Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel In-situ- Verwenden der TUNEL-Methode
16. Dezember 2014
Dieses Video beschreibt das Sezieren, die Gewebeverarbeitung, das Schneiden und die fluoreszenzbasierte TUNEL-Markierung von Maus-Skelettmuskeln. Es wird auch ein Verfahren zur halbautomatischen Analyse der TUNEL-Markierung beschrieben.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, DNA-Brüche und Zelltod in C zwei zu erkennen. Dies wird durch erste Perme-Gewebeschnitte erreicht, damit Tunnelreagenzien in den Zellkern gelangen können. Als nächstes wird das TDT-Enzym verwendet, um DTPs kovalent an drei Hauptenden von DNA-Brüchen in diesen Zellen zu binden.
Dann wird der Prüfling mit einer Fluoreszenzsonde markiert. Letztendlich wird das positive Tunnelsignal in Gewebeschnitten quantifiziert, die die relative Häufigkeit von DNA-Brüchen in den Zellen widerspiegeln. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Southern Blotting oder Immunhistochemie besteht darin, dass sie relativ schnell spezifisch ist und eine Möglichkeit bietet, Rauschen und Autofluoreszenz zu eliminieren.
Beginnen Sie mit der Fixierung isolierter Hintergliedmaßen in 4%Para-Formaldehyd in PBS in einem 15-Milliliter-Röhrchen, damit die Fixierung vier bis höchstens 24 Stunden bei vier Grad Celsius dauern kann. Es werden nur zwei Stunden benötigt, wenn es sich um embryonales Gewebe handelt. Ersetzen Sie jedoch nach der Fixierung die Lösung durch 10%ige Saccharose, um das Gewebe kryozu schützen, und inkubieren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius.
Wechseln Sie die Lösung am nächsten Tag zu steril filtrierter 30%iger Saccharose und setzen Sie die Inkubation über Nacht fort oder bis die hinteren Gliedmaßen auf den Boden des Röhrchens sinken. Beim Einbetten ist es wichtig, dass die Hintergliedmaßen vollständig in das Einbettmedium eingetaucht sind. Die Einbettungsformen können direkt auf Trockeneis oder in ISOP-Pentan auf Trockeneis platziert werden, um das Medium einzufrieren.
Bei der Kryosektion. Die Blöcke schneiden Transferabschnitte, die 10 Mikrometer dick oder dünner sind, dickere Abschnitte werden von den Tunnelmarkierungsreagenzien nicht durchdrungen. Sammeln Sie diese Dünnschliffe bei Raumtemperatur auf gelatine- oder vektorgebundenen Glasobjektträgern.
Übertragen Sie die Objektträger sehr schnell zur Aufbewahrung auf Trockeneis. Tauen Sie zunächst einen Objektträger aus gefrorenem Gewebe auf Raumtemperatur auf und lassen Sie ihn 16 bis 64 Stunden trocknen. Sobald der Objektträger Raumtemperatur erreicht hat, rehydrieren Sie den Abschnitt 10 Minuten lang in einem mit PBS gefüllten Kupplungsglas.
Wiederholen Sie diesen Rehydrationsschritt einmal, trocknen Sie dann den Objektträger vorsichtig mit einem Labortuch ab, ohne den Gewebeschnitt zu stören, um den Schnitt zu permieren, legen Sie den Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer und pipettieren Sie 50 Mikroliter nicht-proteolytische Reagenzien auf Saponinbasis auf den Schnitt. Pipettieren Sie nicht direkt auf die Schnitte, da sie sich ablösen oder beschädigt werden können. Legen Sie dann ein kleines Stück Para-Folie über den Abschnitt, um das Reagenz zu verteilen.
Wenn sich Blasen bilden, tragen Sie die Parafolie erneut auf. Lassen Sie die Folie nach einer Stunde eine Stunde lang inkubieren. Entfernen Sie die Reagenzien mit zwei fünfminütigen Wäschen in PBS und tupfen Sie es vorsichtig trocken.
