfernung aus teilabgebauten gesamten RNA Vergleich von zwei verschiedenen Kits wurde von Lim et al veranschaulicht. (2012) 9. Insgesamt ist es das Ziel dieses Manuskripts zu einem kompletten Satz von Protokollen (Abbildung 1), um virale und mikrobielle shotgun metagenomes erzeugen und eine metatranscriptome bereitzustellen, aus einem einzigen Tier assoziierten Probe unter Verwendung induzierter Sputumprobe als Beispiel. Molekulare Labor-Workflow sollten getrennt vor und nach Verstärkung Bereiche umfassen, um eine Kreuzkontamination zu minimieren. Die Methoden sind einfach an anderen Probentypen wie Gewebe 22, Nasen-Rachen-und Oropharynxabstriche 25, Bronchiallavage (BAL) und Korallen (unveröffentlichte Daten). Jede Probe sollte sofort nach der Entnahme verarbeitet vor allem, wenn mikrobielle Metagenomik und eingehalten werdenatranscriptomics Studien erwünscht. Wenn die Proben eingefroren, schränkt sie die Isolierung der intakten mikrobiellen Zellen auf mikrobielle Metagenomen das Einfrieren möglicherweise zu einer Störung der Zellintegrität. Allerdings bedeutet Gefrieren nicht metatranscriptomics und Virusisolierung, aber die Qualität der RNA und der Menge von Viruspartikeln gewonnen kann durch die Frost-Tau-Prozeß betroffen auszuschließen. Es ist wichtig zu beachten, dass induzierten Sputum hat als primäre Quelle der Proben in vielen Studien mit erwachsenen CF-Patienten und anderen chronischen Lungenerkrankungen 26,27 verbunden als BAL kann zu invasiv werden serviert. In unseren Studien wurden Sputum-Proben mit einer sorgfältigen und konsistenten Methode, dh, nach Mundwasser und Spülen der Mundhöhle mit steriler Kochsalzlösung zur oralen Mikroorganismen Kontamination innerhalb der Sputum-Proben auf ein Minimum gesammelt.

<table><tbody><tr><td>Guanidin-Isothiocyanat-basierter RNA-Lysepuffer</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>TRIzol LS Reagenz wurde in dieser Studie verwendet</td></tr><tr><td>Kieselsäurekügelchen; 0,1 bis 0,15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>Zirkonoxid-Silikat-Kügelchen wurden in dieser Studie verwendet</td></tr><tr><td>Dithiothreitol, molekulare Qualität (trockenes Pulver)</td><td>Promega</td><td>V3155</td><td>Kann von jedem anderen Unternehmen</td></tr> <tr><td>erworben werdenSteriler Spritzenvorsatzfilter; 0,45 &Mikro; m Porengröße hydrophile PVDF-Membran</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>DNase I Enzym&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Spritzenvorsatzfilter; 0,02 & Mikro; m Porengröße</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>Durchmesser: 25 mm</td></tr><tr><td>Ultraklare Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &frac12; in. (14 x 90 mm), geeignet für SW41 Ti Rotor und VLPs Dichtegradienten-Ultrazentrifugation</td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 Festwinkelrotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA-Polymerase</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&micro; l</td></tr><tr><td>Phi29 Random Hexamer</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>Zuvor bei Fidelity Systems gekauft</td></tr><tr><td>Aluminiumoxid-Matrixfilter mit ringförmigem Polypropylen-Stützring; 0,02 & Mikro; m Porengröße</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>Whatman Anodisc Filtermembranen wurden in dieser Studie verwendet; Durchmesser 25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Gold Nukleinsäure-Gelfärbung</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNase-freie DNase I&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Kann von jedem anderen Unternehmen erworben werden</td></tr><tr><td>Glykogen, RNA-Qualität</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>Kann von jedem anderen Unternehmen erworben werden</td></tr><tr><td>Oak Ridge Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>Für großvolumige DNA-Extraktionsverfahren, geeignet für SS-34-Rotor mit festem Winkel</td></tr><tr><td>Gesamt-rRNA-Entfernungskit</td><td>Epicenter</td><td>MRZE724</td><td>Das ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiologie) kann verwendet werden, um die Entfernung von rRNA mit der Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek zu koppeln</td></tr><tr><td>Cäsiumchlorid&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecytrimethyl-Ammoniumbromid (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

reinigung der unreine: sequencing metagenomen und metatranscriptomes von complex tierassoziierte proben

