Name: Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Erfahren Sie die kontinuierliche Nährstoffzufuhr für Mammalzell-Sphäroide in Rührreaktor-Bioreaktoren. Diese Methode verbessert Wachstumsraten und ermöglicht groß angelegte Zellkulturen für zelluläre Therapien.

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Die Autoren danken Michael Garwood und Sam Stein für ihre hilfreichen Kommentare und Kristen M. Maynard für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung des Manuskripts.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Erzeugen von Säugerzellprodukten für die Herstellung von biologischen Wirkstoffen und für die Zelltherapie erfordert die Kultur und Überwachung von Säugetierzellen in großem Maßstab 55-58. Außerdem rufen diese Anwendungen für die Kulturbedingungen definiert und validiert. Erhöhung einfach das Volumen der Zellen Forschungstechnologien werden alle diese Anforderungen nicht erfüllen. Manuelle Medium Änderungen Schwankungen an Nährstoffen und Anhäufung von Abfallprodukten reduzieren Zellqual...

Um eine große Zahl von lebensfähigen und funktionellen humanen Zellen für eine Transplantation zu erzeugen, die Regulierung der Kulturbedingungen ist zwingend notwendig. Depletion von Nährstoffen sowie Anhäufung von Stoffwechselschlacken sind die Hauptursachen von Seneszenz und metabolischen Veränderungen, die die Qualität des Zellprodukt 1 reduzieren - 3. Dieses Verfahren veranschaulicht ein Verfahren zur Kultur von Säugerzellen in Sphäroide einen gerührten Bioreaktor mit einer eingestellten Rate Perfusion Zuführsystem Glukose zu regulieren in einem physiologischen Bereich 4 während der gesamten Dauer der Kultur kombiniert werden. Für den Zweck dieser Studien wurde die physiologischen Bereich zwischen 100 und 200 mg / dl definiert. Die gleichen Verfahren können verwendet werden, um andere Nährstoffe und Stoffwechselschlacken regulieren wie Lactat. Statische Kulturen in kleinen Mengen (1 bis 30 ml) werden typischerweise in der Laborumgebung verwendet zu erhalten und Zelllinien für Experime differenzierenntal Zwecke. Zell Passagierung wird mit vollständigem Medium Änderungen durchgeführt, wie in regelmäßigen Abständen erforderlich. Die meisten &quot;konventionellen&quot; Kulturmedium hat eine hohe Glukosekonzentration (450 mg / dl für DMEM in diesen Studien verwendet) für weniger häufigen Medienwechsel, ohne das Risiko von Nährstoffbegrenzungen zu ermöglichen. Allerdings ist diese batch-Einspeisung Verfahren erfordert noch häufige Manipulation führt Variabilität in der Zellumgebung und erhöht das Risiko einer Kontamination von 5 bis 9. Gerührte Suspension Bioreaktoren (SSB) eine bessere Durchmischung sorgen und verringerte 3,10 Handhabung - 20, aber wie statische Kulturen, erfordern eine manuelle Medium Änderungen, die potenziell schädlichen Schwankungen Nährstoff- und Abfallprodukt Niveaus beitragen. Perfusions-Fütterung von SSB Kulturen reduziert diese Probleme durch eine kontinuierliche Infusion und Entfernung von Medium, aber große Veränderungen in der Nährstoffgehalt aufgrund des Zellwachstums bleiben ein Problem. Die Verwendung einer angepassten Fütterung rate aus Berechnungen der Nährstoffnutzung auf Basis der geschätzten Zell Anforderungen können die stabilen Zellumgebung bieten erforderlich die Lebensfähigkeit der Zellen zu optimieren und Funktion 21-24. Es gibt eine große Menge an Literatur beschreibt Methoden für skalierbare SSB Kulturen von Säugetierzellen spezifisch für Kultur und Expansion von pluripotenten Zellen 25 - 32, mit anderen auf Insel konzentriert (beta) Zellen 17,33,34, oder die Produktion von biologischen Produkten 24, 35-38. Viele dieser untersuchten Zelltypen können in Sphäroid-Kulturen und spezifische Verfahren für den Zelltyp sollte die Implementierung einer kontinuierlichen Zuführungssystem vor optimiert werden verwendet wird gezüchtet werden. In dieser Demonstration wurde eine Perfusion Fütterungsmethode verwendet , um eine Beta - Zelllinie als Sphäroiden in einem gerührten Bioreaktor 39 gewachsen zu erweitern - 43. Das hier beschriebene Verfahren stellt eineinfache Implementierung Kursanpassungen der Fütterung auf Basis von Messungen off-line Glucose gezielte Kulturbedingungen zu erreichen. Einstellen der Vorschubgeschwindigkeit mit dieser Methode eine physiologische Zuckerspiegel aufrecht zu erhalten ist zu einem Anstieg Zellausbeuten gezeigt. Säugerzellen sind abhängig von einem Schlüsselnährstoff, Glukose, für die Energieproduktion, so dass die Verwendung dieser Zelllinie stellt ein Modell für viele kultivierten Säugetierzellen 44. Darüber hinaus beispielhaft für diese Linie die weitere Komplexität der Beta - Zellen, die Glukose zu chronisch hohen Niveaus von 45 empfindlich sind. Für diese Studie wurden β-TC6 Zellen erlaubt Sphäroide in der Kultur zu bilden , die durchschnittliche Größe der Langerhans&#39;schen Inseln in vivo zu approximieren. Die Perfusionsbioreaktorsystem System 17 - 19,21,46 mit einer Vorschubgeschwindigkeit eingestellt Verbrauch zu Glukose, führte zu physiologischen Bedingungen zu erhalten und höhere Zellausbeuten ohne Veränderungen der Lebensfähigkeit.

