Name: Spezifitätsanalyse von Protein Lysin Methyltransferasen Mit SPOT Peptidarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie die Analyse der Substratspezifität von Protein-Lysin-Methyltransferasen mit SPOT-Peptidarrays. Diese Methode ermöglicht die effiziente Untersuchung kritischer Aminosäuren für die Methylierung.

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1. Herstellung von Peptidarrays <ol><li> Programmieren der Peptidsequenzen <ol><li> Gestalten Peptidsequenzen für die Synthese mit dem MultiPep Spotter Software. Geben Sie die Peptidsequenzen in Einzelbuchstabencodes. Peptid 1: TARKSTGGKA </li><li> Gene Alanin oder Arginin Spaziergang Bibliotheken mit einem bestimmten Befehl (.replace, A), die für die Anerkennung der einen definierten Untergrund erforderlich wichtigen Aminosäuren zu untersuchen. Zum Beispiel in dem folgenden Beispiel wird die erste Zeile ist der Wildtyp-Sequenz und die aus der zweiten Zeile jeder Aminosäure in einem Peptid mit Alanin sequentiell verändert. ersetzen, A TARKSTG Ein -ARKSTG T- A -RKSTG TA-A -KSTG TAR- A -STG TARK- A -TG TARKS- A -G TARKST- A </li><li> Verwenden Sie ähnliche Befehle (.replace R,.ersetzen N etc.), wie in 1.1.2 mit allen natürlich vorkommenden Aminosäureresten (schließlich Weglassen Cystein, Methionin und Tryptophan beschrieben, weil diese Rückstände sind anfällig für Oxidation und manchmal niedriger Syntheseausbeute), um eine Peptidanordnung zur Bestimmung der Konsensus synthetisieren Substrat Sequenzmotiv für ein Enzym. HINWEIS: Wie in 4A gezeigt ist, stellt die horizontale Achse die gegebene Peptidsequenz und die vertikale Achse repräsentiert die Aminosäuren, die für die Befehls ausgewählt sind. Ähnlich zu der in 1.1.2 gezeigt durch A auf der vertikalen Achse bedeutet, daß ein Ala sequentiell jede Position der gegebenen Reihenfolge in der ersten Reihe in Fig ersetzt. 4A. Ähnlich Arginin nacheinander ersetzt jede Aminosäure in der zweiten Reihe und so weiter bei den anderen Aminosäuren. Komplette Peptidarray-Bibliotheken werden von systematisch in die bereitgestellten Peptidsubstrats Folge Ersetzen jedes Rückstand mit jedem th synthetisierte andere natürlich verfügbaren Aminosäureresten, das hilft, den Einfluss von jedem Rest an jeder Position des gegebenen Sequenz zu verstehen. </li><li> Alternativ kann die Methylierung von bekannten oder vorhergesagten Peptidsubstrate leicht verifiziert werden Synthetisieren von Peptid-Bibliotheken mit den Zielpeptide der PKMT zusammen mit positiven und negativen Kontrollen Methylierung (dh Peptide, die methylierte bekannt oder bekannten nicht methyliert sind). Synthetisieren Peptide durch Austausch des mutmaßlichen Ziel Lysin zu Alanin auf Methylierung des Ziel Lysin zu bestätigen, wie unten durch manuelle Programmierung angezeigt. Wildtyp-Peptid: StGG K PRQFL Mutant Peptid: StGG A PRQFL HINWEIS: Die Software ist auch inhärent Skripte verschiedenen Bibliotheken zu erstellen, wie Epitop-Kartierung mit einer gewünschten Rahmenverschiebung der Sequenz wichtig für eine Interaktion erforderlichen Aminosäuren abzubilden. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Membran, Aminosäuren eind Reagenzien <ol><li> Pre-schwellen die SPOT-Membran in DMF (N, N-Dimethylformamid) für 10 Minuten und dann die feuchte Membran auf der SPOT-Synthesizer Rahmen ohne Luftblasen oder Falten. </li><li> Dreimal mit 100% Ethanol waschen Membran. Man trocknet die Membranen vollständig mindestens 10 min vor Beginn der Syntheseprogramm. </li><li> Parallel frisch zubereiten 0,5 M Arbeitskonzentrationen von kommerziell erhältlichen Fmoc-geschützten Aminosäuren in NMP löst sie und auch den Aktivator und Base herzustellen, wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle Abfalllösungsbehälter des SPOT-Synthesizer geleert wurden und füllen Sie die Lösungsmittelbehälter mit dem DMF, Ethanol und Piperidin. HINWEIS: Das Gerät ist nun bereit für die Synthese. </li></ol></li><li> Spotten von der ersten Aminosäure <ol><li> Um die Amidbindung mit der freien Aminogruppe auf der Membran zu erzeugen, aktivieren Sie die Carboxy-Gruppe der ankommenden Aminosäure des Anbietersding der Aktivator (N, N &#39;-Diisopropylcarbodiimide) und Basenlösung (Ethyl hydroxyimino cyanoacetat) zu dem Aminosäurederivat. </li><li> Finde die gewünschten Volumina der aktivierten Aminosäuren an die Amino-PEG funktionalisierten Membran unter Verwendung der programmierbaren Roboter. HINWEIS: Dadurch wird der C-Terminus der Aminosäure an die Aminogruppe der Membran gekoppelt ist. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang drei Mal, um eine bessere Kopplung der ersten aktivierten Aminosäure zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Membran für 20 Minuten und waschen mit DMF zu abgekoppelt Aminosäuren entfernen Sie dann. </li></ol></li><li> Das Blockieren der freien Plätze auf Non-Spot Bereiche HINWEIS: Nach der Kupplung der ersten C-terminalen Aminosäure aller Peptide an der Aminogruppe der Membran, werden die Aminogruppen zwischen den Flecken und einige der Aminogruppen in den Punktbereichen keine Bindungen mit den Aminosäuren bilden. <ol><li> Blockieren diese freien Aminogruppen durch Inkubation mit dem Capping-Lösung (20% Essigsäureanhydrid in DMF)für 5 min. ANMERKUNG: Dies vermeidet die Kupplung der Aminosäuren in den weiteren Zyklen mit der Membran anstatt der wachsenden Peptidkette. </li></ol></li><li> Die Entfernung der Fmoc-Gruppe <ol><li> Nach der Blockierung, Waschen der Membran mit DMF 4 mal und dann inkubiert mit 20% Piperidin in DMF für 20 Minuten, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen. Anmerkung: Dieser Schritt führt zu einer Entfernung der Aminoschutzgruppe Fmoc-Gruppen, und es heißt Entschützung. </li><li> Danach waschen Sie die Membran zweimal mit DMF und zweimal mit Ethanol und lassen Sie ihn trocknen. HINWEIS: Nun ist die Membran ist für die Kopplung der nächsten Aminosäuren. </li></ol></li><li> Kettenverlängerung HINWEIS: Die Zugabe jeder Aminosäure wird als ein Zyklus bezeichnet. Abgesehen von der Kopplung der ersten Aminosäure, beginnt der Zyklus mit der Abspaltung der Schutzgruppe Fmoc-Gruppe der gekoppelten Aminosäure und es wird durch die Kopplung der aktivierten Carboxylgruppe einer ankommenden Aminosäure an die Aminogruppe der wachsenden pep gefolgtFlut Kette. <ol><li> Schritte 1.3 und 1.5, bis die gewünschte Peptidlänge erreicht wird. </li></ol></li><li> Färbung HINWEIS: Nach dem letzten Zyklus werden die Peptidarrays mit Bromphenolblau gefärbt, um die erfolgreiche Synthese von Peptiden zu bestätigen. Bromphenolblau bindet mit den freien Aminogruppen der Peptide. Peptid-Spots zeigen hellblaue Farbe nach dem Färben, aber die Intensität der Flecken variiert abhängig von der Peptidsequenz. Diese Färbung kann die Bestätigung der vollständigen Entfernung des Piperidin, weil in Gegenwart von Piperidin Bromphenolblau nicht die Peptide zu färben. Außerdem hilft dies auch, um die Peptid-Arrays für die weitere Verwendung zu markieren. <ol><li> Nach der Entfernung der Schutzgruppe Fmoc-Gruppe im letzten Synthesezyklus, waschen Sie die Membran mit DMF und 100% Ethanol. Dann behandeln die Membran mit Bromphenolblau (0,02% Bromphenolblau in DMF) für mindestens 5 Minuten, bis es vollständig blau. </li><li> Danach waschen Sie die Membran mit DMF und ethanol gefolgt von Trocknen für 10 min. Nun nehmen Sie die Membran aus dem Synthesizer und durchzuführen, Seitenkettenschutzgruppenentfernung (Abschnitt 1.8) von Hand. Falls benötigt, fotografieren der Membran, um die Ergebnisse des Peptid-Synthese (Fig. 2) zu dokumentieren. </li></ol></li><li> Side Chain Entfernung der Schutzgruppe <ol><li> Behandlung der Membran mit 20 bis 25 ml der Seitenkettenschutzgruppenabspaltung Mischung bestehend aus 95% Trifluoressigsäure (TFA), um die Seitenkettenschutzgruppen und Reagenzien Scavenger (2,5% Wasser und 2,5% Triisopropylsilan), um die Seitenketten von Aminosäuren aus schützen spalten Änderung bei diesem Schritt. Nehmen Sie eine ausreichende Menge an Entschützung Mischung, um sicherzustellen, dass er die Membran vollständig in einem dicht geschlossenen chemikalienbeständige Box und inkubieren Sie für 1-2 Stunden unter leichtem Schütteln. </li><li> Sechsmal Waschen der Membran mit 20-25 ml DCM (Dichlormethan), jeweils 2 min und schließlich zweimal mit 100% Ethanol und trocknet es im Exsikkator über Nacht. HINWEIS: Jetztkann die Membran für Experimente verwendet werden. Ein Schema der Peptidsynthese-Array ist in 1 bereitgestellt. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification <ol><li> Protein Expression von PKMTs als GST Fusions <ol><li> Verwendung von Standardtechniken, klonen die über die gesamte Länge PKMT oder seine katalytische Domäne in einen bakteriellen Expressionsvektor (wie pGEX-6p2), um sie als GST-Fusionsprotein zu exprimieren kodierenden Gens. </li><li> Übertragen Sie den Vektor mit dem gewünschten PKMT einfügen in BL21 oder BL21-Codon und E. coli-Zellen durch das Hitzeschock-Methode oder jede andere Methode. </li><li> Vorbereiten einer Vorkultur in 30 ml Luria-Bertani (LB) Medium am Tag der Expression und Inkubation bei 37 ° C für 7 bis 8 Stunden unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Als nächstes über 10 ml der Vorkultur in