Ein Ex-vivo- Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten
5. Februar 2015
Um die Mechanismen der Demyelinisierung und der neuronalen Apoptose in kortikalen Läsionen von entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen zu untersuchen, werden verschiedene Tiermodelle verwendet. Wir beschreiben hier einen ex vivo Ansatz, bei dem Oligodendrozyten-spezifische CD8+ T-Zellen auf Hirnschnitten verwendet werden, was zum oligodendroglialen und neuronalen Tod führt. Mögliche Anwendungen und Grenzen des Modells werden diskutiert.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Oligodendrozyten-gerichteten Angriff von Zöliakie-Acht-T-Zellen ex vivo zu untersuchen. Dazu werden zunächst Zöliakie-Acht-T-Zellen aus der Milz von Mäusen isoliert. Der zweite Schritt besteht darin, akute Hirnschnitte vorzubereiten.
Dann werden die Hirnschnitte mit den aktivierten acht T-Zellen der CD bis zu sechs Stunden lang inkubiert, gefolgt von einer Kryokonservierung und histologischen Studien. Letztendlich kann die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die Position von T-Zellen sowie die Apoptose von Oligodendrozyten zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Techniken wie der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis, einem Tiermodell für leichte Sklerose, besteht darin, dass die Schädigung der Neuronen besteht.
Nach Zöliakie 8 kann der vermittelte Oligodendrozytenangriff im Detail untersucht werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Neuroimmunologie zu beantworten, wie z.B. den Transport von Immunzellen im Gewebe oder die Degeneration von Neuronen und Oligodendrozyten. Alexander Hamman, ein Doktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren. Fünf Tage vor der Vorbereitung der Gehirnschnitte stimulieren Sie die OT one T-Zellen, um die Zellen zu aktivieren.
Befolgen Sie zunächst das sehende Protokoll, um die Milz mehrerer O OT one transgener Mäuse zu entfernen. Sammeln Sie die Milz in frisch zubereitetem, ergänztem Medium. Stellen Sie als Nächstes eine einzellige Suspension her, indem Sie die Milz durch ein 70-Mikron-Sieb zerkleinern und dann die Suspension fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 300 g zentrifugieren.
Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgegossen und die Zellen in fünf Millilitern Ammoniumchlorid-Kaliumpuffer resuspendiert. Lassen Sie die Zellen in diesem Puffer fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius inkubieren, um die roten Blutkörperchen zu lysieren. Beenden Sie dann die Reaktion, indem Sie 10 Milliliter ergänztes Medium bei vier Grad Celsius hinzufügen.
Sammeln Sie anschließend die Zellen wieder, indem Sie sie wie zuvor nach unten drehen. Sammeln Sie dann die pelletierten Zellen, reanimieren Sie sie, suspendieren Sie sie in Medien und zählen Sie sie, wenn ihre Dichte bekannt ist. Übertragen Sie die Zellen auf eine 12-Well-Platte mit 30 Millionen Zellen pro Well.
Fügen Sie dann Medien mit OVA und Interleukin zwei hinzu und inkubieren Sie die Zellen vier Tage lang. Nach vier Tagen fügen Sie mehr Interleukin zwei in einer Konzentration von 500 Einheiten pro Milliliter hinzu. Inkubieren Sie die Zellen dann für einen weiteren Tag.
Mit einem CD-Acht-positiven T-Zell-Isolationskit reinigen Sie nun die O-OT-Ein-T-Zellen aus den kultivierten Zellen. Kurz. Acht positive Zellen ohne Zöliakie werden mit einem Cocktail aus Antikörpern depleziert und mit einer magnetischen Säule getrennt. Bereiten Sie dabei die Probe auf Eis vor und stellen Sie sicher, dass an der Reaktion nur einzelne Zellen beteiligt sind, damit die Säule nicht blockiert wird.
Zählen Sie dann die Zellen. Für dieses Experiment. Haben acht bis 10 Wochen alte transgene Mäuse, O-D-C-O-V-A, Mäuse und Alter und Geschlecht stimmten mit C 57 schwarz sechs Kontrollen überein.
Halten Sie die Mäuse wie gewohnt in einer pathogenfreien Umgebung mit freiem Zugang zu Futter und Wasser. Nachdem Sie eine Maus betäubt haben, verwenden Sie eine Kneifung der Hinterpfote, um den Grad der Anästhesie zu beurteilen, und euthanasieren Sie sie dann sofort. Positioniere nun eine Maus nach ventral und desinfiziere die Kopfhaut und enthaupte sie.
Schneiden Sie dann schnell die Kopfhaut ab, öffnen Sie den Schädel und schöpfen Sie das Gehirn heraus. Fixieren Sie das Gehirn mit Klebstoff und übertragen Sie es auf eine Vibramplatte. Füllen Sie dann den Teller mit eiskalter physiologischer Kochsalzlösung.
