Name: Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Lernen Sie eine effiziente Methode zur Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen mit definierten Faktoren. Dieses Protokoll beschleunigt die Differenzierung und erhöht die Ausbeute für regenerative Therapien.

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Wir danken den folgenden Personen: Dr. Tim Krohne und Dr. Eyal Banin (zusammen mit Dr. Mandy Lehmann und David Friedlander) für ihre großzügige Hilfe bei der Entwicklung der Differenzierungsprotokolle. Dr. Felicitas Bucher leistete Unterstützung bei der Differenzierung der in dieser Studie verwendeten RPE-Zellen. Wir danken auch dem National Eye Institute (NEI-Zuschüsse EY11254 und EY021416), dem California Institute for Regenerative Medicine (CIRM-Zuschuss TR1-01219) und dem Lowy Medical Research Institute (LMRI) für die sehr großzügige Finanzierung dieses Projekts.

1. gerichteten Differenzierung von Stammzellen gewonnenen RPE Anmerkung: Alle Inkubationsschritte werden bei 37 ° C in 5% CO 2 durchgeführt <ol style="margin-left: 40px;"><li> Pflegen Sie die hES oder Hüfte Linien (täglich füttern) in Erhaltungsmedium (MM; Tabelle 1). Sobald die Leitungen ausreichende Standards der Qualitätskontrolle zu erreichen, halten sie auf einer Schicht von embryonalen Maus-Feeder-Zellen (MEFs) ausgesät mit einer Dichte von 250.000 / well eines Sechs-Well-Platte. Xeno freien Kulturen kann auch nach der von Tucker et al. 40 festgelegten Protokoll erzeugt werden. </li><li> Lassen Sie die Stammzellenkolonien zur Konfluenz erreichen. </li><li> Wechseln Sie in Differenzierungsmedium mit Nicotinamid (DM / NIC; Tabelle 1); Futter täglich. </li><li> Nach drei Wochen in der Kultur, die Differenzierung Medien wechseln mit Nicotinamid und entweder Activin-A oder IDE-1 (DM / NIC / AA oder DM / NIC / IDE1; Tabelle 1) zu RPE Differenzierung zu verbessern. </li&gt; <li> Nach fünf Wochen in der Kultur, wechseln Sie wieder in DM / NIC. Fütterungszeiten sind nicht mehr notwendig, nachdem die pH-Indikatoren in den Medien nicht mehr drehen, gelb den Tag nach der Fütterung. </li><li> Warten Sie, bis Inseln pigmentierten Zellen angezeigt werden, die groß genug sind, um geschnitten und entfernt werden (siehe Abbildungen 2D-F und 3A). </li></ol> 2. Isola pigmentierte Inseln <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bestreichen Sie die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen mit einer Matrix, die den natürlichen Zellumgebung (Xeno-frei ist vorzuziehen) nachahmt. HINWEIS: Cornea Messer und scharfen, spitzen Pinzette sind sehr nützlich für die Kommissionierung. Das gesamte Blatt von differenzierten Zellen können zu lösen, während Kommissionierung. Vermeiden Sie dies, indem Sie vorsichtig arbeiten und zunächst Kommissionierung Kolonien in der Mitte der Schale. </li><li> Füllen so viele Vertiefungen der Platte mit 24 Vertiefungen mit Differenzierungsmedium (DM; Tabelle 1), je nach Bedarf. Diese Entscheidung wird von der Anzahl der pigmentierten Kolonien hängengesammelt. </li><li> In einer Zellkultur Kapuze mit einem Binokular, von Hand ausgeschnitten pigmentierte Inselchen. Hacken jedes Inselchen an der Unterseite der Originalplatte mit einem Skalpell in etwa 2-6 Stücke und ergreifen Sie