Reinigung der Unreine: Sequencing Metagenomen und Metatranscriptomes von Complex Tierassoziierte Proben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, komplexe wirtsassoziierte Proben wie Mukoviszidose-Sputum zu sammeln und zu verarbeiten, um die viralen und mikrobiellen Gemeinschaften mit metagenomischen und metatranskriptomischen Ansätzen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem der Proband zunächst 7%ige hypertone Kochsalzlösung über einen Vernebler inhaliert und dann über einen Zeitraum von 30 Minuten induzierte Sputumproben sammelt. Als nächstes wird die Probe sofort homogenisiert und gleichmäßig auf vier Röhrchen verteilt, die als virales Metagenom, mikrobielles Metagenom, Metatranskriptom und zusätzliches Sputum gekennzeichnet sind.

Als nächstes wird das Meta-Transkriptom-Röhrchen versiegelt, horizontal platziert und das Sputum 10 Minuten lang bei mittlerer Geschwindigkeit homogenisiert. Schließlich werden einzelne Aliquots separat verarbeitet, um virale oder bakterielle Zellen vor der Nukleinsäureisolierung für metagenomische Studien zu isolieren und zu reinigen. Letztendlich werden die isolierten Nukleinsäuren für die Erstellung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsbibliotheken verwendet, um Metagenomik- und Metatranskriptomik-Bibliotheken zu generieren.

Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es einen umfassenden Arbeitsablauf für die Verarbeitung komplexer wirtsassoziierter Proben für die Untersuchung von Virus- und Bakteriengemeinschaften auf DNA- und RNA-Ebene bietet. Die visuelle Demonstration dieses Verfahrens ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Probenvorbehandlung wichtig sind, um eine ordnungsgemäße Handhabung der Probe zu gewährleisten, während die Aufreinigungsschritte der viralen und mikrobiellen Zellen schwer zu erlernen sind. Aufgrund der Komplexität des Verfahrens Vor der Probenentnahme sind vier 15-Milliliter-Röhrchen pro Probe mit den folgenden Angaben zu beschriften, das erste mit dem viralen Metagenom: das zweite als mikrobielles Metagenom Nummer drei mit Meta-Transkriptom und Röhre Nummer vier als zusätzliches Sputum. Geben Sie zwei Milliliter 0,1 Millimeter großer Kieselsäurekügelchen in das Röhrchen mit der markierten Meta-Transkriptom, gefolgt von sechs Millilitern RNA-Lysepuffer auf Guinea-Isothiocyanat-Basis oder GITC-Lysepuffer.

Befolgen Sie das im Textprotokoll beschriebene Verfahren zur Probenentnahme und verwenden Sie Probenbecher vor dem Waten, schätzen Sie das Probenvolumen, indem Sie den Becher nach der Probenentnahme wiegen und das Gewicht des leeren Bechers subtrahieren. Für das verbleibende Gewicht entspricht ein Gramm einem Milliliter Probe. Wenn das Volumen der Probe weniger als acht Milliliter beträgt, fügen Sie das entsprechende Volumen von 0,02 Mikrometer gefiltertem XPBS hinzu, um das endgültige Volumen auf acht Milliliter zu erhöhen.

Verwenden Sie dann sofort eine Drei-Milliliter-Spritze, um die Probe zu homogenisieren, bis keine sichtbaren Klumpen mehr im Sputum zurückbleiben, ziehen Sie mit derselben Spritze sofort zwei Milliliter Sputum auf und injizieren Sie es in das Mikrotranskriptomröhrchen, das die Kieselsäurekügelchen und den GITC-Lysepuffer enthält. Schließen Sie den Deckel und verwenden Sie Para-Folie, um den Deckel sicher zu verschließen Um ein Auslaufen zu vermeiden, verwenden Sie einen Wirbel, Sir, um den Auswurf sofort 10 Minuten lang bei mittlerer Geschwindigkeit zu homogenisieren. Unter Verwendung derselben Spritze aliquotiert man jeweils zwei Milliliter Sputum in die mit vira metagenom und mikrobielles Metagenom gekennzeichneten Röhrchen und überträgt das restliche Sputum aus dem Sputumbecher in das mit extra Sputum beschriftete Röhrchen.