einen 2 l großen Schikane-Kolben mit 1 l LB-Medium und bei 37 ° C im Brutschrank unter ständigem Schütteln bis die Kultur die Reichweitees eine definierte optische Dichte bei 600 nm. Anmerkung: Dies kann zwar für jedes Protein optimiert werden wir routinemäßig bei einer OD 600 nm von etwa 0,8 zu induzieren. Die Induktionstemperatur muss für jedes Protein einzeln optimiert werden einige Proteine ​​zeigen eine gute Ausdrucks 22 ° C und einige bei höheren Temperaturen. </li><li> Verschieben die Zellen an den Induktionstemperatur für 15 min, dann mit 1 mM Isopropyl- &amp; beta; -D-thiogalactopyranosid induziert und damit der Kultur für 10-12 Stunden bei Induktionstemperatur wachsen. </li><li> Danach Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 15 Minuten und schließlich Waschen des Pellets mit 30 ml STE-Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl und 0,1 mM EDTA) resuspendiert und bei -20 ° C für die weitere Verwendung. </li></ol></li><li> Proteinreinigung <ol><li> Auftauen Zellpellet und resuspendiere in 30 ml Beschallungspuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT und 5% Glycerin) und stören durch Beschallung. HINWEIS: Dieser Puffer needs für jedes Protein schließlich optimiert werden. </li><li> Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 22.000 · g für 1 Stunde und später den Überstand zu sammeln und durch eine Säule, die 600 &amp; mgr; an Glutathion Sepharose 4B-Harz. </li><li> Mit 50 ml Beschallungspuffer und anschließend mit 100 ml Hochsalzpuffer (50 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT und 5% Glycerin) unspezifisch gebundene Proteine ​​zu entfernen Die Säule. Eluieren des gebundenen Proteins mit 5 ml Hochsalzpuffer, enthaltend 40 mM Glutathion. </li><li> Dialysieren des eluierten Proteins in 2 l Dialysepuffer mit niedrigem Glycerol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT und 10% Glycerin) für 2 Stunden und dann in 20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT und 70% Glycerin 8 Stunden oder über Nacht. Achten Sie darauf, alle Reinigungspuffer bei 4 ° C und führen Sie die Proteinreinigung im Kühlraum, um Proteindenaturierung zu vermeiden. </li></ol></li></ol> 3. Peptid-Array-Methylierung <ol><li> Pre-incuBewährung von Peptidarrays <ol><li> Führen Peptidanordnung Methylierung entweder in einem Feld mit der entsprechenden Größe oder in einem Kunststoffbeutel, die Verschwendung des teuren Enzyms und radioaktiv markiertem AdoMet vermeiden. Pre-Inkubation der Peptidarray-Membran in versiegelten Plastikbeutel mit dem jeweiligen Methylierungspuffer ohne Enzym und mit [Methyl-3H] -AdoMet 10 min. Das Puffervolumen ist abhängig von der Größe des Arrays, beispielsweise verwenden 8 ml Methylierungspuffer für eine volle Spezifität Profil Peptidanordnung. Optimieren der Menge und Konzentration der AdoMet für jedes Enzym. </li></ol></li><li> Die Methylierung von Peptidarrays <ol><li> Entsorgen Sie die Vorinkubation Puffer und Inkubation der Membran in 8 ml Methylierungspuffer, der die jeweilige PKMT und mit [Methyl-3H] -AdoMet für 1 bis 2 Stunden. HINWEIS: Die Enzymmenge, für eine Methylierungsreaktion erforderlich ist, hängt von der Aktivität des speziellen PKMT initiieren wir unserem Screening-Experimente in der Regel mit 50 nM Enzym final-Konzentration. </li></ol></li><li> Das Waschen von Peptidarrays <ol><li> Danach verwerfen Methylierungspuffer in einer radioaktiven Abfallbehälter und waschen die Peptidarrays 5 mal mit 20 ml Puffer, enthaltend 100 mM Ammoniumbicarbonat und 1% SDS für 5 Minuten, um das gebundene Protein zu entfernen. Entsorgen Sie den Waschpuffer in einem radioaktiven Abfallbehälter. </li></ol></li><li> Detektion der radioaktives Signal <ol><li> Nach den Wäschen Inkubieren der Membran für 5 Minuten in 10 ml Lösung Amplify (NAMP100V). </li><li> Dann werfen Sie die amplify Lösung in die radioaktive Abfälle Behälter für organische Lösemittel, dichten den Peptidarray in einer Plastiktüte und legen Sie sie in einer Autoradiographie Kassette. </li><li> Platzieren Sie die Autoradiographie-Film auf dem Peptidarray in den dunklen Raum. Schließen Sie die Kassette vorsichtig und setzen Sie es bei -80 ° C für die erforderliche Zeit. Dann entwickeln die Folie, um die Ergebnisse zu analysieren. Nehmen Sie das Bild mehrmals mit unterschiedlichen exposition-mal, um eine Sättigung von stark methylierten Peptidsubstrate zu vermeiden. </li></ol></li></ol> 4. Datenverarbeitung und -analyse <ol><li> Densitometrische Analyse der Spotintensitäten <ol><li> Scannen Sie den Film in einem konventionellen Scanner und die Spotintensitäten analysieren densitometrisch. Tun