die pigmentierte Teile mit scharfen Pinzette. </li><li> Übertragen Sie 1-2 pigmentierte Stücke in jedem 24-Loch. </li><li> Medien für 3-5 Tage nicht verändern, bis die Zellen haften, dann starten verändernden Medien drei Mal pro Woche. (Wenn sie nicht nach dieser Zeit halten, ist die Wahrscheinlichkeit gut, dass sie nie tun). </li><li> Erweitern Zellen für 3-4 Wochen in Differenzierungsmedium (DM; Tabelle 1) - Ein Bild einer typischen Kultur wird in 3B gezeigt. Die Zellen können auch die gesamte noch nicht füllen, sondern wartet länger scheint nicht zu helfen. Feed-Zellen dreimal pro Woche. </li><li> Nach ca. 3 Wochen, Trauben von weißen Zellen manuell entfernen in Klumpen ggf. mit scharfen Pinzette. Diesen Schritt nicht tun, wenn es notwendig ist - es ist leicht zu Verunreinigungen einzuführen. Es ist ideal,versuchen, reinster Populationen von RPE von den ursprünglichen pigmentierte Kolonien in Schritt 1.6 erhalten. </li></ol> 3. Passagieren Stammzellen gewonnenen RPE <ol style="margin-left: 40px;"><li> Lösen die Zellen mit 200 &amp; mgr; l mit einer Zelldissoziationslösung (vorzugsweise nicht Trypsin ein Reagens, inaktiviert durch Verdünnung ist bevorzugt werden) bei 37 ° C für 5-8 min, und inaktivieren es durch Verdünnen mit DM. Verwenden Sie ein 200 ul Pipette abzuwaschen alle Zellen und sie wieder zu suspendieren (Wenn der gewählte und nur wenige Zellen enthält, sollten Sie die Bündelung der Zellen, die aus zwei 24-Brunnen). </li><li> Zentrifuge (800 xg für 5 min), Überstand verwerfen, und resuspendieren in 3 ml DM-Medien. </li><li> Wiederplatte Zellen aus einem (oder zwei) 24-Vertiefungen in einer Matrix beschichtet mit 6 Vertiefungen in 3 ml DM pro Napf (1: 5 Expansion). </li><li> Erweitern für 1-2 Wochen, bis sich die Zellen ~ 90% konfluent; ein Bild der ausdifferenzierten reine Kultur ist in 3C gezeigt. </li><li> Trennen Sie die Zellen mit 1 ml Zell dissociation Lösung für ca. 5-8 Minuten bei 37 ° C, zu inaktivieren es durch Verdünnen mit DM, verwenden Sie 1000 ul Pipette abzuwaschen alle Zellen und Resuspendieren sie. </li><li> Spin down (800 xg für 5 min), Überstand verwerfen und Resuspension in 18 ml DM-Medien. </li><li> Wiederplatte Zellen von einer 6-well jeder in sechs Matrix beschichteten 6-wells in 3 ml DM pro Napf (1: 6 Expansion) oder einer beschichteten 75 cm 2 -Kolben (1: 7.5 Expansion). </li><li> Die Schritte 3,4-3,8 wie nötig, bis genügend Zellen erhalten werden. HINWEIS: Versuchen Sie so viele Kolonien wie möglich für die Expansion und nicht planen, die Kulturen über Passagierung zu verstärken, da jeder Durchgang induziert RPE Entdifferenzierung zu sammeln. </li></ol>

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Keiner der Autoren hat kommerzielle Angaben zu machen.

In diesem Manuskript wir einen Überblick über die Schritte, um eine große Anzahl von reinen iPS-RPE Kulturen effizient zu erzeugen. Wir haben bereits mit dieser gerichtet Differenzierung Protokoll mit Activin A, die wir iPS-RPE, die stark ähneln hRPE basierend auf Transkriptom, Proteomik, Metabolomik und Funktionalität zu generieren gezeigt, und dass sie zu verzögern Netzhautdegeneration, wenn in RCS Ratten implantiert 12,31,32 . Der Prozess der Erzeugung iPS-RPE ist zeitaufwendig, aber nicht mühsam (...

