Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, reproduzierbar hochwertiges retinales Pigmentepithel (RPE) aus Stammzellen zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst induzierbare pluripotente Stammzellen zur Kofluenz gezüchtet werden. Im zweiten Schritt wird das Medium gewechselt, um die Zellen in RPE-Schicksale zu lenken.

Als nächstes werden die RPE-Zellen von den anderen differenzierten Zellen in der Schale isoliert und dann die Kulturen expandiert, bis eine ausreichende Anzahl von Zellen erhalten ist. Letztendlich können die dunkle Pigmentierung und die Kopfsteinpflastermorphologien der Kulturen verwendet werden, um zu bestätigen, dass die RPE-Zellen die terminale Differenzierung erreichen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der spontanen Differenzierung besteht darin, dass das Hinzufügen definierter Faktoren die Differenzierung und die Zeit beschleunigt und die RPE-Ausbeute erhöht.

Bis heute wurden Tausende von Nagetieren mit RPE-Zellen geheilt, die aus IPSA-verschiedenen degenerativen Netzhauterkrankungen stammen. Wenn wir dies jedoch effizient und effektiv in die Behandlung von Menschen mit diesen Krankheiten in den Kliniken umsetzen, ist es absolut unerlässlich, dass wir gut etablierte reproduzierbare Protokolle entwickeln, die uns eine hohe Qualität, hohe Zahlen von RPE-Verkäufen und IPS liefern. Die visuelle Präsentation dieser Methode ist unerlässlich, da immer nur eine Person am Mikroskop unter der Haube arbeiten kann. wodurch der Isolationsschritt schwer zu visualisieren ist. Mitchell Prince, ein Forschungstechniker aus meinem Labor, wird nun das Protokoll demonstrieren, das mit digitalen Kulturaspekten des Verfahrens verbunden ist. Um die Differenzierung der aus Stammzellen gewonnenen RPE-Kultur, der Stammzelllinie von Interesse, auf einer Schicht embryonaler Feeder-Zellen der Maus bei zwei mal 10 auf die sechs Zellen pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zu lenken, Lassen Sie die Völker die COF-Flüssigkeit erreichen und wechseln Sie dann zu täglichen Fütterungen mit Differenzierung.

Medium, ergänzt mit Nicotinamid. Beginnen Sie nach drei Wochen mit der Zugabe von active in a oder IDE one zu den Fütterungen, um die RPE-Differenzierung zu verbessern. Wechseln Sie zwei Wochen später wieder auf das Differenzierungsmedium und Nicotinamid allein und brechen Sie die täglichen Fütterungen ab.

Sobald die pH-Indikatoren im Medium am Tag nach der Fütterung nicht mehr gelb werden, stellen Sie die Kultur wieder in den Inkubator, bis Ösen der pigmentierten Zellen erscheinen, die groß genug sind, um geschnitten und entfernt zu werden. Um die pigmentierten Ösen zu isolieren, werden die Vertiefungen als nächstes beschichtet, die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit einer xenofreien Matrix, die die natürliche Zellumgebung nachahmt. Füllen Sie anschließend so viele Vertiefungen der 24-Well-Platte mit Differenzierungsmedien, wie Sie benötigen.

Und in einer Zellkulturhaube zerkleinern Sie mit einem Präparierfernrohr und einem Skalpell jede pigmentierte Öse am Boden der Originalplatte in zwei bis sechs Stücke, greifen Sie die pigmentierten Teile mit einer scharfen Pinzette und übertragen Sie dann ein bis zwei pigmentierte Stücke in jedes Stück.24. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid drei bis fünf Tage lang, bis die Zellen anhaften. Beginnen Sie dann, das Medium dreimal pro Woche zu wechseln.

Expandieren Sie die Zellen für drei bis vier Wochen in den Differenzierungsmedien. Füttern Sie die Zellen weiterhin dreimal pro Woche bis zur Passage. Die RPE fügen 200 Mikroliter vorwärmte Nicht-Trypsin-Zelldissoziationslösung bei 37 Grad Celsius hinzu, um die Zellen zu lösen.

Nach fünf bis acht Minuten stoppen Sie die Reaktion mit frischen Differenzierungsmedien und resuspendieren Sie die Kulturen dann mit einer 200-Mikroliter-Pipette in Einzelzellsuspensionen, wobei die Kolonien mit wenigen Zellen gepoolt werden. Übertragen Sie dann die dissoziierten Kolonien in 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen herunter. Durch die Resus-Suspendierung der Pellets in drei Millilitern Differenzierungsmedium werden die Kolonien jeweils in jede Vertiefung einer matrixcodierten Sechs-Well-Platte übertragen, die drei zusätzliche Milliliter Differenzierungsmedium pro Vertiefung enthält.

Expandieren Sie dann die Zellen für ein bis zwei Wochen, bis die Zellen zu etwa 90 % zusammenfließen, und lösen Sie die Zellen wieder in einem Milliliter Dissoziationslösung, wie gerade gezeigt. Dieses Mal. Übertragen Sie die Einzelzelllösung mit einer 1000-Mikroliter-Pipette zur Resuspendierung der Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Und dann, nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie das Pellet. Bei einer Differenzierung von 18 Millilitern stoßen Medien schließlich die Zellen in einem matrixkodierten Kulturbehälter ab, um die maximale Anzahl der gewünschten Zellen in der minimalen Anzahl von Passagen für die weitere nachgelagerte Analyse zu erhalten. Nach fünf bis sieben Wochen induzierbarer Kultur pluripotenter Stammzelllinien beginnen pigmentierte Kolonien zu erscheinen. Diese Völker können wochenlang weiter wachsen, wenn die Kulturen erhalten bleiben.

Sobald sie eine ausreichende Größe erreicht haben, können sie manuell herausgeschnitten werden. Eine sorgfältige Exzision zur Vermeidung einer Kontamination mit Nicht-RPE-Zellen erleichtert die Erzeugung ausreichend reiner RPE-Kulturen erheblich. Einmal gemeistert, kann eine große Anzahl von RPE-Zellen in acht bis 12 Wochen gewonnen werden, wenn die Technik richtig durchgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Kulturen bei der Herstellung von Medien und der Fütterung von Zellen nicht kontaminiert werden. Wir hoffen, dass viele von Ihnen nach dem Anschauen dieses Videos in der Lage sein werden, eine große Anzahl hochwertiger RPE-Zellen aus IPS herzustellen. Es ist zu hoffen, dass dies eine schnellere Übertragung von der Laborbank auf das Krankenbett erleichtern und zellbasierte Therapien für Patienten anbieten wird, die an derzeit nicht behandelbaren degenerativen neovaskulären Erkrankungen der Netzhaut leiden.