Name: Verwendung plusTipTracker Software zum Messen in die Dynamik der Mikrotubuli Xenopus laevis Wachstumskegel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte Analyse von Mikrotubuli-Dynamik in Xenopus laevis Wachstumskegeln mit plusTipTracker. Diese MATLAB-basierte Methode ermöglicht schnelle Detektion, Tracking und Visualisierung von EB1-GFP-Kometen für quantitative Zellbiologie-Forschung.

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Wir danken Dr. Gaudenz Danuser und Mitgliedern seines Labors für die Erstellung der plusTipTracker-Software und für hilfreiche Diskussionen über die Verwendung der Software, insbesondere Maria Bagonis und Sebastien Besson. Wir danken insbesondere dem Boston College Media Center für seine Hilfe und Unterstützung bei der Erstellung und Bearbeitung des Videos. Wir danken auch den Mitgliedern des Lowery Lab für nützliche Diskussionen und konstruktive Kritik sowie Abigail Antoine für das Korrekturlesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch einen NIH R00 MH095768 Award an LAL finanziert.

Dieses Protokoll und Video werden soll als Ergänzung zum ursprünglichen Papier beschreibt das Software-Paket im Detail 4, sowie der Technische Bericht, der mit dem Software-Download auf der Website Danuser Lab kommt zu dienen. Die Leser werden aufgefordert, diese Unterlagen sorgfältig prüfen, ob es weitere Fragen zur Verwendung der Software. 1. Vor der Bildanalyse <ol><li> Jedes Zeitraffer-Film zu konvertieren in eine Folge von TIFF (Tagged Image File Format)-Image-Dateien. Wenn es mehrere Wachstumskegel /-Zellen in einem gegebenen Film, um erste Ernte jeder Wachstumskegel / Zelle ihre eigene Bildsequenz zu erstellen. Hinweis: Dies ist nicht notwendig, da die einzelnen Regionen-of-Interest (ROI) innerhalb plusTipTracker ausgewählt werden. Jedoch mit kleineren Bildabmessungen erhöht die Geschwindigkeit der Rechenverarbeitung, so dass dieser Schritt wird empfohlen, wenn eine signifikante Leerstelle in dem Bild. </li><li> Speichern Sie jede TIFF-Serie im eigenenOrdner &quot;Bilder&quot; in einem Pfad, MATLAB, um den Zugang gesetzt (beachten Sie, dass &quot;Bilder&quot; ist case-sensitive). Um einen neuen Pfad im Fenster &quot;Aktueller Ordner&quot; hinzufügen, auf die entsprechende Datei-Verzeichnis zu navigieren, der rechten Maustaste auf das Verzeichnis-Symbol, und wählen Sie &quot;In den Pfad - Ausgewählte Ordner und Unterordner&quot;. Es ist wichtig, dass die Software plusTipTracker Ordner auf den Weg gegeben werden, wie gut. </li></ol> 2. plusTipGetTracks Hinweis: Der erste Schritt in der Bildanalyse ist es, die EB1-GFP Kometen erkennen, verknüpfen Sie die Kometen in Spuren, und bestimmen Sie die Parameter der Dynamik der Mikrotubuli. Dies wird mit dem Befehl &quot;plusTipGetTracks&quot; 4 erhalten. <ol><li> Um die Analyse, offene MATLAB-Anwendung beginnen und geben Sie &quot;plusTipGetTracks&quot; in das Befehlsfenster. Dies führt dazu, dass ein neues Dialogfeld angezeigt. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Neues Projekte&quot; und wählen Sie einen (oder more) der vorigen TIFF-Bild-Serie durch eine entsprechende &quot;Bilder&quot;-Ordner (oder Verzeichnisse mit &quot;Bilder&quot;-Ordner). Nach Abschluss dieser Schritt ein Dateiverzeichnis (roi_1) wird (im selben Ordner, die &quot;Bilder&quot; hält) geschaffen werden, die die zukünftigen Datendateien enthält. Hinweis: Die &quot;Set Up New Projects&quot; Schritt kann vor der Zeit abgeschlossen werden kann, während einer separaten Sitzung. </li><li> Ein neues Fenster wird angezeigt: &quot;Wählen Sie ein Polygon, rechtsklicken Sie auf letzten Punkt, und klicken Sie auf &#39;Erstellen Maske&#39;&quot;. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Das erste Bild der ausgewählten Bildserie werden dann angezeigt. Mit der Maus zu klicken, und erstellen Sie ein Polygon, das die Gesamtheit der Wachstumskegel umfasst. Doppelklicken Sie auf die Maus, um das Polygon zu schließen. </li><li> Sobald das Polygon geschlossen wurde, wird ein Dialogfeld angezeigt: &quot;Möchten Sie eine andere ROI auswählen?&quot; Wenn das Bild hat einen weiteren Wachstumskegel zu analysieren, wählen Sie &quot;Ja&quot;; sonst sAuserwählten &quot;Nein&quot;. </li><li> Wählen Sie die Projekte, die sofort analysiert werden. Klicken Sie auf &quot;Wählen Sie Projekte&quot; und wählen Sie den Ordner (roi_X) zu analysieren. </li><li> Ein listSelectGUI Bildschirm erscheint. Wählen Sie das Projekt (e) von der linken Seite des Bildschirms, und verschieben Sie sie auf die rechte Seite des Bildschirms. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Wählen Sie einen Speicherort für die Projektliste zu speichern und klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Wählen Sie &quot;Erkennung&quot;, &quot;Verfolgung&quot; und &quot;Post-Processing&quot;. Sobald diese Einstellungen vorgenommen wurden, wird die rechte Seite des Dialogfelds werden konfigurierbar. Konfigurieren Sie jede Option. <ol><li> Diese Parameter werden verwendet, um erkannt Kometen in MT-Tracks zu verbinden. Details für die Wahl dieser Steuerparameter für die Verfolgung sind auf den Seiten 9-10 des technischen Berichts, der die PDF-Software-Paket herunterladen beiliegt; Lesen Sie diesen Bericht sorgfältig, wenn Probleme auftreten. Für die Zwecke des Tracking-EB1-GFP Kometen in xenopuns laevis Wachstumskegel, verwenden Sie die folgenden Einstellungen Verfolgung: Suche Radiusbereich (Pixel) 5-12, Mindestteilstreckenlänge (Frames) 3; Max Gap Länge (Frames) 8; Max Schrumpffaktor 0,8, Max Winkel vorne 50, Max Winkel rückwärts 10, Fluktuation Radius 2.5. Diese Einstellungen werden in Abbildung 1 dargestellt. </li></ol> Hinweis: Max Schrumpffaktor ist auf die Anzahl der &quot;rückwärts Lücken&quot; erkannt zu reduzieren, als &quot;rückständig Lücken&quot; sind nicht sinnvoll, im Rahmen der Wachstumskegel zu analysieren, da die überfüllten Bedingungen und wahrscheinlich Fehler in der Spurgestänge. Zusätzlich sowohl Max Vorwärtswinkel sowie Fluktuation Radius relativ hoch eingestellt ist, als Wachstumskegel MTs zeigen häufige kleine Translokationen zusätzlich zu Wucherungen und Schrumpfungen, und die Erhöhung dieser Steuer Einstellungen ermöglicht dieser erhöhten Bewegung während der Verknüpfungsschritt. <ol><li> Füllen Sie die Post-Processing-Einstellungen abhängig von den gewünschten spezifischen Bildaufnahme-Einstellungen. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Sobald die Einstellungen konfiguriert wurden, klicken Sie auf &quot;Start&quot;. Die Software läuft je nachdem, welche Einstellungen gewählt wurden. Das kann Minuten bis Stunden dauern, abhängig von der Anzahl der ausgewählten Projekte und ihre Größen. Das Befehlsfenster zeigt die voraussichtliche Rest für jede Funktion. Wenn die plusTipGetTracks Schritt abgeschlossen ist, das Befehlsfenster zeigt &quot;Fertig!&quot; Hinweis: Eine lange Liste von spezifischen Parameter der MT Dynamik haben nun von dieser Software berechnet (siehe Referenz 4 für Details), aber für die Analyse von MT Dynamik in Wachstumskegeln sind die gängigsten Parameter zu untersuchen, MT Wachstumskurs Geschwindigkeit (in Mikrometer / Minute), Wachstumsspurdauer (in Sekunden), und das Wachstum Spurlänge (in Mikrometern). </li></ol> 3. plusTipSeeTracks Hinweis: Nachdem die Mikrotubuli-Tracks definiert wurden, ist die Funktion &quot;plustipSeeTracks&quot; für Spur 4 Visualisierung eingesetzt. Diese Funktionkönnen mehrere Ausgänge für die Visualisierung, einschließlich räumliche Dynamik MT Karten und Geschwindigkeit Filme bieten, aber hier liegt der Fokus ausschließlich auf mit &quot;Track