Name: Bewertung der Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter Strömungsbedingungen in einem Ex vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Erfahren Sie, wie Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter physiologischen Flussbedingungen in einem ex vivo Mikroflusskammer-Assay mit Mäusen untersucht werden. Diese Methode ermöglicht die Echtzeit-Analyse von Leukozyten-Recruitment.

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R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) und P30EY014104: Forschung in dieser Veröffentlichung berichtet, wurde vom National Eye Institute der National Institutes of Health unter preisNummern unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. Zusätzliche Unterstützung wurde von der Massachusetts Lions Eye Research Fund (KMC) und einer Sonder Scholar Award der Forschung zu Prevent Blindness (KMC) zur Verfügung gestellt.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit der Association for Research in Vision and Ophthalmology Erklärung für die Nutzung von Tieren in Ophthalmic und Vision Research behandelt, und die Richtlinien und Vorschriften von der Massachusetts Eye and Ear Infirmary Animal Care Committee dargelegt. Am Tag vor dem Experiment: 1. Vorbereitung der Rohre für Flusskammer <ol><li> Um die Halsschlagseite vorzubereiten, schließen 1 cm PE10 Polyethylenschlauch bis 6 cm Silikonschlauch, gefolgt von 5 cm Polyethylenschlauch. Für die Halsseite vorzubereiten ähnlich jugularis Seite mit der Zugabe von einem T-Rohr in den 6 cm Silikonschlauch etwa 1,5 cm entfernt von der 1 cm Polyethylenschlauch (1A, B). Um die T-Rohreinsatz, verbreitern den Silikonschlauch durch Verwendung einer feinen Pinzette, falls erforderlich. </li><li> Verbinden Sie ein Ende des 10 cm Silikonschlauch mit dem Druckwandler und stecken Sie den T Ende der Halsschlag side T-Rohr in das andere Ende. Sicherstellen, dass die Verbindungsstellen fest und dicht sind kostenlos. Anwenden eines kleinen rechteckigen Stück Parafilm über dem sich der Schlauch zusammenpasst, wenn nötig, ein Auslaufen zu verhindern (Figur 1C). </li></ol> 2. Beschichtung der Kammer <ol><li> Bereiten Sie die endothelialen Oberflächenbeschichtungsprotein (zB P-Selectin, ICAM-1 (ICAM-1), vaskulärer Zelladhäsionsprotein-1 (VCAM-1)) in 0,1% BSA. Als eine Richtlinie in 200 ul BSA 1 ug Protein ausreichend zu beschichten 4-5 Kammern. Verwendung einer 1 ml Spritze zu einer 25 G Nadel verbunden ist, zu infundieren jede Kammer (0,04 x 0,4 x 50 mm) mit einer endothelialen Oberflächenbeschichtung Protein. Bewahren Sie die beschichtete Kammern in einem 15 ml Röhrchen bei 4 ° C über Nacht. </li></ol> Am Tag des Experiments: 3. Vorbereitung des Kammer <ol><li> Entfernen Sie die beschichtete Kammern von 4 ° C, und schließen Sie die Vena und Halsrohr zu jeder Seite. Dichten Sie die connections durch vorsichtiges Dehnen eines kleinen rechteckigen Stück Parafilm über, wo der Schlauch in die Kammer erfüllt. Unter Verwendung einer Spritze zu füllen den Raum und Schläuche mit 0,1% BSA (Kontrolle auf Dichtheit). Inkubieren für 45 min. </li><li> Bereiten Sie eine 35 mm Petrischale, um die Kammer durch Schneiden Kerben auf jeder Seite der Schale zu halten. Stabilisieren Sie die Kammer in die Kerben; dann mit einem kleinen Tropfen Silikon, um die Kammer an der Schale an der Kerbstelle zu befestigen. Achten Sie darauf, die Kammer ist, indem Sie unter dem Mikroskop Ebene. Lassen Sie das Silikon für mindestens 15 min trocknen. </li><li> Füllen Sie eine 60 ml Spritze Verriegelung mit Heparin und eine Verbindung zum Druckwandler. Schließen Sie den Druckgeber an der Halsschlauch in der folgenden Reihenfolge: Transducer, Silikonschlauch und T-Rohr. <ol><li> Verwenden eine 1 cm PE50 zwischen Silikonschlauch mit dem Wandler und dem T-Rohr, um die Verbindung zu sichern, verbunden sind. Übergeben Sie die Halsschlagader Silikonschlauch durch den Druckbügel (1D). Führen 100USP Heparin through der Schlauch und Kammer, bis keine Luftblasen. </li></ol></li></ol> 4. Einstellen der Software <ol><li> Um die Software zu erstellen, schalten Sie den Computer, Mikroskop, und offene Laborgerät. Doppelklicken Sie auf die Leica Application Suite (LAS) (oder gleichwertig) und erstellt einen Ordner, um das Video zu speichern: blättern → erwerben → Film → definieren Abfolge von Clips (Clips = 15, Aufnahmezeit = 30 sec, und Intervalle = 15 sec) klicken Sie auf die &quot;+&quot; Zeichen, um zu bestätigen. </li><li> Zum Aufnehmen