Name: Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel In-situ- Verwenden der TUNEL-Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Lernen Sie die TUNEL-Methode zur Erkennung von DNA-Schäden und Zelltod in Maus-Skelettmuskel. Diese Technik ermöglicht eine schnelle, spezifische Quantifizierung von DNA-Brüchen mit semi-automatischer Analyse.

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Diese Arbeit wurde durch den NIH-NINDS-Zuschuss RO1-NS065895 und den NIH-NINDS-Zuschuss 5-F31-NS076250-02 unterstützt. 
Wir danken der JHU SOM Microscope Facility für die Verwendung des Kryostaten.

HINWEIS: Alle in diesem Protokoll beschriebenen Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Bedienungsanleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health 26 durchgeführt. Das Protokoll (MO13M391) wurde von der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. neonatale Maus Opfer, Dissection, und Fixierung <ol><li> Opfere eine neonatale Maus durch CO 2 Inhalation. </li><li> Unmittelbar vor der Hinterlauf oberhalb des Knies geschnitten. Bis etwa postnatalen Tag 7, sind die Beinknochen weich genug über mit großen Labor Schere oder scharfe Klinge zu schneiden und anschließend Abschnitt eines Kryostaten. </li><li> Platzieren Sie den Hinterlauf in 10 ml eiskaltem 4% Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in einem 15 ml Röhrchen. </li><li> Eint fixieren den Hinterlauf in Paraformaldehyd für 4-24 h bei 4 ° C. Embryonalem Gewebe erfordert nur wenige Stundens der Fixierung. <ol><li> Fixierung Vermeiden von mehr als 24 Stunden, da dies TUNEL-Assay Effizienz reduzieren. </li></ol></li><li> Cryoprotect den Hinterlauf durch in einer Zuckerlösung eingetaucht wird. <ol><li> Ändern Paraformaldehyd und 10% Saccharose in PBS auf die gleiche 15-ml-Röhrchen, Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Änderung bis 30% Saccharose in PBS, inkubiert über Nacht bei 4 ° C oder, bis der Hinterlauf sinkt auf den Boden des Röhrchens. Gewebe kann in 30% Sucrose für eine längere Zeit verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Saccharose wurde sterilfiltriert. </li></ol></li></ol> 2. Gewebeeinbettung <ol><li> Füllen Sie eine markierte Einbettform Hälfte mit Einbettmedium. </li><li> Platzieren hindlimb auf der Oberseite des Einbettungsmediums, mit der Schnittfläche möglichst nahe an einer Wand der Form. Markieren die Ausrichtung der Hinterlauf an der Außenseite der Form. <ol><li> Betten Sie mehrere Hinterbeine und im selben Block geschnitten. Jedoch ist es wichtig, sicherzustellen, dass alle Hindlimbs im Block sind parallel zueinander ausgerichtet sind, um Abschnitte fristenkon- Ebenen längs der Achse des Gliedes zu erhalten. </li></ol></li><li> Bedecken Hinterbeine mit Einbettmedium. Wenn Hinterbeine verschieben beim Schütten von Medium, neu orientieren sie mit stumpfen Pinzette oder einem Zahnstocher. </li><li> Zulassen Einbettmedium, um das Gewebe bei Raumtemperatur für mindestens 15 min zu infiltrieren. </li><li> Platz Formen direkt auf Trockeneis oder in Isopentan auf Trockeneis zu frieren Einbettmedium. Achten Sie auf die Formen Niveau halten zu allen Zeiten und Verschiebung der eingebetteten Gewebe vermeiden. </li><li> Halten gefrorenen Formen bei -80 ° C bis bereit zu schneiden, bis zu mehreren Monaten. </li></ol> 3. Kryoschneiden Embedded Gliedmaßen <ol><li> Stellen Kryostatkammer Temperatur bis -20 ° C, Objekttemperatur bis -18 ° C; einstellen Objekttemperatur abkühlen. </li><li> Äquilibrieren der Gewebeblock in der Kryostatkammer für mindestens 30 min. Correct Block Tempratur ist entscheidend für Schnittqualität. </li><li> Geschnitten Querschnitte mit einer Dicke von 10 um oder weniger. Dickere Abschnitte nicht vollständig durch TUNEL Reagenzien durchdrungen werden. Verwenden Sie den Treckerplatte, Klingen und Klingenwinkel (in der Regel 5 °) empfohlen für den Kryostaten. </li><li> Sammeln Schnitte auf gelatin- oder vectabond beschichteten Glasobjektträger bei Raumtemperatur. Platzieren Sie sofort in eine Schiebefenster auf Trockeneis. Halten Sie den Schiebefenster in einem separaten Behälter mit Trockeneis in der Nähe des Kryostaten in Reichweite platziert. <ol><li> Schneiden Querschnittserien durch die lange Achse des Gliedes, das Überspringen von 100 bis 200 &amp; mgr; m. Sammeln Sie mindestens 3 benachbarte Abschnitte an jedem Serienniveau. </li></ol></li></ol> 4. TUNEL Assay am Hinterlauf Abschnitte mit einem handelsüblichen Kit (alle Schritte bei Raumtemperatur wenn nicht anders vermerkt) <ol><li> Tauen Sie Dias mit Abschnitten auf Raumtemperatur und trocken über Nacht oder über das Wochenende. </li><li> Rehydrieren Abschnitte von immersing Dias in PBS für 2 x 10 min in einem Coplin-Gefäß. Dry mit einem Labor zu wischen, zu entfernen so viel Flüssigkeit um den Abschnitt wie möglich. </li><li> Permeabilisieren Abschnitte <ol><li> Verwenden Sie entweder eine nicht-proteolytischen, Saponin-basierten kommerziellen Reagenz oder 0,5% Tween 20 und 0,05% Triton X100 in PBS. </li><li> Den Objektträger in eine feuchte Kammer überführen. Eine einfache Feuchtigkeitskammer ist eine leere Pipettenspitzenkasten mit einem dichten Deckel, mit gerade genug Wasser zugesetzt, um die Unterseite der Box ab. </li><li> Pipette genügend Reagenz auf den Objektträger, um den Abschnitt zu decken (50 ul reicht für neonatale Maus Gliedmaßen). Direkt pipettieren Sie nicht auf den Abschnitt, als wiederholte Rühren kann den Abschnitt zu veranlassen, heben Sie die Folie. </li><li> Mit stumpfen Pinzette, legen Sie ein kleines Rechteck von Parafilm auf der Oberseite des Abschnitts, um sich auszubreiten die Tropfen des Reagens und den Abschnitt vollständig zu bedecken. Sollten Blasen unter der Parafilm, heben Sie sie vorsichtig ab, trocknen und erneut anwenden. </li><li> Folien mit permeabili inkubierensierung Reagenz für 1 Stunde in einem abgedeckten feuchten Kammer. Sofern Teile beginnen, aus dem Schlitten abheben kann Permeabilisierung Zeit auf 30 Minuten reduziert werden. </li><li> Waschen Sie Dias in PBS in einer Coplin-Gefäß 2 x 5 min. Die Parafilm