Filme&quot;, ​​um MT Spuren auf den Wachstumskegel Bilder überlagert anzuzeigen. Während plusTipGetTracks können mehrere Filme auf einmal zu analysieren, können plusTipSeeTracks nur einen Film analysieren zu einer Zeit. <ol><li> Geben Sie &quot;plusTipSeeTracks&quot; in das Befehlsfenster. </li><li> Nachdem das Dialogfeld lädt, klicken Sie auf &quot;Select Project&quot;. Wählen Sie das übergeordnete Verzeichnis, das Projekt zu visualisieren und klicken Sie auf &quot;Ordner auswählen&quot;. Ein neues Fenster wird angezeigt: &quot;Wählen Sie das Projekt, das Sie visualisieren möchten&quot;. Wählen Sie die Datei, um zu visualisieren und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Als nächstes klicken Sie auf &quot;Wählen Sie Gespeicherte ROI&quot;. Navigieren Sie zu dem gleichen Ordner wie die roi_X im vorherigen Schritt ausgewählt und wählen Sie die Datei mit dem Namen &quot;roiYX&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Wählen Sie Output Directory&quot; auf w bezeichnenMATLAB hier wird die Track-Visualisierungsdateien zu speichern. Hinweis: Wir empfehlen mit den gleichen Ordner, die den Rest der Daten enthält. </li><li> &quot;Make Track-Film&quot; und ein Fenster angezeigt, die Anzeige alle Titel aus den plusTipGetTracks + TIP Kometen berechnet. Dieser Schritt sichert die verfolgten Zeitreihen in einem Film-Format, in der Datei &quot;allTracks_X_X_X&quot;. Es gibt eine Option für das Speichern der Film als AVI, sonst das Standardformat ist als Quicktime.mov Datei. </li></ol> 4. plusTipGroupAnalysis Hinweis: Diese letzte Funktion wird verwendet, um Gruppen von Filmen für die Analyse und den Vergleich ihrer MT Spurparameter. <ol><li> Geben Sie &quot;plusTipGroupAnalysis&quot; in das Befehlsfenster. Manuell wählen Sie die Gruppen zu vergleichen, zuerst de-wählen Sie &quot;Auto-Gruppe aus Hierarchie&quot;. Dann klicken Sie auf &quot;Select-Projekte&quot;. Navigieren Sie zu den übergeordneten Verzeichnissen alle roi_X Ordner mitzu analysieren. </li><li> Ein listSelectGUI Bildschirm erscheint. Wählen Sie alle Projekte, die in den Gruppen, von der linken Seite des Bildschirms umfassen und verschieben Sie sie auf die rechte Seite des Bildschirms. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Wählen Sie einen Speicherort für die Projektliste zu speichern und klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Ein Fenster wird angezeigt: &quot;Bitte wählen Sie zuerst Gruppe aus der Liste&quot;. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Das Fenster listSelectGUI wird erneut angezeigt. Dieses Mal, wählen Sie nur die Dateien, die zu der ersten Gruppe, die zusammengeführt werden sollten übereinstimmen. Klicken Sie auf &quot;OK&quot;. </li><li> Geben Sie dann den Namen der Gruppe, und klicken Sie auf &quot;OK&quot;. Entsprechend &quot;Wählen Sie eine andere Gruppe?&quot; Antwort und weiter Gruppen auswählen: Ein Fenster wird angezeigt. Es erscheint ein Fenster: &quot;Wählen Sie einen Speicherort für die Gruppenliste speichern&quot;. Navigieren Sie zum Speicherort und klicken Sie auf &quot;Speichern&quot;. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Select Output Directory&quot; zu wählen, wo die Ausgangsordner werdengespeichert. </li><li> Wählen Sie, welche Art von Gruppenanalyse durchzuführen, um - ob die MT-Tracks sollten für jede Gruppe oder pro Zellanalyse durchgeführt werden soll gebündelt werden. Die empfohlenen statistischen Tests sind bereits bezeichnet. Um alle Titel in der Analyse, sind de-select &quot;-Tracks am Anfang / Ende des Film Entfernen&quot;. Ansonsten hat dieses Feld gewählt entfernt alle Spuren, die MT Wachstum in der Prozess sind wie der Film beginnt oder endet. </li><li> Nachdem die Gruppenanalyse Auswahl getroffen wird, wählen Sie &quot;Gruppen vergleichen&quot;. </li></ol>