der Fließdruck öffnen LabChart (oder gleichwertig) Datei und koordinieren Sie den Dateinamen in die Aufnahmeordner in Schritt 4.1 vor. </li></ol> 5. Chirurgisches Verfahren <ol><li> Anesthetize eine 8-10 Wochen alte Maus unter Verwendung einer Kombination von Ketamin (60 mg / kg) und Xylazin (6 mg / kg) intraperitoneal injiziert (IP). Bestätigen Sie, dass tiefe Sedierung ist innerhalb von 5-10 Minuten mit dem Verlust der Pedalrückzugreflex erreicht. Falls erforderlich, Isofluranüber Gesichtsmaske geliefert werden können je nach Bedarf gegeben werden. </li><li> Während der Narkose, legen Sie eine Unterlage unter Erwärmung des Käfigs und auf 37 ° C eingestellt, um die Körpertemperatur aufrecht zu erhalten. Sobald geeignete Anästhesie bestätigt wird, platzieren Sie den Mauszeiger in einer Bauchlage und Mantel die Augen mit Bacitracin Salbe auf Augentrockenheit zu verhindern. </li><li> Danach rasieren Sie die Haare an der Inzisionsstelle mit einer Rasierklinge und gründlich zu reinigen Sie die Seite mit Alkohol. </li><li> Einmal vollständig betäubten sichern das Tier mit Klebeband hält die Maus in einer Bauchlage. Setzen Sie den Halsbereich mit einer Schere und die Schilddrüse, um die Luftröhre und Behälter (2A) freizulegen. </li><li> Reinigen Sie die Halsschlagader, bis er vollständig ausgesetzt kümmert sich nicht um den Vagusnerv (2B) zu beschädigen. Falten Sie ein Stück Faden und übergeben die Kurve unterhalb der Halsschlagader dann in der Kurve, so gibt es nun 2 Stück Faden unterhalb der Halsschlag geschnitten. Loop jeweils Naht in Knoten (nicht festziehen dieKnoten). </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang, um die linke Halsschlagader (2C) ausgesetzt, die Vorbereitung der Nahtmaterial in der gleichen Weise (2D). </li><li> Den Schlauch an der Maus Gefäßsystem. <ol><li> Heparinisierung mit der Maus durch die Injektion von 1 ml Heparin IP. </li><li> Ziehen Sie die obere Naht auf der Halsschlagader. Stellen Sie das Gefäß Klemme so günstig wie es auf der Halsschlagader (3A) zu gehen. Pinzette benutzen, um die Arterie durch den oberen Naht halten und einen kleinen Schnitt, etwa 1/8 des Umfangs der Arterie unter Verwendung der Mikroschere (3B). </li><li> Übergeben Sie die Halsschlagader Schlauch durch den zweiten Knoten in der oberen Naht und in den Einschnitt in die Arterie gemacht. Vernähen des unteren Naht, so dass die Arterie um den Schlauch abgedichtet ist (mehrere Knoten werden sollten, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten; 3C). </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang zum Einsetzen des Halsschlagader-Schlauch (das SchiffKlemme für die Vena Seite benötigt; 3D). </li><li> Testen Sie die Strömung durch das Schiff freigegeben Klemme. Wenn es keine undichten Stellen bewegen Sie die Maus mit dem Mikroskop und schließen Sie das Halsrohr und Halsschlagader in die Kammer Schlauch (siehe beigefügte Video zur Demonstration der chirurgischen Eingriff). </li></ol></li></ol> 6. Aufnahme Rollgeschwindigkeit <ol><li> Öffnen Sie die Halsschlag Klammer, um die Kammer zu füllen, so dass eine Schaltung mit der Maus Kreislauf-System. Das Blut für 3-5 min zirkulieren, so dass die Strömungsbedingungen zu stabilisieren. Während der Wartezeit von 3-5 min, Einstellung der Mikroskoptisch, so dass die Kammer Ebene von einem Ende zum anderen mit dem Mikroskopobjektiv und seiner Kante parallel mit dem Video-Aufzeichnungsfenster auf dem Bildschirm ist. </li><li> Füllen Sie den modifizierten Petrischale mit der Glaskammer mit Wasser, dann senken Sie den 10X Wasserimmersionsobjektiv in die Schüssel, so dass die Zellen durch die Kammer strömenden sichtbar sind.Die Lichtintensität kann für eine angemessene Betrachtung der Zellen eingestellt werden. Im allgemeinen wird eine geringere Intensität ist besser. </li><li> Die Schelle auf dem Schlauch, so daß der Wandler liest einen stetigen 30 mm Hg, in Korrelation zu einem Medium physiologische Strömungsdruck oder nach Wunsch. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Start&quot;, auf dem sowohl das Video und den Druck mit dem ersten Zeitablauf in der Nähe der Halsschlagende und Bewegen gegen die Strömung in Richtung der Halsschlagende, bis vollendet zu initiieren. HINWEIS: Mehrere Beschichtungsbedingungen unter Verwendung verschiedener Adhäsionsmoleküle können in der gleichen Maus, indem mehrere Kammern untersucht werden. Nur eine Kammer in einer Zeit aufgezeichnet. <ol><li> Wenn die Aufzeichnung beendet ist, schließen Sie das Ventil am Eingang Website, Stoppen des Blutflusses. Entfernen Sie die Kammer und eine neue Kammer (mit einem anderen Adhäsionsmolekül beschichtet) an die Schaltung mit feinen Pinzette in der Hand und gerillte Zange in der anderen Hand. Fortsetzen der Aufnahme für die neue Kammer wie in den Schritten beschrieben6,1 bis 6,4. </li></ol></li><li> Euthanize alle Mäuse durch CO 2 erstickt, gefolgt von einer Rückenmarks Dislokation am Ende des Experiments. Das Verfahren wird Anschluß daher werden die Mäuse durch eine Rückenmarks Dislokation am Ende des Experiments getötet. </li></ol> 7. Interpretation der Ergebnisse <ol><li> Um zu analysieren, die aufgezeichneten Daten mit der &quot;M TrackJ&quot; Plug-In für ImageJ Software 23. </li><li> Konvertieren Sie die Datei durch Datei → Import → → AVI umwandeln in Graustufen Graustufen. </li><li> Standardisieren Sie die Rahmen von Select → Bild → Immobilien → Geben Sie die Rahmenintervalle (i) → global. Berechnen der Rahmenintervalle durch Teilen der Gesamtvideodauer (in der Regel 30 sec) durch die Anzahl von Rahmen in einem Video (in der oberen Ecke des Bildes J Videofenster angezeigt). </li><li> Messen Sie den Fluss jedes Leukozyten durch Wählen Plugin → M → TrackJ Tracks hinzufügen → wählen Sie ein Leukozyten-→ verfolgen es mit jedem Frame für 15-20 sec → Zusammenführen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 7.4 für alle Leukozyten im Blick. </li><li> Die mittlere Rollgeschwindigkeit der Leukozyten durch Wählen Maßnahme → zwei Spalten angezeigt → Kopieren alle M TrakJ: Tracks in eine Tabellenkalkulation. Die Bezeichnung &quot;bedeuten V&quot; Spalte ist der Leukozyten voll in Pixel / Sekunde gemessen. In um / s umzuwandeln, indem man von 2/3. </li><li> Für einen Vergleich zwischen den einzelnen Versuchsgruppe AP (mm Hg) und t (dyn / cm 2): Um in eine Tabellenkalkulation analysieren die Druckdaten Highlight und Export, und führen Sie die folgende Berechnung. Nach der Berechnung, kopieren Sie die Daten in das Prisma Software für die grafische Darstellung. </li></ol>

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Die Autoren (L.M., H.S. und K.M.C.) haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

Der Prozess der Rekrutierung von Leukozyten ist ein entscheidender Schritt in der Entzündungsreaktion; sie beinhaltet die Migration von Leukozyten aus dem Kreislaufsystem zu Zielgeweben, wo sie ihre Effektorfunktion ausüben können. Leukozytenrekrutierung ist integral in einer Vielzahl von entzündlichen Erkrankungen wie arteriosklerotischen Plaques, Herzinfarkt, Ischämie / Reperfusion und Transplantationschirurgie 1 sowie mehrerer ZNS Neuroentzündungszuständen 10-12,20,24,25. In Anbetracht der Vielfalt der Krankheitszustände, dass die Rekrutierung von Leukozyten Spannweiten bietet der autoperfused Mikrokammer ein unverzichtbares Werkzeug erlaubt dem Untersucher die Möglichkeit, Leukozytenmigration Dynamik zu studieren. In den letzten Jahrzehnten eine Vielzahl von in-vitro-Assays sind entwickelt worden, um die Dynamik der Leukozyten Zelladhäsion 26 zu studieren. Leider sind alle diese Tests erfordern die Gewinnung vonLeukozyten aus dem Blut, die Einführung der mechanischen Aktivierung. Um näher an die in vivo-Umgebung zu erhalten, wurden Anpassungen vorgenommen, um Vollblut-Proben sammeln und steuern die hämodynamischen Strömungsbedingungen 16,17. Hierbei erweitern wir die bisherigen Fortschritte auf dem Gebiet durch die Verknüpfung eines beschichteten Kammer zur Maus Kreislaufsystems. Wir sind in der Lage, den Fluss des Blutes zu einem physiologischen Bereich zu regulieren und Untersuchung der Dynamik von Leukozytenrollen. Die beschichtete Kammer gibt uns die Möglichkeit, Leukozyten-Wechselwirkungen mit spezifischen Adhäsionsmolekülen studieren. Da das System als eine Einheit von einem lebenden Mausbetriebs ist es ahmt die natürliche Umgebung und erlaubt uns, Leukozyten-Endothel-Interaktionen in einer Vielzahl von immunologischen Mausmodellen zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht dieses System uns die Vorteile der mehrfachen genetischen Mausmodellen zur Verfügung zu nehmen. Während das System nicht vollständig die in vivo Umgebung zu replizieren, bietet es eine Plattform Spezifi studierenc Elemente der Leukozyten unter physiologischen Bedingungen, ein Kunststück, die zuvor nicht möglich war. Auch wenn dies bringt uns einen Schritt näher zu einer physiologischen Umgebung gibt es Einschränkungen für das System. Sie