<table><tbody><tr><td>&#946; TC-6 Zellen</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>CRL-11506</td><td>Maus-Insulinom-Zelllinie (adhärenter Zelltyp)</td></tr><tr><td>DPBS Kein Ca, Kein Mg</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>14190-144</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=Suche-14190144">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144</a></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td>Produktnummern siehe unten&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM mit hohem Glukosegehalt (500 mM)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11965-092</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092</a></td></tr><tr><td>DMEM mit niedrigem Glukosegehalt (100 mM)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11885-084</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084%20(note%20that%20this%20medium%20already%20contains%20pyruvat)">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (beachten Sie, dass dieses Medium bereits Pyruvat enthält)</a></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>25030081</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=Suchprodukt">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=Suche-Produkt</a></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat-Invitrogen</td><td>, Carlsbad, Kalifornien</td><td>11360070</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=Suchprodukt">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>Hitzeinaktiviertes Schweineserum</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>10082147</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147</a></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>25200056</td><td><ein href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=Suchprodukt">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>T-150 Mit Gewebekulturen behandelte Kolben</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>430825</td><td>http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) & categoryname=</td></tr><tr><td>NuAire Zellkultur-Inkubator</td><td>Princeton, MN</td><td></td><td>US Autoflow. Es kann jeder wasserummantelte CO2-regulierende Zellkultur-Inkubator verwendet werden.</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td></td><td></td><td>Sorvall RT 7 (Jede ähnliche Tischzentrifuge kann verwendet werden)</td></tr><tr><td>Kühlschrank</td><td></td><td></td><td>Jeder Laborkühlschrank kann verwendet werden (für diese Studien wurde eine kleine Tischversion verwendet)</td></tr><tr><td>1 L Glasflasche</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>1395-1L</td><td>Jeder Anbieter kann verwendet werden. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Biowissenschaften) & categoryname=</td></tr>2 <tr><td>L Glasflasche</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>1395-2L</td><td>Jeder Anbieter könnte</td></tr><tr><td>250 ml gerührte Bioreaktoren verwenden&nbsp;</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>4500-250</td><td>http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Biowissenschaften) & categoryname=</td></tr><tr><td>Rührplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-496-104A</td><td>Jede inkubatorsichere Rührplatte kann verwendet werden, jeder Anbieter</td></tr><tr><td>Gewebekulturschalen 100 mm Durchmesser</td><td>Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)</td><td>1256598&nbsp;</td><td>Jeder Anbieter kann verwendet werden (bestellt über Fisher Sci)</td></tr><tr><td>FALCON 50 ml konische Röhrchen</td><td>Falcon, San Jose, CA</td><td>1256598</td><td>Jeder Anbieter kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Delran Kunststoff Wird für kundenspezifische Teile</td><td>verwendet McMaster Carr</td><td>Verschiedenes</td><td>Jedes Material der Wahl kann verwendet werden, aber Deran wird gewählt, weil es autoklavensicher, nicht reaktiv und leicht zu bearbeiten ist. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac</td></tr><tr><td>Edelstahlrohr für kundenspezifische Deckel</td><td>McMaster Carr</td><td>Verschiedenes</td><td>Jeder Anbieter kann verwendet werden. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91</td></tr><tr><td>Kundenspezifische modifizierte Delran Bioreaktordeckel für die kontinuierliche Ernährung</td><td>Sonderanfertigungen</td><td></td> Es <td>ist mir kein Anbieter bekannt, der ein ähnliches Produkt herstellt</td></tr><tr><td>Kundenspezifische modifizierte Glasflaschendeckel für die kontinuierliche Ernährung</td><td>Sonderanfertigungen</td><td></td><td>Einige Anbieter (z. B. , Fischer Sci, Corning) stellen ähnliche Produkte in den unten stehenden Links her.</td></tr><tr><td>Masterflex Digitale Schlauchpumpe</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>EW-77919-25</td><td>Jede Präzisions-Schlauchpumpe kann verwendet werden. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25</td></tr><tr><td>PVDF Schlauchverbinder (diverse)</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>siehe Link Jeder</td><td>Anbieter kann verwendet werden. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889</td></tr><tr><td>Pharmed BPT Tubing L/S 16</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-16</td><td>Jeder Anbieter kann verwendet werden. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16</td></tr><tr><td>Pharmed BPT Tubing L/S 14</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-14</td> Jeder <td>Anbieter kann verwendet werden. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14</td></tr><tr><td>Pharmed BPT Tubing L/S 13</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-13</td><td>Jeder Anbieter kann verwendet werden. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/ WU-06508-13</td></tr><tr><td>Millipore Millex GP PES-Membran 0,22 &#181; l Steriler Spritzenvorsatzfilter (zur Entlüftung und Mediumfiltration)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGP033RS</td><td>Jeder Anbieter kann verwendet werden</td></tr><tr><td>25 ml Graduiertpipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11</td> Jeder <td>Anbieter kann verwendet werden, und es können verschiedene Größen verwendet werden</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15E</td><td>Jeder Anbieter oder ein ähnliches Produkt kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td>Jedes Produkt eines Herstellers oder eines ähnlichen Produkts kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>15250-061</td> Es <td>kann ein beliebiges Produkt eines Herstellers oder eines ähnlichen Produkts verwendet werden. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061</td></tr><tr><td>Inverslichtmikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Jedes Produkt eines Herstellers oder eines ähnlichen Produkts kann verwendet werden</td></tr><tr><td>One Touch Ultra Blutzuckermessgerät</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-293</td><td>Jedes Produkt kann verwendet werden (<z>z. B. , Bayer)</td></tr><tr><td>One Touch Ultra-Strips</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-292&nbsp;</td><td>Es kann ein beliebiger Anbieter oder ein ähnliches Produkt verwendet werden (<>z.B. , Bayer)</td></tr></tbody></table>