<ol><li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 2655-2664 (2003).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microtubule+plus+end+tracking+protein+Orbit%2FMAST%2FCLASP+acts+downstream+of+the+tyrosine+kinase+Abl+in+mediating+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The microtubule plus end tracking protein Orbit/MAST/CLASP acts downstream of the tyrosine kinase Abl in mediating axon guidance.</a> Neuron. , 913-926 (2004).</li>
<li>Purro, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+regulates+axon+behavior+through+changes+in+microtubule+growth+directionality%3A+a+new+role+for+adenomatous+polyposis+coli%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Wnt regulates axon behavior through changes in microtubule growth directionality: a new role for adenomatous polyposis coli.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 8644-8654 (2008).</li>
<li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plusTipTracker%3A+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of structural biology. 176, 168-184 (2011).</li>
<li>Lowery, L. A., Faris, A. E., Stout, A., Van Vactor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Explant+Cultures+from+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Neural Explant Cultures from Xenopus laevis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (68), e4232(2012).</li>
<li>Long, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+CLASP-interacting+protein+functions+during+interphase+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of CLASP-interacting protein functions during interphase microtubule dynamics.</a> Molecular and cellular biology. 33, 1528-1545 (2013).</li>
<li>Myers, K. A., Applegate, K. T., Danuser, G., Fischer, R. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+ECM+mechanosensing+pathways+regulate+microtubule+dynamics+to+control+endothelial+cell+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Distinct ECM mechanosensing pathways regulate microtubule dynamics to control endothelial cell branching morphogenesis.</a> The Journal of cell biology. 192, 321-334 (2011).</li>
<li>Nishimura, Y., Applegate, K., Davidson, M. W., Danuser, G., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+microtubule+growth+dynamics+identifies+MARK2+as+a+regulator+of+leading+edge+microtubules+downstream+of+Rac1+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated screening of microtubule growth dynamics identifies MARK2 as a regulator of leading edge microtubules downstream of Rac1 in migrating cells.</a> PLoS One. 7, e41413(2012).</li>
<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+ends%3A+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 309-322 (2008).</li>
<li>Schuyler, S. C., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+%27plus-end-tracking+proteins%27%3A+The+end+is+just+the+beginning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule 'plus-end-tracking proteins': The end is just the beginning.</a> Cell. 105, 421-424 (2001).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312, 237-242 (1984).</li>
<li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Current biology : CB. 10, 865-868 (2000).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+tracking+by+CLIP-170+requires+EB1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end tracking by CLIP-170 requires EB1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 492-497 (2009).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+promotes+microtubule+dynamics+by+recruiting+Sentin+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">EB1 promotes microtubule dynamics by recruiting Sentin in Drosophila cells.</a> The Journal of cell biology. 193, 973-983 (2011).</li>
<li>Maurer, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EB1+accelerates+two+conformational+transitions+important+for+microtubule+maturation+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">EB1 accelerates two conformational transitions important for microtubule maturation and dynamics.</a> Current biology : CB. 24, 372-384 (2014).</li>
<li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nature cell biology. 15, 688-693 (2013).</li>
<li>Lowery, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone-specific+functions+of+XMAP215+in+restricting+microtubule+dynamics+and+promoting+axonal+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+development%22%5BJournal%5D)">Growth cone-specific functions of XMAP215 in restricting microtubule dynamics and promoting axonal outgrowth.</a> Neural development. 8, 22(2013).</li>
<li>Marx, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+cytoplasmic+linker-associated+protein+1+%28XCLASP1%29+promotes+axon+elongation+and+advance+of+pioneer+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Xenopus cytoplasmic linker-associated protein 1 (XCLASP1) promotes axon elongation and advance of pioneer microtubules.</a> Molecular biology of the cell. 24, 1544-1558 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