Verwenden Sie neben der Markierung von DNA-Brüchen mit TDT auch ein kommerziell erhältliches Kit. Zuerst stellen Sie den einen XTDT-Puffer her und pipettieren über den Abschnitt. Dann inkubieren Sie den Objektträger fünf Minuten lang in der Befeuchtungskammer.
Zweitens, stellen Sie eine TDT-Beschriftungsmischung gemäß den Anweisungen des Kits oder einer positiven Kontrollfolie her. Fügen Sie der TDT-Markierungsmischung DNA hinzu. Bei einem negativen Kontrollobjektträger lassen Sie das TDT-Enzym aus der Mischung weg.
Entfernen Sie nun mit einem Tuch so viel Puffer wie möglich vom Objektträger und pipettieren Sie ihn auf die Etikettiermischung. 50 Mikroliter sollten ausreichen. Verteilen Sie die Lösung erneut mit Paraform, ohne Blasen zu bilden.
Lassen Sie den Objektträger nun eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in der Kammer inkubieren. Drittens, stellen Sie den Puffer mit einem x Stopp gemäß den Anweisungen des Kits her. Nachdem Sie die Markierungsmischung mit dem Labortuch entfernt haben, fügen Sie zwischen zwei und 300 Mikroliter der Stoppmischung hinzu, um den Abschnitt vollständig zu bedecken.
Dann inkubieren Sie den Objektträger fünf Minuten lang in der Kammer. In diesem Schritt wird kein Parafilm verwendet. Um den Stopppuffer zu entfernen, verwenden Sie zwei zweiminütige Wäschen in PBS.
Pipettieren Sie nun 50 Mikroliter frisch zubereitete Fluorescein-Markierungslösung. Auf den Objektträger Perfil auftragen und 20 Minuten in der Kammer inkubieren, jetzt jedoch im Dunkeln. Entfernen Sie die Markierungslösung mit einer einzigen zweiminütigen Wäsche in PBS, während Sie einige Haken verdünnen.
3 3, 2, 5 8 bis ein Mikrogramm pro Milliliter in PBS. Bedecken Sie die Abschnitte nach dem Waschen mit einem bis 200 Mikrolitern der verdünnten Hakenlösung. Inkubieren Sie dann den Objektträger fünf Minuten lang, vor Licht geschützt, um die Haken zu entfernen, um Flecken zu erzeugen, und verwenden Sie drei fünfminütige Wäschen in PBS.
Trocknen Sie dann den Objektträger vorsichtig mit einem Labortuch ab und bringen Sie einen Deckslip für die Bildgebung an. Bilden Sie den Schnitt mit dpi-, fitzy- und texanischen Rotfiltern ab, um die Hakenflecken-, Tunnelflecken- und Autofluoreszenzsignale in einem einzigen Bild in drei Falschfarbenkanäle zu unterteilen. Standardisieren und pflegen Sie die gleichen Bildgebungseinstellungen für alle Objektträger, damit sie leicht verglichen werden können.
Verwenden Sie keine automatischen Belichtungs- oder Verstärkungseinstellungen als anatomische Referenz. Verwenden Sie ein helles Hellfeldbild eines benachbarten Abschnitts der hinteren Gliedmaßen, der in der Bildanalysesoftware mit h und e gefärbt wurde. Deaktivieren Sie den Tunnelkanal.
Zeichnen Sie dann manuell den Umriss des zu quantifizierenden Muskelbereichs mit den anderen Kanälen nach. Wandeln Sie den nachgezeichneten Bereich in eine Maske um. Schalten Sie dann den Tunnelkanal wieder ein und passen Sie den minimalen Intensitätsschwellenwert an, um das autofluoreszierende Signal auszuschließen.
Verwenden Sie denselben Schwellenwert für alle in der Studie analysierten Abschnitte. Konvertieren Sie als Nächstes die Schwellenwertpixel in eine Maske. Kombinieren Sie in jedem Bild die Muskelbereichsmaske und die Schwellentunnelmaske.
