Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden

Das übergeordnete Ziel dieses Prozesses ist es, eine große Anzahl von Zellen unter kontrollierten Nährstoffbedingungen zu kultivieren. Mit herkömmlichen Geräten, die in einem Zellkulturlabor zu finden sind. Die zugehörigen Algorithmen ermöglichen die Kontrolle und Manipulation von Nährstoffen innerhalb von Versuchsbereichen.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen für großtechnische Zellkulturanwendungen zu beantworten. Wie zum Beispiel humane Zelltherapien. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Kultivierung von Zellen in großem Maßstab mit gleichmäßiger Verteilung von Nährstoffen und Gasen ermöglicht.

Dies ermöglicht höhere Zelldichten als statische oder massengefütterte Zellkulturen, erhöht die Ausbeute und reduziert den Zellverlust. Dies kann mit Geräten erfolgen, die in den meisten Zellkulturlabors zu finden sind. Die visuelle Demonstration dieser Methode kann für neue Forscher hilfreich sein, da diese verwendeten Techniken aufgrund der großen Anzahl von Schritten, die in einer bestimmten Reihenfolge unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen, schwierig zu beherrschen sein können.

Sammeln Sie die fünf Hauptkomponenten, die für das Fütterungssystem benötigt werden. Ein mittleres Reservoir, eine Schlauchpumpe, ein gerührter Bioreaktor, ein Abfallreservoir und ein speziell entwickeltes Schlauchprobenahmeset. Stellen Sie das Mediumreservoir mit einer Ein-Liter-Glasflasche her.

Das Abfallreservoir mit einer Zwei-Liter-Glasflasche. Der gerührte Bioreaktor verwendet einen Glasreaktor mit einem Volumen von 250 ml. Verwenden Sie eine digitale Schlauchpumpe oder eine ähnliche Pumpe mit einem Achtkanal-Pumpenkopf, um den Medienwechsel zu steuern.

Bauen Sie das Reservoir und die modifizierten Bioreaktordeckel aus hartem und autoklavierbarem Kunststoff zusammen. Mit Durchgangsöffnungen aus Edelstahlrohren für die Belüftung durch Sterilfilter und den Transfer des Mediums zwischen Reservoirs und Bioreaktoren. Befestigen Sie ein Abflussrohr aus porösen Glasbelüftungsrohren an dem modifizierten Deckel des Rührsuspensionsbioreaktors.

Konfektionieren Sie autoklavierbare Perfusionsschlauchsets aus Polyvinylidenfluorid-Schlauchanschlüssen und langlebigen peristaltischen Pumpenschläuchen. Die Länge des Abschnitts ist abhängig vom Abstand zwischen den verschiedenen Komponenten. Konfektionieren Sie die Zuleitung mit zwei Schlauchdurchmessern.

Verwenden Sie L/S 14 für den Primärschlauch, der die Strecke vom Bioreaktor zum Mediumreservoir überspannt. Führen Sie in der Mitte der Schlauchlänge L/S 13 für den Pumpenabschnitt eine Sortierlänge L/S 13 mit den entsprechenden PVDF-Adaptern ein. Verwenden Sie Standard-PVDF-Schlauchadapter mit Widerhaken, um zwei Stücke L/S 14-Schläuche auf beiden Seiten des kürzeren Pumpenabschnitts zu verbinden.

Montieren Sie den Querschnittsschlauch für die Abfallentsorgung mit einem L/S 16-Schlauch mit größerem Durchmesser und führen Sie in der Mitte einen kurzen Abschnitt L/S 14-Schlauch für den Pumpabschnitt ein. Dies geschieht auf die gleiche Weise wie bei der Montage der Zuleitung mit PVDF-Schlauch-Stacheladaptern. Bauen Sie das endgültige Bauteil des Schlauchsets zusammen, indem Sie das Set aus drei kurzen L/S 14 Schlauchlängen konstruieren.

Verbunden mit einem T-förmigen HVDF-Stecker und zwei kleinen Schlauchschellen an zwei der Schlauchlängen. Verbinden Sie die Probenbaugruppe mit dem Probenanschluss aus Edelstahl, der am Deckel des Bioreaktors angebracht ist. Nach der Sterilisation wird an einer der eingespannten Längen ein steriler Gasfilter zur Gasentlüftung angebracht.

Die andere dient zum Anschluss an eine sterile Probenahmespritze. Autoklavieren Sie die Probenahmeanordnung, während sie mit dem Bioreaktor verbunden ist, bevor Sie mit dem Experiment beginnen, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie diese Anordnung, um bei Bedarf sterile Proben aus dem Bioreaktor zu entnehmen, ohne den kontinuierlichen Zuführprozess zu stören.

Bringen Sie sterile Belüftungsöffnungen an den entsprechenden Stellen an den Deckeln des Spinnerkolbens, dem Mediumgefäß, den Abfallbehältern und den Probenanschlüssen an. Kultivieren und ernten Sie die Zellen wie im Textprotokoll beschrieben. Lassen Sie die Zellen zwei bis drei Minuten lang in einer Biosicherheitswerkbank bei Raumtemperatur in Trypsin inkubieren und sammeln Sie sie dann in einem konischen Röhrchen.

Anschließend wird eine kleine Zellprobe entnommen und mit Trypanblau gefärbt. Zählen Sie die Zelldichte mit einem Mikroskop und einem Standard-Hämozytometer mit Trypanblau-Färbung, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie die gewünschte Anzahl von Gesamtzellen für jede Bedingung in sterile Rührsuspensions-Bioreaktoren.