nicht vollständig das komplexe 3D-Matrix der Vaskulatur zu replizieren, so dass wir nur in der Lage, bestimmte Elemente Leukozyten-Wechselwirkungen, die auf die Kammer-Beschichtungs eingeschränkt beurteilen. Außerdem sollte große Sorgfalt darauf verwendet werden, um ein geschlossenes System zur Maus Umlauf folgenden alle im Protokoll erwähnten Schritte zu gewährleisten. Der Eintrag von Luftblasen wird stark auf die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Experimente. Während wir beschreiben die Verwendung des Autoperfused Mikroströmungskammer zur Beurteilung Leukozytenrollen Dynamik das Verfahren hat das Potential, von Forschern gestaltet werden, um eine Vielzahl von Krankheiten zu studieren. Beispielsweise metastasieren von Krebszellen durch Expression von vielen der gemeinsamen Integrinen durch Leukozyten geteilt. Studying die Rolldynamik in einer Umgebung, die stärker imitiert eine in vivo-Umgebung konnte in unserem Wissen helfen, und möglicherweise der Vorhersage, der invasiven Charakter bestimmter Krebszellen. Ein möglicher Ansatz könnte darin bestehen, ein Markierungsverfahren für die Krebszellen, wie zum Beispiel GFP 27 verbinden, zusammen mit der Strömungskammer Assay Rolldynamik der Krebszellen, die GFP verfolgen. Aufgrund der Flexibilität der Beschichtung der Kammer mit einer Vielzahl von Stoffen und den Anschluss mehrerer Kammern auf dieselbe murine es wird interessant sein zu sehen, wie dieses Verfahren für den Einsatz in anderen Labors in Verbindung mit genetisch veränderten Mäusen und Krankheitsmodelle modifiziert. Die Technik, die wir hier beschreiben, berührt eine viel breitere Anwendungsmöglichkeiten, die nur durch die Kreativität der Forscher begrenzt.

Die Entzündung ist die körpereigene universelle Reaktion auf eine Verletzung und ist ein entscheidender Schritt in beiden angeborenen und adaptiven Immunsystem. In Reaktion auf eine Verletzung und / oder Entzündungsreize, Endothelzellen hochreguliert spezifischen Adhäsionsmolekülen; dies führt zu einer Extravasation durch die mikrovaskuläre Endothel Leukozyten, vor allem in der Post Venolen. Dieser Prozess beginnt mit der Anbindung rieselfähigen Leukozyten im Blutkreislauf auf das Endothel. Stabile Roll und feste Adhäsion von Leukozyten, die wiederum zu einer Seelenwanderung und die Sekretion von zytotoxischen Mitteln, folgen Sie diesem Anbindehaltung 1,2. Selektine sind bekannt, um die frühen Stufen der Kaskade 3-5 vermitteln; Integrine sind für die späteren Schritte des festen Adhäsion und Trans 1,6-8 verantwortlich. Eine wachsende Zahl von Hinweisen deutet darauf hin, Leukozyten und endotheliale Adhäsionsmoleküle haben eine lebenswichtige Rolle im Tiermodell der Ischämie ReperfusionsschadenAsthma, Psoriasis, Multiple Sklerose, und altersbedingte Makuladegeneration 9-12. Unter diesen Bedingungen wird die Entzündungsreaktion fehlgeleitet, um den eigenen Körper angreifen, der den Zusammenbruch des gesunden Gewebes. Vorhandenen entzündungshemmenden Mitteln (wie nicht-steroidale Antiphlogistika, Kortikosteroide, oder andere chemotherapeutische Mittel) tragen das Risiko von schweren Nebenwirkungen bei Langzeitanwendung 13. Von großem Interesse ist es daher, die entsprechenden Werkzeuge mit der Fähigkeit, krankheitsspezifische Moleküle zu identifizieren, die letztendlich gezielte kann, um die gewünschte entzündungshemmende Wirkung haben werden, während verbleibende ungiftigen 14 haben. Bestehende in vitro-Methoden wie die statische Leukozytenadhäsion Assays wurden bereits 1976 15 verwendet. Die parallelen Strömungskammer wurde zuerst in vitro 1987 verwendet, um Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter Strömungsbedingungen zu studieren. In diesen Experimenten stimulierte human polymorphkernigen Leukozyten (PMNs) aus venösem Blut wurden über eine Monoschicht von primären menschlichen Nabelschnur-Endothelzellen (HUVECs) perfundiert. Um die hämodynamischen Strömungsbedingungen zu kontrollieren, wurde das Harvard Apparatus-Spritzenpumpe 16 eingesetzt. Alternativ zu künstlichen Leukozyten Isolation zu vermeiden, Vollblut wurde in Kombination mit dem Glaskammer mit immobilisiertem Adhäsionsmoleküle 17 beschichtet verwendet. Um Leukozytenstimulation zu vermeiden und deren Wechselwirkung mit der Adhäsionsmoleküle unter annähernd physiologischen Bedingungen mechanistisch zu untersuchen, ein ex vivo autoperfused, extrakorporalen, arteriovenösen Kreis wurde 16 entwickelt. In dieser Schaltung fließt das Blut zwischen