Dadurch wird das Tunnelsignal innerhalb des verfolgten Muskelbereichs dargestellt. Quantifizieren Sie nun die kombinierte Maske, um die Anzahl der tunnelpositiven Objekte und die gesamte Pixelfläche des Tunnelsignals innerhalb des Muskels zu bestimmen. Verwenden Sie diese Werte für die statistische Analyse.
Tunnelpositive Objekte mit geringer Vergrößerung können als helle, unregelmäßige Fragmente in der Skelettmuskulatur erscheinen. Bei höherer Vergrößerung sollten jedoch einige tunnelpositive Objekte mit der klassischen apoptotischen Morphologie beobachtet werden, wenn der Zelltodtyp diese Apoptose beinhaltete. Die Positivkontrolle mit zugesetzter D-DNA sollte ein reichlich positives Tunnelsignal aufweisen, das gleichmäßig über alle Gewebe verteilt ist.
In dem Abschnitt. Die Negativkontrolle ohne TDT-Enzym sollte einen Hintergrund mit geringer Intensität haben und nur Autofluoreszenz zeigen. Mit dem beschriebenen Protokoll wurde festgestellt, dass Erythrozyten, Knochen- und Endothelzellen zum Autofluoreszenzsignal in den präparierten Schnitten der oberen Gliedmaßen beitrugen.
Das positive Signal des echten Tunnels war viel intensiver. Es könnte mit Hilfe einer Pixelintensitätsschwelle vom autofluoreszierenden Signal isoliert werden. Eine weitere Möglichkeit, das Tunnelsignal zu isolieren, bestand darin, den roten Autofluoreszenzkanal digital vom Tunnelkanal zu subtrahieren.
Mit dieser Technik wird der Zelltod der Skelettmuskulatur gestoppt. In einem Mausmodell von SMA wurde die Tunnelmarkierung in fünf Tage alten SMA-Mäusen mehr apoptotische Zellen als in Kontrollen gezeigt. Durch die Quantifizierung der Tunnelfärbung konnte gezeigt werden, dass diese Beobachtung für mehrere Muskelgruppen innerhalb der hinteren Extremität statistisch signifikant ist.
Einmal gemeistert, kann die Tunneltechnik in etwa vier Stunden durchgeführt werden, um zuverlässige quantitative Ergebnisse zu erzielen.
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Übersicht
Dieses Video beschreibt eine Methode zum Nachweis von DNA-Strangbrüchen und Zelltod im Skelettmuskel von Mäusen mittels TUNEL-Färbung. Es erläutert die Dissektion, die Gewebeaufbereitung sowie die damit verbundene halbautomatisierte Analyse.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Histologie
Hintergrund
- Das Verständnis von DNA-Strangbrüchen ist entscheidend für die Untersuchung des Zelltods.
- Die TUNEL-Markierung ist eine spezifische Methode zum Nachweis dieser Brüche.
- Herkömmliche Methoden können langsamer und weniger spezifisch sein.
- Dieses Verfahren zielt darauf ab, die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Detektion zu verbessern.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode zur Quantifizierung von DNA-Strangbrüchen in Gewebeschnitten bereitzustellen.
- Das Verständnis der Mechanismen des Zelltods zu vertiefen.
- Eine schnellere Alternative zu bestehenden Methoden anzubieten.
Verwendete Methoden
- Präparation der Skelettmuskulatur von Mäusen.
- Gewebeprozessierung zur Probenvorbereitung für die Analyse.
- Fluoreszenzbasierte TUNEL-Markierung zur Detektion von DNA-Strangbrüchen.
- Semi-automatisierte Analyse zur Quantifizierung von TUNEL-positiven Signalen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Detektion von DNA-Strangbrüchen im Muskelgewebe.
- Quantifizierung von TUNEL-positiven Signalen, die den Zelltod widerspiegeln.
- Veranschaulichung der Schnelligkeit und Spezifität der Methode.
- Vergleich mit herkömmlichen Methoden, der die Vorteile hervorhebt.
Schlussfolgerungen
- Die TUNEL-Markierungsmethode ist wirksam zur Untersuchung des Zelltods.
- Dieser Ansatz kann die Forschung in der Muskelbiologie verbessern.
