Name: Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Live-Bildgebung des Drosophila-Puppenaugen-Neuroepithels. Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung von Zellgrenzen und das Studium von Entwicklungsprozessen in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken David Larson für die Entwicklung des ursprünglichen Protokolls zur Bildgebung des lebenden Drosophila-Puppenauges. Wir danken unseren Kollegen Richard Carthew, Shoichiro Tsukita und Matthew Freeman, die die transgenen Fliegen entwickelt haben, die wir kombiniert haben, um unsere Live-Imaging-Fliegenschnüre zu erzeugen. Brittany Baldwin-Hunter gab hilfreiche Kommentare zu dem Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Startkapital unterstützt, das Ruth Johnson von der Wesleyan University zur Verfügung gestellt wurde.

3 zeigt eine Zusammenfassung der experimentellen Verfahren. 1. Gewebepräparation <ol><li> Um die Folgen der veränderten Expression eines Gens von Interesse, die folgende Quer in zweifacher Ausfertigung zur Ermittlung und Pflege bei 25 ° C: UAS-Transgen (Männer) X GMR-GAL4; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (jungfräulichen Weibchen) HINWEIS: Um Kontrollgewebe Quer UAS-lacZ erhalten Männchen zu GMR-GAL4; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP Frauen. β-Galactosidase erzeugt keine Mängel in den Zellverhalten in der Netzhaut. </li><li> Um die Wirksamkeit der RNAi Transgenen zu verbessern, Männchen Quer UAS-RNAi, um GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-Katze: GFP, ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b jungfräulichen Weibchen. HINWEIS: Gelegentliche Fehler in das Zellverhalten in retinae Ausdruck Eileiter DCR-2 beobachtet (Daten nicht gezeigt). Wachsamkeit ist empfehlenswert, wenn mit diesem Ansatz. </li><li> Select weiß Pre-Puppen von geeigneten Genotypen und in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wenn die Puppen zum Ausdruck DCR-2, wählen Sie entweder männlich oder weiblich Puppen: Ausdruck der UAS-DCR-2 ist ein Einsatz auf dem X-Chromosom, ist stärker bei Männern. Puppen sollten bei 0 h APF vor Pigmentierung der Puppenhülle sexed werden - die Keimdrüsen der Männchen sind so groß scheinenden Kugeln auf den Seiten der Puppe (etwa ein Drittel aus dem hinteren) sichtbar. </li><li> Mikrozentrifugenröhrchen, die Puppen in einem sauberen Plastikspitze-Box bei 25 ° C inkubieren. Um Austrocknung der Puppen Ort verhindern, dass ein 10 cm 2 Gewebestück, in destilliertem Wasser eingeweicht, in die Spitze-Box. HINWEIS: Wenn die Luftfeuchtigkeit im Tip-Box zu hoch wird die Puppenhülle kann matschig und schwer in den nachfolgenden Schritten zu sezieren werden. </li><li> Inkubieren für angemessene Zeit. Zur Erfassung Zelle Verhalten mit Mustern des Auges verbunden sind, vorzubereiten Puppen für die Bildgebung bei rund 17 Stunden APF, 20 Stunden oder 24-Stunden-APF APF. Siehe Repräsentative Ergebnisse für die weitere Diskussion auf, wenn bestimmte Zelle Verhaltensweisen am besten beobachtet. </li><li> Legen Sie ein Stück frischen doppelseitigem Klebeband auf einem schwarzen Sylgard Dissektion Gericht. Positionieren Sie eine Puppe, Rückenseite nach oben, mit dem Kopf der Puppe mit dem doppelseitigen Klebeband (1A) eingehalten .try nicht, den Brust- und Bauch Regionen der Puppe mit dem doppelseitigen Klebeband haften. Mit einer Pinzette vorsichtig anheben und entfernen Sie das Operculum, den Puppenkopf aus. Reißen entlang der Seite der Puppenhülle um den Bereich um ein Auge aus. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Puppe vom Klebeband. Wenn die Puppe haften bleibt, geben Sie eine kleine Menge von destilliertem Wasser zu dem Übergang zwischen der Puppenhülle und Klebeband, um die Haftung zu schwächen. </li></ol> 2. Montage <ol><li> Konstruktion eines kleinen 15 mm 2 Rahmen aus Löschpapier und ein Loch in der middlethat ist 5,5 mm im Durchmesser (1B). Tauchen Sie ein in destilliertem Wasser und indie Mitte eine Mikroskop-Objektträger. Mit einem 30-ml-Spritze, Squeeze-out eine einheitliche Ring Vaseline das Löschpapier Frame zu umgeben. Sicherzustellen, daß die Vaseline Ring geringfügig höher ist als die Breite der Puppe und daß der Durchmesser des Rings geringfügig kleiner als die Breite eines Deckglases ist. </li><li> Fügen Sie eine kleine Raupe aus Vaseline direkt auf den Objektträger, in das Loch in das Löschpapier (1C) gestanzt .Carefully ordnen Sie die Puppe auf die Seite, von der Vaseline Wulst (1D) unterstützt. </li><li> Legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des Vaseline Ring, so dass er in Kontakt mit dem Epithel über dem Auge Neuroepithel (1D). Komprimieren Sie vorsichtig die Vorbereitung auf das Deckglas gegen die Vaseline verschließen und erzeugen einen kleinen flachen Kontaktfläche zwischen dem Puppenaugenbereich und dem Deckglas. </li></ol> 3. Fluoreszenz-Imaging <ol><li> Bild des Puppenvorbereitung mit einFluoreszenzmikroskop. Alle 7 min Abscheidung Serienschnitte durch den apikalen Domäne des Auges Neuroepithel, in den Bereich der Adhärenzverbindungen. HINWEIS: a) geeignete Serienschnitte sind in der Regel 4-5 pro Z-Stapel von 0,2 um z-Schritten zusammen. b) Unregelmäßigkeiten in der Topologie des Epithels, einschließlich milde Beulen und Falten, kann es schwierig sein Scharf Bilder von großen Gewebebereiche zu erwerben. Während Bildgebung kann ein Teil eines Bereichs von Interesse zu finden, um in-Fokus, und eine Nachbarregion zu out-of-Fokus. Einschließlich ein kleines Tröpfchen destilliertes Wasser zwischen dem Puppen Auge und Deck einige akute Gewebefalten aber nicht beseitigen die leicht unebenen Topologie Eigenschaft der frühen Stadien der Puppenauge Morphogenese. In diesen Fällen überabzutasten das Gewebe durch die Verlängerung der Z-Stapel, bis Scharf Scheiben werden für den gesamten Bereich erworben. c) Aufnahme von Serienschnitten alle 7 min sollten Live-Bildgebung für 3 bis 4 Stunden ohne signifikante redu aktivierenction in der Intensität der GFP-Fluoreszenz, die die