Name: Ein Ex-vivo- Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Erfahren Sie ein Ex-vivo-Modell zur Untersuchung von CD8+-T-Zell-Angriffen auf Oligodendrozyten in akuten Hirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse immunvermittelter neuronaler Schädigung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Interdisziplinäre Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), die Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 bis S.G.M. ME3283/2-1 bis S.G.M.) und durch Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB und SGM).

Alle Versuche mit Mäusen sollte in Übereinstimmung mit den Richtlinien der jeweiligen institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschuss durchgeführt werden. 1. Allgemeine Kommentare zu Maus Experimente <ol><li> Halten Sie die Maus unter pathogenfreien Bedingungen und ihnen Zugang zu Futter und Wasser ad libitum. HINWEIS: Es ist wichtig, Alter und Geschlecht abgestimmte Mäuse in Versuchsgruppen zu verwenden, da immunologische Muster können mit Alter und Geschlecht variieren. </li></ol> 2. Herstellung und Aktivierung von OVA-spezifischen CD8 + T-Zellen (OT-I) <ol><li> Führen Stimulation der OT-I T-Zellen, wie unter 5 Tage vor der Vorbereitung Hirnschnitten beschrieben. HINWEIS: 5 × 10 5 aktiviert Effektor CD8 + OT-I T-Zellen (CD8 + T-Zellen von transgenen Mäusen, die Anerkennung nur die OVA 257-264-Peptid im Kontext der MHC-I-Moleküle) pro Schicht benötigt Die Konzentration 5 x 10 5 wurde Experiment gewählteVerbündeter als optimal ein, um eine gute Zell-Zell-Interaktion einmal bevorzugen, dass die Zellen beginnen, in die Scheibe der Migration und, zur gleichen Zeit, ist die Menge der Zellen nicht zu hoch ist, um eine Überreaktion ermöglicht Einzelzellzählung 8,18 induzieren. </li><li> Bereiten Sie das Medium zur Kultivierung OT-I T-Zellen. Supplement 500 ml DMEM mit 5% fötalem Kälberserum (FCS), 10 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 50 uM 2-Mercaptoethanol, 1% nicht-essentielle Aminosäuren und 25 &amp; mgr; g / ml Gentamicin. Lagern Sie das Medium bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Entfernen Sie die Milz von OT-I transgenen Mäusen nach Referenz 16. Übertragen Sie sie in die vorbereitete Medium. </li><li> Generieren Einzelzellsuspension durch Maischen Milzen durch ein 70 um-Sieb und Zentrifugen Suspension bei 300 xg für 5 min, 4 ° C. </li><li> Inkubieren Zellsuspension mit 5 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK) Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) für 5 min, um rote Blutkörperchen zu lysieren. </li><li> Stoppen incubatiauf 10 ml Medium und zentrifugiert erneut wie oben beschrieben. </li><li> Verdünnte Zellsuspension in mittleren und berechnen Zahlen. Platten Zellen in einer Dichte von 3 x 10 7 Zellen / Vertiefung in eine Platte mit 12 Vertiefungen und prime sie durch Inkubation mit OVA 257-264 (SIINFEKL; 1 nM) und Interleukin 2 (IL-2) (500 IU / ml) 5 Tage. </li><li> Nach 4 Tagen hinzuzufügen IL-2 in einer Konzentration von 500 IU / ml wieder. </li><li> Nach Stimulation reinigen OT-I-T-Zellen aus der Zellsuspension durch die Verwendung eines negativen Selektion basierend Maus CD8 + T-Zellisolations-Kit den Anleitungen des Herstellers. Die Reinigung wird auf die Verringerung von allen nicht-CD8 + -Zellen mit einem Cocktail von Antikörpern gegen CD4, CD11b, CD11c, CD19, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, MHC