der rechten gemeinsamen Halsschlagader und der linken Vena jugularis externa eines lebenden Maus in Narkose, die eine Interaktion von nativen PBLs in einem Glasmikrokammer mit Ein- oder koimmobilisierten Adhäsionsmolekülen beschichtet. Ein großer Vorteil dieser System ist die Fähigkeit, die genetisch veränderte Mäuse, bei denen Entzündungswege direkt oder indirekt manipuliert einzusetzen. Zusätzlich gibt es die Möglichkeit, die isoliert Beitrag der Leukozyten-Adhäsionsmoleküle, um Entzündung, frei von äußeren Aktivierung unter Strömungsbedingungen festzulegen,. Die Anwendung eines Durchflussregler an dem Eingangspunkt der Durchflusskammer eine Vielzahl von experimentellen Schwankungen der Scherkräfte, entweder arteriell oder venös Systeme 18-22 nachahmen. Hier beschreiben wir in allen Einzelheiten eines Protokolls über die Vorbereitung und Durchführung der ex vivo autoperfused Mikrokammer-Assay.

<table><tbody><tr><td>Mikroglaskammer 0,4 x 0,04 x 50 mm</td><td>VitroCom</td><td>2540-050</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch PE 10</td><td>Fisher Scientific</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenschlauch PE 60</td><td>Fisher Scientific</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>Silikonschlauch 002</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15A</td><td></td></tr><tr><td>Y-Schlauch</td><td>Wert Kunststoffe</td><td>Y210-6</td><td></td></tr><tr><td>T </td><td>Tube Value Kunststoffe</td><td>T410-6</td><td></td></tr><tr><td>Silikongel</td><td>Baumarkt - Startseite Depo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischale</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Kunststoffverpackung</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Feine Pinzette</td><td>FST</td><td>11253-25</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Röhrchenhalter</td><td>FST</td><td>00608-11</td><td></td></tr><tr><td>Klemmapplikator</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Gefäßklemme</td><td>FST</td><td>18055-04</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Seidennähte</td><td>George Tiemann & Co</td><td>160-1215-6/0</td><td></td></tr><tr><td>25 x 1 G Nadeln</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>30 x 1/2 G Nadeln</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Heparin 100 USP Einheiten/ml</td><td>Krankenhausapotheke</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der leukozyten-endothel-interaktionen unter strömungsbedingungen in einem ex vivo autoperfused microflow chamber assay

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukozyten-Endothel-Interaktionen sind frühe und kritische Ereignisse bei akuten und chronischen Entzündungen und kann bei fehlreguliert, vermitteln Gewebeverletzung führt zu ständigen pathologischen Schäden. Bestehenden herkömmlichen Assays ermöglichen die Analyse von Leukozyten-Adhäsionsmoleküle nur nach der Extraktion von Leukozyten aus dem Blut. Dies erfordert das Blut in mehrere Schritte zu unterziehen, bevor peripheren Blutleukozyten (PBLs), können für die Analyse bereit, was wiederum PBLs Beeinflussung der Forschungsergebnisse stimulieren. Die autoperfused Mikrofließkammer-Assay jedoch ermöglicht es Wissenschaftlern, früh Leukozyten studieren funktionelle Fehlsteuerung mit Hilfe der systemischen Strömung eines Live-Maus, während die Freiheit der Manipulation eine beschichtete Kammer. Durch Krankheitsmodell kann die funktionelle Expression Leukozytenadhäsionsmoleküle bewertet und in einer Mikro-Glaskammer mit immobilisiertem endothelialen Adhäsionsmolekülen ex vivo beschichtet quantifizieren. In diesem Modell, das Blut fließtzwischen der rechten gemeinsamen Halsschlagader und der linken Vena jugularis externa eines lebenden Maus in Narkose, so dass die Wechselwirkung des nativen PBLs in der Kammer. Echtzeit experimentellen Analyse wird mit Hilfe einer intravital Mikroskop sowie ein Harvard Apparatus Druckvorrichtung gelöst. Die Anwendung eines Durchflussregler an dem Eingangspunkt der Glaskammer ermöglicht vergleichbare physiologische Strömungsverhältnisse zwischen den Experimenten. Leukocyte Walzgeschwindigkeit ist das Hauptergebnis und wird mit den National Institutes of Health Open-Access-Software ImageJ gemessen. Zusammenfassend stellt die autoperfused Mikrofließkammer-Assay eine optimale physiologische Umgebung zu studieren endothelialen Leukozyten Interaktion und ermöglicht es den Forschern, um genaue Rückschlüsse zu ziehen, wenn das Studium Entzündung.