Bildqualität beeinträchtigen können. Kürzere Zeitintervalle können die Gesamtzeit der Bildgebung zu reduzieren. </li><li> Weiter Bildgebung für 3 bis 4 Stunden. Verwenden Sie keinen Autofokus und Zeitfunktion, die auf vielen Fluoreszenz-Mikroskope zur Verfügung steht, da Puppen Wachstum und Pumpen der Hämolymphe bewegt sich die Position der Netzhaut und wachsam Neuausrichtung benötigt jede 14 bis 21 min. Beachten Sie, dass Bildgebung über 4 Stunden kann verlangsamen oder zum Stillstand Morphogenese des Auges. </li><li> Verwenden Sie geeignete Entfaltungssoftware Hintergrund zu verringern und den Kontrast der seriellen Schnittbilder. Für jede Z-Stapel-Datei, führen Sie das folgende in LAS AF Software (siehe Tabelle der Werkstoffe): Wechseln Sie zum Werkzeugfenster, wählen Sie 3D Dekonvolution und klicken Sie auf Übernehmen. </li><li> Erzeugen Sie eine maximale Projektion (MP) für jeden entfaltet Stack-Datei: Navigieren Sie zu der Werkzeugleiste, wählen Sie 3D-Projektion und klicken Sie auf Übernehmen. Hinweis: Die maximale Projektionsalgorithmus kann fehlschlagen, ein einheitliches erzeugenly Bild in-Fokus für Gewebe, die überabgetastete hat. Ein Verfahren zum Schärfen von out-of-focus-Regionen in Schritt 5.2 beschrieben sind. </li></ol> 4. Post-Bildgebung Pupal Rettungs- und Phänotyp Verification <ol><li> Um Adresse, ob Artefakte eingeführt wurden oder die Puppe während der Bildgebung zu Schaden, entfernen Sie vorsichtig die Puppe von der Bild rig: mit einer Pinzette entfernen Sie die Deckglas und übertragen Sie die Puppe in eine saubere Phiole von Lebensmitteln. Bei einer Raumtemperatur oder 25 ° C, bis die erwachsene Fliege auftaucht. </li><li> Sorgfältig prüfen, den Phänotyp der erwachsenen Auge und im Vergleich zu den Augen der erwachsenen Fliegen, die aus dem ursprünglichen Flug Kreuz. </li></ol> 5. Bildverarbeitung <ol><li> Automatische Bildausrichtung: HINWEIS: Die Live Drosophila Gewebe verschieben und zu wachsen in der gesamten Abbildungsprozesses. Folglich sind die Mitten der Bilder gesammelt zu aufeinanderfolgenden Zeitpunkte nicht auf den gleichen Punkt in der Drosophila Gewebe entsprechen. Neben dergesamte Retina Scheibe dreht sich um 30 ° zwischen ~ 21 und 23 h APF. Um einzelne Zelle Verhaltensweisen hervorheben und Ablenkungen durch organismal Wachstum zu reduzieren, richten Sie jeden MP image.While dies kann manuell durchgeführt werden, die Bildbearbeitungs-Software verwendet hier (siehe Tabelle der Materialien) verfügt über eine integrierte Algorithmen, die den Prozess zu beschleunigen kann. <ol><li> Von der Registerkarte Datei im Hauptmenü geöffnet Scripts und wählen Sie Dateien in Stapel laden. </li><li> Importieren Sie die MP-Bilddateien in das Panel laden Layer und wählen Sie OK. Stellen Sie sicher, dass der Versuch, die Bilder-Option Quelle automatisch ausrichten nicht aktiviert ist. HINWEIS: Wenn diese Option aktiviert ist, kann die Software eine Alignment-Algorithmus, der die Bilddaten verfälscht verwenden. </li><li> Sobald alle MP-Dateien in die Ebenen-Fensterbereich geladen werden, um sicherzustellen, dass alle Bilder in chronologischer Reihenfolge, so dass der früheste Zeitpunkt ist an der Spitze des Schichtstapels. Wenn die Schichten nicht in der richtigen Reihenfolge per Drag &amp; Drop, bis sie bestellt werdenrichtig. </li><li> Wählen Ebenen automatisch ausrichten auf der Registerkarte Bearbeiten des Hauptmenüs. Wählen Sie neu positionieren und klicken Sie auf OK. </li><li> Wenn die Auto-Align-Algorithmus nicht den Rahmen zu einem relevanten Schwerpunkt zu orientieren, stellen kleinere Anpassungen mit dem Verschieben-Werkzeug. </li></ol></li><li> Verbundschleif: HINWEIS: Out-of-Schwerpunktregionen eines anfänglichen Bild MP kann durch &quot;Abschneiden&quot; der entsprechende entfaltet Stack in LAS AF Software geschärft werden. Zuschneiden eines Stack-Datei ermöglicht es, den Abstand eines Z-Stapel, der dem Maximum Projektion-Algorithmus unterzogen wird manuell zu beschränken. <ol><li> Suchen Sie die Crop-Funktion in der Werkzeugleiste (unter der Registerkarte Prozess). Manuell begrenzen die ersten und letzten Schichten, so dass sie nur das Haftband im anfänglich außerhalb des Fokusbereichs zu überspannen. Klicken Sie auf Übernehmen, um einen neuen Stapel-Datei, die für diese Region optimiert ist zu generieren. </li><li> Generieren Sie ein neues Maximum Projektion für die lokal optimierte Stack und Export als TIFF-Datei. </li><li> In the Bildbearbeitungs-Software (siehe Tabelle der Materialien), offene Scripts (in der Registerkarte Datei des Hauptmenüs befindet) und wählen Sie Dateien in Stapel laden. </li><li> Importieren Sie die anfängliche Bild MP-Datei und vor Ort optimiert MP-Datei für einen bestimmten Zeitpunkt in das Panel laden Layer und wählen Sie OK. Stellen Sie sicher, dass der Versuch, die Bilder-Option Quelle automatisch ausrichten nicht aktiviert ist. </li><li> Wählen Sie beide Schichten in der Ebenen-Fensterbereich und wählen Sie Ebenen automatisch überblenden (in der Registerkarte Bearbeiten des Hauptmenüs befindet), um die entsprechenden Bereiche der beiden Bilder automatisch zu maskieren, wodurch eine gleichmäßig im Fokus der Netzhaut ein. Sichern Sie das Bild Verbund als TIFF-Datei. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.2.1 bis 5.2.5 für alle suboptimalen MP Bilder. </li></ol></li><li> Weitere Einstellmöglichkeiten: drehen, zuschneiden und stellen Sie die Pegel der Film-Schichten: <ol><li> Mit all den Schichten gewählt, verwenden Sie das Transformieren-Werkzeug (Edit&gt; Free Transform), um die Bilder zu drehen, so dass der dorsal-ventralen Achse der Netzhaut ist ausgerichtetzu der y-Achse des Films Rahmen. </li><li> Verwenden Sie gegebenenfalls die Freistellungswerkzeug, um das Sichtfeld auf die gewünschte Größe und Form zu reduzieren. </li><li> Verwenden Pegeleinstellung (von Einzelbildern), die zur Verbesserung Kontrast zwischen der Zellmembran und Zellkörper. </li><li> Für stilistischen Zwecken und an spezifische Zellverhalten zu betonen, stellen Falschfarben zu Sehenswürdigkeiten in jedem Bild zu markieren. </li></ol></li><li> Animation: Konvertieren Sie die Bilder in einen Film: <ol><li> Öffnen Sie das Animationsfenster aus dem Windows-Register des Hauptmenüs. Wählen Stellen Frames von Schichten aus dem Menü in der oberen rechten Ecke des Animationsbereich entfernt. </li><li> Man beachte, dass die Schichten der Animationsfenster in sequentieller Reihenfolge, beginnend von der Unterseite des Stapels hinzugefügt. Um die Reihenfolge der Frames umgekehrt, zunächst alle Bilder auswählen und dann umge Frames aus dem Animationsfenster Menü. </li><li> Wählen Sie eine Bildverzögerungszeit für jedes Bild mit Hilfe der Dropdown-Menü unten am Rahmen DaumenNagel. HINWEIS: Die Frame-Verzögerung für Filme 1 bis 4 in diesem Papier ist 0,8 Sekunden. </li><li> Von der Registerkarte Datei im Hauptmenü geöffnet Export und wählen Sie Video Render. Wählen Sie Quicktime-Export unter Dateioptionen und wählen Sie das gewünschte Videoformat. Unter Render Optionen eingestellt Frame Rate auf Benutzerdefiniert, geben Sie eine Bildrate von 15, und klicken Sie auf Render. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cell-cell+adherens+junctions+reveals+that+Drosophila+mesoderm+invagination+begins+with+two+phases+of+apical+constriction+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells.</a> J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).</li>
<li>Oda, H., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+adherens+junctions+during+Drosophila+embryonic+epithelial+morphogenesis+revealed+by+a+Dalpha-catenin-GFP+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein.</a> Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).</li>
<li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87, 651-660 (1996).</li>
<li>Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fate+specification+in+the+developing+Drosophila.+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Suppl%22%5BJournal%5D)">Cell fate specification in the developing Drosophila. retina.</a> Dev Suppl. , 19(1993).</li>
<li>Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).</li>
<li>Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+behavior+in+the+developing.+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina.</a> Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).</li>
<li>Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+death+zone%3A+a+spatially+restricted+region+for+programmed+cell+death+that+sculpts+the+fly+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye.</a> Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).</li>
<li>Lee, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Drosophila+Dicer-1+and+Dicer-2+in+the+siRNA%2FmiRNA+silencing+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways.</a> Cell. 117, 69-81 (2004).</li>
<li>Zitserman, D., Roegiers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+sensory+organ+precursor+cells+in+intact+Drosophila+pupae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae.</a> J. Vis. Exp. (51), 2706(2011).</li>
<li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li>
<li>Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waves+of+differentiation+in+the+fly+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Waves of differentiation in the fly visual system.</a> Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).</li>
<li>Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+wingless+in+an+early+pupal+cell+death+event+that+contributes+to+patterning+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye.</a> Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).</li>
<li>Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+simulation+of+cellular+patterning+within+the+Drosophila+pupal+eye%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye.</a> PLoS Comput. Biol. 6, e1000841(2010).</li>
<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+order+in+the+Drosophila+pupal+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The emergence of order in the Drosophila pupal retina.</a> Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).</li>
<li>Cagan, R. L., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+is+required+for+successive+cell+decisions+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina.</a> Genes Dev. 1099, 1112(1989).</li>
<li>Miller, D. T., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+induction+of+patterning+and+programmed+cell+death+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina.</a> Development. 125, 2327-2335 (1998).</li>
<li>Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+argos+in+regulating+cell+fate+decisions+during+Drosophila+eye+and+wing+vein+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development.</a> Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).</li>
<li>Yu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathway+of+signals+regulating+effector+and+initiator+caspases+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye.</a> Development. 129, 3269-3278 (2002).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tugging+force+regulates+the+size+of+cell-cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).</li>
<li>Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+tension+is+required+for+correct+recruitment+of+adherens+junction+components+and+zonula+occludens+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation.</a> Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die Beschreibung der Wildtyp-Entwicklung (siehe oben) ist die Basis für Vergleiche der Strukturierung Ereignisse in RNAi oder Überexpression Genotypen. Vergleiche von lebenden Gewebeentwicklung sind von unschätzbarem Wert, wenn genau zu bestimmen, welcher Zellverhalten werden durch ein Protein von Interesse reguliert. Weitere und hier nicht beschrieben, ermöglicht Live Cell Imaging eine qualitative und / oder quantitative Beschreibungen der Rolle eines Gens von Interesse in den Ereignissen, die Muster das Auge zu machen...