Sie dies mit ImageJ (die Freeware ist) oder ein kommerzielles Programm. BEMERKUNG: Wir verwenden Phoretix Software für diese Aufgabe. </li></ol></li><li> Normalisierung und Mittelwertbildung der Ergebnisse aus verschiedenen Membranen <ol><li> Führen Sie die Peptidarray-Methylierungsexperimente zumindest in dreifacher Ausfertigung. Normalisieren die gescannten Intensitäten für jedes Experiment durch Subtraktion des Hinter und Einstellung der Tätigkeit bei einer Referenzsubstrat als 1,0. Der Mittelwert der Daten für die einzelnen Punkte und melden sie als Mittelwerte und Standardabweichungen. </li></ol></li><li> Datenanalyse und Anzeige <ol><li> Zeichnen Sie die Daten in 2D mit einem Graustufen- oder Farbschema, um die relative Tätigkeit hinweisen. Tun Sie dies with Excel oder Sigmaplot wie hier gezeigt. Auch bereiten eine graphische Darstellung der Verteilung der Standardabweichungen der wiederholten Versuchen, um die Qualität der Daten zu analysieren. </li><li> Vergleichen und zeigt die Genauigkeit der Erkennung von jedem Rest in dem Substrat Peptid quantitativ berechnen die relative Präferenz der PKMT für jede Aminosäure i an Position x durch ein Diskriminierungsfaktor D 16,17: D X; i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 Wobei v i ist die Geschwindigkeit der Methylierung der Peptidvariante trägt Aminosäure i an Position x und &lt;v j ≠ i&gt; ist der Durchschnittskurs der Methylierung aller 19 Peptiden mit unterschiedlichen Aminosäure j ≠ i an der Position x (einschließlich der Wildtyp-Sequenz). HINWEIS: Das Diskriminierungsfaktor dadurch definiert, hängt von der Hintergrundebene. Wenn nur ein Rückstand an einer bestimmten Position mit einem Hintergrund von 3%, eine Diskriminierung akzeptiertFaktor von 32,3 erhalten wird. Keine Präferenz in einer Position ergibt sich eine Diskriminierungsfaktor von 0. </li></ol></li></ol>

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

SPOT-Synthese, wie hier beschrieben ist eine leistungsfähige Methode zur Karte Protein-Protein-Interaktionsstellen und untersuchen die Substraterkennung von Peptid-modifizierende Enzyme. Jedoch hat SPOT Synthese noch bestimmte Nachteile, denn obwohl die Peptide von der SPOT-Verfahren synthetisiert wird berichtet, daß mehr als 90% Reinheit 21 haben, ist dies schwierig, in jedem Fall zu bestätigen. Deshalb müssen Ergebnisse, die durch andere Methoden zum Beispiel mit Proteindomänen oder mit gereinigten Peptide ...

In den letzten zwei Jahrzehnten, zeigen mehrere Berichte die Bedeutung der post-translationale Modifikationen (PTM) in zellulären Entwicklung und mehrere Krankheiten wie Krebs, aber vor kurzem Protein Lysin-Methylierung hat sich als eine andere lebenswichtige PTM entstanden. Während zunächst Histon Lysin-Methylierung wurde festgestellt, eine wesentliche Chromatin Marke werden, zeigten spätere Arbeit auch Lysin-Methylierung von mehreren Nicht-Histon-Proteine ​​1-4. Die sequentielle Übertragung der Methylgruppe von S-Adenosyl-L-methionin zu der ε-Aminogruppe der Lysinreste wird durch eine Familie von Enzymen, genannt Protein Lysin-Methyltransferasen (PKMTs), die mehr als 60 Proteine, die in das menschliche Genom enthält katalysiert. PKMTs wurden zunächst als Histon-modifizierenden Enzymen, die spezifisch Lysinrest methylieren aber später Berichte gezeigt, dass sie auch zu methylieren Nicht-Histon-Proteine ​​5 entdeckt. Bisher wurden etwa 5.000 Lysin Methylierungsstellen auf verschiedenen Proteinen 6 ermittelten </sup&gt;, aber die Enzyme, die für diese Änderungen verantwortlich sind oft nicht identifiziert. Ein Grund dafür ist, dass die Spezifität der meisten PKMTs nicht ausführlich untersucht worden. Daher ist es immer wieder vor, dass neuartige Substrate PKMTs entdeckt werden. Das Fehlen einer detaillierten Kenntnis der Substratspezifität PKMTs behindert Verständnis ihrer biologischen Funktion und Rolle. Um die Spezifität einer PKMT im Detail zu untersuchen, müssen die Methylierung Geschwindigkeiten vieler Peptidsubstrate, die in einer oder einigen Aminosäuren unterscheiden, gemessen und verglichen werden, die im Idealfall unter Verwendung von Peptid-Arrays durchgeführt wird werden. Basierend auf den erhaltenen Spezifität Profile können potentielle Substrate PKMTs identifizieren, die weiter untersucht werden können. Peptid-Arrays werden häufig verwendet Werkzeuge für die biochemische Analyse von Antikörpern, Peptid modifizierende Enzyme und Kartierung von Protein-Protein-Interaktionsstellen (Antikörper-Antigen, Rezeptor-Ligand) 7-9. Mehrere hundert Peptide zur suc erforderlichh Anwendungen. Verschiedene Methoden stehen zur Verfügung für