Klasse II, Ter-119 und TCRγ basierend / δ welche dann durch Verwendung von Magnetspalten zur Elution der gereinigten CD8 + T-Zellen verworfen werden. HINWEIS: Kritische Schritte in diesem procedure werden von den Herstellern angegeben: Es ist wichtig, daß die Reaktion beinhaltet nur einzelne Zellen, weil die Anwesenheit von Klumpen könnten die Spalte während des Elutionsschritts zu blockieren; Zählen der Zellen vor der Zugabe des Byotin Cocktail ist wichtig für den Grad der Reinheit der Probe, und die Prozedur sollte auf Eis durchgeführt, um unspezifische Antikörperbindungen minimieren. </li></ol> 3. Vorbereitung der akuten Hirnschnitten und Co-Kultur mit OT-I T-Zellen <ol><li> Vor der Herstellung des akuten Hirnschnitten 19, bereiten placedine eiskalter physiologischer Kochsalzlösung mit 200 mM Saccharose, 20 mM PIPES, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 10 mM MgSO 4, 0,5 CaCl 2 und 10 mM Dextrose und künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) durch Verwendung von 125 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 24 mM NaHCO 3, 2 mM MgSO 4, 2 mM CaCl 2, 10 mM Dextrose. Der pH-Wert jeder Lösung auf 7,35 durch using NaOH. Vor Einstellung des pH der ACSF müssen Lösung mit einer Mischung aus 95% O 2 und 5% CO 2 gesprudelt werden. </li><li> Vorkühlung des Lösungen. </li><li> Anesthetize 8 - 10 Wochen alten Mäusen (zB C57Bl / 6 als Kontrolle oder transgenen ODC-OVA Mäusen 17 mit der Inhalation mit 5,0% Isofluran, 5,0% Halothan oder injizieren 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Körpergewicht Xylazin über ip Wait für Anästhesie und verwenden eine Zehe Prise, um das Niveau der Anästhesie zu bewerten und zu enthaupten sie sofort. Euthanize die Mäuse nach institutionellen Tierpflege und verwenden Ausschuss Kriterien für Euthanasie. </li><li> Setzen Maus in Bauchlage. Desinfizieren und schneiden Kopfhaut sagittal. Öffnen Sie die Schädelknochen sagittal, entfernen Sie das Gehirn schnell mit Hilfe einer Schaufel und befestigen Sie es auf der Platte eines Vibratom mit Hilfe von Leim. </li><li> Füllen Sie den Teller mit der vorbereiteten placedine eiskalter physiologischer Kochsalzlösung. </li><li> Cut 300 um koronalen Scheiben mit dem Vibratom. Hinweis: Diese Vorgehensweise ist weißn, um lebensfähige intakte Gewebeproben für die funktionelle zelluläre Studien innerhalb eines Zeitintervalls von mindestens 8 h 19 bis 21 entsprechende ergeben. In der Tat, nach dieser Zeit, schon nach 6 Stunden ab der Zubereitung hat ergeben, verminderter Qualität, nämlich Veränderungen in einfachen und funktionalen Eigenschaften wie Aktionspotential Erzeugung und Ausbreitung. </li><li> Nach dem Schneiden, übertragen eine Scheibe sofort in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit ACSF gefüllt. </li><li> Fügen Sie sorgfältig 5 × 10 5 OT-I T-Zellen pro Scheibe. </li><li> Scheiben Inkubieren für bis zu 8 h in einem Brutschrank (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Nach der Inkubationszeit, Ernte Scheiben schneiden und mit Hilfe OCT-Verbindung Tissue-Tek betten sie und frieren sie in flüssigem Stickstoff. Im Kühlschrank bei -20 ° C für die weitere histologische Untersuchungen zu Beispiel auszuwerten neuronale Struktur (zB unter Verwendung von Anti-MAPII oder Anti-Synaptophysin-Antikörper) oder Apoptose (zB mit Anti-Caspase-3-Antikörpern und Anti-Anti NeuNStellen) nach Standardverfahren. </li></ol>