Rechtecke sollte nach oben schweben und kann dann entfernt und entsorgt werden. </li><li> Mit einem Labortuch trocknen so viel Flüssigkeit um die Abschnitte wie möglich. </li></ol></li><li> TdT-vermittelte DNA-Pause Kennzeichnung <ol><li> Folgen Sie den Anweisungen, um Kit 1x TdT Markierungspuffer pipettieren genug Markierungspuffer auf den Objektträger auf den Gewebeschnitt zu decken (50 ul reicht für neonatale Maus Gliedmaßen). Inkubieren in der Feuchtigkeitskammer für 5 min. Alternativ tauchen Sie die Folie in TdT Markierungspuffer in einer Coplin-Gefäß. </li><li> Folgen Kit Anweisungen TdT Kennzeichnung Mix zu machen. Das Kit umfasst Kobalt, Magnesium und Mangan-Kationen; das Mangankation funktioniert gut auf einer Vielzahl von Geweben, einschließlich Skelettmuskel, dem Nervensystem tissues, Leber, Haut und Knochen. </li><li> Für eine positive Kontrolle, fügen DNase (mit &quot;Nuklease&quot; im Satz) an die TdT Markierungsmischung. Alternativ vorzubehandeln eine positive Steuerabschnitt mit DNase in Nuklease-Puffer für 1 h bei 37 ° C, je nach Montageanweisungen. Halten DNase-Lösung und DNase behandelten Abschnitte entfernt von anderen experimentellen Abschnitten um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li><li> Für eine negative Kontrolle, wegzulassen TdT-Enzym von der Markierungsmischung. </li><li> Verwenden Sie eine Laborwischtuch, um so viel TdT Markierungspuffer von dem Objektträger wie möglich zu entfernen. Pipette TdT Markierungsmischung auf den Objektträger (50 ul pro Abschnitt), Deckel mit einem neuen Rechteck von Parafilm, und Inkubation in der Feuchtigkeitskammer bei 37 ° C für 1 Stunde. </li><li> Folgen Sie den Anweisungen, um Kit 1x Anschlagpuffer zu machen. Verwenden Sie ein Labor wischen TdT Markierungsmischung von der Folie zu entfernen, und fügen Sie 200-300 ul Stop-Puffer, um den Gewebeschnitt zu bedecken, und Inkubation in der Feuchtigkeitskammer für 5 min. Al<html> nativ, tauchen Sie die Folie in Anschlagpuffer in einer Coplin-Gefäß. </li><li> Die Folie 2 x 2 min in PBS waschen. Verwenden Sie eine Laborwischtuch, um so viel PBS zu entfernen von der Folie wie möglich. </li></ol></li><li> Fluoreszenzmarkierung <ol><li> Folgen Kit Anweisungen an Fluorescein Etikettierungslösung vorbereiten, dNTPs auf DNA-Brüche kennzeichnen. Pipette Lösung auf den Objektträger (50 ul pro Abschnitt), Deckel mit einem neuen Rechteck von Parafilm, und Inkubation in der feuchten Kammer für 20 min. </li><li> Wash Rutsche für 2 min in PBS in einer Coplin-Gefäß. Verwenden Sie eine Laborwischtuch, um so viel PBS von der Folie zu entfernen, wie möglich. </li><li> Verdünne Hoechst 33258 Kernfärbung bis 1 ug / ml in PBS und Pipette auf den Schlitten (100-200 &amp; mgr; l ist ausreichend, um Teilabdeckung). Inkubieren in der Feuchtigkeitskammer für 5 min. </li><li> Für 5 min in PBS waschen 3x. </li><li> Deckglas mit Antifade Fluoreszenz Eindeckmittel und Dichtung Kanten mit Nagellack. </li></ol></li></ol>jove_title &quot;&gt; 5. Digitale Bildaufnahme <ol><li> Erwerben von Bildern mit einem konventionellen Fluoreszenzmikroskop mit DAPI, FITC und Texas Red-Filter (oder äquivalent). Verwenden Sie eine höhere Vergrößerung Ziel (20X oder 40X), um zu überprüfen, dass die Kennzeichnung war erfolgreich und Kerne (intakt oder fragmentiert) markiert waren. A 10X-Objektiv ist ausreichend für die Quantifizierung der TUNEL-positiven puncta. </li><li> Bilder der Hoechst-Färbung, TUNEL-Färbung und Autofluoreszenzsignals Sammeln Sie so drei separate Falschfarbenkanäle in einem Bild kombiniert. Wenn der TUNEL Fluorophormarkierung ist grün, Bild Autofluoreszenzsignals im Rotfilter, und umgekehrt. <ol><li> Bewahren Sie alle Bildeinstellungen Äquivalent zwischen den Folien für die anschließende Schwellen und Quantifizierung. Für jeden Filter, Presets und Plattenbelichtungszeiten, Verstärkung und Binning (kein Binning ist am besten); Verwenden Sie keine automatische Belichtungs oder Verstärkungseinstellungen. </li><li> Verwenden Sie Trial-and-error, um Belichtung und Gain-Einstellungen, die am besten erfassen wird die Palette der inten findenschulen in allen gefärbten Schnitten. Stellen Sie sicher, dass es keine gesättigten Pixel in den erfassten Bildern, da dies die Bias-Quantifizierung. </li></ol></li><li> Nehmen Sie Bilder des gesamten Muskelgruppe von Interesse. Dies kann erfordern, mehrere Bilder zu &quot;genäht&quot; werden zusammen. </li></ol> 6. Bildanalyse <ol><li> Verwenden Sie handelsübliche Bildanalyse-Programme, um digitale Bilder von TUNEL-Färbung analysiert. Analyse mittels kommerzieller Software wird hier gezeigt. Alternativ kann die freie Software ImageJ von NIH zur TUNEL-Färbung analysiert werden. </li><li> Fleck einen Abschnitt neben dem TUNEL-gefärbten Abschnitt mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) und einen Vollschnitt digitalen Bildes mit einem konventionellen Hellfeldmikroskop. Verwenden Sie dieses Bild H &amp; E in Kombination mit einem Anatomieatlas 5,18,19, um die anatomischen Strukturen zu quantifizieren verfolgen. </li><li> Bei ausgeschaltetem TUNEL Kanal manuell die Kontur der Fläche zu verfolgen, um zu quantifizieren, mitHoechst und Autofluoreszenz-Kanäle für die Führung. Die zurückBereich in eine Maske konvertieren (eine Reihe von ausgewählten Pixelkoordinaten zu analysieren). </li><li> Schalten Sie den TUNEL-Kanal. Mit der Intensität Schwellenwertfunktion in der Bildanalyse-Programm, stellen Sie die untere Schwelle, um alle Autofluoreszenzsignal aus. </li><li> Übernehmen Sie die gleiche Schwellenwerteinstellungen für alle Bilder in der Studie Set. Konvertieren einer Schwellenwertauswahl in Masken. </li><li> Für jedes Bild, kombinieren die Muskelfläche Maske und die TUNEL-Maske. Die neue Kombination Maske TUNEL Signal innerhalb nur der zurückMuskelBereich darstellen. </li><li> Führen Maske Quantifizierung auf die Kombination Maske Anzahl von Objekten zu bestimmen, und Objektbereich des TUNEL-Signal innerhalb des Muskelbereichs zurückzuführen. Führen Sie diese mit Hilfe der Particle Analyzer-Funktion in ImageJ. </li></ol>