Während jeder Aufnahme nur die Interaktion Leukozyten an der Kammer deutlich. Die Ergebnisse von einem repräsentativen Experiment kann in 4 gesehen werden kann. Die weißen Pfeile zeigen den individuellen Leukozyten, die durch die Haftung Molekül von Interesse eingefangen wurden und entlang der Kammer unter anderem rieselfähigen diejenigen innerhalb der Blutströmung Walzen. Ein gemeinsames Artefakt außerhalb der Kammer mit den großen dunklen Bereichen in allen Bildern zu sehen. Die dunklen Bereiche um dem Leser zu einem festen Punkt schätzen Leukozytenbewegung bezogen. Leukozyten Fortschritt über einen Zeitraum von 22 sec in Bezug auf die Bereiche zu erkennen. Die graphische Darstellung in der gleichen Figur zeigt eine letzte Diagramm der Daten in dem Tx1 verringert die Rollgeschwindigkeit (eine Verschiebung nach links) und Tx2 erhöht die Geschwindigkeit (eine Verschiebung nach rechts) im Vergleich zu der Kontrolle. 0 "/&gt; Abbildung 1: Herstellung von Schläuchen für den Strömungsraum. (A) Werkzeuge für Schläuche und Kammeranordnung (Mikro-Glaskammer 0,4 x 0,04 x 50 mm, Polyethylenschlauch PE10, PE60 Polyethylenschlauch erforderlich, Silikonschlauch 002, Y Rohr, T Rohr, 35 mm Petrischale, feinen Pinzette, einer feinen Schere, Schlauchhalterung, Gefäßklemme, 7-0 Seidennaht. (B) Herstellung der Arteria carotis und Jugularvene Schläuche für das Umleiten der Mausblutfluss durch das beschichtete Kammer. (C) Verbinden des Karotis Schlauch an den Druckwandler. (D) Führen Sie den Schlauch vom Wandler durch die Klemme, die Geschwindigkeit des Blutflusses ein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig2.jpg" width="700"> Abbildung 2:. Freilegen der Halsschlagader und Halsschlagader (A) den Halsbereich Schneiden Sie vorsichtig, um die Luftröhre freizulegen (B) Reinigen Sie die rechte Halsschlagader, so dass ein Stück der Naht kann unterhalb des Schiffes übergeben werden (gestrichelte gelb. Linie umreißt die Halsschlagader). (C) Reinigen Sie die linke Halsschlagader, so dass ein Stück der Naht unter Schiffes übergeben werden (gestrichelte gelbe Linie umreißt die Halsschlagader). (D) Anordnen lose an den oberen und unteren Bereich gebunden Nähte der Halsschlagader und Halsschlagader (Pfeile angedeutet, die oberen und unteren Bereich der Gefäße). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig3.jpg" width="700"> Abbildung 3: Anschließen der Schläuche zu ter Halsschlagader und Halsschlagader. (A) Ziehen Sie die oberen Knoten an der Halsschlagader und legen Sie die Klammer unter den unteren Knoten. (B) Mit Hilfe der Mikroschere, machen einen kleinen Schnitt in der Halsschlagader, ca. 1/8 der Umfang (gepunktete gelbe Kreis zeigt den Schnitt). ( C) Setzen Sie den Schlauch in die Halsschlagader und mit mindestens zwei Nähte (grün gestrichelte Linie zeigt den Schlauch und die gelbe gepunktete Linie die Halsschlagader). (D) In ähnlicher Schlauch in die Halsschlag einfügen (grün gestrichelte Linie zeigt den Schlauch und die gelb gepunktete Linie die Halsschlagader). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52130/52130fig4.jpg" width="700"> Abbildung 4: Vertreter Zeitverlauf der Leukozyten rollen durch den Strömungs Chamber (Maßstabsbalken = 100 um) (weiße Pfeilspitzen weisen darauf hin rollen Leukozyten). Graph zeigt repräsentative Ergebnisse nach dem Export in eine Grafik-Programm (Tx1 und Tx2 sind experimentelle Behandlungsgruppen und CTR ist der Kontrollgruppe). Tx1 eine Behandlung bei denen Leukozyten verlangsamt, was zu einer Abnahme der Leukozyten Walzgeschwindigkeit und eine Linksverschiebung der Kurve im Vergleich zu der unbehandelten Gruppe (CTR), während Tx2 führt zu einer Rechtsverschiebung infolge einer Zunahme der Leukozyten Walzgeschwindigkeit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52130/52130fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Hier stellen wir ein Protokoll, das die Ermittler Leukozytenrekrutierung Dynamik ex vivo durch Verbinden einer Kammer mit Endothelzellen stamm Adhäsionsmolekülen auf das Kreislaufsystem der Maus beschichtet beurteilen können. Dieses Verfahren bietet deutliche Vorteile, da es eine Leukozyten-Beurteilung nach relativen biologischen Bedingungen.

