Verwendung plusTipTracker Software zum Messen in die Dynamik der Mikrotubuli Xenopus laevis Wachstumskegel
7. September 2014
Die MATLAB-basierte Open-Source-Software-Paket, plusTipTracker, können verwendet werden, um Bild-Serie von fluoreszenzmarkierten + Tricks zu analysieren, um die Dynamik der Mikrotubuli zu quantifizieren.
Ziel dieses Verfahrens ist es, mit Hilfe des Softwarepakets plus tip tracker quantitative Informationen über Mikrotubuli plus Endverfolgungsprotein oder plus Spitzendynamik und lebende Wachstumszapfen zu erhalten. Hier beschreiben wir die Schritte zur Analyse von Bildern der EB one GFP-Dynamik und kultivierten XUS lavis Wachstumskegeln, aber ein ähnliches Protokoll kann auch für andere Zelltypen verwendet werden, nachdem hochauflösende Live-Bilder von markierten EB one und kultivierten embryonalen Wachstumskegeln aufgenommen wurden. Der erste Schritt in der Prozedur besteht darin, mit dem Befehl plus Tipp Spuren zu erhalten, um die EB one GFP-Kometen zu erkennen, die Kometen zu Spuren zu verknüpfen und die Parameter der Mikrotubuli-Dynamik zu bestimmen.
Der zweite Schritt besteht darin, die Mikrotubuli-Spuren mit Befehl und Tipp C zu visualisieren, die den Wachstumskegelbildern überlagert sind. Der letzte Schritt besteht darin, die Plus-Tipp-Gruppenanalyse zu verwenden, um die Mikrotubuli-Spurparameter von Filmgruppen zu analysieren und zu vergleichen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Verwendung von Hand-Tracking zur Analyse einzelner Plus-Tip-Spuren besteht darin, dass diese Methode eine schnelle und automatisierte Erkennung, Verfolgung, Visualisierung und Analyse ermöglicht.
Der erste Schritt der Bildanalyse besteht darin, die EB one GFP-Kometen zu detektieren, die Kometen zu Bahnen zu verknüpfen und die Parameter der Mikrotubuli-Dynamik zu bestimmen. Dies erhalten Sie mit dem Befehl plus Tipp. Erhalten Sie Tracks vor der Bildanalyse.
Konvertieren Sie jeden Zeitrafferfilm in eine Sequenz von TIFF-Bilddateien und speichern Sie jede Serie in einem eigenen Ordner namens images. Beachten Sie, dass bei Bildern zwischen Groß- und Kleinschreibung unterschieden wird. Um mit der Analyse zu beginnen, öffnen Sie die MATLAB-Anwendung, und geben Sie plus tip get tracks in das Befehlsfenster ein.
Daraufhin wird ein neues Dialogfeld angezeigt. Klicken Sie auf, neue Projekte einrichten und wählen Sie eine oder mehrere der vorherigen TIFF-Bildserien aus, indem Sie den entsprechenden Bildordner auswählen. Nach Abschluss dieses Schritts wird ein Dateiverzeichnis erstellt.
Klicken Sie auf, okay. Sobald das erste Bild angezeigt wurde, klicken Sie mit der Maus und erstellen Sie ein Polygon. Umfasst dann die Gesamtheit des Wachstumskegels.
Doppelklicken Sie mit der Maus, um das Polygon zu schließen. Ein Dialogfeld wird angezeigt, wenn das Bild einen weiteren Wachstumskegel aufweist. Wählen Sie zum Analysieren Ja aus.
Andernfalls wählen Sie Nein aus. Der nächste Schritt besteht darin, die Projekte auszuwählen, die sofort analysiert werden sollen. Klicken Sie auf Projekte auswählen und wählen Sie den Ordner aus.
Um eine Liste zu analysieren, wählen Sie Gooey Screen wird angezeigt. Wählen Sie die Projekte auf der linken Seite des Bildschirms aus und verschieben Sie sie auf die rechte Seite. Klicken Sie auf, okay.
Wählen Sie einen Speicherort für die Projektliste und klicken Sie auf Speichern, wählen Sie Erkennung, Nachverfolgung und Nachbearbeitung. Sobald diese Auswahl getroffen wurde, kann die rechte Seite des Dialogfelds konfiguriert werden. Geben Sie die Nachbearbeitungseinstellungen ein.