<ol><li>Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+end-labelling+detects+DNA+strand+breaks+in+apoptosis+and+other+physiological+and+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states.</a> 170 (1), 1-8 (1993).</li>
<li>Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUNEL+as+a+tumor+marker+of+tongue+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">TUNEL as a tumor marker of tongue cancer.</a> Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).</li>
<li>Colecchia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+by+the+TUNEL+technique+in+clinically+localised+prostatic+cancer+before+and+after+combined+endocrine+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy.</a> 50 (5), 384-388 (1997).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Delaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Limb+Anatomy+Atlas%3A+an+interactive+3D+tool+for+studying+embryonic+limb+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning.</a> 8, 83(2008).</li>
<li>Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+necrotic+cell+death+by+the+TUNEL+assay+in+the+hypoxic-ischemic+neonatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain.</a> Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDidenko%2C+VV+%22In+Situ+Detection+of+DNA+Damage+%3A+Methods+and+Protocols%22">In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols</a>. , Humana Press. 978-970 (2002).</li>
<li>Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).</li>
<li>Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+the+detection+of+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved method for the detection of DNA fragmentation.</a> J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).</li>
<li>Fayzullina, S., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+DNA+damage+precedes+spinal+motor+neuron+DNA+damage+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy+%28SMA%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA).</a> PLoS.One. 9 (3), e93329(2014).</li>
<li>Ferrer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+cell+death+in+the+developing+cerebral+cortex+of+the+rat.+Evidence+of+apoptosis-associated+internucleosomal+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation.</a> Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).</li>
<li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).</li>
<li>Gown, A. M., Willingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+apoptotic+cells+in+archival+paraffin+sections%3A+immunohistochemistry+using+antibodies+to+cleaved+caspase+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3.</a> J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).</li>
<li>Hara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+apoptosis+studied+by+a+sequential+TUNEL+technique%3A+a+method+for+tract-tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).</li>
<li>Harn, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+occurs+more+frequently+in+intraductal+carcinoma+than+in+infiltrating+duct+carcinoma+of+human+breast+cancer+and+correlates+with+altered+p53+expression%3A+detected+by+terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated+dUTP-FITC+nick+end+labelling+%28TUNEL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL).</a> Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).</li>
<li>Hsieh-Li, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model for spinal muscular atrophy.</a> Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).</li>
<li>Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+detection+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Screening and detection of apoptosis.</a> J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).</li>
<li>Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).</li>
<li>Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).</li>
<li>Koppen, G., Angelis, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+X-ray+induced+DNA+damage+measured+by+the+comet+assay+in+roots+of+Vicia+faba%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba.</a> Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).</li>
<li>Kuehl, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).</li>
<li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li>
<li>Labat-Moleur, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUNEL+apoptotic+cell+detection+in+tissue+sections%3A+critical+evaluation+and+improvement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement.</a> J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).</li>
<li>Modak, S. P., Bollum, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+measurement+of+single-strand+breaks+in+nuclear+DNA+in+fixed+lens+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections.</a> Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).</li>
<li>Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+against+single-stranded+DNA+detects+both+programmed+cell+death+and+drug-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis.</a> Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).</li>
<li>National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals</a>. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).</li>
<li>Negoescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+apoptotic+cell+labeling+by+the+TUNEL+method%3A+improvement+and+evaluation+on+cell+preparations%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations).</a> J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).</li>
<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mild+hypothermia+mitigates+post-ischemic+neuronal+death+following+focal+cerebral+ischemia+in+rat+brain%3A+immunohistochemical+study+of+Fas%2C+caspase-3+and+TUNEL%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL.</a> Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+neuronal+death+in+the+immature+brain+is+an+apoptosis-necrosis+morphological+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum.</a> J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-NMDA+and+NMDA+receptor-mediated+excitotoxic+neuronal+deaths+in+adult+brain+are+morphologically+distinct%3A+further+evidence+for+an+apoptosis-necrosis+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum.</a> J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).</li>
<li>Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+programmed+cell+death+in+oral+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">De novo programmed cell death in oral cancer.</a> Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).</li>
<li>Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+and+apoptosis+of+smooth+muscle+cells+in+intracranial+aneurysms.+Studies+with+in+situ+DNA+end+labeling+and+antibody+against+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir.%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA.</a> Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).</li>
<li>Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future.</a> J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).</li>
<li>Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+immunohistochemistry+under+the+influence+of+pH+using+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies.</a> J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+apoptosis+in+breast+cancer+pT1-pT2%29.+A+TUNEL%2C+p53%2C+bcl-2%2C+bag-1+and+Bax+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.Histopathol%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study.</a> Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).</li>
<li>Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+apoptosis-inducing+factor+%28AIF%29+in+keratoacanthomas+and+squamous+cell+carcinomas+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin.</a> Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).</li>
<li>Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+rheumatoid+arthritis+synovial+membrane%3A+modulation+by+disease-modifying+anti-rheumatic+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology.%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment.</a> Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).</li>
<li>Stadelmann, C., Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptosis+in+tissue+sections%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptosis in tissue sections).</a> Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).</li>
<li>Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+damage+in+cells+exposed+to+ionizing+radiation+by+use+of+anti-single-stranded+DNA+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Radiat.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody.</a> Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).</li>
<li>Watanabe, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+apoptotic+cells+in+human+colorectal+cancer+by+two+different+in+situ+methods%3A+antibody+against+single-stranded+DNA+and+terminal+deoxynucleotidyl+transferase-mediated+dUTP-biotin+nick+end-labeling+%28TUNEL%29+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn.+J.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods.</a> Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+signal-regulating+kinase+1+is+involved+not+only+in+apoptosis+but+also+in+non-apoptotic+cardiomyocyte+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).</li>
<li>Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+ischemia%2Freperfusion+injury+in+rats+by+a+caspase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor.</a> Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Verfahren zum Nachweis und zur quantitativen Analyse von DNA-Schäden assoziierten Apoptose in Skelettmuskel der Maus beschrieben. Das Verfahren beinhaltet Gewebeernte, TUNEL-Färbung, digitale Bildaufnahme und Bildanalyse. Gemeinsame histologische Lieferungen und Werkzeuge benötigt werden, und eine spezielle Handels TUNEL-Kit erforderlich. Die wesentlichen große Ausrüstungsteile nötig sind, einen Kryostat, Epifluoreszenz-Mikroskop mit digitaler Bildfähigkeit und ein Computersystem zur Bildanalyse. <p class="jove_cont...