- Sie stellt ein wertvolles Werkzeug für zukünftige Studien zur DNA-Schädigung dar.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Der Nachweis von DNA-Schäden im Skelettmuskel liefert Einblicke in die Mechanismen von Zelltodwegen, die für Modelle neuromuskulärer Erkrankungen und die Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit relevant sind. Die TUNEL-Methode ermöglicht eine quantitative und reproduzierbare Messung der Apoptose in Gewebeschnitten und unterstützt so die Validierung von Zielstrukturen und die Identifizierung führender Wirkstoffkandidaten in der präklinischen Forschung. Durch die Isolierung des echten Signals von Autofluoreszenz mittels digitaler Kanalsubtraktion verbessert der Test die Vorhersagesicherheit bei der Bestätigung pathologischer Mechanismen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem DNA-Schäden als pathologischer Mechanismus in Krankheitsmodellen bestätigt werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch direkte Messung des Zelltods in relevanten Geweben.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung durch Quantifizierung der Apoptosewirksamkeit therapeutischer Interventionen in vivo.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, quantitative Messungen des TUNEL-positiven Signals für Screening-Kampagnen mit Wirkstoffen.
- Reproduzierbarkeit: Die halbautomatisierte Quantifizierung gewährleistet eine konsistente Erkennung des Signals über verschiedene Schnitte und experimentelle Gruppen hinweg.
- Rauschunterdrückung: Die digitale Kanalsubtraktion schließt Autofluoreszenz aus und verbessert so die Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit des Assays.
Translationale und präklinische Forschung
- Relevanz für die Krankheit: Wird in Mausmodellen des spinalen muskulären Atrophie (SMA) eingesetzt, um den Zelltod in Skelettmuskelzellen zu bewerten, und zeigt damit eine translationale Anwendbarkeit.
- Mechanistische Ent风险entwicklung: Bestätigt die Beteiligung von Apoptose am Zelltod und reduziert damit Unklarheiten bei der Analyse von Signalwegen.
- Vorklinische Kohärenz: Unterstützt risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem sie die Modulation des Zielmoleküls mit phänotypischen Ergebnissen verknüpft.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein und liefert quantitative Apoptose-Auswertungen, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch unterstützen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch den Nachweis von DNA-Strangbrüchen und die Aufklärung von Zelltodmechanismen im Skelettmuskel.
- Screening: Liefert gebrauchsfertige, quantitative Ergebnisse zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Apoptose auf Gewebeebene.
- Analytik: Erzeugt signalbasierte Schwellenwerte und Objektanzahlen, die statistische Vergleiche zwischen verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet Erkenntnisse aus der Grundlagenforschung mit der präklinischen Validierung durch die Modellierung krankheitsrelevanter Apoptosevorgänge im Mausmuskel.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare, fluoreszenzbasierte Plattform zum Nachweis von Apoptose in verschiedenen Gewebetypen und Krankheitsmodellen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Target-Validierung, indem die mechanistische Uneindeutigkeit bezüglich der Zelltodwege verringert wird.
- Operationaler Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit sicher durch feste Bildgebungsparameter und halbautomatisierte Quantifizierung.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem frühzeitige, datengestützte Go/No-Go-Entscheidungen auf Grundlage der Apoptosewirksamkeit ermöglicht werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung durch Quantifizierung des therapeutischen Effekts auf DNA-Schäden und Zelltod.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Histologie, Gewebeschnitten und Fluoreszenzmikroskopie.
- Benötigt einen Kryostaten, ein Fluoreszenzmikroskop und Bildanalyse-Software mit Kanaltrennfähigkeit.
- Setzt eine Standardisierung der Fixierungs-, Einbettungs- und Schnittprotokolle über verschiedene Teams hinweg voraus.
- Muss gewebespezifische Autofluoreszenz von Quellen wie roten Blutkörperchen, Knochen und endothelialen Zellen berücksichtigen.
- Eingeschränkt durch artefakte Effekte der Gewebeverarbeitung, die die Effizienz der TdT-Enzyms und das Signal-Rausch-Verhältnis beeinträchtigen können.