Die Verbindung Drosophila Auge wird durch die stereotype Anordnung seiner ~ 750 Ommatidien von einem Wabengitter von Zubehörpigmentzellen 4,5 getrennt sind. Lokale Zellbewegungen, Zellwachstum, die Veränderungen in der Zellform und Apoptose: Diese Pigmentzellen werden durch eine koordinierte Kombination von Ereignissen gemustert. Live-Anzeige dieser Epithel ermöglicht es, die molekularen Mechanismen, auf denen diese Ereignisse in einem physiologisch relevanten und gelassen dreidimensionalen Kontext zu untersuchen. Im Gegensatz zu bisherigen Protokolle 6,7, die Technik hier skizzierten umfasst ein effizientes Verfahren zum Stabilisieren von äußerem Gewebe Bewegung, die nicht entkoppelt von dem Abbildungsprozess sein kann. Dieses Verfahren verbessert die Untersuchungen des Zellverhaltens in dem Entwicklungs Drosophila Puppenauge Epithel - einem Gewebe wächst dreht und verschiebt sich im Laufe der Bildverarbeitung. Neben der Bewegungsstabilisierungstechnik dehier beschrieben wird zur Untersuchung von Zellen in anderen Zusammenhängen, wo Fremdbewegung auftritt. Um Zellgrenzen in der Netzhautfeld Drosophila sichtbar zu machen, wurden transgene Fliegenlinien erzeugt, die ubi-DE-Cadherin Ausdruck: GFP sowie UAS-α-Catenin: GFP unter Kontrolle des Auges spezifischen Treiber GMR-GAL4 1-3. Die Verwendung von zwei GFP-markierten Membranmarker erlaubt die Visualisierung von Zellgrenzen zu niedrigeren Lichtintensität. Dies minimiert Gewebeschäden und Photobleaching auf wiederholte Exposition gegenüber Hochenergiewellenlängen, so dass erhöhte Bildrate und Filmdauer. Zur Verbesserung der Wirksamkeit der RNAi-Transgene, UAS-DCR-2 wurde auch in eine zweite Fliege Linie 8 eingearbeitet. In einem dritten Update von früheren Protokollen wird ein einfacher Bild rig, die leicht in den meisten Labors zusammengesetzt beschrieben. Diese Vorrichtung vermeidet die Erfordernis, eine spezielle Abbildungs ​​r habenig von einer Universität &quot;Werkstatt&quot; oder ähnlichen Dienst generiert. Diese Bild rig ist ähnlich wie die Bild anderen Puppen Gewebe 9,10 verwendet. Präsentiert hier ist eine einfache Live-Cell-Imaging-Protokoll, das verwendet werden kann, um direkt bewerten die morphogenetischen Ereignisse, die zu Augen Strukturierung von ~ 17 bis 42 Stunden nach der Pupariumbildung (hr APF) beitragen. Insbesondere ermöglicht es dieses Protokoll, um die Konsequenzen der Modifizierung Genexpression während Puppenentwicklung zu bestimmen.