Desoxyribonukleotidyltransferase (TdT) dUTP nick end labeling (TUNEL) ist der Prozess, mit dem TdT-Enzym zu dUTP bis 3 befestigen-Enden von Doppel- und Einzelstrang-DNA bricht 12,23. Die TUNEL-Methode zur Detektion von Apoptose und DNA-Schädigung wurde zuerst vor mehr als 20 Jahren von Gavrieli et al. 1,12,24 gemeldet. Es ist seit bewertet worden und in verschiedenen Gewebepräparaten 7,23,27,40 optimiert. TUNEL verwendet wurde, um Ischämie-induziertem Zelltod von Neuronen 6,14,29 und Kardiomyozyten 43,44, exzitotoxischen neuronalen Zelltod 30,31 studieren und als Biomarker in Arthritisbehandlung 39. Es hat sich auch als prognostischer Faktor und Tumorzellmarker in verschiedenen menschlichen Krebsarten 2,3,15,32,37,38,42 verwendet. Alternative Methoden gibt es für DNA-Schädigung und Zelltod-Erkennung, aber sie technische Herausforderungen und Einschränkungen haben. Southern-Blotting verwendet werden, um quantif werdeny DNA-Schäden in ganz Gewebelysaten 7,9-11, aber diese Methode bietet keine Zellebene Auflösung und ist schwer zu quantifizieren. Der Comet-Assay ist eine Alternative zellbasierte Verfahren, die Extraktion erhaltenen Kerne von Zellen 4,20,28,36 erfordert. Obwohl der Comet-Assay eignet sich gut an kultivierten isolierten Zellen, ist es viel schwieriger, intakten Zellkernen von Skelettmuskelgewebe 8,21 vorzubereiten. Wie bei Southern-Blot, wird der Comet-Assay keine Zelltyp-spezifische Informationen aus einer ganzen Muskel Gewebehomogenat. Eine weitere Alternative der TUNEL-Methode ist die Immunhistochemie unter Verwendung von Antikörpern gegen einzelsträngige DNA 25,33,41 oder gegen Proteine, die in die DNA-Reparatur und Zelltod Wege beteiligt (zB p53, H2AX und Caspasen) 13,17,22,40. Solche Antikörper-basierten Verfahren benötigen sorgfältige Charakterisierung von Antikörpern und ausgezeichnete Antikörperspezifität, ein hohes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis zu erhalten. Auch wenn specific Antikörper vorhanden sind, sie die Denaturierung des Zielproteins durch Antigengewinnungsverfahren 34,35 erfordern. Wie wir hier diskutieren, Antigen-Retrieval im Muskelgewebe führt zu inakzeptabel hohen Autofluoreszenz. Im Gegensatz zu den alternativen Methoden, TUNEL erreicht DNA Schadenserkennung mit einem hohen Signal und niedrige Hintergrund, ausgezeichnete Spezifität, die mit einfachen Positiv- und Negativkontrollen, gute Gewebepenetration, die keine Antigen-Retrieval nicht verlangen, und zellulären Ebene Auflösung getestet werden können. Darüber hinaus nimmt der TUNEL-Methode ca. 4 Stunden in Anspruch, während alternative Methoden erfordern in der Regel über Nacht Inkubationen. Wir untersuchen die Skelettmuskulatur Zelltod in einem Mausmodell der spinalen Muskelatrophie (SMA) 10, die von Hsieh-Li und seine Kollegen 16 generiert wurde. Apoptotische Zellen quantifizieren im Muskel, haben wir ein Verfahren zur Gewebevorbereitung, Anfärbung und Quantifizierung, das robust gegenüber verschiedenen skele arbeitet entwickeltental Muskelgruppen in verschiedenen Entwicklungszeitpunkten bei Mäusen. Wir verwenden ein handelsübliches TUNEL-Markierungs-Kits und handelsüblichen Bildanalyse-Software. Wir haben erfolgreich die TUNEL-Assay in Kombination mit Immunfluoreszenzfärbung in der Wirbelsäule 10 eingesetzt. Die hier beschriebenen Methoden sind nützlich für Ermittler, die zu Gewebepathologie, Mechanismen der Krankheits, Mechanismen des Alterns und Entwicklungs (prä- und postnatalen) Zelltod in der Skelettmuskulatur bewerten möchten. Die TUNEL-Technik ist besonders nützlich für die Untersuchung der DNA-Schädigung und Reparatur und Zelltod in Modellsystemen, wo nur eine Untergruppe von Zellen notwendig betroffenen und zellulärer Ebene Auflösung. Dieses Video beschreibt Dissektion Gewebeverarbeitung, Schneide- und Fluoreszenz basierenden TUNEL Kennzeichnung Maus Skelettmuskel. Sie beschreibt auch ein Verfahren zur halbautomatischen TUNEL Signal Quantifizierung.