Die verschiedenen Zelltypen, die die Netzhaut besetzen, sind in einer funktionalen Architektur organisiert. Die Photorezeptoren im hinteren Teil der Netzhaut sind dafür verantwortlich, Licht durch Phototransduktion in elektrische Impulse umzuwandeln. Die Phototransduktion kann jedoch nicht ohne die koordinierten Bemühungen anderer benachbarter Zelltypen wie Mueller-Gliazellen und retinaler Pigmentepithelzellen (RPE) stattfinden. Eine Monoschicht aus RPE-Zellen trennt die sensorische Netzhaut von der Choriokapillaris, der primären Blutversorgung für Photorezeptoren, und ist ideal positioniert, um mehrere Funktionen zu steuern, die für die Photorezeptorhomöostase wichtig sind. Tatsächlich sind das RPE und die Photorezeptoren so voneinander abhängig, dass sie weithin als eine einzige funktionelle Einheit angesehen werden. (Für einen Überblick über alle verschiedenen Funktionen des RPE siehe Strauss, 20051.) Der Tod oder die Funktionsstörung der retinalen Pigmentepithelzellen kann die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) auslösen, die in den Industrieländern die Hauptursache für dauerhaften Sehverlustist 2-4. 
AMD ist eine multifaktorielle Erkrankung des RPE, der Photorezeptoren und des choroidalen Gefäßsystems; die Risikofaktoren sind vielfältig und umfassen Kombinationen von Umwelteinflüssen und genetischen Einflüssen5,6. Die Behandlungsmöglichkeiten für AMD sind sehr begrenzt, aber eine vielversprechende mögliche Therapie ist der RPE-Zellersatz7,8. Obwohl die Ergebnisse gemischt sind, hat die Transplantation von RPE-Zellen bei AMD-Patienten (und bei anderen Patienten mit Netzhautdegeneration) und auch bei Nagetiermodellen der Netzhautdegeneration das Potenzial, eine signifikante Photorezeptoratrophie vorübergehend zu verhindern9-23. (Das Tiermodell, das üblicherweise für diese Studien verwendet wird, sind Ratten des Royal College of Surgeons (RCS), die eine Mutation im MerTK-Gen aufweisen. Diese Mutation macht RPE-Zellen unfähig, die äußeren Photorezeptorsegmente zu phagozytieren und fördert die Degeneration der Netzhaut24.) Während die berichteten Überlebensraten von implantiertem RPE im subretinalen Raum von RCS-Ratten und -Mäusen stark variieren, besteht das Potenzial, dass sie mehrere Monate oder Jahre überleben9,10,12,20. 
RPE-Zellen können in ausreichender Anzahl für eine Transplantation gewonnen werden, indem sie aus pluripotenten Stammzellen9-14,25-28 gewonnen werden. Mehrere unabhängige Gruppen haben gezeigt, dass diese Zellen auf ähnliche Weise wie ihre somatischen Gegenstücke funktionieren, und Langzeitstudien deuten darauf hin, dass sie bei der Implantation in Ratten- und Mauskrankheitsmodellensicher sind 9,10,12,14,19,20,25,29-32. Die Verwendung von induzierten pluripotenten Stammzellen anstelle von embryonalen Stammzellen kann vorteilhaft sein, da ethische Fragen und immunologische Herausforderungen im Zusammenhang mit allogener RPE vermieden werden können33,34. Eine weitere spannende Anwendung für die iPS-Technologie ist die Krankheitsmodellierung35. Die Fähigkeit, eine große Anzahl von RPE-Zellen von Patienten mit RPE-Erkrankungen zu untersuchen, könnte für das Verständnis ihrer molekularen Grundlagen von unschätzbarem Wert sein. Diese Art von Studie wurde kürzlich mit Morbus Best Patient RPE durchgeführt und könnte den Weg für ähnliche Studien zu erblichen Makulopathien ebnen36. 
Die Gewinnung von RPE aus Stammzellen ist ein relativ einfacher Prozess und kann vollständig unter xenofreien Bedingungen durchgeführt werden. Die einfachste Strategie besteht darin, Monoschichten von RPE-Zellen spontan zu gewinnen, die Ausbeute kann jedoch durch gezielte Differenzierungstechniken deutlich verbessert werden. Diese Techniken beinhalten jedoch die Verwendung exogener Proteinfaktoren, die teuer sein können und oft in Bakterien oder anderen nicht-menschlichen Quellen erzeugt werden10,12,37. In unseren Studien folgten wir einem etablierten Protokoll10, das Nicotinamid und Activin A verwendet, einen Signalfaktor, der sich für die RPE-Spezifikation als ausreichend erwiesen hat38. Hier wird gezeigt, dass das niedermolekulare IDE-1 Activin A adäquat ersetzen kann, wodurch die Kosten gesenkt und die Bedenken im Zusammenhang mit der Verwendung rekombinanter Proteine gelindertwerden 39. Zusätzlich verwenden wir einen xenofreien Serumersatz und kultivieren die differenzierenden RPE-Zellen auf einem synthetischen xenofreien Substrat. Es wurde bereits gezeigt, dass RPE-Zellen mit diesem Ansatz sehr effektiv differenzierenkönnen 40.
Wenn wir als Monoschicht differenziert werden, visualisieren wir pigmentierte Kolonien, die RPE-Zellen enthalten, bereits nach fünf Wochen12. Sobald sie eine ausreichende Größe erreicht haben, können sie manuell herausgeschnitten und zur Expansion in eine andere Schale übertragen werden. RPE-Zellen sind berüchtigt dafür, dass sie sich mit jeder Passage dedifferenzieren, und die Verwendung von allem, was älter als fünf Passagen ist, sollte vermieden werden (wir stellen fest, dass eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Charakterisierung und Transplantation in Tiermodellen nach zwei oder drei Passagen leicht erzeugt werden kann). Sobald sie vollständig differenziert sind, setzen wir mehrere Techniken ein, um die Zellen anatomisch und funktionell zu charakterisieren und sicherzustellen, dass sie als adäquater Ersatz für erkrankte RPE dienen. Die Beschreibung dieser Techniken und das Protokoll für die Implantation des iPS-RPE in den subretinalen Raum von Nagetieren gehen über den Rahmen dieser Methodenarbeit hinaus und wurden bereits veröffentlicht12,32,41. 
Während die Entwicklung standardisierter Protokolle für die effektive Ableitung von iPS-RPE für die Kliniken eindeutig wichtig ist, gibt es auch noch erhebliche präklinische Arbeit in Tiermodellen zu leisten. Es gibt Bedenken hinsichtlich der Immunogenität von iPS-abgeleiteten Zellen, und es werden mehrere verschiedene Implantationstechniken untersucht, einschließlich der Implantation von Zellen auf künstliche Substrate42,43. Aus diesen Gründen sind wir der Meinung, dass die Veröffentlichung standardisierter Protokolle von Vorteil ist, um sowohl klinische als auch präklinische Studien zu erleichtern. Vor allem, wenn direkte Vergleiche von iPS-RPE-Zellen durchgeführt werden, die in verschiedenen Labors von verschiedenen Forschungsgruppen gewonnen wurden.