PlusTipTracker bietet eine einfache, grafische Benutzerschnittstelle für nahezu alle sichtbar EB1-GFP Kometen schnell und automatisch erkennen in einer Zelle oder Wachstumskegel, verknüpfen Sie die Kometen in Spuren, und berechnen MT-Parameter. Andere Veröffentlichungen haben die Gestaltung ähnliche Arten von Software (zum Beispiel Marx et al ebenfalls verwendet quantitative Analyse von markierten EB1 Dynamik in Wachstumskegel 18.) Berichtet. Aber wird dieses Software in seiner einfachen Zugang, einz...

Das Ziel dieser Methode ist, um quantitative Informationen über Mikrotubuli (MT) plus-End-Tracking-Protein (+ TIP) Dynamik in lebenden Wachstumskegel zu erhalten. MT + Tipps sind eine Gruppe von Proteinen, die an den Enden der plus-MT 9,10 lokalisieren. Sie führen eine Reihe von Funktionen, um die Parameter der MT dynamische Instabilität 11, einschließlich der Sätze der Polymerisation Katastrophe und Rettung zu regulieren. Ein allgemein verwendetes Verfahren zum Analysieren MT Dynamik ist, um das Verhalten des TIP + EB1, die spezifisch an wachsenden MT bindet plus-Enden 1,12 verfolgen. EB1 ist bekannt, dass mehrere andere Proteine ​​zu rekrutieren wachsenden MT plus-Enden 13,14, und wurde kürzlich als ein MT Reifung Faktor 15 festgestellt, die Förderung sowohl MT Wachstum und Katastrophe Frequenz 15,16. Viele Studien der MT Dynamik in Wachstumskegeln haben Hand-Tracking-Methoden, um Veränderungen in der EB1-GFP Dynamik über die Zeit zu messen 1-3 genutzt, wie EB1 localizatian MT plus-Enden können als Marker für MT-Polymerisation verwendet werden. Ein wesentlicher Vorteil für die Prüfung EB1-GFP Kometen als Proxy für MT Wachstum ist, dass MT Dynamik kann auch in Regionen mit signifikanter MT Überlappung gemessen werden. Während das Verfahren von Hand Verfolgung EB1-GFP Kometen hat nützliche Einblicke in MT vorgesehen Verhaltensweisen 1-3, es ist zeitaufwendig und kann vorgespannt werden. Zusätzlich wird, wie abweichende Wachstumskegel Verhaltensweisen sind wahrscheinlich das Ergebnis von winzigen Verschiebungen im Zytoskelett-Dynamik, die Analyse nur eine kleine Teilmenge von MT (in der Regel notwendig, wenn die Hand-Tracking) kann wichtige Informationen zu verpassen. So messen wir globale Dynamik MT Parameter mit dem Software-Paket, plusTipTracker 4, nach dem Erwerb der hochauflösenden Live-Bilder von markierten EB1 in kultivierten embryonalen Wachstumskegel 5. Diese Software, die im Labor entwickelt Danusers, wurde in mehreren Studien Charakterisierung MT Dynamik in verschiedenen Zelltypen 6-8 verwendet. Es ist ein Open-Source, unser-freundlich, MATLAB-basierte Paket, automatische Erkennung, Verfolgung, Visualisierung und Analyse für Filme von fluoreszenzmarkierten + Tips enthält. Eine lange Liste von spezifischen Parameter der MT Dynamik werden von dieser Software berechnet (siehe Referenz 4 für Details), aber für die Analyse von MT Dynamik in Wachstumskegeln sind die gängigsten Parameter MT Wachstumskurs Geschwindigkeit (in Mikrometer / Minute), Wachstumskurs Lebensdauer (in Sekunden), und das Wachstum Spurlänge (in Mikrometern). Die Software kann direkt von der Website Danuser Lab (unter &quot;Software&quot;) heruntergeladen werden. Während der Danuser Lab unterstützt derzeit eine neuere Schnittstelle für TIP + Tracking-Analyse, die in einem Software-Paket namens u-Track 2.0, das Original, Stand-alone-Software zur Verfügung stehen aufgenommen wird. Die zugrundeliegenden Algorithmen zwischen den beiden Programmen gleich sind (zumindest 2014), wobei nur ein Unterschied von Schnittstelle und Analyse Ausgänge. Für den Anfänger mit wenig MATLAB und / oder Computeranalyse Erfahrenz hat plusTipTracker benutzerfreundlichen Funktionen, einschließlich automatisierter statistischer Parameter Ausgänge. Hier beschreiben wir die Schritte zum Analysieren von Bildern von EB1-GFP Dynamik in kultivierten Xenopus laevis Wachstumskegeln. Dieses Protokoll wurde in einer aktuellen Arbeit untersucht die Dynamik MT 17 genutzt. Siehe auch Lowery et al. 2012 5 für ausführliche Anweisungen für die Kultivierung Wachstumskegel ausdrücken EB1-GFP. Während dieses Papier in erster Linie auf die Untersuchung EB1-GFP Dynamik in Wachstumskegel konzentriert, kann das gleiche Protokoll für andere Zelltypen, 17 verwendet werden. Für alle Zelltypen, sollte das Zeitintervall zwischen den Rahmen zwischen 0,5-2 sec für optimale + TIP Verfolgungs sein. Ein Zeitintervall von bis zu 4 Sekunden zwischen den Rahmen möglich ist, aber dies erhöht Intervallzeit zu zusätzlichen Spurfehler.

