Bewertung der Leukozyten-Endothel-Interaktionen unter Strömungsbedingungen in einem Ex vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen ex vivo arteriovenösen geschlossenen Kreislauf zu schaffen, um Leukozyteninteraktionen mit endothelialen Adhäsionsmolekülen unter physiologischen Strömungsbedingungen zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine dünne Glaskammer mit dem interessierenden endothelialen Adhäsionsmolekül beschichtet wird. Im zweiten Schritt werden Polyethylen- und Silikonschläuche mit der Kammer und anschließend chirurgisch mit der Maus verbunden.

Als nächstes wird Blut aus der Halsschlagader durch den Schlauch fließen gelassen. Und die anschließenden Wechselwirkungen der nativen Leukozyten mit der beschichteten Glaskammer werden in Echtzeit aufgezeichnet. Letztendlich können die Auswirkungen verschiedener Behandlungen auf die Verschiebung und Rollgeschwindigkeit der Leukozyten bei der Interaktion mit den immobilisierten Adhäsionsmolekülen über die Zeit berechnet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken wie einer Prozytometrie-Analyse besteht darin, dass mit dieser Technik die Interaktion von Leukozyten mit Endothelmolekülen unter physiologischen Strömungsbedingungen beurteilt wird. Am Tag vor dem Experiment verbinden Sie einen Zentimeter PE 10 Polyethylenschlauch mit einem sechs Zentimeter großen Stück Silikonschlauch, gefolgt von fünf Zentimetern Polyethylenschlauch. Um den Schlauchaufbau für die Halsschlagaderseite des Tieres für die Halsschlagaderseite vorzubereiten, verbinden Sie den Schlauch wie gerade gezeigt mit dem Zusatz einer TTU innerhalb des sechs Zentimeter langen Silikonschlauchs, etwa 1,5 Zentimeter von dem einen Zentimeter langen Polyethylenschlauch entfernt.

Verbinden Sie als Nächstes ein Ende eines 10 Zentimeter großen Stücks Silikonschlauch mit dem Druckmessumformer und führen Sie das T-Ende des T-Schlauchs auf der Halsschlagaderseite in das andere Ende ein. Stellen Sie sicher, dass die Verbindungsstellen dicht und leckagefrei sind. Verwenden Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 25-Gauge-Nadel verbunden ist, um jede Mikroflusskammer mit dem frisch vorbereiteten endothelialen Oberflächenbeschichtungsprotein von Interesse zu infundieren, und lagern Sie die beschichteten Kammern in einem 15-Milliliter-Röhrchen bei vier Grad Celsius über Nacht am nächsten Tag.

Um den Jugular- und Karotisschlauch mit der Mikroflusskammer zu verbinden, schließen Sie einen Zentimeter langen Silikonschlauch an jede Seite der Kammer an und versiegeln Sie dann die Verbindungen mit einem kleinen rechteckigen Stück Param, das mit dem Schlauch auf die Kammer gespannt ist. Verwenden Sie eine Spritze, um die Kammer und den Schlauch mit 0,1 % Rinderserumalbumin zu füllen. Und dann, nachdem Sie auf Dichtheit geprüft haben, inkubieren Sie 45 Minuten lang in der Kammer.

Stabilisieren Sie die Mikroströmungskammer bei Raumtemperatur gegen Ende der Inkubation auf einer Kerbe zur Petrischale mit einem kleinen Tropfen Silikon an jeder Kerbe. Verbinden Sie dann die Jugular- und Karotisschläuche mit jeder Seite der Kammer. Während das Silikon trocknet, schließen Sie eine mit Heparin gefüllte 60-mil-Verriegelungsspritze an den Druckmesskopf an und führen Sie 100 USP-Heparin durch den Schlauch und die Kammer, bis keine Luftblasen mehr vorhanden sind.

Bevor Sie die Maus an die Mikroströmungskammer anschließen, schalten Sie den Computer, das Mikroskop und das entsprechende Druckaufzeichnungsgerät ein. Sobald die Software eingerichtet ist, sichern Sie sich eine 10 bis 12 Wochen alte Maus. Machen Sie in der Bauchlage mit einer Schere einen Schnitt im Halsbereich und präparieren Sie dann die Schilddrüse, um die Luftröhre und die Gefäße freizulegen.

Reinige die Halsschlagader, bis sie vollständig freiliegt. Achten Sie darauf, den Vagusnerv nicht zu beschädigen. Führen Sie dann die Biegung eines gefalteten Nahtstücks unter der Halsschlagader durch und schneiden Sie die Naht an der Biegung durch.