die Peptidsynthese, unter ihnen die Peptidsynthese am Harz wird sehr häufig verwendet, aber es kann nur eine beschränkte Durchsatz und relativ teuer ist. Diese Probleme wurden mit der Einführung des SPOT-Syntheseverfahren von Frank und seine Kollegen 10 gelöst. Die SPOT-Syntheseverfahren erlaubt die Synthese von mehreren hundert Peptide parallel und im Mittel er preiswert ist, verglichen mit der Harzsynthese. Die synthetisierten Peptide auf Cellulosemembran kann entweder direkt für verschiedene Anwendungen oder Peptide verwendet werden, können aus der Membran geschnitten und als freie Peptide in Lösung Assays verwendet werden oder Peptid-Mikroarrays 10-13 vorzubereiten. SPOT-Synthese ist eine Variante des Festphasen-Peptidsynthese, die eine Cellulose-Membran als fester Träger verwendet und verwendet den Standard-Fmoc-Chemie 10-13. Daher ist die Synthese der Peptidketten beginnt am C-terminalen Ende und schreitet in Richtungdie N-terminalen Ende im Vergleich zu der biologischen Synthese in Ribosomen. Cellulosemembranen sind für die Befestigung des ersten aktivierten Aminosäuren (Fig. 1) funktionalisiert. Der Spot-Verfahren basiert auf der sequentiellen Abgabe aktivierten Aminosäuren in einem Tröpfchen von Lösungsmittel zu definierten Spots auf der Membran unter Verwendung eines automatisierten Pipettiersystems bezogen. Die Flüssigkeitströpfchen auf der porösen Membran, wo sie eine Kreis nassen Fleck, der später wirkt als offener Reaktor für die chemischen Reaktionen bei der Peptidsynthese bildet verzichtet. Die Fleckgrße wird durch das Volumen abgefüllt und die Absorptionskapazität der Membran bestimmt wird, werden Vielfache von solchen Stellen als Arrays angeordnet sind. Der Synthesemaßstab korreliert mit der Punktgrße und die Belastbarkeit der Membran. Der Abstand zwischen den Flecken und der Dichte des Arrays werden durch Variation der Punktgrßen verwaltet. Cellulosemembran hat mehrere Vorteile, wie Festphasenpeptidsynthese, preiswert, tolerant gegenüber dem chemic ist esals in der Peptidsynthese verwendet, in wässrigen Lösungen stabil ist und leicht zu handhaben. Darüber hinaus macht seine hydrophile Natur es für verschiedene biologische Testsysteme geeignet. SPOT-Synthese kann manuell oder automatisiert (für 1000 von Peptiden), je nach der gewünschten Anzahl von Peptiden werden. Eine vollautomatische SPOT-Synthesizer von Intavis (Köln, Deutschland) ist für unsere Anwendungen. Es ermöglicht die Synthese von Peptiden in unterschiedlichen Mengen und von unterschiedlicher Länge. Lineare Peptide sind regelmäßig mit 15 bis 20 Aminosäuren Länge synthetisiert, zusätzlich Peptiden von bis zu 42 Aminosäuren können auch durch stufenweise Synthese 14,15 hergestellt werden. Eine Erhöhung der Anzahl von Aminosäuren führt zu einer Verringerung in der Gesamtkopplungsausbeuten, die die Qualität der Peptide beeinträchtigen. Wegen der geringen Menge an Peptiden pro Spot, die Produkte sind oft schwierig zu reinigen, und die Qualität der einzelnen Peptide können nicht einfach beurteilt werden. Daher sind die Ergebnisse von SPOT Pept erhaltenenide Arrays müssen entweder mit Peptiden nach Standardverfahren in größerem Maßstab, die gereinigt und nach Standards in der Peptidsynthese oder durch Synthese der Proteine, die die gewünschten Peptidsequenzen analysiert werden können synthetisiert bestätigt werden. Dennoch fanden wir die SPOT-Synthese durch hohe Zuverlässigkeit und führt in der Regel reproduzierbar sein. SPOT-Synthese ist nicht beschränkt auf Aminosäuren, mehreren kommerziell erhältlichen modifizierten Aminosäuren können auch für die Synthese verwendet werden proteinogenen, wodurch Peptide, die vor und nach der abschließenden Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppe und ferner modifiziert werden, sondern ermöglicht auch den Einbau von phosphoryliert, methyliert oder acetyliert Aminosäuren 11. Immobilisierte Peptidbibliotheken durch die SPOT-Verfahren synthetisiert können direkt für viele biologische und biochemische Assays verwendet werden. Wir verwendeten Peptidarrays, umfassend 300-400 Peptide, die Substratspezifität von PKMTs untersuchen. Für enzymatische modifiKationen werden die Peptid-Arrays mit den entsprechenden PKMT inkubiert und mit [Methyl- 3 H] -AdoMet in einem geeigneten Puffer. Die Methylierung des jeweiligen Substrats durch folgenden die enzymatische Übertragung von radioaktiv markierten Methylgruppen von AdoMet auf das Peptidsubstrat über Autoradiographie (Fig. 3) untersucht. Durch dieses Verfahren werden die Peptid-Arrays erlauben das Studium der Methylierung von verschiedenen Peptidsubstrate gleichzeitig. Ein