<table><tbody><tr><td>Hornhautmesser&nbsp;</td><td>Surgipro</td><td>SPOI-070</td><td>Messer x 1</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td>500 ml x 4&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1X ohne Ca oder Mg</td><td>VWR</td><td>45000-434</td><td>500 ml x 6</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, regulär (hitzeinaktiviert)</td><td>VWR</td><td>45000-736</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 10-155) Rekombinante Human Protein</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0021</td><td>100 &micro; g x 1</td></tr><tr><td>IDE-1</td><td>Stemgent</td><td>04-0026</td><td>2 mg x 1</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Ersatz</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>500 ml x 1</td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>MEM Lösung nicht-essentieller Aminosäuren 100X&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>100 ml x 1</td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636-100G</td><td>100 g x 1</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td>20 ml x 1</td></tr><tr><td>rekombinantes Aktivin für Mensch/Maus/Ratte</td><td>PeproTech</td><td>120-14E</td><td>10 & Mikro; g x 2</td></tr><tr><td>Synthemax-T Surface 6 Well Platten</td><td>Corning</td><td>3877</td><td>Gehäuse(12) x 1</td></tr><tr><td>TrypLE-Express Enzym (1X), kein Phenolrot&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12604-021</td><td>500 ml x 1&nbsp;</td></tr><tr><td>Vakuumfilter-/Vorratsflaschensystem, 0,1&Mikro; M Pore, 500ml&nbsp;</td><td>Corning</td><td>431475</td><td>Gehäuse(12) x 1&nbsp;</td></tr></tbody></table>