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<li>Misgeld, U., Frotscher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+the+viability+of+neurons+in+hippocampal+slices+on+oxygen+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Dependence of the viability of neurons in hippocampal slices on oxygen supply.</a> Brain Res Bull. 8 (1), 95-100 (1982).</li>
<li>Ling, C., Verbny, Y. I., Banks, M. I., Sandor, M., Fabry, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+activation+of+antigen-specific+CD8%2B+T+cells+in+the+presence+of+antigen+in+organotypic+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">In situ activation of antigen-specific CD8+ T cells in the presence of antigen in organotypic brain slices.</a> J Immunol. 180, 8393-8399 (2008).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Verschiedene Tiermodelle haben in den letzten Jahrzehnten, die pathologischen Merkmale der entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen wie MS-Adresse beschrieben. In-vivo-Maus- und Rattenmodelle sind weit verbreitet, um pathophysiologische Merkmale der Krankheit nachahmen, nämlich Analyse der Folgen der Demyelinisierung und Remyelinisierung Prozesse und der vermischten Episoden von Entzündungen und Neurodegeneration. Trotzdem nur eine ex vivo Ansatz erlaubt es, die genauen zugrunde liegenden Mechanis...

Der Tod von Oligodendrozyten und die Zerstörung der Myelinscheide, begleitet von Verlust von Neuronen und Axonen, sind typische pathologische Befunde bei Läsionen der grauen Substanz bei Personen, die an Multipler Sklerose (MS) leiden)1,2. Kortikale Läsionen lassen sich bisher in drei verschiedene Subtypen2 unterteilen: subpiale, intrakortikale und leukokarkale Läsionen. Im Vergleich zu Plaques der weißen Substanz zeichnen sich Infiltrate durch eine Dominanz von CD8+ T-Zellen aus, was auf eine möglicherweise entscheidende Rolle bei der Entzündung der grauen Substanz hindeutet3. Darüber hinaus finden sich oligoklonale Expansionen im Blut, in der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und innerhalb entzündlicher Läsionen für CD8+ T-Zellen selbst4-6. 
Dementsprechend wird davon ausgegangen, dass CD8+ T-Zellen spezifisch für verschiedene Myelinproteine sein könnten7,8. In der Tat finden sich CD8+ T-Zellen in der Nähe von Oligodendrozyten und Myelinscheiden9,10, die eine MHC I-Expressionaufweisen 11 und daher für den Verlust der Myelinscheide verantwortlich sein könnten. Dieser Prozess wird oft zusammen mit ausgedehnten "kollateralen" neuronalen und axonalen Schäden in der grauen Substanz des Zentralnervensystems (ZNS) beobachtet1,2. Tatsächlich wird der direkte und indirekte Tod von Oligodendrozyten und Neuronen durch CD8+ T-Zellen über zwei verschiedene Mechanismen induziert: (i) Schwellung und Ruptur der Zellmembran aufgrund der Bildung zytotoxischer Granula nach der Freisetzung von Perforinen und Granzymen und (ii) Ligation zu den Fas-Rezeptoren oder Exposition von FasL auf ihrer Oberfläche8,12,13.
Verschiedene Arten von Tiermodellen werden etabliert, um den zugrundeliegenden Mechanismus der genannten Prozesse zu untersuchen. In dieser Hinsicht können geprimte CD8+ T-Zellen, die spezifisch für Autoantigene mit induzierter Expression in ZNS-Gliazellen sind, wie Oligodendrozyten oder Astrozyten, adoptiv übertragen werden, um anschließend den "kollateralen" neuronalen und axonalen Tod in der grauen Substanz zu analysieren14,15. Die Durchführung solcher in vivo Experimente ist eine große Hilfe, um einige pathophysiologische Aspekte der MS nachzuahmen, jedoch ist dieser Ansatz nicht geeignet, um den zugrunde liegenden Mechanismus und die Kinetik der axonalen Schädigung und der neuronalen Apoptose aufzuklären.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde ein ex vivo-Ansatz entwickelt, um die Mechanismen und den zeitlichen Verlauf des neuronalen Zelltods nach einem Oligondendrozyten-gerichteten CD8+ T-Zell-Angriff zu untersuchen. Da nur die Produktion von Oligodendrozyten und damit die Produktion von Myelinscheiden von Immunzellen angesteuert werden sollte, werden MHC-Klasse-I-beschränkte, Ovalbumin (OVA)-reaktive OT-I-T-Zellen verwendet16. Diese Zellen werden anschließend in Hirnschnitte übertragen, die von Mäusen gewonnen wurden, die selektiv OVA in Oligodendrozyten exprimieren (ODC-OVA-Mäuse)17.