<table><tbody><tr><td>4 % Paraformaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Wissenschaften 19202</td><td>Für die hier beschriebenen Verfahren wurde eine 4%ige Lösung frisch aus Pulver hergestellt. Paraformaldehyd von jedem Lieferanten kann verwendet werden. Die vorbereitete Formaldehydlösung sollte bei 4 μg gelagert werden; C und sollte nach dem Verfallsdatum (bis zu mehreren Monaten) nicht mehr verwendet werden. Paraformaldehyd ist ein Karzinogen und ein Toxin durch Einatmen und Hautkontakt. Bitte befolgen Sie beim Umgang mit Paraformaldehyd die im Sicherheitsdatenblatt angegebenen Vorsichtsmaßnahmen.</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Wird zum Kryoschutz von Gewebe vor dem Einfrieren verwendet. Saccharose von jedem Lieferanten kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Einbettmedium für Kryosektionen.</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM 3050S</td><td>Für die hier beschriebenen Präparationen wurde ein Leica CM3050S Kryostat verwendet. Jeder Kryostat, der in der Lage ist, 10 μm zu schneiden. Es können m-Sektionen verwendet werden.</td></tr><tr><td>Objektträger, 25 x 75 x 1 mm</td><td>Fisher</td><td>12-552-3</td><td>Objektträger können von jedem Anbieter verwendet werden.</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G-9391</td><td>Gelatine wird verwendet, um die Haftung von Gewebeschnitten auf Objektträgern zu fördern. Um Objektträger mit Gelatine zu beschichten, lösen Sie 2,75 g Gelatine und 0,275 g Chromalaun in 500 ml destilliertem Wasser auf, erwärmen Sie es auf 60 °; C, die Objektträger einige Sekunden lang eintauchen und trocknen lassen. Es kann Gelatine von jedem Lieferanten verwendet werden. Alternativ können gelatinevorbeschichtete Objektträger erworben werden.</td></tr><tr><td>Chrom(III)-Kaliumsulfat-Dodecahydrat (Chromalaun)</td><td>Sigma</td><td>243361</td><td>Chromalaun wird der Gelatinelösung zugesetzt, um die Gewebehaftung auf Objektträgern zu fördern. Es ist ein mögliches Karzinogen und ein Toxin durch Einatmen und Hautkontakt. Bitte befolgen Sie die im Sicherheitsdatenblatt angegebenen Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Chromalaun.</td></tr><tr><td>Vectabond Gewebehaftungsreagenz</td><td>Vector Labs</td><td>SP-1800</td><td>Optionales Substrat für eine bessere Gewebehaftung auf Objektträgern; stattdessen können gelatinebeschichtete Objektträger verwendet werden.</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Ein Reinigungsmittel zur Permeabilisierung von Gewebe. Tween20 von jedem Anbieter kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Ein Waschmittel zur Permeabilisierung von Gewebe. Triton X100 von jedem Hersteller kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>TACS 2 TdT Fluorescein in situ Apoptose-Detektionskit</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>Kommerzielles Kit für die fluoreszenzbasierte TUNEL-Markierung.</td></tr><tr><td>DNase/Nuklease</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(im Kit enthalten)</td></tr><tr><td>DNase/Nuklease-Puffer</td><td>Trevigen</td><td>4812-30-K</td><td>(im Kit enthalten)</td></tr><tr><td>10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4</td><td>Amresco</td><td>780</td><td>Make 1x PBS für Waschungen und Verdünnungen. PBS von jedem Lieferanten kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>DNasefreies Wasser</td><td>Qualität Biologicals</td><td>351-029-131</td><td>Es kann Wasser von jedem Lieferanten verwendet werden.</td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Sigma</td><td>94403</td><td>Kernfarbstoff. Es kann jeder blau fluoreszierende Kernfarbstoff verwendet werden. Als DNA-bindender Farbstoff steht Hoechst im Verdacht, krebserregend zu sein, und sollte mit Schutzausrüstung angefasst werden, um den Hautkontakt zu minimieren.</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>mehrfach</td><td>807</td><td>Jede andere hydrophobe Folie oder Deckfolie kann verwendet werden. Erhältlich von mehreren Lieferanten.</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop mit Digitalkamera</td><td>&nbsp;-</td><td>-&nbsp;-</td>-Jedes <td>Fluoreszenzmikroskop, das in der Lage ist, rote, grüne und blaue Fluoreszenz in getrennten Kanälen digital zu erfassen, kann verwendet werden.</td></tr><tr><td>Vectashield Antifade-Medien</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Antifade-Medien von jedem Anbieter können verwendet werden.</td></tr><tr><td>Glas-Deckgläser, Nr.1 Stärke</td><td>Brain Research Labs</td><td>2222-1</td><td>Deckgläser aller Anbieter können verwendet werden. Die kleinste Größe von 22 x 22 mm ist ausreichend für die Beinabschnitte von Neugeborenenmäusen.</td></tr><tr><td>Nagellack</td><td>Ted Pella</td><td>114-8</td><td>Wird zum Versiegeln von Deckgläsern verwendet. Nagellack von jedem Anbieter (auch von regulären Einzelhändlern) kann verwendet werden. Vermeiden Sie die Verwendung von Nagellack mit Farbe oder Zusätzen, die während der Fluoreszenzbildgebung Licht reflektieren können.</td></tr></tbody></table>

erkennung und analyse von dna-schädigungen in maus-skelettmuskel in-situ- verwenden der tunel-methode