effiziente ableitung von retinapigmentepithel-zellen aus stammzellen

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Es wurde keine Heilung für altersbedingte Makuladegeneration (AMD) entdeckt, die Hauptursache für Sehverlust bei Menschen über 55 Jahren. AMD ist eine komplexe multifaktorielle Erkrankung mit unbekannter Ätiologie, obwohl man weitgehend davon ausgeht, dass sie aufgrund des Todes oder einer Funktionsstörung des retinalen Pigmentepithels (RPE) auftritt, einer Monoschicht von Zellen, die der Netzhaut zugrunde liegt und die Photorezeptoren entscheidend unterstützt. RPE-Zellersatzstrategien können vielversprechend sein, um einer großen Untergruppe von AMD-Patienten therapeutische Linderung zu verschaffen, und RPE-Zellen, die primären menschlichen Zellen (hRPE) stark ähneln, wurden in mehreren unabhängigen Labors erzeugt, einschließlich unseres eigenen. Darüber hinaus beschränken sich die Einsatzmöglichkeiten von iPS-RPE nicht nur auf zellbasierte Therapien, sondern wurden auch zur Modellierung von RPE-Erkrankungen eingesetzt. Diese Art von Studien kann nicht nur die molekularen Grundlagen der Krankheiten aufklären, sondern auch als unschätzbare Werkzeuge für die Entwicklung und Erprobung neuartiger Medikamente dienen. Wir stellen hier ein optimiertes Protokoll zur gerichteten Differenzierung von RPE aus Stammzellen vor. Die Zugabe von Nicotinamid und entweder Activin A oder IDE-1, einem kleinen Molekül, das seine Wirkung nachahmt, zu bestimmten Zeitpunkten, erhöht die Ausbeute von RPE-Zellen erheblich. Mit dieser Technik können wir bereits in drei Monaten eine große Anzahl von RPE mit geringer Passage ableiten.

Die in diesem Manuskript dargelegt, wie in 1 dargestellt Schritten kann verwendet werden, um ohne weiteres erzeugen RPE aus Stammzellen, wie zuvor berichtet 10,12 werden. Nach Aufrechterhaltung der iPS-Linien für mehrere Wochen, beginnen pigmentierte Kolonien nach 5-7 Wochen (7 Wochen alten Kulturen werden in 2A-C gezeigt) in den Kolonien erscheinen. Diese Kolonien können weiterhin für Wochen wachsen die Kulturen gehalten. Nach Erzielung einer ausreichenden Größe, wie in <str...

Aus Stammzellen gewonnene retinale Pigmentepithelzellen (RPE) können für mehrere Anwendungen verwendet werden, einschließlich zellbasierter Therapien für Netzhautdegeneration, Krankheitsmodellierung und Medikamentenstudien. Hier stellen wir ein einfaches Protokoll zur reproduzierbaren Gewinnung von RPE aus Stammzellen vor.

