Spezifitätsanalyse von Protein Lysin Methyltransferasen Mit SPOT Peptidarrays

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Substratspezifität von Protein-Lysin-Methyltransferasen oder PK-mts zu untersuchen. Dies wird durch die Identifizierung eines Ausgangssubstrats und die Herstellung von Peptidarrays mit mehreren Varianten dieses Substrats erreicht, die einzelne Aminosäureaustausche an verschiedenen Positionen enthalten. In einem zweiten Schritt wird das Peptidarray mit dem PKMT in Gegenwart eines radioaktiven Methylgruppendonors inkubiert, was den Nachweis der Peptidmethylierung durch Übertragung von Radioaktivität auf den entsprechenden Peptidspot ermöglicht.

Als nächstes wird das Array einem Röntgenfilm ausgesetzt und quantitativ analysiert, um die Methylierungsaktivität an jedem der Peptide zu bestimmen. Um das Spezifitätsprofil der PKMT zu definieren, zeigen die Ergebnisse, welche Aminosäuren im Substratpeptid für seine Methylierung durch die PKMT entscheidend sind. Der Hauptvorteil dieser Technik oder bestehender Methoden wie der Methylierung einzelner Peptide besteht darin, dass eine Reihe verschiedener Peptide in einem Experiment kostengünstig getestet werden kann.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Protein-Lym-Methylierung zu beantworten, wie z.B. die Spezifikation bisher unbekannter neuer Substrate von PK mtss. Diese Methode kann also Aufschluss über die Spezifität von PK mts geben. Es kann auch auf andere Systeme wie Proteinkinasen, andere Proteinmethoden, Transferasen oder als Zusatz zu Transferasen angewendet werden.

Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich mich mit der Möglichkeit vertraut machte, mit Hilfe der Peptid-Spot-Synthese große kundenspezifische Peptid-Arrays zu vertretbaren Kosten herzustellen. Um dieses Verfahren zu beginnen, entwerfen Sie Peptidsequenzen für die Synthese mit der Multi-Pep-Spotter-Software. Geben Sie die Peptidsequenzen als Ein-Buchstaben-Code ein, wobei jeder Buchstabe die spezifische Aminosäure definiert, die diesem Pre-Swell, der Amino-Peg-funktionalisierten Spot-Membran am Ende, Ende Dimethylformamid oder DMF für 10 Minuten folgt. Wenn Sie fertig sind, platzieren Sie die nasse Membran ohne Luftblasen oder Falten auf dem Synthesizer-Rahmen.

Trocknen Sie die Membran mindestens 10 Minuten lang vollständig ab, bevor Sie das Syntheseprogramm starten. Waschen Sie die Membran dreimal mit 100%Ethanol, um die Amidbindung mit der freien Aminogruppe auf der Membran zu erzeugen. Aktivieren Sie die Carboxygruppe der eingehenden Aminosäure, indem Sie DIC und Ethylhydroxy-Amino-Sinoacetat zum Aminosäurederivat hinzufügen.

Erkennen Sie nach der Aktivierung mit dem programmierbaren Roboter die gewünschten Mengen an aktivierten Aminosäuren auf der Amino-Peg-funktionalisierten Membran. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt dreimal, um eine bessere Kopplung der ersten aktivierten Aminosäure zu gewährleisten. Nachdem Sie die Membran 20 Minuten lang inkubiert haben, waschen Sie sie mit DMF, um nach dem Trocknen und Blockieren der freien Aminogruppen ungekoppelte Aminosäuren zu entfernen.

Waschen Sie die Membran viermal mit DMF und inkubieren Sie sie dann 20 Minuten lang mit 20 % Piperin in DMF, um die FM-Schutzgruppe zu entfernen. Wiederholen Sie nach dem Waschen und Trocknen der Membran die Schritte zum Fleckenbildung und zur Entfernung von F MOC, bis die gewünschte Peptidlänge erreicht ist. Nach dem letzten Schutz der F MOC-Gruppe D waschen Sie die Membran mit DMF und 100 % Ethanol.

Behandeln Sie dann die Membran mindestens fünf Minuten lang mit 0,02 % Bromphenolblau in DMF, bis sie vollständig blau wird. Nachdem Sie die Membran gewaschen und getrocknet haben, nehmen Sie sie aus dem Synthesizer und legen Sie sie in eine chemikalienbeständige Box. Behandeln Sie es mit 20 bis 25 Millilitern einer Seitenketten-D-Schutzmischung, bestehend aus 95%iger Trichloressigsäure zur Spaltung der Seitenkettenschutzgruppen und Scavenger-Reagenzien zum Schutz der Aminosäure-Seitenketten vor Modifikationen.

Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Tiefenschutzmischung die Membran bedeckt, schließen Sie die Box vollständig und inkubieren Sie sie ein bis zwei Stunden lang, während Sie sie nach der Inkubation leicht schütteln. Waschen Sie die Membran sechsmal mit 20 bis 25 Millilitern Dichlormethan für jeweils zwei Minuten. Nach zweimaligem Waschen mit 100%igem Ethanol trocknen Sie die Membran über Nacht in einem Trockenmittel.

Als nächstes wird die Peptidarray-Membran in einem versiegelten Plastikbeutel, der den jeweiligen Methylierungspuffer ohne Enzym enthält, vorinkubiert und mit der radioaktiv markierten Methylgruppe versehen. Entsorgen Sie den Vorinkubationspuffer für 10 Minuten, und inkubieren Sie die Membran in acht Millilitern Methylierungspuffer, der den jeweiligen PKMT enthält, für ein bis zwei Stunden. Anschließend wird der Methylierungspuffer in einen Behälter für radioaktive Abfälle geworfen und die Peptidarrays fünfmal mit 20 Millilitern Puffer gewaschen, der 100 millimolare Ammoniumbicarbonat und 1 %STS enthält, um das gebundene Protein zu entfernen. Nachdem Sie den letzten Waschpuffer in den Behälter für radioaktive Abfälle geworfen haben, inkubieren Sie die Membran fünf Minuten lang in 10 Millilitern Amplifikationslösung.

Entsorgen Sie dann die Amplify-Lösung im Behälter für radioaktive Abfälle für organische Lösungsmittel. Verschließen Sie das Peptidarray in einer Plastiktüte und legen Sie es in eine Autoradiographiekassette. Legen Sie den Autoradiographiefilm in einem dunklen Raum auf das Peptid.

Schließen Sie dann die Kassette vorsichtig. Nachdem Sie den Film bei minus 80 Grad Celsius belichtet haben, entwickeln Sie ihn weiter, um die Ergebnisse zu analysieren. Nehmen Sie das Bild schließlich einige Male mit unterschiedlichen Belichtungszeiten auf, um eine Sättigung stark methylierter Peptidsubstrate zu vermeiden.

Ein Beispiel für eine Methylierungsreaktion eines Peptidarrays mit NSD One ist hier dargestellt. Die horizontale Achse stellt die Sequenz des Peptids dar und verläuft in vertikaler Richtung. Die veränderte Aminosäure ist indiziert Methylierung mit nsd, man zeigt, dass sie spezifisch auf H drei K 36 wirkt und erkennt drei bis vier Aminosäurereste auf beiden Seiten des Ziellysin-Konsolidierungs.

Etwa 85 % der Peptide weisen Standardabweichungen kleiner als plus oder minus 20 % auf, und mehr als 97 % der Peptide weisen Standardabweichungen kleiner als plus oder minus 30 % auf. Die berechneten Daten des Diskriminationsfaktors zeigen, dass NSD eins aromatische Reste an der Minus-Zwei-Position bevorzugt. An den Minus- und Plus-Zwei-Stellen bevorzugt es hydrophobe atische Rückstände. Und an der Plus-Eins-Stelle gibt es eine Präferenz für Arginin, Lysin, Glutamin oder Asparagin.

Potentiell neuartige Peptidsubstrate können durch Datenbankrecherchen im menschlichen Proteom gefunden werden. Die starke Methylierung einiger dieser Peptide mit ome bestätigt ihre Identität als neuartige NSD-Ein-Peptid-Substrate. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das am besten geeignete Ausgangssubstrat zu verwenden.

Andere Methoden, wie die Methylierung der entsprechenden Proteine in vitro und in Zellen, können durchgeführt werden, um herauszufinden, ob Proteine als Substrate akzeptiert werden, sowie nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Protein-Lysin-Mesylierung, um die Substratspezifität vieler PK-mts zu definieren und mehrere neuartige Substrate zu identifizieren. Dies trug dazu bei, die wichtige biologische Funktion von PK mts zu verstehen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität und organischen Lösungsmitteln bei der Peptidsynthese durchgesetzt werden kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.