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Endständige Desoxynukleotidyltransferase (TdT) Desoxyuridintriphosphat (dUTP) Nick-End-Markierung (TUNEL) ist die Methode, das TdT-Enzym zu verwenden, um eine markierte Form von dUTP kovalent an 3'-Enden von doppel- und einzelsträngigen DNA-Brüchen in Zellen zu binden. Es ist eine zuverlässige und nützliche Methode, um DNA-Schäden und Zelltod in situ nachzuweisen. Dieses Video beschreibt die Dissektion, Gewebeverarbeitung, Schnittbestimmung und fluoreszenzbasierte TUNEL-Markierung von Maus-Skelettmuskeln. Es wird auch eine Methode zur halbautomatischen Quantifizierung von TUNEL-Signalen beschrieben. Inhärente normale Gewebemerkmale und Gewebeverarbeitungsbedingungen beeinflussen die Fähigkeit des TdT-Enzyms, DNA effizient zu markieren. Bei der Gewebeverarbeitung kann es auch zu unerwünschter Autofluoreszenz kommen, die die TUNEL-Signalerkennung beeinträchtigt. Daher ist es wichtig, die Gewebeverarbeitungs- und TUNEL-Markierungsmethoden empirisch zu bestimmen, die das optimale Signal-Rausch-Verhältnis für die anschließende Quantifizierung liefern. Der hier beschriebene fluoreszenzbasierte Assay bietet eine Möglichkeit, das Autofluoreszenzsignal durch digitale Kanalsubtraktion auszuschließen. Der TUNEL-Assay, der mit geeigneten Gewebeverarbeitungstechniken und -kontrollen verwendet wird, ist eine relativ schnelle, reproduzierbare, quantitative Methode zum Nachweis von Apoptose im Gewebe. Es kann verwendet werden, um DNA-Schäden und Apoptose als pathologische Mechanismen zu bestätigen, betroffene Zelltypen zu identifizieren und die Wirksamkeit therapeutischer Behandlungen in vivo zu beurteilen.

Mit erfolgreichen Färbung sollte TUNEL-positiven Signal hell genug, um von Autofluoreszenz, indem Intensitätsschwellen zu isolieren. TUNEL-positive Objekte bei geringer Vergrößerung als helle unregelmäßige Fragmente im Skelettmuskel (1A) angezeigt. Jedoch bei höherer Vergrößerung einige TUNEL-positive Objekte mit dem klassischen apoptotische Morphologie zu beachten, wenn der Zelltod-Typ beteiligt ist, Apoptose (Figur 1B). Die positive Kontrolle (DNase zugegeben) sollte reichlich TUNEL-p...

Dieses Video beschreibt das Sezieren, die Gewebeverarbeitung, das Schneiden und die fluoreszenzbasierte TUNEL-Markierung von Maus-Skelettmuskeln. Es wird auch ein Verfahren zur halbautomatischen Analyse der TUNEL-Markierung beschrieben.

Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel In-situ- Verwenden der TUNEL-Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, DNA-Brüche und Zelltod in C zwei zu erkennen. Dies wird durch erste Perme-Gewebeschnitte erreicht, damit Tunnelreagenzien in den Zellkern gelangen können. Als nächstes wird das TDT-Enzym verwendet, um DTPs kovalent an drei Hauptenden von DNA-Brüchen in diesen Zellen zu binden.Dann wird der Prüfling mit einer Fluoreszenzsonde markiert. Letztendlich wird das positive Tunnelsignal in Gewebeschnitten quantifiziert, die die relative Häufigkeit von DNA-Brüchen in den Zellen widerspiegeln. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Southern Blotting oder Immunhistochemie besteht darin, dass sie relativ schnell spezifisch ist und eine Möglichkeit bietet, Rauschen und Autofluoreszenz zu eliminieren.Beginnen Sie mit der Fixierung isolierter Hintergliedmaßen in 4%Para-Formaldehyd in PBS in einem 15-Milliliter-Röhrchen, damit die Fixierung vier bis höchstens 24 Stunden bei vier Grad Celsius dauern kann. Es werden nur zwei Stunden benötigt, wenn es sich um embryonales Gewebe handelt. Ersetzen Sie jedoch nach der Fixierung die Lösung durch 10%ige Saccharose, um das Gewebe kryozu schützen, und inkubieren Sie es über Nacht bei vier Grad Celsius.Wechseln Sie die Lösung am nächsten Tag zu steril filtrierter 30%iger Saccharose und setzen Sie die Inkubation über Nacht fort oder bis die hinteren Gliedmaßen auf den Boden des Röhrchens sinken. Beim Einbetten ist es wichtig, dass die Hintergliedmaßen vollständig in das Einbettmedium eingetaucht sind. Die Einbettungsformen können direkt auf Trockeneis oder in ISOP-Pentan auf Trockeneis platziert werden, um das Medium einzufrieren.Bei der Kryosektion. Die Blöcke schneiden Transferabschnitte, die 10 Mikrometer dick oder dünner sind, dickere Abschnitte werden von den Tunnelmarkierungsreagenzien nicht durchdrungen. Sammeln Sie diese Dünnschliffe bei Raumtemperatur auf gelatine- oder vektorgebundenen Glasobjektträgern.Übertragen Sie die Objektträger sehr schnell zur Aufbewahrung auf Trockeneis. Tauen Sie zunächst einen Objektträger aus gefrorenem Gewebe auf Raumtemperatur auf und lassen Sie ihn 16 bis 64 Stunden trocknen. Sobald der Objektträger Raumtemperatur erreicht hat, rehydrieren Sie den Abschnitt 10 Minuten lang in einem mit PBS gefüllten Kupplungsglas.Wiederholen Sie diesen Rehydrationsschritt einmal, trocknen Sie dann den Objektträger vorsichtig mit einem Labortuch ab, ohne den Gewebeschnitt zu stören, um den Schnitt zu permieren, legen Sie den Objektträger in eine Feuchtigkeitskammer und pipettieren Sie 50 Mikroliter nicht-proteolytische Reagenzien auf Saponinbasis auf den Schnitt. Pipettieren Sie nicht direkt auf die Schnitte, da sie sich ablösen oder beschädigt werden können. Legen Sie dann ein kleines Stück Para-Folie über den Abschnitt, um das Reagenz zu verteilen.Wenn sich Blasen bilden, tragen Sie die Parafolie erneut auf. Lassen Sie die Folie nach einer Stunde eine Stunde lang inkubieren. Entfernen Sie die Reagenzien mit zwei fünfminütigen Wäschen in PBS und tupfen Sie es vorsichtig trocken.Verwenden Sie neben der Markierung von DNA-Brüchen mit TDT auch ein kommerziell erhältliches Kit. Zuerst stellen Sie den einen XTDT-Puffer her und pipettieren über den Abschnitt. Dann inkubieren Sie den Objektträger fünf Minuten lang in der Befeuchtungskammer.Zweitens, stellen Sie eine TDT-Beschriftungsmischung gemäß den Anweisungen des Kits oder einer positiven Kontrollfolie her. Fügen Sie der TDT-Markierungsmischung DNA hinzu. Bei einem negativen Kontrollobjektträger lassen Sie das TDT-Enzym aus der Mischung weg.Entfernen Sie nun mit einem Tuch so viel Puffer wie möglich vom Objektträger und pipettieren Sie ihn auf die Etikettiermischung. 50 Mikroliter sollten ausreichen. Verteilen Sie die Lösung erneut mit Paraform, ohne Blasen zu bilden.Lassen Sie den Objektträger nun eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in der Kammer inkubieren. Drittens, stellen Sie den Puffer mit einem x Stopp gemäß den Anweisungen des Kits her. Nachdem Sie die Markierungsmischung mit dem Labortuch entfernt haben, fügen Sie zwischen zwei und 300 Mikroliter der Stoppmischung hinzu, um den Abschnitt vollständig zu bedecken.Dann inkubieren Sie den Objektträger fünf Minuten lang in der Kammer. In diesem Schritt wird kein Parafilm verwendet. Um den Stopppuffer zu entfernen, verwenden Sie zwei zweiminütige Wäschen in PBS.Pipettieren Sie nun 50 Mikroliter frisch zubereitete Fluorescein-Markierungslösung. Auf den Objektträger Perfil auftragen und 20 Minuten in der Kammer inkubieren, jetzt jedoch im Dunkeln. Entfernen Sie die Markierungslösung mit einer einzigen zweiminütigen Wäsche in PBS, während Sie einige Haken verdünnen.3 3, 2, 5 8 bis ein Mikrogramm pro Milliliter in PBS. Bedecken Sie die Abschnitte nach dem Waschen mit einem bis 200 Mikrolitern der verdünnten Hakenlösung. Inkubieren Sie dann den Objektträger fünf Minuten lang, vor Licht geschützt, um die Haken zu entfernen, um Flecken zu erzeugen, und verwenden Sie drei fünfminütige Wäschen in PBS.Trocknen Sie dann den Objektträger vorsichtig mit einem Labortuch ab und bringen Sie einen Deckslip für die Bildgebung an. Bilden Sie den Schnitt mit dpi-, fitzy- und texanischen Rotfiltern ab, um die Hakenflecken-, Tunnelflecken- und Autofluoreszenzsignale in einem einzigen Bild in drei Falschfarbenkanäle zu unterteilen. Standardisieren und pflegen Sie die gleichen Bildgebungseinstellungen für alle Objektträger, damit sie leicht verglichen werden können.Verwenden Sie keine automatischen Belichtungs- oder Verstärkungseinstellungen als anatomische Referenz. Verwenden Sie ein helles Hellfeldbild eines benachbarten Abschnitts der hinteren Gliedmaßen, der in der Bildanalysesoftware mit h und e gefärbt wurde. Deaktivieren Sie den Tunnelkanal.Zeichnen Sie dann manuell den Umriss des zu quantifizierenden Muskelbereichs mit den anderen Kanälen nach. Wandeln Sie den nachgezeichneten Bereich in eine Maske um. Schalten Sie dann den Tunnelkanal wieder ein und passen Sie den minimalen Intensitätsschwellenwert an, um das autofluoreszierende Signal auszuschließen.Verwenden Sie denselben Schwellenwert für alle in der Studie analysierten Abschnitte. Konvertieren Sie als Nächstes die Schwellenwertpixel in eine Maske. Kombinieren Sie in jedem Bild die Muskelbereichsmaske und die Schwellentunnelmaske.Dadurch wird das Tunnelsignal innerhalb des verfolgten Muskelbereichs dargestellt. Quantifizieren Sie nun die kombinierte Maske, um die Anzahl der tunnelpositiven Objekte und die gesamte Pixelfläche des Tunnelsignals innerhalb des Muskels zu bestimmen. Verwenden Sie diese Werte für die statistische Analyse.Tunnelpositive Objekte mit geringer Vergrößerung können als helle, unregelmäßige Fragmente in der Skelettmuskulatur erscheinen. Bei höherer Vergrößerung sollten jedoch einige tunnelpositive Objekte mit der klassischen apoptotischen Morphologie beobachtet werden, wenn der Zelltodtyp diese Apoptose beinhaltete. Die Positivkontrolle mit zugesetzter D-DNA sollte ein reichlich positives Tunnelsignal aufweisen, das gleichmäßig über alle Gewebe verteilt ist.In dem Abschnitt. Die Negativkontrolle ohne TDT-Enzym sollte einen Hintergrund mit geringer Intensität haben und nur Autofluoreszenz zeigen. Mit dem beschriebenen Protokoll wurde festgestellt, dass Erythrozyten, Knochen- und Endothelzellen zum Autofluoreszenzsignal in den präparierten Schnitten der oberen Gliedmaßen beitrugen.Das positive Signal des echten Tunnels war viel intensiver. Es könnte mit Hilfe einer Pixelintensitätsschwelle vom autofluoreszierenden Signal isoliert werden. Eine weitere Möglichkeit, das Tunnelsignal zu isolieren, bestand darin, den roten Autofluoreszenzkanal digital vom Tunnelkanal zu subtrahieren.Mit dieser Technik wird der Zelltod der Skelettmuskulatur gestoppt. In einem Mausmodell von SMA wurde die Tunnelmarkierung in fünf Tage alten SMA-Mäusen mehr apoptotische Zellen als in Kontrollen gezeigt. Durch die Quantifizierung der Tunnelfärbung konnte gezeigt werden, dass diese Beobachtung für mehrere Muskelgruppen innerhalb der hinteren Extremität statistisch signifikant ist.Einmal gemeistert, kann die Tunneltechnik in etwa vier Stunden durchgeführt werden, um zuverlässige quantitative Ergebnisse zu erzielen.