<table><tbody><tr><td>GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b</td><td>Auf Anfrage bei den Autoren</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-dcr-2 erhältlich; UAS-a-Kat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b&nbsp;</td>Auf <td>Anfrage bei den Autoren</td><td></td><td></td>erhältlich</tr><tr><td>Scotch double stick tape</td><td>3M</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>Black Sylgard Sezierschale</td><td></td><td></td><td>Füllen Sie die Petrischale aus Glas bis zum Rand mit Sylgard (schwarz gefärbt mit fein gemahlenem Holzkohlepulver) oder Sylgard 170; lassen Sie es 24-48 Stunden bei Raumtemperatur ruhen, um</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard (Schwarz)</td><td>Dow Corning zu polymerisieren</td><td></td><td></td>SYLG170</tr><tr><td>Petrischale aus Glas</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 x 1 mm Objektträger aus Glas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 mm Glasdeckglas</td><td>VWR</td><td>48393-172</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 3mm Chromatographie Papier</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-713-336</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-086-291</td><td>Oder kaufen Sie es in der örtlichen Apotheke.</td></tr><tr><td>30 ml Spritze</td><td>Fisher Scientific</td><td>S7510-30</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 DM Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LAS AF Version 2.6.0.7266 Mikroskop Software</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live-bilder aus dem drosophila pupal augen