Bewertung der Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter Strömungsbedingungen in einem Ex vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen ex vivo arteriovenösen geschlossenen Kreislauf zu schaffen, um Leukozyteninteraktionen mit endothelialen Adhäsionsmolekülen unter physiologischen Strömungsbedingungen zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine dünne Glaskammer mit dem interessierenden endothelialen Adhäsionsmolekül beschichtet wird. Im zweiten Schritt werden Polyethylen- und Silikonschläuche mit der Kammer und anschließend chirurgisch mit der Maus verbunden.Als nächstes wird Blut aus der Halsschlagader durch den Schlauch fließen gelassen. Und die anschließenden Wechselwirkungen der nativen Leukozyten mit der beschichteten Glaskammer werden in Echtzeit aufgezeichnet. Letztendlich können die Auswirkungen verschiedener Behandlungen auf die Verschiebung und Rollgeschwindigkeit der Leukozyten bei der Interaktion mit den immobilisierten Adhäsionsmolekülen über die Zeit berechnet werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie einer Prozytometrie-Analyse besteht darin, dass mit dieser Technik die Interaktion von Leukozyten mit Endothelmolekülen unter physiologischen Strömungsbedingungen beurteilt wird. Am Tag vor dem Experiment verbinden Sie einen Zentimeter PE 10 Polyethylenschlauch mit einem sechs Zentimeter großen Stück Silikonschlauch, gefolgt von fünf Zentimetern Polyethylenschlauch. Um den Schlauchaufbau für die Halsschlagaderseite des Tieres für die Halsschlagaderseite vorzubereiten, verbinden Sie den Schlauch wie gerade gezeigt mit dem Zusatz einer TTU innerhalb des sechs Zentimeter langen Silikonschlauchs, etwa 1,5 Zentimeter von dem einen Zentimeter langen Polyethylenschlauch entfernt.Verbinden Sie als Nächstes ein Ende eines 10 Zentimeter großen Stücks Silikonschlauch mit dem Druckmessumformer und führen Sie das T-Ende des T-Schlauchs auf der Halsschlagaderseite in das andere Ende ein. Stellen Sie sicher, dass die Verbindungsstellen dicht und leckagefrei sind. Verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel verbunden ist, um jede Mikroflusskammer mit dem frisch vorbereiteten endothelialen Oberflächenbeschichtungsprotein von Interesse zu infundieren, und lagern Sie die beschichteten Kammern in einem 15-Milliliter-Röhrchen bei vier Grad Celsius über Nacht am nächsten Tag.Um den Jugular- und Karotisschlauch mit der Mikroflusskammer zu verbinden, schließen Sie einen Zentimeter langen Silikonschlauch an jede Seite der Kammer an und versiegeln Sie dann die Verbindungen mit einem kleinen rechteckigen Stück Param, das mit dem Schlauch auf die Kammer gespannt ist. Verwenden Sie eine Spritze, um die Kammer und den Schlauch mit 0,1 % Rinderserumalbumin zu füllen. Und dann, nachdem Sie auf Dichtheit geprüft haben, inkubieren Sie 45 Minuten lang in der Kammer.Stabilisieren Sie die Mikroströmungskammer bei Raumtemperatur gegen Ende der Inkubation auf einer Kerbe zur Petrischale mit einem kleinen Tropfen Silikon an jeder Kerbe. Verbinden Sie dann die Jugular- und Karotisschläuche mit jeder Seite der Kammer. Während das Silikon trocknet, schließen Sie eine mit Heparin gefüllte 60-mil-Verriegelungsspritze an den Druckmesskopf an und führen Sie 100 USP-Heparin durch den Schlauch und die Kammer, bis keine Luftblasen mehr vorhanden sind.Bevor Sie die Maus an die Mikroströmungskammer anschließen, schalten Sie den Computer, das Mikroskop und das entsprechende Druckaufzeichnungsgerät ein. Sobald die Software eingerichtet ist, sichern Sie sich eine 10 bis 12 Wochen alte Maus. Machen Sie in der Bauchlage mit einer Schere einen Schnitt im Halsbereich und präparieren Sie dann die Schilddrüse, um die Luftröhre und die Gefäße freizulegen.Reinige die Halsschlagader, bis sie vollständig freiliegt. Achten Sie darauf, den Vagusnerv nicht zu beschädigen. Führen Sie dann die Biegung eines gefalteten Nahtstücks unter der Halsschlagader durch und schneiden Sie die Naht an der Biegung durch.Unter der Arterie befinden sich also zwei Nahtstücke. Schlingen Sie jede Naht zu Knoten, ohne sie festzuziehen, und platzieren Sie dann die Nähte für die linke Halsvene auf die gleiche Weise. Wenn die Halsnähte an Ort und Stelle sind, injizieren