<table><tbody><tr><td>12-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutan</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Sieb</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Merck</td><td>1.02382.0500</td><td>Calciumchlorid</td></tr><tr><td>CD8+-Isolationskit</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-859</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glukose</td><td>Merck</td><td>1.08337.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>warm in 37 > C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15-151</td><td>fötales Kälberserum</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Peprotech</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Abbott</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04933.0500</td><td>Kaliumchlorid</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td>Kaliumhydrogencarbonat</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td>Magnesiumsulfat</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td>Natriumchlorid</td></tr><tr><td>NaH2PO4 * H2O</td><td>Merck</td><td>1.06346.0500</td><td>Natriumhydrogenphosphat</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>Natriumhydrogencarbonat</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1.09137.1000</td><td>Natriumhydroxid</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>213330</td><td>Ammoniumchlorid</td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäure</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>OVA (257-264)</td><td>Genscript</td><td>RP10611</td><td>Ovalbumin</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Merck</td><td>1.07687.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

ein ex-vivo- modell eines oligodendrozyten-gerichtete t-cell attack in akuten hirnschnitten

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Der Tod von Oligodendrozyten, begleitet von der Zerstörung von Neuronen und Axonen, sind typische histopathologische Befunde bei kortikalen und subkortikalen Läsionen der grauen Substanz bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen wie Multiple Sklerose (MS). Bei diesen Erkrankungen werden hauptsächlich CD8+ T-Zellen mit mutmaßlicher Spezifität für Myelin- und Oligodendrozyten-verwandte Antigene gefunden, so dass die neuronale Apoptose in Läsionen der grauen Substanz ein Kollateraleffekt dieser Zellen sein kann. Es werden verschiedene Arten von Tiermodellen etabliert, um die zugrundeliegenden Mechanismen der genannten pathophysiologischen Prozesse zu untersuchen. Obwohl sie einige Aspekte der MS nachahmen, ist es unmöglich, den genauen Mechanismus und den zeitlichen Verlauf des "kollateralen" neuronalen Zelltods zu entschlüsseln. Um diesen Kurs zu untersuchen, zeigen wir hier ein Protokoll zur Untersuchung der Mechanismen und der zeitlichen Reaktion neuronaler Schäden nach einem Oligodendrozyten-gerichteten CD8+ T-Zell-Angriff. Um nur auf die Myelinscheide und die Oligodendrozyten abzuzielen, werden in vitro aktivierte Oligodendrozyten-spezifische CD8+ T-Zellen in akut isolierte Hirnschnitte transferiert. Nach einer definierten Inkubationszeit können Myelin- und neuronale Schäden in verschiedenen Regionen von Interesse analysiert werden. Mögliche Anwendungen und Grenzen dieses Modells werden diskutiert.

Nach einer Inkubation von Gehirnschnitten mit Oligodendrozyten gerichtete CD8 + T-Zellen, Oligodendrozyten und Neuronen Apoptose (2A bzw. 1C). Histologische Anzeichen von Apoptose (zB Caspase-3, Tunel) kann frühestens nach 3 h Inkubation nachgewiesen werden. Inkubationszeit sollte, um eine gute Qualität der Vorbereitung und reproduzierbare Ergebnisse garantieren nicht länger als 8 Stunden sein. Apoptotischen Zellen kann auf der ganzen Scheibe mit Übergewicht in markh...

Um die Mechanismen der Demyelinisierung und der neuronalen Apoptose in kortikalen Läsionen von entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen zu untersuchen, werden verschiedene Tiermodelle verwendet. Wir beschreiben hier einen ex vivo Ansatz, bei dem Oligodendrozyten-spezifische CD8+ T-Zellen auf Hirnschnitten verwendet werden, was zum oligodendroglialen und neuronalen Tod führt. Mögliche Anwendungen und Grenzen des Modells werden diskutiert.