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, reproduzierbar hochwertiges retinales Pigmentepithel (RPE) aus Stammzellen zu gewinnen. Dies wird erreicht, indem zunächst induzierbare pluripotente Stammzellen zur Kofluenz gezüchtet werden. Im zweiten Schritt wird das Medium gewechselt, um die Zellen in RPE-Schicksale zu lenken.Als nächstes werden die RPE-Zellen von den anderen differenzierten Zellen in der Schale isoliert und dann die Kulturen expandiert, bis eine ausreichende Anzahl von Zellen erhalten ist. Letztendlich können die dunkle Pigmentierung und die Kopfsteinpflastermorphologien der Kulturen verwendet werden, um zu bestätigen, dass die RPE-Zellen die terminale Differenzierung erreichen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der spontanen Differenzierung besteht darin, dass das Hinzufügen definierter Faktoren die Differenzierung und die Zeit beschleunigt und die RPE-Ausbeute erhöht.Bis heute wurden Tausende von Nagetieren mit RPE-Zellen geheilt, die aus IPSA-verschiedenen degenerativen Netzhauterkrankungen stammen. Wenn wir dies jedoch effizient und effektiv in die Behandlung von Menschen mit diesen Krankheiten in den Kliniken umsetzen, ist es absolut unerlässlich, dass wir gut etablierte reproduzierbare Protokolle entwickeln, die uns eine hohe Qualität, hohe Zahlen von RPE-Verkäufen und IPS liefern. Die visuelle Präsentation dieser Methode ist unerlässlich, da immer nur eine Person am Mikroskop unter der Haube arbeiten kann. wodurch der Isolationsschritt schwer zu visualisieren ist. Mitchell Prince, ein Forschungstechniker aus meinem Labor, wird nun das Protokoll demonstrieren, das mit digitalen Kulturaspekten des Verfahrens verbunden ist. Um die Differenzierung der aus Stammzellen gewonnenen RPE-Kultur, der Stammzelllinie von Interesse, auf einer Schicht embryonaler Feeder-Zellen der Maus bei zwei mal 10 auf die sechs Zellen pro Vertiefung einer Sechs-Well-Platte zu lenken, Lassen Sie die Völker die COF-Flüssigkeit erreichen und wechseln Sie dann zu täglichen Fütterungen mit Differenzierung.Medium, ergänzt mit Nicotinamid. Beginnen Sie nach drei Wochen mit der Zugabe von active in a oder IDE one zu den Fütterungen, um die RPE-Differenzierung zu verbessern. Wechseln Sie zwei Wochen später wieder auf das Differenzierungsmedium und Nicotinamid allein und brechen Sie die täglichen Fütterungen ab.Sobald die pH-Indikatoren im Medium am Tag nach der Fütterung nicht mehr gelb werden, stellen Sie die Kultur wieder in den Inkubator, bis Ösen der pigmentierten Zellen erscheinen, die groß genug sind, um geschnitten und entfernt zu werden. Um die pigmentierten Ösen zu isolieren, werden die Vertiefungen als nächstes beschichtet, die Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit einer xenofreien Matrix, die die natürliche Zellumgebung nachahmt. Füllen Sie anschließend so viele Vertiefungen der 24-Well-Platte mit Differenzierungsmedien, wie Sie benötigen.Und in einer Zellkulturhaube zerkleinern Sie mit einem Präparierfernrohr und einem Skalpell jede pigmentierte Öse am Boden der Originalplatte in zwei bis sechs Stücke, greifen Sie die pigmentierten Teile mit einer scharfen Pinzette und übertragen Sie dann ein bis zwei pigmentierte Stücke in jedes Stück.24. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid drei bis fünf Tage lang, bis die Zellen anhaften. Beginnen Sie dann, das Medium dreimal pro Woche zu wechseln.Expandieren Sie die Zellen für drei bis vier Wochen in den Differenzierungsmedien. Füttern Sie die Zellen weiterhin dreimal pro Woche bis zur Passage. Die RPE fügen 200 Mikroliter vorwärmte Nicht-Trypsin-Zelldissoziationslösung bei 37 Grad Celsius hinzu, um die Zellen zu lösen.Nach fünf bis acht Minuten stoppen Sie die Reaktion mit frischen Differenzierungsmedien und resuspendieren Sie die Kulturen dann mit einer 200-Mikroliter-Pipette in Einzelzellsuspensionen, wobei die Kolonien mit wenigen Zellen gepoolt werden. Übertragen Sie dann die dissoziierten Kolonien in 15-Milliliter-Röhrchen und schleudern Sie die Zellen herunter. Durch die Resus-Suspendierung der Pellets in drei Millilitern Differenzierungsmedium werden die Kolonien jeweils in jede Vertiefung einer matrixcodierten Sechs-Well-Platte übertragen, die drei zusätzliche Milliliter Differenzierungsmedium pro Vertiefung enthält.Expandieren Sie dann die Zellen für ein bis zwei Wochen, bis die Zellen zu etwa 90 % zusammenfließen, und lösen Sie die Zellen wieder in einem Milliliter Dissoziationslösung, wie gerade gezeigt. Dieses Mal. Übertragen Sie die Einzelzelllösung mit einer 1000-Mikroliter-Pipette zur Resuspendierung der Zellen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.Und dann, nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, suspendieren Sie das Pellet. Bei einer Differenzierung von 18 Millilitern stoßen Medien schließlich die Zellen in einem matrixkodierten Kulturbehälter ab, um die maximale Anzahl der gewünschten Zellen in der minimalen Anzahl von Passagen für die weitere nachgelagerte Analyse zu erhalten. Nach fünf bis sieben Wochen induzierbarer Kultur pluripotenter Stammzelllinien beginnen pigmentierte Kolonien zu erscheinen. Diese Völker können wochenlang weiter wachsen, wenn die Kulturen erhalten bleiben.Sobald sie eine ausreichende Größe erreicht haben, können sie manuell herausgeschnitten werden. Eine sorgfältige Exzision zur Vermeidung einer Kontamination mit Nicht-RPE-Zellen erleichtert die Erzeugung ausreichend reiner RPE-Kulturen erheblich. Einmal gemeistert, kann eine große Anzahl von RPE-Zellen in acht bis 12 Wochen gewonnen werden, wenn die Technik richtig durchgeführt wird.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Kulturen bei der Herstellung von Medien und der Fütterung von Zellen nicht kontaminiert werden. Wir hoffen, dass viele von Ihnen nach dem Anschauen dieses Videos in der Lage sein werden, eine große Anzahl hochwertiger RPE-Zellen aus IPS herzustellen. Es ist zu hoffen, dass dies eine schnellere Übertragung von der Laborbank auf das Krankenbett erleichtern und zellbasierte Therapien für Patienten anbieten wird, die an derzeit nicht behandelbaren degenerativen neovaskulären Erkrankungen der Netzhaut leiden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In diesem Video zeigen wir Ihnen, wie Sie retinalen Stammzellen aus dem Ciliarepithels der Maus Auge zu isolieren und zu wachsen sie in Kultur zu klonalen Netzhaut Kugeln zu bilden. Die Kugeln, die isoliert besitzen den Kardinal Eigenschaften von Stammzellen: Selbsterneuerung und multipotentiality.