Nach der Zubereitung 300-Mikron-Scheiben schneiden. Übertragen Sie die Scheiben in einzelne Vertiefungen einer 12- oder 24-Well-Platte, die mit A CSF gefüllt ist. Fügen Sie dann vorsichtig eine halbe Million OT-Ein-T-Zellen zu jeder Scheibe hinzu.
Eine halbe Million aktivierte Zellen Personalisiert sorgt für eine gute Interaktion mit den Zellzellen. Sobald Zellen vorhanden sind, beginnen die Zellen in die Scheibe zu wandern. Gleichzeitig ist die Anzahl der Zellen nicht zu hoch, um eine Überreaktion auszulösen, so dass eine Einzelzellzählung möglich ist.
Nachdem Sie alle Vertiefungen geladen haben, inkubieren Sie die Co-Kultur bis zu acht Stunden nach der Inkubation, ernten Sie die Scheiben und betten Sie sie in die OCT-Mischung ein. Frieren Sie dann die eingebetteten Scheiben in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius für weitere histologische Untersuchungen. Nach der Inkubation von Hirnschnitten mit Oligodendrozyten-gerichteten Zöliakie-8-positiven T-Zellen durchliefen die Oligodendrozyten eine Apoptose.
Auch Neuronen durchliefen eine Apoptose. Die frühesten Anzeichen einer Apoptose wurden nach dreistündiger Inkubation beobachtet und waren nach acht Stunden robust. Apoptose wurde bei O-D-C-O-V-A-Zellen, die OT-1-T-Zellen ausgesetzt waren, häufiger beobachtet als bei jeder anderen Erkrankung.
Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden angewendet werden, um Fragen zum Migrationsverhalten von T-Zellen oder zur Beteiligung von Ionenkanälen an der eigenen Laborptosis zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man akute Hirnschnitte vorbereitet und wie man sie mit T-Zellen co-kultiviert.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Mechanismen der Demyelinisierung und der neuronalen Apoptose in kortikalen Läsionen unter Verwendung eines ex vivo-Modells mit oligodendrozytenspezifischen CD8+-T-Zellen. Der Ansatz ermöglicht die Untersuchung des Tods oligodendroglialer Zellen und Neuronen in einer kontrollierten Umgebung.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunologie
- Neurodegenerative Erkrankungen
Hintergrund
- Die Demyelinisierung ist ein Schlüsselmerkmal entzündlicher demyelinisierender Erkrankungen.
- CD8+-T-Zellen spielen eine Rolle bei der Immunantwort, die Oligodendrozyten betrifft.
- Das Verständnis dieser Wechselwirkungen kann therapeutische Strategien maßgeblich beeinflussen.
- Bisherige Modelle können die bei diesen Erkrankungen beobachteten neuronalen Schäden möglicherweise nicht vollständig nachbilden.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Wirkung von CD8+-T-Zell-Angriffen auf Oligodendrozyten ex vivo.
- Beurteilung der resultierenden neuronalen Apoptose unter kontrollierten Bedingungen.
- Erörterung möglicher Anwendungen und Grenzen dieses Modells.
Verwendete Methoden
- Isolierung von CD8+-T-Zellen aus Mausmilzen.
- Herstellung akuter Hirnschnitte für die Experimentierung.
- Inkubation der Hirnschnitte mit aktivierten CD8+-T-Zellen für bis zu sechs Stunden.
- Verwendung der Immunfluoreszenzmikroskopie zur Analyse der T-Zelllokalisation und der Oligodendrozytenapoptose.
Hauptergebnisse
- Nachgewiesener oligodendroglialer und neuronaler Zelltod nach Exposition gegenüber T-Zellen.
- Hervorhebung der Vorteile dieses Modells gegenüber herkömmlichen Methoden.
- Gewonnene Erkenntnisse über die Dynamik immunvermittelter neuronaler Schädigungen.
- Identifizierung potenzieller Einschränkungen bei der Übertragung der Ergebnisse auf in-vivo-Bedingungen.
Schlussfolgerungen
- Das ex-vivo-Modell simuliert effektiv die T-Zell-vermittelte Schädigung von Oligodendrozyten.
- Weitere Forschung ist erforderlich, um therapeutische Interventionen zu untersuchen.
- Dieser Ansatz kann das Verständnis von demyelinisierenden Erkrankungen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Dieses ex vivo-Modell ermöglicht die mechanistische Entschärfung von Oligodendrozyten-gerichteten Immuntherapien, indem es CD8+-T-Zell-vermittelte neuronale Schäden in akuten Hirnschnitten isoliert. Es unterstützt die Target-Validierung in der Entdeckung neuroinflammatorischer Erkrankungen, indem es quantitative, zeitlich aufgelöste Messgrößen für die Apoptose von Oligodendrozyten und Neuronen bereitstellt. Der Ansatz verbessert die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem direkte Wirkungen auf Oligodendrozyten von sekundärer Neurodegeneration in einem krankheitsrelevanten System entkoppelt werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Untersucht therapeutische Hypothesen bezüglich oligodendrozyten-spezifischer Angriffsmechanismen von CD8+ T-Zellen in grauer Substanz-Läsionen.