<table><tbody><tr><td>plusTipTracker-Software</td><td>Danuser Lab</td><td><a href="http://lccb.hms.harvard.edu/software.html">http://lccb.hms.harvard.edu/software.html</a></td><td>Diese Software kann in Zukunft von einer anderen Website gehostet werden.&nbsp; Wenn die aufgeführte Website nicht vorhanden ist, suchen Sie in einer Websuchmaschine nach "Danuser Lab Software", um die Website zu finden.</td></tr><tr><td>MATLAB-Software</td><td>Mathworks</td><td><a href="http://www.mathworks.com/products/matlab/">http://www.mathworks.com/products/matlab/</a></td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung plustiptracker software zum messen in die dynamik der mikrotubuli xenopus laevis wachstumskegel

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Mikrotubuli (MT) plus-End-Tracking-Proteine ​​(+ Tips) zu lokalisieren, um den wachsenden Plus-Enden der MTS und regulieren MT Dynamik 1,2. Eine der bekanntesten und weithin genutzte + Tipps für die Analyse MT Dynamik ist die End-bindendes Protein, EB1, die alle wachsenden MT plus-Enden bindet, und somit ist ein Marker für die MT-Polymerisation 1. Viele Studien von EB1 Verhalten innerhalb Wachstumskegel haben zeitaufwendig und voreingenommen computergestützte, Hand-Tracking-Methoden zur Analyse einzelner MTs 1-3. Unser Ansatz ist es, globale Parameter des MT Dynamik mit dem Softwarepaket, plusTipTracker 4, nach dem Erwerb von hochauflösenden Live-Bilder von markierten EB1 in kultivierten embryonalen Wachstumskegel 5 quantifizieren. Diese Software ist eine MATLAB-basierte Open-Source-, benutzerfreundlichen Paket, das automatisierte Erkennung, Verfolgung, Visualisierung und Analyse für Filme von fluoreszenzmarkierten + Filtern kombiniert. Hier präsentieren wir das Protokoll für die Verwendung plusTipTAufsteller für die Analyse von fluoreszenzmarkierten + TIP Kometen in kultivierten Xenopus laevis Wachstumskegeln. Jedoch kann diese Software auch zum MT Dynamik in verschiedenen Zelltypen 6-8 charakterisieren.

Mit dieser Software, wie hier beschrieben wird mehrere Dateien mit Informationen, + TIP Dynamik in lebenden Zellen zu quantifizieren ist. Die Funktion plusTipGetTracks identifiziert die Tracks (mit Beispiel in Abbildung 1 gezeigten Einstellungen), und stellt Parameter in Bezug auf die + TIP Tracks dann. Um die Informationen, dass die Software erhalten sehen, gehen Sie in das Verzeichnis, in roi_X Schritt 2.2 erstellt wurde. Die "feat" Ordner enthält "overlayImages", die eine...

Die MATLAB-basierte Open-Source-Software-Paket, plusTipTracker, können verwendet werden, um Bild-Serie von fluoreszenzmarkierten + Tricks zu analysieren, um die Dynamik der Mikrotubuli zu quantifizieren.