Isolierung von Retinal Stammzellen aus der Maus Eye

Die microRNA (miRNA)-Profile der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen), retinale Pigmentepithel (RPE) aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) (iPS-RPE) und fetale RPE abgeleitet, wurden verglichen.

MicroRNA Expressionsprofile der Menschen iPS-Zellen, Retinapigmentepithel Abgeleitet aus iPS und Fetal Retinapigmentepithel

Hier präsentieren wir ein von der Community akzeptiertes Protokoll im Multimedia-Format für die subretinale Injektion eines Bolus von RPE-Zellen in Ratten und Mäuse. Dieser Ansatz kann zur Bestimmung von Rettungspotenzialen, Sicherheitsprofilen und Überlebenskapazitäten von transplantierten RPE-Zellen nach Implantation in Tiermodellen der Netzhautdegeneration verwendet werden.

Darstellende Subretinale Injektionen in Nagetiere zu retinalen Pigmentepithelzellen in Suspension liefern

Das Ziel dieses Berichts ist es, die Protokolle zu beschreiben, um die retinale Pigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) mit unterschiedlichen Größen Embryoidkörpern abzuleiten.

Ableiten Retinapigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von verschiedenen Größen von Embryoidkörpern

Dieses Protokoll beschreibt die retinalen Pigment Epithelzellen (RPE) aus pluripotenten Stammzellen zu produzieren. Die Methode verwendet eine Kombination von Wachstumsfaktoren und kleine Moleküle, um die Differenzierung von Stammzellen in unreifen RPE in vierzehn Tagen und Reifen, funktionale RPE nach drei Monaten zu lenken.

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur retinalen Pigmentepithels (RPE) Pigmentzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen tragen Patienten abgeleitet Mutationen zu unterscheiden. Die mutierten Zelllinien können für Funktionsanalysen einschließlich Immunoblotting, Immunfluoreszenz und Patch-Clamp verwendet werden. Dieser Krankheit im Gericht Ansatz umgeht die Schwierigkeit, native menschlichen RPE-Zellen.

Differenzierung, Wartung und Analyse der menschlichen Retina Pigment Epithelzellen: eine Krankheit im Gericht-Modell für BEST1 Mutationen

Wir beschreiben eine Methode um eine netzhautgewebe bestehend aus retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gezüchtet auf menschliche amniotic Membranen und deren Vorbereitung für die Verpflanzung in Tiermodellen zu konstruieren.

Engineering-Transplantation geeignet retinalen Pigment Epithel Gewebe abgeleitet aus humanen embryonalen Stammzellen

Hier beschreiben wir ein optimiertes retinale Organoid-Induktionssystem, das für verschiedene humane pluripotente Stammzelllinien geeignet ist, netzhautähnliche Gewebe mit hoher Reproduzierbarkeit und Effizienz zu erzeugen.

Retinale Organoid-Induktionssystem zur Ableitung von 3D-Netzhautgewebe aus humanen pluripotenten Stammzellen

Der nicht-menschliche Primat (NHP) ist aufgrund der anatomischen und genetischen Ähnlichkeiten ein ideales Modell für die Untersuchung der zellulären Therapeutika der menschlichen Netzhaut. Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur submakulären Transplantation von retinalen Pigmentepithelzellen im NHP-Auge und Strategien zur Verhinderung intraoperativer Komplikationen im Zusammenhang mit der Makulamanipulation.

Retinale Pigmentepitheltransplantation in einem nicht-menschlichen Primatenmodell für degenerative Netzhauterkrankungen

Diese Studie liefert ein detailliertes Protokoll für die effiziente Kryokonservierung von aus menschlichen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen.

Kryokonservierung von aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnenen retinalen Pigmentepithelzellen im optimalen Stadium

Das retinale Pigmentepithel (RPE) fungiert als entscheidende Barriere zwischen Aderhaut und Netzhaut und fördert die Gesundheit und Funktion von retinalen Zelltypen, wie z. B. Photorezeptoren. Darin beschreiben wir ein einfaches und effektives Protokoll zur Isolierung und Kultivierung adulter muriner RPE.

Eine vereinfachte Methode zur Isolierung und Kultivierung von retinalen Pigmentepithelzellen aus erwachsenen Mäusen

Lernen Sie eine effiziente Methode zur Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen mit definierten Faktoren. Dieses Protokoll beschleunigt die Differenzierung und erhöht die Ausbeute für regenerative Therapien.

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

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