Klicken Sie je nach den gewünschten Einstellungen für die Bildaufnahme auf Start. Die Software führt dann die eingegebenen Schritte aus. Im Befehlsfenster wird die geschätzte verbleibende Zeit für jede Funktion angezeigt, und Wird angezeigt, wenn die Ausführung des Schritts abgeschlossen ist.
Nachdem nun Mikroröhrenbahnen definiert wurden, wird die Funktion plus Tipp C Leiterbahnen zur Spurvisualisierung und zur Überlagerung der Mikroröhrenbahnen mit Wachstumskegelbildern verwendet. Dies wird mit dem Befehl plus Tipp C Spuren Typ plus Tipp C Spuren in das Befehlsfenster erhalten. Nachdem das Dialogfeld geladen wurde, klicken Sie auf Projekt auswählen.
Wählen Sie das übergeordnete Verzeichnis aus, in dem sich das zu visualisierende Projekt befindet, und klicken Sie auf Ordner auswählen. Sobald das Fenster erscheint, wählen Sie die zu visualisierende Datei aus und klicken Sie auf. Okay, klicken Sie anschließend auf Gespeicherten ROI auswählen, navigieren Sie zu demselben Ordner für die Interessenregion wie im vorherigen Schritt und wählen Sie die Datei mit dem Namen R-O-I-Y-X aus.
Klicken Sie auf Ausgabeverzeichnis auswählen, um festzulegen, wo MATLAB die Track-Visualisierungsdateien speichern soll, und wählen Sie dann Make Track Movie aus. Es erscheint ein Bildschirm, auf dem alle Titel angezeigt werden. Plus-Tipp: Holen Sie sich die Tracks, die aus den Plus-Tipp-Kommentaren berechnet werden.
In diesem Schritt wird die Spurzeitreihe in einem Filmformat gespeichert. Die letzte Funktion wird verwendet, um Gruppen von Filmen für die Analyse und den Vergleich der Parameter der Mikroröhrenspur zu erstellen. Dies wird mit der Gruppenanalyse Befehl plus Tipp erreicht.
Once plus tip get tracks wurde für mehrere Filme ausgeführt und verschiedene Datenteilmengen stehen zum Vergleich bereit. Geben Sie plus Tipp-Gruppenanalyse in das Befehlsfenster ein: Um die zu vergleichenden Gruppen manuell auszuwählen, deaktivieren Sie zuerst die automatische Gruppe aus der Hierarchie. Klicken Sie dann auf Projekte auswählen.
Navigieren Sie zu den übergeordneten Verzeichnissen, die alle ROI-Ordner enthalten. Um eine Liste zu analysieren, wählen Sie GUI-Fenster wird angezeigt. Wählen Sie auf der linken Seite des Bildschirms alle Projekte aus, die in die Gruppen aufgenommen werden sollen, und verschieben Sie sie auf die rechte Seite.
Klicken Sie auf, okay. Wählen Sie dann einen Speicherort für die Projektliste aus und klicken Sie auf Speichern, ein Fenster wird angezeigt. Anklicken.
Okay, und das klebrige Fenster mit der Listenauswahl wird angezeigt. Wählen Sie auch hier nur die Dateien aus, die der ersten Gruppe entsprechen, die zusammengezogen werden soll, und klicken Sie auf. Okay. Geben Sie den Gruppennamen ein und klicken Sie auf, okay.
Es erscheint ein Fenster, antworten Sie entsprechend und fahren Sie mit der Auswahl der Gruppen fort. Wählen Sie dann einen Speicherort für die Gruppenliste aus und klicken Sie auf Speichern. Klicken Sie auf Ausgabeverzeichnis auswählen, um auszuwählen, wo die Ausgabeordner gespeichert werden sollen.
Wählen Sie abschließend aus, welche Art von Gruppenanalyse durchgeführt werden soll. Hier wählen wir Pool-Daten aus allen Zellen und Gruppen aus. Klicken Sie auf Gruppen vergleichen.