Verwendung plusTipTracker Software zum Messen in die Dynamik der Mikrotubuli Xenopus laevis Wachstumskegel

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe des Softwarepakets plus tip tracker quantitative Informationen über Mikrotubuli plus Endverfolgungsprotein oder plus Spitzendynamik und lebende Wachstumszapfen zu erhalten. Hier beschreiben wir die Schritte zur Analyse von Bildern der EB one GFP-Dynamik und kultivierten XUS lavis Wachstumskegeln, aber ein ähnliches Protokoll kann auch für andere Zelltypen verwendet werden, nachdem hochauflösende Live-Bilder von markierten EB one und kultivierten embryonalen Wachstumskegeln aufgenommen wurden. Der erste Schritt in der Prozedur besteht darin, mit dem Befehl plus Tipp Spuren zu erhalten, um die EB one GFP-Kometen zu erkennen, die Kometen zu Spuren zu verknüpfen und die Parameter der Mikrotubuli-Dynamik zu bestimmen.Der zweite Schritt besteht darin, die Mikrotubuli-Spuren mit Befehl und Tipp C zu visualisieren, die den Wachstumskegelbildern überlagert sind. Der letzte Schritt besteht darin, die Plus-Tipp-Gruppenanalyse zu verwenden, um die Mikrotubuli-Spurparameter von Filmgruppen zu analysieren und zu vergleichen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von Hand-Tracking zur Analyse einzelner Plus-Tip-Spuren besteht darin, dass diese Methode eine schnelle und automatisierte Erkennung, Verfolgung, Visualisierung und Analyse ermöglicht.Der erste Schritt der Bildanalyse besteht darin, die EB one GFP-Kometen zu detektieren, die Kometen zu Bahnen zu verknüpfen und die Parameter der Mikrotubuli-Dynamik zu bestimmen. Dies erhalten Sie mit dem Befehl plus Tipp. Erhalten Sie Tracks vor der Bildanalyse.Konvertieren Sie jeden Zeitrafferfilm in eine Sequenz von TIFF-Bilddateien und speichern Sie jede Serie in einem eigenen Ordner namens images. Beachten Sie, dass bei Bildern zwischen Groß- und Kleinschreibung unterschieden wird. Um mit der Analyse zu beginnen, öffnen Sie die MATLAB-Anwendung, und geben Sie plus tip get tracks in das Befehlsfenster ein.Daraufhin wird ein neues Dialogfeld angezeigt. Klicken Sie auf, neue Projekte einrichten und wählen Sie eine oder mehrere der vorherigen TIFF-Bildserien aus, indem Sie den entsprechenden Bildordner auswählen. Nach Abschluss dieses Schritts wird ein Dateiverzeichnis erstellt.Klicken Sie auf, okay. Sobald das erste Bild angezeigt wurde, klicken Sie mit der Maus und erstellen Sie ein Polygon. Umfasst dann die Gesamtheit des Wachstumskegels.Doppelklicken Sie mit der Maus, um das Polygon zu schließen. Ein Dialogfeld wird angezeigt, wenn das Bild einen weiteren Wachstumskegel aufweist. Wählen Sie zum Analysieren Ja aus.Andernfalls wählen Sie Nein aus. Der nächste Schritt besteht darin, die Projekte auszuwählen, die sofort analysiert werden sollen. Klicken Sie auf Projekte auswählen und wählen Sie den Ordner aus.Um eine Liste zu analysieren, wählen Sie Gooey Screen wird angezeigt. Wählen Sie die Projekte auf der linken Seite des Bildschirms aus und verschieben Sie sie auf die rechte Seite. Klicken Sie auf, okay.Wählen Sie einen Speicherort für die Projektliste und klicken Sie auf Speichern, wählen Sie Erkennung, Nachverfolgung und Nachbearbeitung. Sobald diese Auswahl getroffen wurde, kann die rechte Seite des Dialogfelds konfiguriert werden. Geben Sie die Nachbearbeitungseinstellungen ein.Klicken Sie je nach den gewünschten Einstellungen für die Bildaufnahme auf Start. Die Software führt dann die eingegebenen Schritte aus. Im Befehlsfenster wird die geschätzte verbleibende Zeit für jede Funktion angezeigt, und Wird angezeigt, wenn die Ausführung des Schritts abgeschlossen ist.Nachdem nun Mikroröhrenbahnen definiert wurden, wird die Funktion plus Tipp C Leiterbahnen zur Spurvisualisierung und zur Überlagerung der Mikroröhrenbahnen mit