Lagern Sie alle Röhrchen bei vier Grad Celsius oder auf Eis und transportieren Sie sie bei Bedarf ins Labor, um ein virales Metagenom zu erzeugen. Nach der Herstellung von Puffern und Lösungen. Die Proben werden vorbehandelt, indem Sie 0,02 Mikrometer filtrierten salzhaltigen Magnesiumpuffer auf ein Gesamtvolumen von sechs Millilitern zugeben.

Um die Schleimauflösung zu unterstützen, fügen Sie jeder Probe sechs Milliliter 6,5 Millimolar DTT hinzu. Zum Mischen kräftig vortexen und eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach kräftigem Vortexen drehen sich die Proben erneut bei 3056 G und 10 Grad Celsius für 15 bis 20 Minuten.

Sammeln Sie jeden Überstand in einem neuen 15-Milliliter-Röhrchen. Verwenden Sie anschließend einen 45-Mikrometer-Punktfilter, der auf einer Spritze montiert ist, um die Überstände in neue 15-Milliliter-Röhrchen zu filtern. Entnehmen Sie 100 Mikroliter der Probe in ein Mikro-Fuge-Röhrchen und führen Sie dann eine Chloroform-Behandlung durch.

Extrahieren Sie den Überstand und führen Sie eine DN-Eins-Behandlung durch. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 4%para Formaldehyd hinzu, um die Probe zu fixieren. Für die Epi-Fluoreszenzmikroskopie finden Sie im Textprotokoll einen umfassenden Ansatz zur Anreicherung von Viruspartikeln.

Andernfalls wird unter Verwendung frisch zubereiteter Cäsiumchlorid-Lösungen ein Cäsiumchlorid-Gradient eingerichtet, indem ein Milliliter von 1,7 Gramm pro Milliliter Cäsiumchlorid-Lösung in jedes Röhrchen geladen wird, gefolgt von einem Milliliter von 1,5 Gramm pro Milliliter, einem Milliliter von einem Punkt 35 Gramm pro Milliliter und schließlich einem Milliliter von 1,2 Gramm pro Milliliter Cäsiumchlorid-Lösung. Zum Schluss werden sechs bis acht Milliliter Probe in einzelne Gradientenröhrchen gefüllt. Markieren Sie einzelne Layer, um die Position der einzelnen Brüche zu kennzeichnen.

Gleichen Sie dann jedes gegenüberliegende Zweierpaar auf ein Milligramm genau aus. Verriegeln Sie jedes Rohr vorsichtig mit dem Schleudereimer. Auf den Rotor laden und bei 82.844 g und vier Grad Celsius zwei Stunden lang zentrifugieren.

Entfernen Sie nach dem Zentrifugieren die Röhrchen vorsichtig aus dem Halter, ohne die Dichtegradienten zu stören, mit einer 18-Gauge-Nadel, die an einer Drei-Milliliter-Spritze befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass das offene Ende der Nadel nach oben zeigt. Durchstechen Sie das Röhrchen knapp unter der Dichteschicht von 1,5 Gramm pro Milliliter und ziehen Sie langsam etwa 1,5 Milliliter Lösung in die Spritze.

Entfernen Sie langsam die Nadel und lassen Sie die verbleibende Fraktion im Röhrchen durch die Punktion in ein neues 15-Milliliter-Röhrchen tropfen. Beschriften Sie dies als obere Fraktion Taille: Übertragen Sie die Lösung in der Spritze, die das V ps enthält, in zwei neue Mikrofuge-Röhrchen. Sobald die Puffer und Lösungen gemäß dem Textprotokoll hergestellt wurden, werden fünf Volumina mit einem filtrierten XPBS von einem XPBS mit einem Mikrometer von 22 Mikrometer zugegeben. Um jedes Homogenat unter einer chemischen Haube zu verdünnen, fügen Sie Beta-MAR-Capta-Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 2 Vol.-% hinzu und rocken Sie das Gemisch nach der Inkubation zwei Stunden lang bei Raumtemperatur.