Geben Sie das Medium mit einer Pipette in den gerührten Suspensionsbioreaktor, um das gewünschte Gesamtkulturvolumen zu erreichen. Bewegen Sie den gerührten Suspensionsbioreaktor mit den Zellen auf eine Rührplatte in einem Zellkultur-Inkubator. Kultivieren Sie Zellen in den Bioreaktoren ohne Fütterung für drei Tage bei 37 Grad Celsius, mit 5 % Kohlendioxid, 100 % relativer Luftfeuchtigkeit und einer Rührrate von 70 U/min, damit sich Sphäroide bilden können.

Nach der Sphäroidbildung den gerührten Suspensionsbioreaktor aus dem Inkubator nehmen. Montieren Sie die Komponenten für das kontinuierliche Fütterungssystem in einer biologischen Sicherheitswerkbank. Füllen Sie zuerst ein Frischmediumreservoir mit dem gewünschten Nährmedium und schließen Sie es dann an eine Seite der Zuleitung an.

Stellen Sie außerdem sicher, dass der Frischmediumbehälter mit einem Sterilfilter ordnungsgemäß entlüftet wird. An der Einlassöffnung des Bioreaktors sollte ein Sterilfilter ausgetauscht werden, um das Medium zu filtern, bevor es in den Bioreaktor gelangt. Schließen Sie die Abfallleitung an den mittleren Abfallbehälter an und stellen Sie sicher, dass der Abfallbehälter mit einem Sterilfilter ordnungsgemäß entlüftet wird.

Stellen Sie den gerührten Suspensionsbioreaktor unter Verwendung der gleichen Kulturparameter wie bei der Sphäroidbildung auf die Rührplatte im Inneren des Inkubators. Stellen Sie das Frischemedium in einen nahegelegenen Minikühlschrank. Stellen Sie sicher, dass die Zuleitungen den Kühlschrank verlassen können, ohne das Schließen der Türen zu verhindern.

Es ist auch wichtig, dass die Zuleitungen nicht durch die Türen des Kühlschranks oder des Inkubators eingeklemmt werden. Der Abfallbehälter kann an einer geeigneten Stelle auf der Tischplatte außerhalb des Inkubators platziert werden. Führen Sie die restlichen Schlauchenden in den Inkubator und verbinden Sie die Zuleitung mit dem Filter an der Einlassöffnung des Bioreaktors.

Verbinden Sie dann die Ablaufleitung mit dem Abflussrohranschluss. Als nächstes platzieren Sie den Pumpenabschnitt der Zu- und Abflussleitungen in den Pumpenkopf und stellen Sie die richtige Ausrichtung sicher, so dass die Zuleitungen das Medium aus dem Frischmediumbehälter in den gerührten Suspensionsbioreaktor pumpen und die Abfallleitungen das Medium aus dem Bioreaktor und zum Abfallmediumbehälter pumpen. Berechnen Sie den Vorschub mit der angepassten Vorschubgleichung, wie im Textprotokoll beschrieben.

Verwenden Sie die neueste Probe mit Informationen zur Zellzahl, zusammen mit der Vorhersage der Wachstumsrate und den mittleren Glukosemessungen, um die Zuführgeschwindigkeit zu schätzen, die erforderlich ist, um die gewünschte Glukosekonzentration in der Kultur aufrechtzuerhalten. Stellen Sie die Pumpendrehzahl basierend auf der berechneten Fördergeschwindigkeit ein. Wiederholen Sie die Berechnung der Fördermenge und passen Sie die Pumpendrehzahl für jede Probenahmestelle an.

Messungen von mittlerer Glukose werden aus Beta-TC6-Insulinom-Sphäroidkulturen unter Verwendung von statisch gerührten Suspensionsbioreaktoren und kontinuierlich gespeisten Rührsuspensionsbioreaktor-Kulturmethoden gezeigt. Fütterung mit Standardmedium mit hohem Glukosegehalt. Die kontinuierliche Fütterung ist in der Lage, die Glukoseschwankungen zu beseitigen, aber die durchschnittlichen Glukosespiegel im Medium ändern sich während der Kulturperiode dramatisch und liegen weit über dem physiologischen Bereich.

Die angepasste Fütterung ist in der Lage, die Schwankungen zu beseitigen und die Glukosekonzentrationen für die Dauer der Kulturperiode in der Nähe des physiologischen Niveaus zu halten. Hier wird das Zellwachstum, das als Faltungsänderung der Zellzahl während des 21-tägigen Kulturzeitraums berichtet wird, für gerührte Suspensionsbioreaktoren mit regelmäßigem Mediumwechsel, konstanter Zufuhrgeschwindigkeit für gerührte Suspensionsbioreaktorkulturen und angepasste Zufuhrgeschwindigkeit für gerührte Suspensionsbioreaktorkulturen verglichen. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden, wie z.B. die Variation von Bedingungen, entwickelt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. den Nährstoffbedarf für neue Zelllinien oder spezifische experimentelle Ergebnisse.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellbiologie, um die metabolischen Anforderungen in Zellen von Menschen mit Krebs oder anderen Erkrankungen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Profusion-Zellkultursystem zusammenstellen, um die Kulturbedingungen besser zu kontrollieren und die Zellausbeute zu maximieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellen äußerst gefährlich sein kann und bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie der Schutz vor durch Blut übertragbaren Krankheitserregern getroffen werden sollten.