Wachstumskegelbildern verwendet. Dies wird mit dem Befehl plus Tipp C Spuren Typ plus Tipp C Spuren in das Befehlsfenster erhalten. Nachdem das Dialogfeld geladen wurde, klicken Sie auf Projekt auswählen.Wählen Sie das übergeordnete Verzeichnis aus, in dem sich das zu visualisierende Projekt befindet, und klicken Sie auf Ordner auswählen. Sobald das Fenster erscheint, wählen Sie die zu visualisierende Datei aus und klicken Sie auf. Okay, klicken Sie anschließend auf Gespeicherten ROI auswählen, navigieren Sie zu demselben Ordner für die Interessenregion wie im vorherigen Schritt und wählen Sie die Datei mit dem Namen R-O-I-Y-X aus.Klicken Sie auf Ausgabeverzeichnis auswählen, um festzulegen, wo MATLAB die Track-Visualisierungsdateien speichern soll, und wählen Sie dann Make Track Movie aus. Es erscheint ein Bildschirm, auf dem alle Titel angezeigt werden. Plus-Tipp: Holen Sie sich die Tracks, die aus den Plus-Tipp-Kommentaren berechnet werden.In diesem Schritt wird die Spurzeitreihe in einem Filmformat gespeichert. Die letzte Funktion wird verwendet, um Gruppen von Filmen für die Analyse und den Vergleich der Parameter der Mikroröhrenspur zu erstellen. Dies wird mit der Gruppenanalyse Befehl plus Tipp erreicht.Once plus tip get tracks wurde für mehrere Filme ausgeführt und verschiedene Datenteilmengen stehen zum Vergleich bereit. Geben Sie plus Tipp-Gruppenanalyse in das Befehlsfenster ein: Um die zu vergleichenden Gruppen manuell auszuwählen, deaktivieren Sie zuerst die automatische Gruppe aus der Hierarchie. Klicken Sie dann auf Projekte auswählen.Navigieren Sie zu den übergeordneten Verzeichnissen, die alle ROI-Ordner enthalten. Um eine Liste zu analysieren, wählen Sie GUI-Fenster wird angezeigt. Wählen Sie auf der linken Seite des Bildschirms alle Projekte aus, die in die Gruppen aufgenommen werden sollen, und verschieben Sie sie auf die rechte Seite.Klicken Sie auf, okay. Wählen Sie dann einen Speicherort für die Projektliste aus und klicken Sie auf Speichern, ein Fenster wird angezeigt. Anklicken.Okay, und das klebrige Fenster mit der Listenauswahl wird angezeigt. Wählen Sie auch hier nur die Dateien aus, die der ersten Gruppe entsprechen, die zusammengezogen werden soll, und klicken Sie auf. Okay. Geben Sie den Gruppennamen ein und klicken Sie auf, okay.Es erscheint ein Fenster, antworten Sie entsprechend und fahren Sie mit der Auswahl der Gruppen fort. Wählen Sie dann einen Speicherort für die Gruppenliste aus und klicken Sie auf Speichern. Klicken Sie auf Ausgabeverzeichnis auswählen, um auszuwählen, wo die Ausgabeordner gespeichert werden sollen.Wählen Sie abschließend aus, welche Art von Gruppenanalyse durchgeführt werden soll. Hier wählen wir Pool-Daten aus allen Zellen und Gruppen aus. Klicken Sie auf Gruppen vergleichen.Dieses Bild zeigt die Parameter der Mikroröhrendynamik, die aus der Funktion abgeleitet wurden, plus tip git tracks. Dieser Film zeigt die Mikrotubuli-Spuren, die aus der Funktion plus Tipp-C-Spuren erhalten wurden. Schließlich zeigt dieses Bild die Mikrotubuli-Parameter, die aus der Analyse der Funktion plus Spitzengruppe erhalten wurden.Mit einer Tabellenkalkulationsanwendung. Diese Parameter, die aus verschiedenen Gruppen von Filmen gewonnen wurden, können auch als Boxplots mit einem Verarbeitungsprogramm untersucht werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Plus Tip Tracker verwenden, um quantitative Informationen über die Dynamik von Mikrotubuli plus Spitze und lebende Wachstumskegel zu erhalten, indem Sie die Funktionen plus tip git tracks plus tip C tracks und plus tip Group analysis verwenden.

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Forschung

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Biology

Biologie

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