Ein Ex-vivo- Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Oligodendrozyten-gerichteten Angriff von Zöliakie-Acht-T-Zellen ex vivo zu untersuchen. Dazu werden zunächst Zöliakie-Acht-T-Zellen aus der Milz von Mäusen isoliert. Der zweite Schritt besteht darin, akute Hirnschnitte vorzubereiten.Dann werden die Hirnschnitte mit den aktivierten acht T-Zellen der CD bis zu sechs Stunden lang inkubiert, gefolgt von einer Kryokonservierung und histologischen Studien. Letztendlich kann die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die Position von T-Zellen sowie die Apoptose von Oligodendrozyten zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Techniken wie der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis, einem Tiermodell für leichte Sklerose, besteht darin, dass die Schädigung der Neuronen besteht.Nach Zöliakie 8 kann der vermittelte Oligodendrozytenangriff im Detail untersucht werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neuroimmunologie zu beantworten, wie z.B. den Transport von Immunzellen im Gewebe oder die Degeneration von Neuronen und Oligodendrozyten. Alexander Hamman, ein Doktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Fünf Tage vor der Vorbereitung der Gehirnschnitte stimulieren Sie die OT one T-Zellen, um die Zellen zu aktivieren.Befolgen Sie zunächst das sehende Protokoll, um die Milz mehrerer O OT one transgener Mäuse zu entfernen. Sammeln Sie die Milz in frisch zubereitetem, ergänztem Medium. Stellen Sie als Nächstes eine einzellige Suspension her, indem Sie die Milz durch ein 70-Mikron-Sieb zerkleinern und dann die Suspension fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 300 g zentrifugieren.Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgegossen und die Zellen in fünf Millilitern Ammoniumchlorid-Kaliumpuffer resuspendiert. Lassen Sie die Zellen in diesem Puffer fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubieren, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Beenden Sie dann die Reaktion, indem Sie 10 Milliliter ergänztes Medium bei vier Grad Celsius hinzufügen.Sammeln Sie anschließend die Zellen wieder, indem Sie sie wie zuvor nach unten drehen. Sammeln Sie dann die pelletierten Zellen, reanimieren Sie sie, suspendieren Sie sie in Medien und zählen Sie sie, wenn ihre Dichte bekannt ist. Übertragen Sie die Zellen auf eine 12-Well-Platte mit 30 Millionen Zellen pro Well.Fügen Sie dann Medien mit OVA und Interleukin zwei hinzu und inkubieren Sie die Zellen vier Tage lang. Nach vier Tagen fügen Sie mehr Interleukin zwei in einer Konzentration von 500 Einheiten pro Milliliter hinzu. Inkubieren Sie die Zellen dann für einen weiteren Tag.Mit einem CD-Acht-positiven T-Zell-Isolationskit reinigen Sie nun die O-OT-Ein-T-Zellen aus den kultivierten Zellen. Kurz. Acht positive Zellen ohne Zöliakie werden mit einem Cocktail aus Antikörpern depleziert und mit einer magnetischen Säule getrennt. Bereiten Sie dabei die Probe auf Eis vor und stellen Sie sicher, dass an der Reaktion nur einzelne Zellen beteiligt sind, damit die Säule nicht blockiert wird.Zählen Sie dann die Zellen. Für dieses Experiment. Haben acht bis 10 Wochen alte transgene Mäuse, O-D-C-O-V-A, Mäuse und Alter und Geschlecht stimmten mit C 57 schwarz sechs Kontrollen überein.Halten Sie die Mäuse wie gewohnt in einer pathogenfreien Umgebung mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Nachdem Sie eine Maus betäubt haben, verwenden Sie eine Kneifung der Hinterpfote, um den Grad der Anästhesie zu beurteilen, und euthanasieren Sie sie dann sofort. Positioniere nun eine Maus nach ventral und desinfiziere die Kopfhaut und enthaupte sie.Schneiden Sie dann schnell die Kopfhaut ab, öffnen Sie den Schädel und schöpfen Sie das Gehirn heraus. Fixieren Sie das Gehirn mit Klebstoff und übertragen Sie es auf eine Vibramplatte. Füllen Sie dann den Teller mit eiskalter physiologischer Kochsalzlösung.Nach der Zubereitung 300-Mikron-Scheiben schneiden. Übertragen Sie die Scheiben in einzelne Vertiefungen einer 12- oder 24-Well-Platte, die mit A CSF gefüllt ist. Fügen Sie dann vorsichtig eine halbe Million OT-Ein-T-Zellen zu jeder Scheibe hinzu.Eine halbe Million aktivierte Zellen Personalisiert sorgt für eine gute Interaktion mit den Zellzellen. Sobald Zellen vorhanden sind, beginnen die Zellen in die Scheibe zu wandern. Gleichzeitig ist die Anzahl der Zellen nicht zu hoch, um eine Überreaktion auszulösen, so dass eine Einzelzellzählung möglich ist.Nachdem Sie alle Vertiefungen geladen haben, inkubieren Sie die Co-Kultur bis zu acht Stunden nach der Inkubation, ernten Sie die Scheiben und betten Sie sie in die OCT-Mischung ein. Frieren Sie dann die eingebetteten Scheiben in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für weitere histologische Untersuchungen. Nach der Inkubation von Hirnschnitten mit Oligodendrozyten-gerichteten Zöliakie-8-positiven T-Zellen durchliefen die Oligodendrozyten eine Apoptose.Auch Neuronen durchliefen eine Apoptose. Die frühesten Anzeichen einer Apoptose wurden nach dreistündiger Inkubation beobachtet und waren nach acht Stunden robust. Apoptose wurde bei O-D-C-O-V-A-Zellen, die OT-1-T-Zellen ausgesetzt waren, häufiger beobachtet als bei jeder anderen Erkrankung.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden angewendet werden, um Fragen zum Migrationsverhalten von T-Zellen oder zur Beteiligung von Ionenkanälen an der eigenen Laborptosis zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man akute Hirnschnitte vorbereitet und wie man sie mit T-Zellen co-kultiviert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Live-Cell-Imaging von Caspase-3-vermittelte Apoptose in verewigt N19-Oligodendrozyten-Zellkulturen unter Verwendung...