Unter der Arterie befinden sich also zwei Nahtstücke. Schlingen Sie jede Naht zu Knoten, ohne sie festzuziehen, und platzieren Sie dann die Nähte für die linke Halsvene auf die gleiche Weise. Wenn die Halsnähte an Ort und Stelle sind, injizieren Sie einen Milliliter Heparin in die Mausip.

Nach der Injektion ziehen Sie die obere Naht an der Halsschlagader fest und platzieren Sie eine Gefäßklemme so tief wie möglich auf dem freiliegenden Abschnitt der Arterie. Halten Sie die Arterie mit einer Pinzette an der oberen Naht fest und verwenden Sie dann eine feine Mikroschere, um einen kleinen Schnitt von etwa einem Achtel des Umfangs der Arterie in der Nähe der oberen Naht zu machen. Führen Sie nun den Karotisschlauch mit einem Schlauchhalter durch den Schnitt in der Arterie ein und führen Sie ihn durch die untere Naht nach unten.

Binden Sie dann die untere Naht ab, gefolgt von der oberen. So wird die Arterie um den Schlauch herum abgedichtet, wodurch mehrere Knoten entstehen, um eine dichte Abdichtung zu gewährleisten. Nachdem Sie das gleiche Verfahren für den Jugularschlauch ohne Gefäßklemme wiederholt haben, öffnen Sie vorübergehend die Gefäßklemme am Karotisschlauch, um den Fluss zu testen.

Wenn keine Lecks vorhanden sind, bewegen Sie die Maus zum Mikroskop und verbinden Sie den Karotis- und Jugularvenenschlauch mit dem Mikroflusskammerschlauch, um die Rollgeschwindigkeit der Leukozyten durch die Mikroflusskammer aufzuzeichnen. Lösen Sie die Halsschlagaderklemme vollständig, um die Kammer zu füllen. Lassen Sie das Blut drei bis fünf Minuten lang zirkulieren, damit sich die Fließbedingungen stabilisieren.

Stellen Sie in der Zwischenzeit den Mikroskoptisch so ein, dass sich die Kammer auf einer Höhe mit dem Mikroskopobjektiv befindet und ihre Kante parallel zum Videoaufzeichnungsfenster auf dem Bildschirm ist. Bauen Sie als Nächstes eine Petrischalen mit Wasser bei Raumtemperatur und senken Sie dann das 10-fache Wasserimmersionsobjektiv in die Schale, so dass die durch die Kammer fließenden Zellen sichtbar sind, passen Sie die Lichtintensität entsprechend an, um einen mittleren physiologischen Strömungsdruck zu simulieren, und stellen Sie die Klemme am Schlauch so ein, dass der Wandler konstant 30 Millimeter Quecksilbersäule anzeigt. Drücken Sie dann auf Start, um die Aufzeichnung sowohl des Leukozytentransports als auch des Drucks zu starten, wobei sich der erste Zeitraffer in der Nähe des jugularen Endes der Kammer befindet und sich gegen die Strömung in Richtung des Karotisendes bewegt, bis dies abgeschlossen ist.

Wenn die Aufzeichnung abgeschlossen ist, schließen Sie das Ventil an der Eingangsstelle, um den Blutfluss zu stoppen, und ersetzen Sie die Kammer durch eine neue Kammer, die auf Wunsch mit einem anderen Adhäsionsmolekül beschichtet ist. Bei jeder Aufzeichnung sind nur interagierende Leukozyten innerhalb der Kammer sichtbar. In jedem dieser Bilder zeigen die weißen Pfeilspitzen beispielsweise einzelne Leukozyten an, die von dem interessierenden Adhäsionsmolekül eingefangen wurden und die entlang der Kammer zwischen den anderen frei fließenden Zellen rollen.

Innerhalb des Blutflusses ist ein gemeinsames Artefakt außerhalb der Kammer mit den großen dunklen Kugeln in allen Bildern zu sehen, das dem Betrachter helfen kann, die Bewegung der Leukozyten in Bezug auf einen Fixpunkt zu verstehen. Das Diagramm veranschaulicht ein endgültiges Diagramm der Daten. Bei der ersten experimentellen Behandlung wurde beobachtet, dass die Walzgeschwindigkeit verringert wurde, die sich als Verschiebung nach links zeigte, und bei der zweiten experimentellen Behandlung wurde beobachtet, dass die Geschwindigkeit erhöht wurde, die als Verschiebung nach rechts erscheint, beide im Vergleich zur Kontrollrollgeschwindigkeit in Kombination mit diesem Verfahren.

Andere Methoden wie die Markierung der Leukozyten und vivo x Viva können verwendet werden, um weitere Fragen zu beantworten, wie z.B. die Rolle bestimmter Leukozyten-Subtypen bei der Krankheitsprogression.