detection-analysis-dna-damage-mouse-skeletal-muscle-situ-using-tunel

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschriebenen Protokolle verwendet werden, um den dynamischen Prozess der MG53-vermittelte Zellmembran Reparatur in ganzen Tieren und auf zellulärer Ebene sichtbar machen. Diese Methoden können auf die Zellbiologie der Plasmamembran Wiederverschließen und der regenerativen Medizin untersucht werden.

Visualisierung der MG53-vermittelte Cell Membrane Repair mit In vivo Und In-vitro- Systems

In diesem Video wird der TUNEL-Assay durchgeführt, um das Vorhandensein von apoptotischen Zellen in einer Probe nachzuweisen. In der Studie wird eine spezielle DNA-Polymerase - terminale Desoxynukleotidyltransferase - verwendet, die die Hinzufügung von markierten dUTPs an den 3'-Terminus der fragmentierten DNA katalysiert, was unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet und identifiziert werden kann.

Endtransferase-vermittelte dUTP-Nick-Endmarkierung – TUNEL-Assay: Eine In-situ-Methode zum Nachweis der DNA-Fragmentierung in apoptotischen Zellen

Elektronenspektroskopische Bildgebung kann Nukleinsäuren und Proteine mit Nanometerauflösung abbilden und unterscheiden. Es kann mit dem miniSOG-System kombiniert werden, das in der Lage ist, markierte Proteine in Transmissionselektronenmikroskopie-Proben spezifisch zu markieren. Den Einsatz dieser Technologien veranschaulichen wir am Beispiel von Doppelstrangbruch-Reparaturschwerpunkten.

Visualisierung von miniSOG Tagged DNA Reparaturproteine ​​in Kombination mit Electron spektroskopischen Bildgebung (ESI)

Aufeinanderfolgende Kryo-Abschnitte werden gesammelt, um histologische Anwendungen und Anreicherung von RNA für Genexpressionsmessungen mit benachbarten Regionen aus einer einzigen Maus Skelettmuskel ermöglichen. 30 mg gepoolt Kryoabschnitte und Messungen werden direkt im Vergleich über mehrere Anwendungen hinweg - Qualitativ hochwertige RNA wird aus 20 erhalten.

Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen

Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll, beide seneszenten erkennen und pluripotenten Stammzellen in der Skelettmuskulatur bei Verletzungen während der Induktion in Vivo Umprogrammierung. Diese Methode eignet sich für die Bewertung der Rolle der zellulären Seneszenz während der Geweberegeneration und Umprogrammierung in Vivo.

Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur

Beschrieben hier ist ein Protokoll zur direkten Immunkennzeichnung von nekrotischen Myofikern in Muskelkryosektionen. Nekrotische Zellen sind durchlässig für Serumproteine, einschließlich Immunglobulin G (IgG). Die Enthüllung der Aufnahme von IgG durch Myofiber ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von Myofiberen, die einer Nekrose unabhängig von Muskelproblemen unterzogen werden.

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muskelbiopsien

Hier schlagen wir eine Methode vor, um einzelne Muskelfasern in frühen postnatalen Entwicklungsstadien aus dem homozygoten Mutanten Lamin-Mausmodell, einem sehr schweren Modell für Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD), effizient zu erhalten.

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Die Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur ist eine praktikable Methode, um die Genexpression zu modulieren, ohne die Muskelkontraktilität bei Mäusen zu beeinträchtigen.

Elektroporation von Plasmid-DNA in die Skelettmuskulatur der Maus

Die Aufrechterhaltung der Integrität des Eizellgenoms ist notwendig, um die genetische Genauigkeit des resultierenden Embryos zu gewährleisten. Hier stellen wir ein genaues Protokoll zum Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in weiblichen Keimzellen von Säugetieren vor.

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Identifizierung und hochdimensionale Analyse von Muskelstamm- und Vorläuferzellen mittels Einzelzell-Massenzytometrie und deren Aufreinigung durch FACS für vertiefte Studien ihrer Funktion. Dieser Ansatz kann angewendet werden, um die Regenerationsdynamik in Krankheitsmodellen zu untersuchen und die Wirksamkeit pharmakologischer Interventionen zu testen.

Identifizierung und Analyse myogener Vorläuferzellen in vivo während akuter Skelettmuskelverletzung mittels hochdimensionaler Einzelzell-Massenzytometrie

Lokale Injektionen einer mitochondrialen Farbstoffbeschriftung terminaler Schwann-Zellmitochondrien in vivo zur konfokalen Mikroskopie. Diese Methode nutzt einen Proof of Concept, der im Skelettgewebe von Mäusen mit gesunden oder kranken Muskeln demonstriert wurde, um eine hochauflösende mitochondriale Visualisierung zu ermöglichen.

Methoden zur In-situ-Quantifizierung der mitochondrialen Morphologie in Muskel- und terminalen Schwannzellen von Mäusen

Lernen Sie die TUNEL-Methode zur Erkennung von DNA-Schäden und Zelltod in Maus-Skelettmuskel. Diese Technik ermöglicht eine schnelle, spezifische Quantifizierung von DNA-Brüchen mit semi-automatischer Analyse.

Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel In-situ- Verwenden der TUNEL-Methode

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