Sie einen Milliliter Heparin in die Mausip.Nach der Injektion ziehen Sie die obere Naht an der Halsschlagader fest und platzieren Sie eine Gefäßklemme so tief wie möglich auf dem freiliegenden Abschnitt der Arterie. Halten Sie die Arterie mit einer Pinzette an der oberen Naht fest und verwenden Sie dann eine feine Mikroschere, um einen kleinen Schnitt von etwa einem Achtel des Umfangs der Arterie in der Nähe der oberen Naht zu machen. Führen Sie nun den Karotisschlauch mit einem Schlauchhalter durch den Schnitt in der Arterie ein und führen Sie ihn durch die untere Naht nach unten.Binden Sie dann die untere Naht ab, gefolgt von der oberen. So wird die Arterie um den Schlauch herum abgedichtet, wodurch mehrere Knoten entstehen, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten. Nachdem Sie das gleiche Verfahren für den Jugularschlauch ohne Gefäßklemme wiederholt haben, öffnen Sie vorübergehend die Gefäßklemme am Karotisschlauch, um den Fluss zu testen.Wenn keine Lecks vorhanden sind, bewegen Sie die Maus zum Mikroskop und verbinden Sie den Karotis- und Jugularvenenschlauch mit dem Mikroflusskammerschlauch, um die Rollgeschwindigkeit der Leukozyten durch die Mikroflusskammer aufzuzeichnen. Lösen Sie die Halsschlagaderklemme vollständig, um die Kammer zu füllen. Lassen Sie das Blut drei bis fünf Minuten lang zirkulieren, damit sich die Fließbedingungen stabilisieren.Stellen Sie in der Zwischenzeit den Mikroskoptisch so ein, dass sich die Kammer auf einer Höhe mit dem Mikroskopobjektiv befindet und ihre Kante parallel zum Videoaufzeichnungsfenster auf dem Bildschirm ist. Bauen Sie als Nächstes eine Petrischalen mit Wasser bei Raumtemperatur und senken Sie dann das 10-fache Wasserimmersionsobjektiv in die Schale, so dass die durch die Kammer fließenden Zellen sichtbar sind, passen Sie die Lichtintensität entsprechend an, um einen mittleren physiologischen Strömungsdruck zu simulieren, und stellen Sie die Klemme am Schlauch so ein, dass der Wandler konstant 30 Millimeter Quecksilbersäule anzeigt. Drücken Sie dann auf Start, um die Aufzeichnung sowohl des Leukozytentransports als auch des Drucks zu starten, wobei sich der erste Zeitraffer in der Nähe des jugularen Endes der Kammer befindet und sich gegen die Strömung in Richtung des Karotisendes bewegt, bis dies abgeschlossen ist.Wenn die Aufzeichnung abgeschlossen ist, schließen Sie das Ventil an der Eingangsstelle, um den Blutfluss zu stoppen, und ersetzen Sie die Kammer durch eine neue Kammer, die auf Wunsch mit einem anderen Adhäsionsmolekül beschichtet ist. Bei jeder Aufzeichnung sind nur interagierende Leukozyten innerhalb der Kammer sichtbar. In jedem dieser Bilder zeigen die weißen Pfeilspitzen beispielsweise einzelne Leukozyten an, die von dem interessierenden Adhäsionsmolekül eingefangen wurden und die entlang der Kammer zwischen den anderen frei fließenden Zellen rollen.Innerhalb des Blutflusses ist ein gemeinsames Artefakt außerhalb der Kammer mit den großen dunklen Kugeln in allen Bildern zu sehen, das dem Betrachter helfen kann, die Bewegung der Leukozyten in Bezug auf einen Fixpunkt zu verstehen. Das Diagramm veranschaulicht ein endgültiges Diagramm der Daten. Bei der ersten experimentellen Behandlung wurde beobachtet, dass die Walzgeschwindigkeit verringert wurde, die sich als Verschiebung nach links zeigte, und bei der zweiten experimentellen Behandlung wurde beobachtet, dass die Geschwindigkeit erhöht wurde, die als Verschiebung nach rechts erscheint, beide im Vergleich zur Kontrollrollgeschwindigkeit in Kombination mit diesem Verfahren.Andere Methoden wie die Markierung der Leukozyten und vivo x Viva können verwendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, wie z.B. die Rolle bestimmter Leukozyten-Subtypen bei der Krankheitsprogression.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Bewertung der Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter Strömungsbedingungen in einem Ex vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay (Video) | JoVE Journal

Bewertung der Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter Strömungsbedingungen in einem Ex vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

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