wichtiger Vorteil dieses Verfahrens ist, dass alle Peptide in Konkurrenz methyliert, so dass während der linearen Phase der Methylierung Kinetik, ist die relative Methylierungs jedes Peptids proportional zu der katalytischen Geschwindigkeitskonstante geteilt durch die Dissoziationskonstante (k cat / K D) des Enzyms für die jeweiligen Peptidsubstrat. Daher wird die Menge an Radioaktivität in jedem Spot einge direkt mit der enzymatischen Aktivität gegenüber dem jeweiligen Peptids korreliert. Mit derErgebnisse einer Peptidarray-Methylierung Experiment kann die Spezifität Profil des PKMT definiert und basieren auf dieser neuartige Substrate ausgesagt werden. Peptidarrays ermöglichen die schnelle und kostengünstige Überprüfung der Methylierung neuartige Substrate in Peptiden. Hierzu werden Arrays hergestellt, die die vorhergesagten neuen Substrate mit modifizierten Peptide, die eine Ala anstelle von Lys an den Zielorten sowie positive und negative Kontrollpeptide enthalten. Schließlich können die erfindungsgemäßen Proteine ​​als Substrate zusammen mit Mutanten, in denen das Ziel Lys Ala verändert und die Methylierung kann auf Proteinebene zu bestätigen, hergestellt werden. Je nach Ergebnis wird diese dann von biologischen Studien zu möglichen Rollen der Methylierung der neu beschriebenen Proteinsubstraten gefolgt.

<table><tbody><tr><td>Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td><td>Honeywell</td><td>10299901</td><td>brennbar</td></tr><tr><td>N,N-Dimethylformamid Peptidsynthese</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td><td>brennbares, giftiges</td></tr><tr><td>Piperidin &ge; 99% für die Peptidsynthese</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>Entflammbares, giftiges, ätzendes</td></tr><tr><td>Oxyma Pure (Ethyl (Hydroxyimino)cyanoacetat )</td><td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>N,N' -Diisopropylcarbodiimide purum &ge; 98% GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>Entzündliches, giftiges, ätzendes</td></tr><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>Entzündliches, giftiges, ätzendes</td></tr><tr><td>Triisopropylsilan 99%</td><td>Aldrich</td><td>233781</td><td>Entzündliches, giftiges</td></tr><tr><td>Dichlormethan &ge; 99,9%</td><td>Roth</td><td>P089.1</td><td>Karzinogen</td></tr><tr><td>N-Methyl-2-pyrrolidon</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td>Toxische</td></tr><tr><td>derivatisierte Cellulosemembran</td><td>Intavis AG K&ouml; ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>Giftiges, ätzendes</td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydrogencarbonat</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td>Giftige</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat-Pellets</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>Giftiger, brennbarer</td></tr><tr><td>MultiPep-Synthesizer</td><td>Intavis AG K&ouml; ln</td><td>n.a.HyperfilmTM</td><td></td></tr> <tr><td>Hochleistungsfolie</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Phoretix Software</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

spezifitätsanalyse von protein lysin methyltransferasen mit spot peptidarrays

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysin-Methylierung ist ein aufstrebendes posttranslationale Modifikation und es hat auf mehreren Histon und Nicht-Histon-Proteine ​​identifiziert worden, wo er eine entscheidende Rolle bei der Zellentwicklung und viele Krankheiten spielt. Rund 5.000 Lysin Methylierungsstellen wurden auf verschiedene Proteine, die von einigen Dutzenden von Protein Lysin-Methyltransferasen eingestellt werden identifiziert. Dies deutet darauf hin, dass jede PKMT methyliert mehrere Proteine ​​jedoch bis jetzt nur ein oder zwei Substrate wurden für mehrere dieser Enzyme identifiziert worden. Um dieses Problem anzugehen, die wir eingeführt haben Peptidarray basierte Substratspezifität Analysen PKMTs. Peptidarrays sind mächtige Werkzeuge, um die Spezifität PKMTs charakterisieren, da die Methylierung der mehrere Substrate mit verschiedenen Sequenzen können auf einem Array getestet werden. Wir Peptidarrays auf Cellulosemembran mit einem Intavis SPOT-Synthese und analysiert die Spezifität der verschiedenen PKMTs. Basierend auf den Ergebnissen aus mehreren dieser Enzyme, neuartige substrates identifiziert werden. Zum Beispiel kann für NSD1 durch Verwendung Peptidarrays, zeigten wir, dass es methyliert K44 H4 statt der berichteten H4K20 und zusätzlich H1.5K168 ist stark bevorzugt Substrat über dem vorbekannten H3K36. Daher Peptid-Arrays sind leistungsfähige Werkzeuge, um biochemisch charakterisieren die PKMTs.