Überwachung Cleaved Caspase-3 Aktivität und Apoptose von Immortalized Oligodendrozyten mit Live-cell Imaging und Cleaveable Fluorogenic-Farbstoff-Substrate Nach Kalium-induzierten Membrandepolarisation

Dieses Video demonstriert eine ex vivo Technik zur Induktion des Zelltods im Gehirn, vermittelt durch zytotoxische CD8+ T-Zellen. Nach der Gewinnung von Hirnschnitten werden aktivierte Oligodendrozyten-gerichtete CD8+ T-Zellen auf die Schnitte übertragen, um die Myelinscheide und die Oligodendrozyten anzugreifen. Nach der Inkubation können die Schädigung des Myelins und der neuronale Tod in den interessierenden Regionen histologisch beurteilt werden.

Eine ex vivo Technik zur Induktion des neuronalen Todes über Oligodendrozyten-spezifische CD8+ T-Zellen

Dieses Video zeigt die Entwicklung eines 3D-Co-Kultursystems. Hirnschnitte von Mäusen werden auf eine Membran gelegt, auf der fluoreszenzmarkierte menschliche Hirntumorzellen wachsen können. Sobald das System fertig ist, wird es für die Bildgebung gefärbt.

Etablierung eines Hirntumors in einem organotypischen Scheiben-Co-Kulturmodell

Phänotypische Wildtyp-Astrozyten und neurale Stammzellen, die von Mäusen entnommen wurden, die mit floxierten, bedingten onkogenen Allelen gezüchtet und über virale Cre-vermittelte Rekombination transformiert wurden, können zur Modellierung der Astrozytom-Pathogenese in vitro und in vivo durch orthotope Injektion von transformierten Zellen in Gehirne von syngenen, immunkompetenten Wurfgeschwistern verwendet werden.