Schleudern Sie die Probe 15 Minuten lang bei 3056 GS und 10 Grad Celsius. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, verwenden Sie 10 Milliliter Wasser in molekularer Qualität, um das Pellet wieder zu suspendieren und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zu inkubieren, bevor Sie die Wäsche wiederholen. Nach einer letzten Drehung und nachdem das SUP-Natin verworfen wurde, verwenden Sie fünf Milliliter eines XDNA-Puffers, um das Pellet wieder zu suspendieren, bevor Sie 15 Mikroliter ds hinzufügen.

Eine pro Milliliter Probe Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und mischen Sie sie zwei Stunden lang. Nach dem Schleudern der Proben und dem Verwerfen des Snats verwenden Sie 10 Milliliter SE-Puffer, um das Pellet wieder zu suspendieren. Schleudern Sie dann die Probe und wiederholen Sie den Waschvorgang.

Verwenden Sie zwei Milliliter SE-Puffer, um das Pellet zu resuspendieren, und übertragen Sie die Suspension in zwei Mikrofuge-Röhrchen. Anschließend die Röhren bei 16.000 GS bei Raumtemperatur 15 Minuten lang drehen. Verwenden Sie schließlich nach dem Entfernen des Überstands ein genomisches DNA-Extraktionskit gemäß den Anweisungen für grampositive Bakterien.

Um die DNA zu isolieren, werden hier frühere Ergebnisse zur Generierung viraler Metagenome zusammengefasst. Die Virome enthalten nur wenige vom Menschen stammende Sequenzen, wobei nur eine Probe 70 % der menschlichen DNA-Probe CCF vier A aus dem Dichtegradienten-Ultrazentrifugationsschritt ausließ und daher mehr als 97 % vom Menschen stammende Sequenzen enthielt. Diese Abbildung zeigt ein Fluoreszenzbild einer typischen CF-Sputumprobe vor und nach der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation.

Klare vlp wurden in Abwesenheit von großen Partikeln nach der hier gezeigten Trennung durch Dichtegradienten beobachtet. Sieben tägliche Sputumproben wurden von einem einzigen Mukoviszidose-Patienten entnommen, der mit oralen Antibiotika begann. Nach dem dritten Tag der Entnahme lag die Gesamtausbeute an hypotoner Lyse oder HL-DNA, die aus jeder Probe entnommen wurde, zwischen 210 Nanogramm und mehr als fünf Mikrogramm aus den Illumina-Sequenzierungsbibliotheken, die für jede Probe generiert wurden.

Alle bis auf eine Bibliothek ergaben mehr als 1 Million Sequenzen, und mehr als 85 % Sequenzen von hoher Qualität wurden bei der Datenvorverarbeitung beibehalten. Unter Verwendung der Print-Seq-Software lag die Gesamtmenge der vom Menschen abgeleiteten Sequenzen zwischen 14 % und 46 %Wie hier gezeigt, sind die mikrobiellen Profile der Teilproben den Proben nach zwei hypotonen Lysebehandlungen sehr ähnlich. Darüber hinaus erhöht die zweite hypotone Lyse den Anteil nicht-menschlicher Sequenzen innerhalb der Metagenome um sechs bis 17 %.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit klinischen Proben und potenziellen Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann. Persönliche Schutzausrüstung sollte während der Probenhandhabung immer verwendet werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens sind gute molekularbiologische und mikrobiologische Techniken erforderlich, um sicherzustellen, dass keine Kontamination erfolgt.

Nach diesem Verfahren sollten Sie in der Lage sein, virale und mikrobielle metagenomische sowie metatranskriptomische Studien an komplexen Proben wie CF-Sputum durchzuführen.