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inhärenten Prozesse der Drosophila Puppenentwicklung können sich verschieben und verdrehen die Augen Epithel in einer Weise, die einzelnen Zellverhalten schwer in lebenden Zellen zu verfolgen, zu machen. Diese Prozesse umfassen: Netzhautrotation, das Zellwachstum und organismischen Bewegung. Zusätzlich Falten Unregelmäßigkeiten in der Topologie des Epithels, einschließlich feinen Unebenheiten und oft eingeführt, wie die Puppe zur Abbildung hergestellt, es schwer machen, in unscharfe Bilder von mehr als ein paar Ommatidien in einer einzigen Brennebene zu erwerben. Der Workflow skizzierten Heil diese Fragen, was eine einfache Analyse zellulärer Prozesse bei Drosophila Puppenaugenentwicklung. Passenderstufigen Puppen sind in einem bildgebenden rig, die leicht in den meisten Labors montiert werden kann angeordnet Ubiquitin-DE-Cadherin. GFP und GMR-GAL4 -driven UAS-α-Catenin: GFP werden verwendet, um Zellgrenzen im Auge Epithel 1 visualisieren -3. Nach Dekonvolution istFluoreszenzbildern mit mehreren Fokusebenen erfasst angewendet werden maximale Projektionsbilder für jeden Zeitpunkt erzeugt und verstärkt mit einer Bildbearbeitungssoftware. Alignment-Algorithmen verwendet werden, um schnell zu stabilisieren flüssige Bewegung, so dass einzelne Zelle Verhalten leichter zu verfolgen.