nährstoff verordnung durch kontinuierliche zufuhr für eine groß angelegte expansion von mammalian cells in sphäroiden

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In dieser Demonstration wurden Sphäroide, die aus der β-TC6-Insulinom-Zelllinie gebildet wurden, als Modell für die Herstellung eines Säugetier-Inselzellprodukts kultiviert, um zu demonstrieren, wie die Regulierung des Nährstoffgehalts die Zellausbeute verbessern kann. In früheren Studien ermöglichten Bioreaktoren ein erhöhtes Kulturvolumen im Vergleich zu statischen Kulturen, aber es wurde keine Steigerung der Zellausbeute beobachtet. Einschränkungen bei wichtigen Nährstoffen wie Glukose, die zwischen den Chargenfütterungen konsumiert wurden, können zu Einschränkungen bei der Zellexpansion führen. Trotz des Anstiegs der Glukosekonzentrationen in den Medien wurden große Schwankungen der Glukosespiegel beobachtet. Die Verwendung von kontinuierlichen Fütterungssystemen eliminierte Schwankungen des Glukosespiegels und verbesserte die Zellwachstumsraten im Vergleich zu chargengefütterten statischen und SSB-Kulturmethoden. Zusätzliche Steigerungen der Wachstumsraten wurden beobachtet, indem die Fütterungsrate auf der Grundlage des berechneten Nährstoffverbrauchs angepasst wurde, was die Aufrechterhaltung der physiologischen Glukose über drei Wochen in Kultur ermöglichte. Diese Methode kann auch für andere Zelltypen adaptiert werden.