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Die Zugänglichkeit der Hochdurchsatz-Sequenzierung hat viele Bereiche der Biologie revolutioniert. Um Host-assoziierten viralen und mikrobiellen Gemeinschaften besser zu verstehen, wurde ein umfassendes Workflow für die DNA- und RNA-Extraktion entwickelt. Der Workflow gleichzeitig erzeugt viralen und mikrobiellen Metagenomen sowie metatranscriptomes, aus einer einzigen Probe für Next-Generation-Sequencing. Die Kopplung dieser Ansätze bietet einen Überblick über sowohl die taxonomischen Eigenschaften und den Community-Funktionen codiert. Die vorgestellten Methoden Mukoviszidose (CF) Sputum, eine problematische Probentyp, weil es außerordentlich zäh und enthält hohe Menge an Schleimstoffen, frei von Neutrophilen DNA und andere unbekannte Verunreinigungen. Die hier beschriebenen Protokolle zielen diese Probleme und erfolgreich wiederherzustellen viralen und mikrobiellen DNA mit minimaler menschlicher DNA-Kontamination. Um die Metagenomik Studien zu ergänzen, wurde eine metatranscriptomics Protokoll optimiert, um sowohl die mikrobielle erholenund Host-mRNA, die nur relativ wenige ribosomale RNA (rRNA) Sequenzen enthält. Eine Übersicht über die Datenmerkmale wird präsentiert, um als Referenz für die Beurteilung des Erfolgs der Methoden dienen. Zusätzliche CF Sputum-Proben wurden auch auf (i) die Konsistenz der microbiome Profile in sieben aufeinander folgenden Tagen zu bewerten innerhalb eines einzelnen Patienten, und (ii) Vergleichen der Konsistenz von Metagenom-Ansatz zu einer ribosomalen 16S-RNA-Gen-basierte Sequenzierung gesammelt. Die Ergebnisse zeigten, dass eine tägliche Schwankung mikrobiellen Profile ohne Antibiotikum Störung war minimal und die Taxonomie Profile der gemeinsamen CF-assoziierten Bakterien waren sehr ähnlich zwischen den 16S rDNA-Bibliotheken und metagenomes vom hypotonische Lyse (HL) stammenden DNA erzeugt. Jedoch sind die Unterschiede zwischen den 16S rDNA taxonomischen Profile Gesamt-DNA und HL-abgeleiteten DNA erzeugt vorschlagen, dass hypotonische Lyse und die Waschschritte nicht nur das Entfernen des vom Menschen stammenden DNA zu profitieren, sondern auch mikrobielle extracellular DNA, die die tatsächlichen mikrobiellen Profile falsch darstellen kann.

Mit der Mukoviszidose Atemwege als Beispiel präsentiert das Manuskript eine umfassende Workflow mit einer Kombination aus Metagenom und metatranscriptomic Ansätze, um die mikrobiellen und viralen Gemeinden in Tierassoziierte Proben zu charakterisieren.

Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, komplexe wirtsassoziierte Proben wie Mukoviszidose-Sputum zu sammeln und zu verarbeiten, um die viralen und mikrobiellen Gemeinschaften mit metagenomischen und metatranskriptomischen Ansätzen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem der Proband zunächst 7%ige hypertone Kochsalzlösung über einen Vernebler inhaliert und dann über einen Zeitraum von 30 Minuten induzierte Sputumproben sammelt. Als nächstes wird die Probe sofort homogenisiert und gleichmäßig auf vier Röhrchen verteilt, die als virales Metagenom, mikrobielles Metagenom, Metatranskriptom und zusätzliches Sputum gekennzeichnet sind.Als nächstes wird das Meta-Transkriptom-Röhrchen versiegelt, horizontal platziert und das Sputum 10 Minuten lang bei mittlerer Geschwindigkeit homogenisiert. Schließlich werden einzelne Aliquots separat verarbeitet, um virale oder bakterielle Zellen vor der Nukleinsäureisolierung für metagenomische Studien zu isolieren und zu reinigen. Letztendlich werden die isolierten Nukleinsäuren für die Erstellung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsbibliotheken verwendet, um Metagenomik- und Metatranskriptomik-Bibliotheken zu generieren.Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es einen umfassenden Arbeitsablauf für die Verarbeitung komplexer wirtsassoziierter Proben für die Untersuchung von Virus- und Bakteriengemeinschaften auf DNA- und RNA-Ebene bietet. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Probenvorbehandlung wichtig sind, um eine ordnungsgemäße Handhabung der Probe zu gewährleisten, während die Aufreinigungsschritte der viralen und mikrobiellen Zellen schwer zu erlernen sind. Aufgrund der Komplexität des Verfahrens Vor der Probenentnahme sind vier 15-Milliliter-Röhrchen pro Probe mit den folgenden Angaben zu beschriften, das erste mit dem viralen Metagenom: das zweite als mikrobielles Metagenom Nummer drei mit Meta-Transkriptom und Röhre Nummer vier als zusätzliches Sputum. Geben Sie zwei Milliliter 0,1 Millimeter großer Kieselsäurekügelchen in das Röhrchen mit der markierten Meta-Transkriptom, gefolgt von sechs Millilitern RNA-Lysepuffer auf Guinea-Isothiocyanat-Basis oder GITC-Lysepuffer.Befolgen Sie das im Textprotokoll beschriebene Verfahren zur Probenentnahme und verwenden Sie Probenbecher vor dem Waten, schätzen Sie das Probenvolumen, indem Sie den Becher nach der Probenentnahme wiegen und das Gewicht des leeren Bechers subtrahieren. Für das verbleibende Gewicht entspricht ein Gramm einem Milliliter Probe. Wenn das Volumen der Probe weniger als acht Milliliter beträgt, fügen Sie das entsprechende Volumen von 0,02 Mikrometer gefiltertem XPBS hinzu, um das endgültige Volumen auf acht Milliliter zu erhöhen.Verwenden Sie dann sofort eine Drei-Milliliter-Spritze, um die Probe zu homogenisieren, bis keine sichtbaren Klumpen mehr im Sputum zurückbleiben, ziehen Sie mit derselben Spritze sofort zwei Milliliter Sputum auf und injizieren Sie es in das Mikrotranskriptomröhrchen, das die Kieselsäurekügelchen und den GITC-Lysepuffer enthält. Schließen Sie den Deckel und verwenden Sie Para-Folie, um den Deckel sicher zu verschließen Um ein Auslaufen zu vermeiden, verwenden Sie einen Wirbel, Sir, um den Auswurf sofort 10 Minuten lang bei mittlerer Geschwindigkeit zu homogenisieren. Unter Verwendung derselben Spritze aliquotiert man jeweils zwei Milliliter Sputum in die mit vira metagenom und mikrobielles Metagenom gekennzeichneten Röhrchen und überträgt das restliche Sputum aus dem Sputumbecher in das mit extra Sputum beschriftete Röhrchen.Lagern Sie alle Röhrchen bei vier Grad Celsius oder auf Eis und transportieren Sie sie bei Bedarf ins Labor, um ein virales Metagenom zu erzeugen. Nach der Herstellung von Puffern und Lösungen. Die Proben werden vorbehandelt, indem Sie 0,02 Mikrometer filtrierten salzhaltigen Magnesiumpuffer auf ein Gesamtvolumen von sechs Millilitern zugeben.Um die Schleimauflösung zu unterstützen, fügen Sie jeder Probe sechs Milliliter 6,5 Millimolar DTT hinzu. Zum Mischen kräftig vortexen und eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach kräftigem Vortexen drehen sich die Proben erneut bei 3056 G und 10 Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten.Sammeln Sie jeden Überstand in einem neuen 15-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie anschließend einen 45-Mikrometer-Punktfilter, der auf einer Spritze montiert ist, um die Überstände in neue 15-Milliliter-Röhrchen zu filtern. Entnehmen Sie 100 Mikroliter der Probe in ein Mikro-Fuge-Röhrchen und führen Sie dann eine Chloroform-Behandlung durch.Extrahieren Sie den Überstand und führen Sie eine DN-Eins-Behandlung durch. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 4%para Formaldehyd hinzu, um die Probe zu fixieren. Für die Epi-Fluoreszenzmikroskopie finden Sie im Textprotokoll einen umfassenden Ansatz zur Anreicherung von Viruspartikeln.Andernfalls wird unter Verwendung frisch zubereiteter Cäsiumchlorid-Lösungen ein Cäsiumchlorid-Gradient eingerichtet, indem ein Milliliter von 1,7 Gramm pro Milliliter Cäsiumchlorid-Lösung in jedes Röhrchen geladen wird, gefolgt von einem Milliliter von 1,5 Gramm pro Milliliter, einem Milliliter von einem Punkt 35 Gramm pro Milliliter und schließlich einem Milliliter von 1,2 Gramm pro Milliliter Cäsiumchlorid-Lösung. Zum Schluss werden sechs bis acht Milliliter Probe in einzelne Gradientenröhrchen gefüllt. Markieren Sie einzelne Layer, um die Position der einzelnen Brüche zu kennzeichnen.Gleichen Sie dann jedes gegenüberliegende Zweierpaar auf ein Milligramm genau aus. Verriegeln Sie jedes Rohr vorsichtig mit dem Schleudereimer. Auf den Rotor laden und bei 82.844 g und vier Grad Celsius zwei Stunden lang zentrifugieren.Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren die Röhrchen vorsichtig aus dem Halter, ohne die Dichtegradienten zu stören, mit einer 18-Gauge-Nadel, die an einer Drei-Milliliter-Spritze befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass das offene Ende der Nadel nach oben zeigt. Durchstechen Sie das Röhrchen knapp unter der Dichteschicht von 1,5 Gramm pro Milliliter und ziehen Sie langsam etwa 1,5 Milliliter Lösung in die Spritze.Entfernen Sie langsam die Nadel und lassen Sie die verbleibende Fraktion im Röhrchen durch die Punktion in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen tropfen. Beschriften Sie dies als obere Fraktion Taille: Übertragen Sie die Lösung in der Spritze, die das V ps enthält, in zwei neue Mikrofuge-Röhrchen. Sobald die Puffer und Lösungen gemäß dem Textprotokoll hergestellt wurden, werden fünf Volumina mit einem filtrierten XPBS von einem XPBS mit einem Mikrometer von 22 Mikrometer zugegeben. Um jedes Homogenat unter einer chemischen Haube zu verdünnen, fügen Sie Beta-MAR-Capta-Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 2 Vol.-% hinzu und rocken Sie das Gemisch nach der Inkubation zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.Schleudern Sie die Probe 15 Minuten lang bei 3056 GS und 10 Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, verwenden Sie 10 Milliliter Wasser in molekularer Qualität, um das Pellet wieder zu suspendieren und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren, bevor Sie die Wäsche wiederholen. Nach einer letzten Drehung und nachdem das SUP-Natin verworfen wurde, verwenden Sie fünf Milliliter eines XDNA-Puffers, um das Pellet wieder zu suspendieren, bevor Sie 15 Mikroliter ds hinzufügen.Eine pro Milliliter Probe Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und mischen Sie sie zwei Stunden lang. Nach dem Schleudern der Proben und dem Verwerfen des Snats verwenden Sie 10 Milliliter SE-Puffer, um das Pellet wieder zu suspendieren. Schleudern Sie dann die Probe und wiederholen Sie den Waschvorgang.Verwenden Sie zwei Milliliter SE-Puffer, um das Pellet zu resuspendieren, und übertragen Sie die Suspension in zwei Mikrofuge-Röhrchen. Anschließend die Röhren bei 16.000 GS bei Raumtemperatur 15 Minuten lang drehen. Verwenden Sie schließlich nach dem Entfernen des Überstands ein genomisches DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen für grampositive Bakterien.Um die DNA zu isolieren, werden hier frühere Ergebnisse zur Generierung viraler Metagenome zusammengefasst. Die Virome enthalten nur wenige vom Menschen stammende Sequenzen, wobei nur eine Probe 70 % der menschlichen DNA-Probe CCF vier A aus dem Dichtegradienten-Ultrazentrifugationsschritt ausließ und daher mehr als 97 % vom Menschen stammende Sequenzen enthielt. Diese Abbildung zeigt ein Fluoreszenzbild einer typischen CF-Sputumprobe vor und nach der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation.Klare vlp wurden in Abwesenheit von großen Partikeln nach der hier gezeigten Trennung durch Dichtegradienten beobachtet. Sieben tägliche Sputumproben wurden von einem einzigen Mukoviszidose-Patienten entnommen, der mit oralen Antibiotika begann. Nach dem dritten Tag der Entnahme lag die Gesamtausbeute an hypotoner Lyse oder HL-DNA, die aus jeder Probe entnommen wurde, zwischen 210 Nanogramm und mehr als fünf Mikrogramm aus den Illumina-Sequenzierungsbibliotheken, die für jede Probe generiert wurden.Alle bis auf eine Bibliothek ergaben mehr als 1 Million Sequenzen, und mehr als 85 % Sequenzen von hoher Qualität wurden bei der Datenvorverarbeitung beibehalten. Unter Verwendung der Print-Seq-Software lag die Gesamtmenge der vom Menschen abgeleiteten Sequenzen zwischen 14 % und 46 %Wie hier gezeigt, sind die mikrobiellen Profile der Teilproben den Proben nach zwei hypotonen Lysebehandlungen sehr ähnlich. Darüber hinaus erhöht die zweite hypotone Lyse den Anteil nicht-menschlicher Sequenzen innerhalb der Metagenome um sechs bis 17 %.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit klinischen Proben und potenziellen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann. Persönliche Schutzausrüstung sollte während der Probenhandhabung immer verwendet werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sind gute molekularbiologische und mikrobiologische Techniken erforderlich, um sicherzustellen, dass keine Kontamination erfolgt.Nach diesem Verfahren sollten Sie in der Lage sein, virale und mikrobielle metagenomische sowie metatranskriptomische Studien an komplexen Proben wie CF-Sputum durchzuführen.

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Forschung

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Biology

Biologie

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