Peptidarrays wurden erfolgreich eingesetzt, um biochemisch charakterisieren die Spezifität PKMTs, und mehrere neue Histon und Nicht-Histon-Substrate PKMT identifiziert durch diesen Ansatz 5,16-19. Definieren der richtigen Substrat-Spektrum einer PKMT (oder einem Enzym), ist ein wesentlicher Schritt in Richtung auf das Verständnis des molekularen Mechanismus und zellulären Funktionen. Als ein Beispiel für die Anwendung der Peptidfleckenanordnung Methylierungsmethode beschreiben wir...

Peptid-Arrays, die mit der SPOT-Methode synthetisiert werden, können verwendet werden, um die Substratspezifität von Protein-Lysin-Methyltransferasen (PKMTs) zu analysieren und das Substratspektrum von PKMTs zu definieren, um ihre biologische Rolle zu verstehen. Dieses Protokoll beschreibt, wie Peptidarrays synthetisiert, mit PKMTs methyliert und die Ergebnisse analysiert werden.

Spezifitätsanalyse von Protein Lysin Methyltransferasen Mit SPOT Peptidarrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Substratspezifität von Protein-Lysin-Methyltransferasen oder PK-mts zu untersuchen. Dies wird durch die Identifizierung eines Ausgangssubstrats und die Herstellung von Peptidarrays mit mehreren Varianten dieses Substrats erreicht, die einzelne Aminosäureaustausche an verschiedenen Positionen enthalten. In einem zweiten Schritt wird das Peptidarray mit dem PKMT in Gegenwart eines radioaktiven Methylgruppendonors inkubiert, was den Nachweis der Peptidmethylierung durch Übertragung von Radioaktivität auf den entsprechenden Peptidspot ermöglicht.Als nächstes wird das Array einem Röntgenfilm ausgesetzt und quantitativ analysiert, um die Methylierungsaktivität an jedem der Peptide zu bestimmen. Um das Spezifitätsprofil der PKMT zu definieren, zeigen die Ergebnisse, welche Aminosäuren im Substratpeptid für seine Methylierung durch die PKMT entscheidend sind. Der Hauptvorteil dieser Technik oder bestehender Methoden wie der Methylierung einzelner Peptide besteht darin, dass eine Reihe verschiedener Peptide in einem Experiment kostengünstig getestet werden kann.Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Protein-Lym-Methylierung zu beantworten, wie z.B. die Spezifikation bisher unbekannter neuer Substrate von PK mtss. Diese Methode kann also Aufschluss über die Spezifität von PK mts geben. Es kann auch auf andere Systeme wie Proteinkinasen, andere Proteinmethoden, Transferasen oder als Zusatz zu Transferasen angewendet werden.Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich mich mit der Möglichkeit vertraut machte, mit Hilfe der Peptid-Spot-Synthese große kundenspezifische Peptid-Arrays zu vertretbaren Kosten herzustellen. Um dieses Verfahren zu beginnen, entwerfen Sie Peptidsequenzen für die Synthese mit der Multi-Pep-Spotter-Software. Geben Sie die Peptidsequenzen als Ein-Buchstaben-Code ein, wobei jeder Buchstabe die spezifische Aminosäure definiert, die diesem Pre-Swell, der Amino-Peg-funktionalisierten Spot-Membran am Ende, Ende Dimethylformamid oder DMF für 10 Minuten folgt. Wenn Sie fertig sind, platzieren Sie die nasse Membran ohne Luftblasen oder Falten auf dem Synthesizer-Rahmen.Trocknen Sie die Membran mindestens 10 Minuten lang vollständig ab, bevor Sie das Syntheseprogramm starten. Waschen Sie die Membran dreimal mit 100%Ethanol, um die Amidbindung mit der freien Aminogruppe auf der Membran zu erzeugen. Aktivieren Sie die Carboxygruppe der eingehenden Aminosäure, indem Sie DIC und Ethylhydroxy-Amino-Sinoacetat zum Aminosäurederivat hinzufügen.Erkennen Sie nach der Aktivierung mit dem programmierbaren Roboter die gewünschten Mengen an aktivierten Aminosäuren auf der Amino-Peg-funktionalisierten Membran. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt dreimal, um eine bessere Kopplung der ersten aktivierten Aminosäure zu gewährleisten. Nachdem Sie die Membran 20 Minuten lang inkubiert haben, waschen Sie sie mit DMF, um nach dem Trocknen und Blockieren der freien Aminogruppen ungekoppelte Aminosäuren zu entfernen.Waschen Sie die Membran viermal mit DMF und inkubieren Sie sie dann 20 Minuten lang mit 20 % Piperin in DMF, um die FM-Schutzgruppe zu entfernen. Wiederholen Sie nach dem Waschen und Trocknen der Membran die Schritte zum Fleckenbildung und zur Entfernung von F MOC, bis die gewünschte Peptidlänge erreicht ist. Nach dem letzten Schutz der F MOC-Gruppe D waschen Sie die Membran mit DMF und 100 % Ethanol.Behandeln Sie dann die Membran mindestens fünf Minuten lang mit 0,02 % Bromphenolblau in DMF, bis sie vollständig blau wird. Nachdem Sie die Membran gewaschen und getrocknet haben, nehmen Sie sie aus dem Synthesizer und legen Sie sie in eine chemikalienbeständige Box. Behandeln Sie es mit 20 bis 25 Millilitern einer Seitenketten-D-Schutzmischung, bestehend aus 95%iger Trichloressigsäure zur Spaltung der Seitenkettenschutzgruppen und Scavenger-Reagenzien zum Schutz der Aminosäure-Seitenketten vor Modifikationen.Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Tiefenschutzmischung die Membran bedeckt, schließen Sie die Box vollständig und inkubieren Sie sie ein bis zwei Stunden lang, während Sie sie nach der Inkubation leicht schütteln. Waschen Sie die Membran sechsmal mit 20 bis 25 Millilitern Dichlormethan für jeweils zwei Minuten. Nach zweimaligem Waschen mit 100%igem Ethanol trocknen Sie die Membran über Nacht in einem Trockenmittel.Als nächstes wird die Peptidarray-Membran in einem versiegelten Plastikbeutel, der den jeweiligen Methylierungspuffer ohne Enzym enthält, vorinkubiert und mit der radioaktiv markierten Methylgruppe versehen. Entsorgen Sie den Vorinkubationspuffer für 10 Minuten, und inkubieren Sie die Membran in acht Millilitern Methylierungspuffer, der den jeweiligen PKMT enthält, für ein bis zwei Stunden. Anschließend wird der Methylierungspuffer in einen Behälter für radioaktive Abfälle geworfen und die Peptidarrays fünfmal mit 20 Millilitern Puffer gewaschen, der 100 millimolare Ammoniumbicarbonat und 1 %STS enthält, um das gebundene Protein zu entfernen. Nachdem Sie den letzten Waschpuffer in den Behälter für radioaktive Abfälle geworfen haben, inkubieren Sie die Membran fünf Minuten lang in 10 Millilitern Amplifikationslösung.Entsorgen Sie dann die Amplify-Lösung im Behälter für radioaktive Abfälle für organische Lösungsmittel. Verschließen Sie das Peptidarray in einer Plastiktüte und legen Sie es in eine Autoradiographiekassette. Legen Sie den Autoradiographiefilm in einem dunklen Raum auf das Peptid.Schließen Sie dann die Kassette vorsichtig. Nachdem Sie den Film bei minus 80 Grad Celsius belichtet haben, entwickeln Sie ihn weiter, um die Ergebnisse zu analysieren. Nehmen Sie das Bild schließlich einige Male mit unterschiedlichen Belichtungszeiten auf, um eine Sättigung stark methylierter Peptidsubstrate zu vermeiden.Ein Beispiel für eine Methylierungsreaktion eines Peptidarrays mit NSD One ist hier dargestellt. Die horizontale Achse stellt die Sequenz des Peptids dar und verläuft in vertikaler Richtung. Die veränderte Aminosäure ist indiziert Methylierung mit nsd, man zeigt, dass sie spezifisch auf H drei K 36 wirkt und erkennt drei bis vier Aminosäurereste auf beiden Seiten des Ziellysin-Konsolidierungs.Etwa 85 % der Peptide weisen Standardabweichungen kleiner als plus oder minus 20 % auf, und mehr als 97 % der Peptide weisen Standardabweichungen kleiner als plus oder minus 30 % auf. Die berechneten Daten des Diskriminationsfaktors zeigen, dass NSD eins aromatische Reste an der Minus-Zwei-Position bevorzugt. An den Minus- und Plus-Zwei-Stellen bevorzugt es hydrophobe atische Rückstände. Und an der Plus-Eins-Stelle gibt es eine Präferenz für Arginin, Lysin, Glutamin oder Asparagin.Potentiell neuartige Peptidsubstrate können durch Datenbankrecherchen im menschlichen Proteom gefunden werden. Die starke Methylierung einiger dieser Peptide mit ome bestätigt ihre Identität als neuartige NSD-Ein-Peptid-Substrate. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, das am besten geeignete Ausgangssubstrat zu verwenden.Andere Methoden, wie die Methylierung der entsprechenden Proteine in vitro und in Zellen, können durchgeführt werden, um herauszufinden, ob Proteine als Substrate akzeptiert werden, sowie nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Protein-Lysin-Mesylierung, um die Substratspezifität vieler PK-mts zu definieren und mehrere neuartige Substrate zu identifizieren. Dies trug dazu bei, die wichtige biologische Funktion von PK mts zu verstehen.Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität und organischen Lösungsmitteln bei der Peptidsynthese durchgesetzt werden kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten.

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Forschung

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Biology

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