Modellierung Astrozytom Pathogenese In-vitro- Und In Vivo Verwenden kortikale Astrozyten oder neuralen Stammzellen aus dem Bedingten, gentechnisch veränderte Mäuse

Globoidzellen sind ein definierendes pathologisches Merkmal der Krabbe-Krankheit, einer Leukodystrophie, für die es derzeit keine wirksame Langzeittherapie gibt. Wir haben ein Zellkulturmodell entwickelt, um die angeborene Biologie und das pathogene Potenzial aktivierter Mikroglia und ihre Umwandlung in Globoidzellen zu untersuchen.

Ein In-vitro- Modell für die Untersuchung der zellulären Pathophysiologie in Globoidzell- Leukodystrophie

Organotypischen hippocampal Slice Kulturen (OHSC) sind eine in-vitro- Modell, die die in-Vivo -Situation sehr gut simuliert. Hier beschreiben wir eine Vibratome-basierte verbessert schneiden-Protokoll, um qualitativ hochwertige Scheiben für den Einsatz bei der Beurteilung der neuroprotektive Potenzial der neuartigen Substanzen oder das biologische Verhalten der Tumorzellen zu erhalten.

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

Myelinating Oligodendrozyten fördern schnelle Aktionspotential Ausbreitung und neuronale überleben. Hier beschriebene ist ein Protokoll für Oligodendrozyt-spezifischen Ausdruck der fluoreszierende Proteine in organotypischen Gehirnscheiben mit nachfolgenden Zeitraffer Bildgebung. Darüber hinaus wird ein einfaches Verfahren zur Visualisierung von ungefärbten Myelin vorgestellt.

Visualisierung und Live Imaging Oligodendrozyt Organellen in organotypischen Gehirnscheiben mit Adeno-assoziierten Virus und konfokale Mikroskopie

Wir führen ein Protokoll zur Messung der Echtzeit-Arzneimittel- und Strahlungsreaktion von metastasierenden Zellen des Brustkrebsgehirns in einem organotypischen Gehirnschnittmodell ein. Die Methoden bieten einen quantitativen Assay, um die therapeutischen Wirkungen verschiedener Behandlungen auf Hirnmetastasen von Brustkrebs in einer Ex-vivo-Weise innerhalb der Mikroumgebungsschnittstelle des Gehirns zu untersuchen.

Ein Ex-vivo-Gehirnschnittmodell zur Untersuchung und Bekämpfung des metastasierenden Tumorwachstums von Brustkrebs im Gehirn

Dieses Protokoll beschreibt langfristige organotypische Kulturen des adulten menschlichen Kortex in Kombination mit der intrakortikalen Ex-vivo-Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten kortikalen Vorläuferzellen, die eine neuartige Methodik zur weiteren Erprobung stammzellbasierter Therapien für neurodegenerative Erkrankungen beim Menschen darstellen.

Organotypische Kulturen des adulten humanen Kortex als Ex-vivo-Modell für die Transplantation und Validierung humaner Stammzellen

Hier stellen wir eine detaillierte Methodik zur Isolierung der Netzhaut vom Mausauge für erweiterte ex vivo-Experimente zur Verfügung. Dieses Protokoll unterstreicht die Zugänglichkeit dieses technisch anspruchsvollen Ansatzes für Forscher, die die Forschungsmöglichkeiten nutzen möchten, die sich durch die In-situ-Haltung von retinalen Gliazellen in lebendem Gewebe bieten.

Ein ex vivo Explantatmodell zur Untersuchung von glialen Wechselwirkungen in der Netzhaut der Maus

Erfahren Sie ein Ex-vivo-Modell zur Untersuchung von CD8+-T-Zell-Angriffen auf Oligodendrozyten in akuten Hirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse immunvermittelter neuronaler Schädigung.

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