Medium Zuckerwerte und Schwankungen einschränken Zellexpansion in Standard - SSB Kulturen Die Glucosespiegel schwanken in statischen Kulturen und SSB Kulturen auf der ganzen Kulturdauer 3. Diese Schwankungen intensivieren mit zunehmender Zellzahl während der 21-tägigen Züchtungsperiode und waren fast identisch in sowohl statische als auch SSB Kulturen. Diese Beobachtungen werden in unserer früheren Veröffentlichung 3 dargestellt. Die Gl...

Die Nährstoffregulierung durch kontinuierliche, wachstumsangepasste Fütterung verbessert die Wachstumsraten von Säugetierzell-Sphäroiden im Vergleich zur intermittierenden Chargenfütterung für Kulturen in gerührten Suspensionsbioreaktoren. Diese Studie zeigt die Methoden, die für die Etablierung einfacher Kulturen mit angepasstem Zinssatz erforderlich sind.

Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Das übergeordnete Ziel dieses Prozesses ist es, eine große Anzahl von Zellen unter kontrollierten Nährstoffbedingungen zu kultivieren. Mit herkömmlichen Geräten, die in einem Zellkulturlabor zu finden sind. Die zugehörigen Algorithmen ermöglichen die Kontrolle und Manipulation von Nährstoffen innerhalb von Versuchsbereichen.Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen für großtechnische Zellkulturanwendungen zu beantworten. Wie zum Beispiel humane Zelltherapien. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Kultivierung von Zellen in großem Maßstab mit gleichmäßiger Verteilung von Nährstoffen und Gasen ermöglicht.Dies ermöglicht höhere Zelldichten als statische oder massengefütterte Zellkulturen, erhöht die Ausbeute und reduziert den Zellverlust. Dies kann mit Geräten erfolgen, die in den meisten Zellkulturlabors zu finden sind. Die visuelle Demonstration dieser Methode kann für neue Forscher hilfreich sein, da diese verwendeten Techniken aufgrund der großen Anzahl von Schritten, die in einer bestimmten Reihenfolge unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen, schwierig zu beherrschen sein können.Sammeln Sie die fünf Hauptkomponenten, die für das Fütterungssystem benötigt werden. Ein mittleres Reservoir, eine Schlauchpumpe, ein gerührter Bioreaktor, ein Abfallreservoir und ein speziell entwickeltes Schlauchprobenahmeset. Stellen Sie das Mediumreservoir mit einer Ein-Liter-Glasflasche her.Das Abfallreservoir mit einer Zwei-Liter-Glasflasche. Der gerührte Bioreaktor verwendet einen Glasreaktor mit einem Volumen von 250 ml. Verwenden Sie eine digitale Schlauchpumpe oder eine ähnliche Pumpe mit einem Achtkanal-Pumpenkopf, um den Medienwechsel zu steuern.Bauen Sie das Reservoir und die modifizierten Bioreaktordeckel aus hartem und autoklavierbarem Kunststoff zusammen. Mit Durchgangsöffnungen aus Edelstahlrohren für die Belüftung durch Sterilfilter und den Transfer des Mediums zwischen Reservoirs und Bioreaktoren. Befestigen Sie ein Abflussrohr aus porösen Glasbelüftungsrohren an dem modifizierten Deckel des Rührsuspensionsbioreaktors.Konfektionieren Sie autoklavierbare Perfusionsschlauchsets aus Polyvinylidenfluorid-Schlauchanschlüssen und langlebigen peristaltischen Pumpenschläuchen. Die Länge des Abschnitts ist abhängig vom Abstand zwischen den verschiedenen Komponenten. Konfektionieren Sie die Zuleitung mit zwei Schlauchdurchmessern.Verwenden Sie L/S 14 für den Primärschlauch, der die Strecke vom Bioreaktor zum Mediumreservoir überspannt. Führen Sie in der Mitte der Schlauchlänge L/S 13 für den