Live-Bildgebung des Puppen Auge ist eine erfolgreiche Strategie zur Zelle Verhaltensweisen, die Strukturierung der Neuroepithel beitragen beobachten. Die Rolle von spezifischen Proteinen kann leicht durch Expression von Transgenen, die während der Entwicklung des Auges Protein-Ebene ändern zu bewerten. Um dieses GMR-GAL4 tun wird zur Expression des Transgens hinter dem morphogenetischen Furche fahren. Dies bietet den Vorteil, nicht zu stören früheren Veranstaltungen, die das Auge Bereich in den ersten beiden La...

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode zur Bildgebung des lebenden Neuroepithels des Puppenaugen von Drosophila dar. Diese Methode kompensiert Gewebebewegungen und ungleichmäßige Topologie, verbessert die Visualisierung von Zellgrenzen durch die Verwendung mehrerer GFP-markierter Verbindungsproteine und verwendet ein einfach zu montierendes Bildgebungsgerät.

Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine effiziente Methode zur Erstellung von Live-Bildfilmen der Pupillenentwicklung von Drosophila zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zuerst die O-Perm des Pupillengehäuses entfernt und an der Seite entlang gerissen wird, um das Neuroepithel eines Auges freizulegen. Der zweite Schritt besteht darin, ein Imaging-Rig zusammenzubauen und die Puppe auf eine kleine Perle Vaseline zu montieren.Die nächsten seriellen Schnitte des Neuroepithels im Bereich des Adhäsionsgürtels werden mit einem Standard-Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Der letzte Schritt besteht darin, das Filmmaterial zu stabilisieren und Farbanpassungen in einer Standard-Bildbearbeitungssoftware vorzunehmen. Letztendlich wird die Bildgebung lebender Zellen des Drosophila-Neuroepithels verwendet, um das Zellverhalten dieses Musters aufzuklären.Die visuelle Demonstration dieser Methode für das Auge ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig sein kann, eine Puppe teilweise zu präparieren und sie dann korrekt in das Bildgebungsgerät zu montieren, da die Puppen in diesem Stadium ziemlich zerbrechlich sind. Darüber hinaus ist die korrekte Ausrichtung der Puppe und die korrekte Platzierung des Deckglases über dem Augenepithel entscheidend für eine erfolgreiche Bildgebung. Das Verfahren wird von Mark Hellerman aus unserem Labor vorgeführt.Zu Beginn des Experiments wählt man weiße Pre puy aus zuvor gekreuzten Genotypen aus und legt sie in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Legen Sie als Nächstes ein 10 Zentimeter großes, quadratisches Stück Taschentuch, das in destilliertem Wasser getränkt ist, in eine saubere Plastik-Trinkgeldbox. Setzen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen in die Spitzenbox ein.Das feuchte Gewebe verhindert das Austrocknen der Puppe und inkubiert dann 17 bis 25 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Legen Sie nach der Inkubation ein Stück frisches doppelseitiges Klebeband auf eine schwarze Zigarren-Sezierschale. Positionieren Sie die Puppe mit der Rückenseite nach oben auf dem Klebeband und stellen Sie sicher, dass der Kopf der Puppe an dem doppelseitigen Klebeband befestigt ist, ohne die Brust- und Bauchregion der Puppe zu verkleben.Heben Sie mit einer Pinzette vorsichtig die A-Dauerwelle an und entfernen Sie sie, um den Pupillenkopf freizulegen. Reißen Sie dann an der Seite des Pupillengehäuses entlang. Um den Bereich um ein Auge freizulegen, entfernen Sie vorsichtig die Pupille vom Klebeband.Konstruieren Sie den kleinen 15 Quadratmillimeter großen Rahmen aus Löschpapier und stanzen Sie in der Mitte ein fünf Millimeter großes Loch. Tauchen Sie den Rahmen und das destillierte Wasser ein und platzieren Sie es in der Mitte eines Mikroskops. Gleiten Sie mit einer 30-ml-Spritze.Drücke einen gleichmäßigen Ring aus Vaseline aus, um den Löschpapierrahmen zu umgeben. Als nächstes gibst du eine kleine Kugel Vaseline direkt auf die Folie. Lege die Puppe vorsichtig auf die Seite und stütze sie mit der Vaselineperle.Lege einen Deckschirm auf den Vaseline-Ring, so dass er das Epithel über dem Auge berührt. Komprimieren Sie das Präparat vorsichtig, um das Deckglas gegen die Vaseline abzudichten und eine kleine flache Kontaktfläche zwischen der Pupillenaugenregion und dem Deckglasbild, der Pupillenvorbereitung, zu erzeugen. Mit einem Fluoreszenzmikroskop werden alle sieben Minuten serielle Schnitte durch die AAL-Domäne des Auges, das Neuroepithel im Bereich der Adhärenzübergangsstelle, aufgenommen.Verwenden Sie eine geeignete Dekonvolutionssoftware, um den Hintergrund zu reduzieren und den Kontrast der Serienschnittbilder für jede Zack-Datei zu verbessern, sowie die L-A-S-A-F-Software. Navigieren Sie zum Werkzeugbereich. Wählen Sie 3D-Dekonvolution und klicken Sie auf Anwenden.Generieren Sie ein maximales Projektions- oder MP-Bild für jede entfaltete Stapeldatei. Richten Sie jedes MP-Bild aus, um das Verhalten einzelner Zellen hervorzuheben und Ablenkungen durch das Wachstum von Organismen zu reduzieren. Öffnen Sie mithilfe der integrierten Algorithmen in Photoshop CS five auf der Registerkarte "Datei" des Hauptmenüs Skripte und wählen Sie "Dateien in Stapel laden".Importieren Sie als Nächstes die MP-Bilddateien in das Bedienfeld "Ladeebenen". Stellen Sie sicher, dass die Option Zum automatischen Ausrichten von Quellbildern versuchen nicht aktiviert ist. Andernfalls können die Bilddaten verzerrt werden.Nachdem alle MP-Dateien in den Ebenenbereich geladen wurden, überprüfen Sie, ob alle Bilder in chronologischer Reihenfolge vorliegen und dass sich der früheste Zeitpunkt am oberen Rand der Ebene befindet. Stapeln Sie sie per Drag & Drop, bis sie richtig sortiert sind. Wählen Sie bei Bedarf die Option Layer automatisch ausrichten aus.Wählen Sie "Neu positionieren" und klicken Sie auf "OK". Unscharf können Bereiche eines anfänglichen MP-Bildes korrigiert werden, um ein gleichmäßig scharfes Netzhautfeld zu erhalten. Um mit der Bildverarbeitung zu beginnen, verwenden Sie die Zuschneidefunktion in LAS.Saf schränkt die Anfangs- und Endschichten manuell ein, sodass sie nur das Adhäsionsband innerhalb des anfänglich unscharfen Bereichs überspannen. Klicken Sie auf Anwenden, um eine neue Stack-Datei zu generieren, die für diesen Bereich optimiert ist. Generieren Sie als Nächstes eine neue maximale Projektion für den lokal optimierten Stapel und exportieren Sie diese als TIF-Datei in Photoshop.Öffnen Sie Skripts, und wählen Sie Dateien in Stack laden aus. Geben Sie dann die anfängliche MP-Datei und die optimierte MP-Datei in das Fenster "Ladeschichten" ein. Stellen Sie erneut sicher, dass die Option Zum automatischen Ausrichten von Quellbildern versuchen nicht aktiviert ist, und wählen Sie OK aus.Wählen Sie beide Ebenen aus und wählen Sie "Ebenen automatisch überblenden", um ein gleichmäßig fokussiertes Netzhautfeld zu erzeugen. Speichern Sie dieses zusammengesetzte Bild als TIF-Datei. Verwenden Sie ein Transformationswerkzeug, um die Bilder so zu drehen, dass die dorsale ventrale Achse der Netzhaut an der Y-Achse des Filmbildes ausgerichtet ist.Nutzen Sie die Pegelanpassung einzelner Rahmen, um den Kontrast zwischen der Zellmembran und dem Zellkörper zu erhöhen. Wählen Sie dann Frames aus Ebenen erstellen, um die Bilder in einen Film zu konvertieren. Beachten Sie, dass Layer dem Animationsbereich in sequenzieller Reihenfolge hinzugefügt werden, beginnend am unteren Rand des Stapels.Um die Reihenfolge der Stapel umzukehren, wählen Sie alle Frames und dann Frames umkehren aus. Wählen Sie die Frame-Verzögerungszeit von 0,8 Sekunden für jedes Frame aus und wählen Sie "QuickTime". Exportieren Sie und wählen Sie das gewünschte Videoformat aus.Wählen Sie abschließend unter Renderoptionen die Bildrate auf benutzerdefiniert aus und geben Sie eine Bildrate von 15 ein. Klicken Sie dann auf Rendern. Bei dieser Technik wurde ein ausgeprägter Entwicklungsgradient im gesamten Auge beobachtet, der zu detaillierten Beschreibungen der Augenmusterung führte.Während des primären Wrappings wurden zwei Zellen als Primärzellen rekrutiert, die die Photorezeptorbündel schnell umschlossen und sich miteinander verbanden, um stabile Verbindungen zu bilden. Undifferenzierte Intero-Materialzellen liegen in einem ungeordneten Muster, während die Primärzellen umwickelt und versiegelt sind. Jedes Photorezeptorbündel organisiert lokale Zellbewegungen neu.Die Anfangszellen gruppieren sich an der dorsalen und ventralen Seite jedes Omas. Durch die Interkalation zwischen den Zellen wurden Zellen von zwei Zeilen in einer einzigen Zeile neu angeordnet. Nach der Interkalation wurde tertiäre Konkurrenz unter dem Mikroskop festgehalten.Konkurrierende Zellen besetzten die tertiäre Nische für fünf bis 10 Minuten, bevor sie verdrängt wurden. Schließlich etablierte eine einzige Zelle die stabile tertiäre Nische. Während des abschließenden Schnitts reduzierte ein Apoptoseschub die Anzahl der ICS auf das Minimum, das erforderlich war, um effizient ein Enter-Material-Zellgitter über dem Facettenauge zu erzeugen.Einmal gemeistert, kann die Bildgebung der PSA bei korrekter Durchführung in vier Stunden durchgeführt werden. Die anschließende Bildverarbeitung dauert etwa eine Stunde.

Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Migration von Gliazellen in den Entwicklungsländern Drosophila Auge mit Live-mikroskopische Analyse mit GFP markierten Gliazellen gepaart untersuchen.

Live-Imaging von Gliazellen Migration in der Drosophila Eye Imaginalscheibe

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie arbeitet darüber hinaus das Eindringen Grenzen der Gewebe-Schnitte Fluoreszenzmikroskopie. Die Technik basiert auf Multi-Projektion Beleuchtung und ein Photon Transport Beschreibung basiert. Wir zeigen in-vivo Ganzkörper-3D-Visualisierung der Morphogenese von GFP-exprimierenden Flügel Imaginalscheiben...

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Drosophila Blutzellen über die Gesamtheit des sich entwickelnden Embryos zu zerstreuen. Dieses Protokoll zeigt, wie die Montage und Bild dieser Migrationen Verwendung von Embryonen mit fluoreszenzmarkierten Blutzellen.

Live-Bildgebung Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migrationen

Erstellung von Entwicklungs-und Adult Drosophila Brains und retinae für Live Imaging

Quelle: Hellerman, M. B.B.. , et al. Live-Imaging des Drosophila J. Vis. Exp. (2015){TAG_ 28}}Das Video zeigt eine Live-Imaging-Technik zur Untersuchung der Augenmusterung bei einer Drosophila melanogaster-Puppe. Grün fluoreszierendes Protein (GFP)-markierte Marker ermöglichen die Visualisierung der zellulären Organisation und Differenzierung während der Bildung der sich entwickelnden Augenstruktur.

Live-Bildgebung des Drosophila-Puppenauges mittels Fluoreszenzmikroskopie

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren beinhaltet die Visualisierung Mosaik Photorezeptorzellen in lebenden Drosophila. Es kann benutzt werden, um einzelne Schicksale Photorezeptorzelle in der Netzhaut für Tage oder Wochen folgen werden. Diese Methode ist ideal für die Untersuchung der Netzhautdegeneration und neurodegenerative Erkrankungen oder Photorezeptorzelle Entwicklung.

Die Tomate / GFP-FLP / FRT Verfahren zur Live-Imaging von Mosaic Erwachsene<em&gt; Drosophila</em&gt; Sehzellen

Dieses Papier zeigt die Verwendung eines schnellen konfokalen Mikroskop, um Bildzelle Verhalten direkt durch die Puppenhülle. Nach dem Verlassen der Puppenhülle intakt ist, erlaubt dieses Verfahren die Beobachtung und Messung von dynamischen Zellprozesse im Stadium der Drosophila-Entwicklung, die schwer direkt zu studieren.

Imaging Durch die Puppenhülle von<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Neuroblasten

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für die langfristigen ex vivo Kultur und die Bildgebung eines Imaginalscheibe Drosophila. Es zeigt Photorezeptordifferenzierung und Ommatidienrotation innerhalb der 10 Stunden Periode von Live-Aufnahmen des Auges Scheibe. Das Protokoll ist einfach und erfordert keine teure Einrichtung erforderlich.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Hier werden nicht-invasive Methoden zur Lokalisation von Photorezeptormembranproteinen und zur Beurteilung der Netzhautdegeneration im Drosophila-Facettenauge mittels eGFP-Fluoreszenz beschrieben.

Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Langzeit-Live-Bildgebung des Drosophila-Beins während des Puppenstadiums vorgestellt, bei dem das Puparium vollständig entfernt wird. Dieses Protokoll kann auch auf andere Gewebe angewendet werden.

Langzeit-Live-Bildgebung der Entwicklung der Puppenbein von Drosophila nach Entfernung der Puppen

Erfahren Sie eine effiziente Methode zur Live-Bildgebung des Drosophila-Puppenaugen-Neuroepithels. Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung von Zellgrenzen und das Studium von Entwicklungsprozessen in vivo.

Live-Bilder aus dem Drosophila Pupal Augen

Weitere Videos entdecken