Dieses Bild zeigt die Parameter der Mikroröhrendynamik, die aus der Funktion abgeleitet wurden, plus tip git tracks. Dieser Film zeigt die Mikrotubuli-Spuren, die aus der Funktion plus Tipp-C-Spuren erhalten wurden. Schließlich zeigt dieses Bild die Mikrotubuli-Parameter, die aus der Analyse der Funktion plus Spitzengruppe erhalten wurden.
Mit einer Tabellenkalkulationsanwendung. Diese Parameter, die aus verschiedenen Gruppen von Filmen gewonnen wurden, können auch als Boxplots mit einem Verarbeitungsprogramm untersucht werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Plus Tip Tracker verwenden, um quantitative Informationen über die Dynamik von Mikrotubuli plus Spitze und lebende Wachstumskegel zu erhalten, indem Sie die Funktionen plus tip git tracks plus tip C tracks und plus tip Group analysis verwenden.
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Übersicht
In diesem Artikel wird die Verwendung des auf MATLAB basierenden Softwarepakets plusTipTracker zur Analyse der Mikrotubulusdynamik mithilfe fluoreszenzmarkierter +TIPs beschrieben. Das Verfahren bietet einen systematischen Ansatz, um das Verhalten von Mikrotubulus-Plus-Ende-Tracking-Proteinen in lebenden Wachstumskonen zu quantifizieren.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Dynamik der Mikrotubuli
Hintergrund
- Mikrotubuli spielen eine entscheidende Rolle bei der zellulären Struktur und Funktion.
- +TIPs sind Proteine, die sich mit den wachsenden Enden von Mikrotubuli assoziieren.
- Die quantitative Analyse der +TIP-Dynamik ist entscheidend für das Verständnis zellulärer Prozesse.
- Bestehende Methoden zur Verfolgung von Mikrotubuli können zeitaufwendig und weniger effizient sein.
Zweck der Studie
- Eine detaillierte Anleitung zur Analyse der Mikrotubulusdynamik unter Verwendung von plusTipTracker bereitstellen.
- Das Verständnis des Verhaltens von +TIPs in lebenden Zellen vertiefen.
- Die Vorteile der automatisierten Verfolgung gegenüber manuellen Methoden demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Nutzung des Befehls plusTip, um mithilfe von get tracks EB1-GFP-Kometen zu detektieren.
- Verknüpfung der Kometen zu Spuren, um Parameter der Mikrotubulusdynamik zu bestimmen.
- Visualisierung von Mikrotubulus-Spuren mittels des Befehls plusTip C tracks.
- Gruppenanalyse von Mikrotubulus-Spurenparametern über mehrere Aufnahmen hinweg.
Hauptergebnisse
- Die automatisierte Detektion und Verfolgung von Mikrotubulusdynamiken wurde erreicht.
- Visualisierungstechniken ermöglichten klare Einblicke in das Verhalten von Mikrotubuli.
- Mit der Gruppenanalyse konnten vergleichende Studien unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt werden.
- Die Methode erwies sich als schneller und effizienter als herkömmliche Verfolgungsmethoden.
Schlussfolgerungen
- plusTipTracker ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Mikrotubulusdynamik.
- Der automatisierte Ansatz verbessert die Genauigkeit und Effizienz der Analyse.
- Dieses Protokoll kann für verschiedene Zelltypen und Bedingungen angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Quantifizierung der Mikrotubulusdynamik in neuronalen Wachstumskonen liefert mechanistische Einblicke in die Axonführung und synaptische Bildung, Prozesse, die für Modelle neurodevelopmentaler Störungen relevant sind. Die automatisierte Analyse von +TIP-Kometenbahnen ermöglicht ein Hochdurchsatz-Screening von Substanzen, die die Zytoskelettregulation beeinflussen, und unterstützt die Target-Validierung in neurowissenschaftlichen Entdeckungsplattformen. Der Ansatz verringert analytische Verzerrungen und erhöht den Durchsatz im Vergleich zum manuellen Tracking, wodurch die Vorhersagegenauigkeit in frühen Target-Bindungsstudien verbessert wird.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der Mikrotubuli-Polymerisationsdynamik als funktionellen Endpunkt für Zielstrukturen, die das axonale Wachstum oder die Stabilität regulieren.