Pumpenabschnitt eine Sortierlänge L/S 13 mit den entsprechenden PVDF-Adaptern ein. Verwenden Sie Standard-PVDF-Schlauchadapter mit Widerhaken, um zwei Stücke L/S 14-Schläuche auf beiden Seiten des kürzeren Pumpenabschnitts zu verbinden.Montieren Sie den Querschnittsschlauch für die Abfallentsorgung mit einem L/S 16-Schlauch mit größerem Durchmesser und führen Sie in der Mitte einen kurzen Abschnitt L/S 14-Schlauch für den Pumpabschnitt ein. Dies geschieht auf die gleiche Weise wie bei der Montage der Zuleitung mit PVDF-Schlauch-Stacheladaptern. Bauen Sie das endgültige Bauteil des Schlauchsets zusammen, indem Sie das Set aus drei kurzen L/S 14 Schlauchlängen konstruieren.Verbunden mit einem T-förmigen HVDF-Stecker und zwei kleinen Schlauchschellen an zwei der Schlauchlängen. Verbinden Sie die Probenbaugruppe mit dem Probenanschluss aus Edelstahl, der am Deckel des Bioreaktors angebracht ist. Nach der Sterilisation wird an einer der eingespannten Längen ein steriler Gasfilter zur Gasentlüftung angebracht.Die andere dient zum Anschluss an eine sterile Probenahmespritze. Autoklavieren Sie die Probenahmeanordnung, während sie mit dem Bioreaktor verbunden ist, bevor Sie mit dem Experiment beginnen, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie diese Anordnung, um bei Bedarf sterile Proben aus dem Bioreaktor zu entnehmen, ohne den kontinuierlichen Zuführprozess zu stören.Bringen Sie sterile Belüftungsöffnungen an den entsprechenden Stellen an den Deckeln des Spinnerkolbens, dem Mediumgefäß, den Abfallbehältern und den Probenanschlüssen an. Kultivieren und ernten Sie die Zellen wie im Textprotokoll beschrieben. Lassen Sie die Zellen zwei bis drei Minuten lang in einer Biosicherheitswerkbank bei Raumtemperatur in Trypsin inkubieren und sammeln Sie sie dann in einem konischen Röhrchen.Anschließend wird eine kleine Zellprobe entnommen und mit Trypanblau gefärbt. Zählen Sie die Zelldichte mit einem Mikroskop und einem Standard-Hämozytometer mit Trypanblau-Färbung, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie die gewünschte Anzahl von Gesamtzellen für jede Bedingung in sterile Rührsuspensions-Bioreaktoren.Geben Sie das Medium mit einer Pipette in den gerührten Suspensionsbioreaktor, um das gewünschte Gesamtkulturvolumen zu erreichen. Bewegen Sie den gerührten Suspensionsbioreaktor mit den Zellen auf eine Rührplatte in einem Zellkultur-Inkubator. Kultivieren Sie Zellen in den Bioreaktoren ohne Fütterung für drei Tage bei 37 Grad Celsius, mit 5 % Kohlendioxid, 100 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer Rührrate von 70 U/min, damit sich Sphäroide bilden können.Nach der Sphäroidbildung den gerührten Suspensionsbioreaktor aus dem Inkubator nehmen. Montieren Sie die Komponenten für das kontinuierliche Fütterungssystem in einer biologischen Sicherheitswerkbank. Füllen Sie zuerst ein Frischmediumreservoir mit dem gewünschten Nährmedium und schließen Sie es dann an eine Seite der Zuleitung an.Stellen Sie außerdem sicher, dass der Frischmediumbehälter mit einem Sterilfilter ordnungsgemäß entlüftet wird. An der Einlassöffnung des Bioreaktors sollte ein Sterilfilter ausgetauscht werden, um das Medium zu filtern, bevor es in den Bioreaktor gelangt. Schließen Sie die Abfallleitung an den mittleren Abfallbehälter an und stellen Sie sicher, dass der Abfallbehälter mit einem Sterilfilter ordnungsgemäß entlüftet wird.Stellen Sie den gerührten Suspensionsbioreaktor unter