- Operativer Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung, indem die sekundäre neuronale Degeneration als direkte Folge einer oligodendrozytengerichteten Immunaktivität isoliert wird.
- Wissenschaftlicher Wert: Stärkt die Vorhersagekraft durch zeitlich aufgelöste Messungen der Apoptose (Beginn nach 3 Stunden, ausgeprägt nach 8 Stunden) unter O-D-C-O-V-A- im Vergleich zu Kontrollbedingungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme (akute Gehirnschnitte mit Myelin und Neuronen) für die nachgeschaltete Bildschirmung von Immunmodulatoren vor.
- Operativer Wert: Schafft Standardisierung des Assays durch definierte Inkubationszeiten (bis zu 8 Stunden) und reproduzierbare apoptotische Endpunkte mittels Immunfluoreszenzmikroskopie.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstreicht die Eignung für die Bildschirmung durch quantifizierbare Apoptose von Oligodendrozyten und Neuronen als abhängige Variablen zur Bewertung von Substanzen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz durch Modellierung kortikaler und subkortikaler grauer Substanz-Läsionspathologie bei entzündlichen demyelinisierenden Erkrankungen.
- Operationaler Wert: Beschreibt die translationale Kontinuität von der Mechanismenaufklärung ex vivo zur Verfeinerung präklinischer Modelle für Therapeutika bei demyelinisierenden Erkrankungen.
- Wissenschaftlicher Wert: Konzentriert sich auf den prädiktiven Entwicklungsrisikoverringerungswert, indem er die mechanistische Aufklärung der zeitlichen Abfolge immunvermittelter neuronaler Schäden ermöglicht.
Pipeline- und Workflow-Integration
Platziert die Methode innerhalb des Entdeckungsprozesses von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Identifizierung und unterstützt die Hypothesenprüfung sowie die Aufklärung von Signalwegen in der Neuroimmunologie.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung bezüglich T-Zell-Mechanismen, die auf Oligodendrozyten abzielen, sowie die Aufklärung von Wegen der immunvermittelten Neurodegeneration unterstützt.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays durch standardisierte Herstellung von Gehirnschnitten und quantitative Erfassung der Apoptose, was eine zuverlässige Evaluierung von Substanzen ermöglicht.
- Analytik: Betont die Messung der Apoptose von Oligodendrozyten und Neuronen mittels immunfluoreszenzmikroskopischer Verfahren als zentrale Messgrößen zum Vergleich experimenteller Bedingungen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem sie die Pathologie von grauer-Materie-Läsionen modelliert, die für den Fortschritt demyelinisierender Erkrankungen relevant ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbares Verfahren für die iterative Validierung von Zielstrukturen im Bereich neuroinflammatorischer Entdeckungen bei verschiedenen immunmodulierenden Kandidaten dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung und Verringerung mechanistischer Unschärfen beim Kreuzgespräch zwischen Oligodendrozyten und Neuronen während eines Immunangriffs.
- Operativer Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der akuten Hirnschnitt-Kokultur mit definierten T-Zell-Dosen (0,5 Millionen Zellen/Schnitt).
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirtschaftlichkeit und verringertes biologisches Risiko in späteren Stadien durch frühzeitige Isolierung von kollateralen neurodegenerativen Mechanismen.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf zeitlich aufgelösten Apoptose-Daten in krankheitsrelevanten grauen Substanz-Systemen.
Durchführungsaspekte
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in Neuroimmunologie, Gehirnschnittpräparation und Immunfluoreszenzmikroskopie.
- Zu den erforderlichen Geräten und analytischen Infrastrukturen gehören Vibratom, Kryostat, Fluoreszenzmikroskopie und Kits zur T-Zell-Isolierung.
- Standardisierungsanforderungen über Teamgrenzen hinweg bezüglich Schnittviabilität, T-Zell-Aktivierungsprotokolle und Schwellenwerte zur Quantifizierung von Apoptose.
- Anpassungsüberlegungen für verschiedene Modellsysteme, einschließlich transgener im Vergleich zu Wildtyp-Stämmen und koinkubierten humanisierten Immunzellen.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind, umfassen die ex-vivo-Bedingung, die langfristige dynamische Untersuchungen begrenzt, sowie potenzielle Variabilität in der Schnittqualität, die die Reproduzierbarkeit beeinträchtigen kann.