- Operativer Wert: Liefert standardisierte, quantitative Parameter (Wachstumsgeschwindigkeit, Pausenhäufigkeit, Katakastrophengeschwindigkeit) für eine konsistente Phänotypbewertung von Zielstrukturen über verschiedene Substanzbibliotheken hinweg.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt reproduzierbare, multiparametrische Messgrößen für das Mikrotubuli-Verhalten, die für die Miniaturisierung und Automatisierung von Assays in 96-/384-Well-Formaten geeignet sind.
- Operationaler Wert: Unterstützt die Standardisierung von Assays zwischen verschiedenen Laboren, indem klare Vorgaben für die Auswahl der Messbereiche (ROI), für die Verfolgungsparameter und für die Schwellenwerte der Gruppenanalyse festgelegt werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet in vitro Mikrotubulusdynamik-Phänotypen mit krankheitsrelevanten Mechanismen in Modellen neurodevelopmentaler oder neurodegenerativer Erkrankungen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die Kontinuität von primären neuronalen Kulturen bis hin zur Validierung in organotypischen Schnitten oder im lebenden Organismus durch eine konservierte +TIP-Tracking-Methode.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein, bei dem quantitative zytoskelettale Phänotypen die Zielstrukturauswahl vor der Identifizierung von Leitverbindungen und vor präklinischen Wirksamkeitstests beeinflussen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Kinasen, Phosphatasen oder Mikrotubuli-assoziierten Proteintargets durch direkte Messung der +TIP-Kometendynamik in lebenden Wachstumskonen.
- Screening: Liefert assaysichere, normalisierte Ausgabewerte (Kometendichte, Spurlänge, Geschwindigkeitsverteilungen), die die Berechnung des Z'-Faktors und die Bestätigung von Hits ermöglichen.
- Analytik: Bietet statistische Vergleiche auf Gruppenebene (Mittelwert, Varianz, Verteilungsverschiebungen), die zur Bewertung der Wirkstoffeffekte über biologische Wiederholungen hinweg unerlässlich sind.
- Translationale Forschung: Verbindet zytoskelettale Phänotypen mit Assays zur Axon-Auswucherung oder Synapsenbildung und orientiert sich dabei an präklinischen funktionellen Endpunkten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft einen zentralisierten, auf MATLAB basierenden Analyserahmen, der auf verschiedene Zelltypen (Neuronen, Fibroblasten, Krebslinien) mit fluoreszierenden +TIPs anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bezüglich der Zielmodulation, indem die inhärente Variabilität der manuellen Verfolgung verringert und der Nachweis subtiler dynamischer Veränderungen ermöglicht wird.
- Operationaler Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch automatisierte Kometenerkennung, standardisierte Verfolgungsalgorithmen und die Batch-Verarbeitung von Zeitrafferserien.
- Strategischer Wert: Steigert die Effizienz von Go/No-Go-Entscheidungen, indem multiparametrische zytoskelettale Profile früher im Entdeckungszeitraum bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen basierend auf der quantitativen Schwere von Mikrotubuli-Phänotypen und der Stärke compoundinduzierter Wiederherstellungseffekte.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Live-Cell-Bildgebung, der MATLAB-Umgebung und der Markierung mit fluoreszierenden Proteinen (z. B. EB1-GFP) in primären neuronalen Kulturen.
- Setzt hochauflösende, lichttoxizitätsarme Zeitraffer-Aufnahmesysteme voraus, die in der Lage sind, die Dynamik von +TIP-Kometen im Abstand von 1–2 Sekunden zu erfassen.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen verschiedenen Arbeitsgruppen hinsichtlich der Definition des interessierenden Bereichs (Umfang des Wachstumskonus), der Tracking-Parameter (Verknüpfungsdistanz, Bildlücke) und der Filtermethoden in der Nachbearbeitung.
- Beinhaltet Anpassungen an unterschiedliche Zellmorphologien (z. B. Wachstumskonus versus axonaler Schaft) sowie an variable +TIP-Expressionsniveaus in verschiedenen Modellsystemen.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit nachweisbarer und persistierender +TIP-Kometen; möglicherweise nicht anwendbar unter Bedingungen mit stark instabilen oder spärlichen Mikrotubuli-Polymerisationsereignissen.