Verwendung der gleichen Kulturparameter wie bei der Sphäroidbildung auf die Rührplatte im Inneren des Inkubators. Stellen Sie das Frischemedium in einen nahegelegenen Minikühlschrank. Stellen Sie sicher, dass die Zuleitungen den Kühlschrank verlassen können, ohne das Schließen der Türen zu verhindern.Es ist auch wichtig, dass die Zuleitungen nicht durch die Türen des Kühlschranks oder des Inkubators eingeklemmt werden. Der Abfallbehälter kann an einer geeigneten Stelle auf der Tischplatte außerhalb des Inkubators platziert werden. Führen Sie die restlichen Schlauchenden in den Inkubator und verbinden Sie die Zuleitung mit dem Filter an der Einlassöffnung des Bioreaktors.Verbinden Sie dann die Ablaufleitung mit dem Abflussrohranschluss. Als nächstes platzieren Sie den Pumpenabschnitt der Zu- und Abflussleitungen in den Pumpenkopf und stellen Sie die richtige Ausrichtung sicher, so dass die Zuleitungen das Medium aus dem Frischmediumbehälter in den gerührten Suspensionsbioreaktor pumpen und die Abfallleitungen das Medium aus dem Bioreaktor und zum Abfallmediumbehälter pumpen. Berechnen Sie den Vorschub mit der angepassten Vorschubgleichung, wie im Textprotokoll beschrieben.Verwenden Sie die neueste Probe mit Informationen zur Zellzahl, zusammen mit der Vorhersage der Wachstumsrate und den mittleren Glukosemessungen, um die Zuführgeschwindigkeit zu schätzen, die erforderlich ist, um die gewünschte Glukosekonzentration in der Kultur aufrechtzuerhalten. Stellen Sie die Pumpendrehzahl basierend auf der berechneten Fördergeschwindigkeit ein. Wiederholen Sie die Berechnung der Fördermenge und passen Sie die Pumpendrehzahl für jede Probenahmestelle an.Messungen von mittlerer Glukose werden aus Beta-TC6-Insulinom-Sphäroidkulturen unter Verwendung von statisch gerührten Suspensionsbioreaktoren und kontinuierlich gespeisten Rührsuspensionsbioreaktor-Kulturmethoden gezeigt. Fütterung mit Standardmedium mit hohem Glukosegehalt. Die kontinuierliche Fütterung ist in der Lage, die Glukoseschwankungen zu beseitigen, aber die durchschnittlichen Glukosespiegel im Medium ändern sich während der Kulturperiode dramatisch und liegen weit über dem physiologischen Bereich.Die angepasste Fütterung ist in der Lage, die Schwankungen zu beseitigen und die Glukosekonzentrationen für die Dauer der Kulturperiode in der Nähe des physiologischen Niveaus zu halten. Hier wird das Zellwachstum, das als Faltungsänderung der Zellzahl während des 21-tägigen Kulturzeitraums berichtet wird, für gerührte Suspensionsbioreaktoren mit regelmäßigem Mediumwechsel, konstanter Zufuhrgeschwindigkeit für gerührte Suspensionsbioreaktorkulturen und angepasste Zufuhrgeschwindigkeit für gerührte Suspensionsbioreaktorkulturen verglichen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Variation von Bedingungen, entwickelt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. den Nährstoffbedarf für neue Zelllinien oder spezifische experimentelle Ergebnisse.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellbiologie, um die metabolischen Anforderungen in Zellen von Menschen mit Krebs oder anderen Erkrankungen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Profusion-Zellkultursystem zusammenstellen, um die Kulturbedingungen besser zu kontrollieren und die Zellausbeute zu maximieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie der Schutz vor durch Blut übertragbaren Krankheitserregern getroffen werden sollten.

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Sphäroide sind eine Art von 3D-Zellkulturmodell, das verwendet wird, um die Umgebung einer Zelle im Vergleich zu 2D-Zellkultur-Monolayer-Modellen genauer darzustellen. Im Beispielprotokoll werden wir sehen, wie Wissenschaftler Sphäroide aus einer Darmkrebszelllinie erzeugen und Lebendzell-Imaging anwenden, um das Wachstum der Sphäroide zu verfolgen.

Sphäroiderzeugung aus Zelllinien: Eine dreidimensionale (3D) Zellkulturmethode

Wir führen ein Protokoll für die Erzeugung einer großen Anzahl (Tausende bis Hunderttausende) von einheitlicher Größe und Zusammensetzung gesteuerten Tumorsphäroide mit handelsüblichen Mikrotiterplatten.

Die Produktion der großen Zahlen von Größe gesteuerte Tumorsphäroide Mit Microwell Platten

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Hier beschreiben wir eine Methode um dreidimensionale Sphäroid Kulturen der menschlichen nasalen Epithelzellen zu generieren. Sphäroide werden dann Laufwerk Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regulator (CFTR) stimuliert-abhängigen Ion und Fluid-Sekretion, Quantifizierung der Änderung der Sphäroid luminalen Größe als Proxy für CFTR-Funktion.

Generation der menschlichen Nase Epithelzelle Sphäroide für individualisierte Cystic Fibrosis Transmembrane Leitwert Regler Studie

Wir stellen hier eine Methode vor, die die Verwendung von chemischer epigenetischer Auslöschung mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren effizient zu erzeugen, ohne dass Gentransfektion oder retrovirale Vektoren erforderlich sind. Diese Strategie ist daher vielversprechend für die translationale Medizin und stellt einen bemerkenswerten Fortschritt in der Stammzellorganoidtechnologie dar.

Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen

Dieses Protokoll stellt ein neuartiges, robustes und reproduzierbares Kultursystem zur Erzeugung und zum Wachstum dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen dar. Die Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Krebsstammzellbiologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.

Ein dreidimensionales Modell von Sphäroiden zur Untersuchung von Darmkrebs-Stammzellen

Diese Protokolle werden den Benutzern helfen, den mitochondrialen Energiestoffwechsel in 3D-Krebszelllinien-abgeleiteten Sphäroiden mithilfe der extrazellulären Flussanalyse von Seepferdchen zu untersuchen.

Erforschung des mitochondrialen Energiestoffwechsels einzelner 3D-Mikrogewebesphäroide mittels extrazellulärer Flussanalyse

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von drei verschiedenen Arten von Sphäroiden in einer Weise, die sie für ein groß angelegtes High-Content-Screening und -Analyse geeignet macht. Darüber hinaus werden Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie sie auf Sphäroid- und Einzelzellebene analysiert werden können.

Eine robuste Methode für die großtechnische Produktion von Sphäroiden für High-Content-Screening- und Analyseanwendungen

Wir stellen ein Protokoll für die Züchtung hochreproduzierbarer Sphäroide und deren phänotypische Charakterisierung mittels Bilderfassung und Proteomik vor.

Halbautomatische phänotypische Analyse funktioneller 3D-Sphäroidzellkulturen

Organoide revolutionieren die personalisierte Gewebemodellierung für die Organentwicklung, Wirkstoffforschung und Krankheitsforschung. Die Organoid-Technik schreitet voran und führt zur Herstellung komplizierter synthetischer Gewebe. Ziel ist es, Morphogenese, Assembloid-Technologie und Biomatrizen zu integrieren, um das Tissue Engineering voranzutreiben. Dieses Protokoll hilft bei der Modellierung der Leberorganogenese und der Festlegung von Richtlinien für den Aufbau synthetischer Gewebe.

In-vitro-Kultivierungstechniken zur Modellierung der Leberorganogenese, zum Aufbau von Assembloiden und zum Design synthetischer Gewebe unter Verwendung menschlicher Zelllinien

In diesem Artikel beschreiben wir verschiedene Methoden zur Bildung von multizellulären Sphäroiden, um eine anschließende Multiparameter-Lebendzellmikroskopie durchzuführen. Unter Verwendung von Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM), zellulärer Autofluoreszenz, Färbefarbstoffen und Nanopartikeln wird der Ansatz zur Analyse des Zellstoffwechsels, der Hypoxie und des Zelltods bei lebenden dreidimensionalen (3D) Krebs- und Stammzell-abgeleiteten Sphäroiden demonstriert.

Herstellung und Multiparameter-Lebendzell-Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebungsmikroskopie (FLIM) von mehrzelligen Sphäroiden

Erfahren Sie die kontinuierliche Nährstoffzufuhr für Mammalzell-Sphäroide in Rührreaktor-Bioreaktoren. Diese Methode verbessert Wachstumsraten und ermöglicht groß angelegte Zellkulturen für zelluläre Therapien.

Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden

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