Name: Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Erfahren Sie die Biolumineszenz-Bildgebung zur nicht-invasiven Überwachung von Candida albicans-Biofilmen in einem subkutanen Mausmodell. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Biofilmbildung und die Testung antimykotischer Therapien.

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Diese Arbeit wurde unterstützt von der KU Leuven PF 'IMIR', der FWO-Forschungsgemeinschaft für Biologie und Ökologie von bakteriellen und pilzlichen Biofilmen (FWO: WO.026.11N) und durch das FWO-Projekt G.0804.11. SK bedankt sich herzlich bei der KU Leuven für das PDMK 11/089-Stipendium und bei der FWO für das Postdoc-Stipendium. Wir danken Nico Vangoethem für seine Unterstützung bei der Erstellung der Zahlen. Wir danken Celia Lobo Romero für ihre technische Unterstützung während der experimentellen In-vivo-Verfahren.

HINWEIS: Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der KU Leuven (Projektnummer 090/2013) genehmigt. Pflegen Tiere im Einklang mit den KU Leuven Tierpflege-Richtlinien. 1. C. albicans Wachstum <ol><li> Vierundzwanzig Stunden vor der Einleitung der Tierexperiment vorbereitet YPD-Platten durch Zugabe von 10 g Hefeextrakt granuliert, 20 g bakteriologischer Pepton und 15 g granuliertes Agar. Make-up Volumen auf 900 ml mit Milli-Q-Wasser und Autoklaven. </li><li> 50 ml sterile 40% Glucose. Gründlich mischen und in Petrischalen gießen. Verlassen Agarplatten abzukühlen und zu verfestigen. HINWEIS: In dieser Studie verwenden zwei Stämme, nämlich Wildtyp C. albicans SC5314 - Gluc negativen Stamm (als WT bezeichnet) und C albicans SKCA23-Stamm, der ein Wildtyp C ist albicans SC5314 mit Clp10 :: Act1p-gLUC59 Plasmid 22 .In diesem Stamm (benannt SKCA23- Eine transformierteCTgLuc) Gluc wurde unter die Kontrolle des ACT1 (Aktin) Promotor des endogenen PGA59 Gens fusioniert (dieser Promotor aktiv in der Hefe sowie hyphalen Stufe des Pilzwachstums). Dieser Stamm kann aus dem Labor von Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgien beantragt werden. Plasmid Clp10 :: Act1p-gLUC59 Plasmid 22 wurde freundlicherweise von Prof. C. d&#39;Enfert, Institut Pasteur, Paris, Frankreich gespendet. </li><li> Halten Sie beide Stämme in Glycerin Lager und bei -80 ° C. </li><li> Vor jeder Versuch Streifen Stämme auf eine YPD-Platte. Inkubieren Platte bei 37 ° C über Nacht. </li></ol> 2. Katheter Stück Vorbereitung <ol><li> Vor dem Versuch, zu bestimmen, wie viele Katheter benötigt werden. Es ist möglich, den Katheter 6 Stück pro Maus (3-Katheter an der linken und 3 Katheters auf der rechten Seite des Tieres (2A) bis zu implantieren. </li><li> Vierundzwanzig Stunden vor der Tierchirurgie, öffnen Sie die PackungAlter, die Triple-Lumen-Katheter unter der biologischen Sicherheitsschrank. Alle nicht benötigten Teile mit einer sterilen Pinzette entfernen und schneiden Sie die mit einem sterilen Skalpell an den Katheter angebracht Teil. Zeigen Herrscher unter dem Kunststoffgehäuse und schneiden Polyurethan Katheter Stücke aus genau 1 cm nach der Skala auf dem Lineal (Abbildung 1). Hinweis: Es ist wichtig zu erwähnen, dass diese Art von Katheter Stück nicht phosphoreszierenden und daher für BLI 18,19. </li><li> Legen Sie ein Maximum von 15 Schnitt Katheterstücke (Schritt. 2.2) in 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Immer bereiten 3 Stück zusätzliche, die verwendet werden, um die Menge der beigefügten Candida-Zellen auf dem Gerät nach Ablauf der Haft aufzuzählen. </li><li> Ergänzen Kathetern mit etwa 1,8 ml 100% igem fötalem Rinderserum (FBS). </li><li> Kräftig vortexen und zusätzliche 100 bis 200 ul 100% FBS. Decken Sie alle Katheterstücke mit Serum. </li><li> Bei 37 ° C über Nacht. </li&gt; </ol> 3. Tiere und Unterdrückung des Immunsystems <ol><li> Halten weiblichen BALB / c-Mäuse (ca. 8 Wochen alt) in einzeln belüfteten Filterober Käfigen mit freiem Zugang zu Standard-Futter und Wasser ad libitum. </li><li> Initiieren Suppression des Immunsystems 24 h vor Tierchirurgie durch Zugabe von Dexamethason (0,4 mg / L), um dem Trinkwasser der Tiere. Um jede bakterielle Kontamination des Wirts zu vermeiden, ergänzen das Trinkwasser mit einer Antibiotika, beispielsweise Ampicillin Natriumpulver (0,5 g / L). </li><li> Halten Immunsuppression von Tieren während des gesamten Experiments (bis 6 Tage). </li></ol> 4. Ex vivo C. albicans Haftung auf FBS beschichtet Polyurethan-Substrate <ol><li> Übertragen Sie jede Serum beschichteten Katheter Stück in ein frisches 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Kratzen Sie einige C albicans Zellen auf YPD-Platten (Schritt 1) angebaut und suspendieren diese in 1 ml PBS. </li><li> Verwässern können,dida Zellen (1: 100) in einem separaten Reaktionsgefäß. Nehmen Sie 10 ul der verdünnten Probe und wenden es auf eine Zelle Zählkammer. Zählen Sie mindestens 16 kleine Quadrate. </li><li> Bereiten Candida-Zellen (jeder Stamm separat) in RPMI 1640-Medium auf eine Endkonzentration von 5 x 10 4 Zellen / ml. </li><li> 1 ml der Zellsuspension in jede Serum beschichteten Katheterstück. </li><li> Kräftig vortexen und sicherzustellen, dass die Katheter in das Medium eingetaucht und nicht oben schwimmen. </li><li> Katheter bei 37 ° C für 90 min (Zeit der Adhäsion). </li><li> Katheter mit einer sterilen Pinzette entfernen und zweimal waschen Sie sie mit 1 ml PBS. Während dieses Schrittes wird sicherstellen, dass die Waschflüssigkeit geht durch den Hohlraum, indem der Katheter in der vertikalen Position während sehr sanft Spülen der Katheter. Wichtig ist, nicht mit einem starken Strömung, die auf die Entfernung von anhaftenden Zellen führen kann. </li><li> Übertragen Sie jede gewaschen Katheter in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen (ein Stück pro tusein). </li><li> Zeigen auf Eis und dort zu halten, bis der Operation. </li></ol> 5. Anästhesie <ol><li> Bereiten Anästhesie durch Mischen von 75 ul von Ketamin (100 mg / ml) mit 100 ul Medetomidin (1 mg / ml) und 825 &amp; mgr; l steriler Kochsalzlösung. Verabreichen intraperitoneal (ip) 60-80 ul Narkosecocktail pro 10 g Körpergewicht, was einer Dosis von 45-60 mg / kg Ketamin und 0,6-0,8 mg / kg Medetomidin. </li><li> Zum Umlegen der Anästhesie, verdünnter 50 ul Atipamezol (5 mg / ml) in 4,95 ml Kochsalzlösung, zu verabreichen ip 100 ul pro 10 g Körpergewicht als Antidot, was in einer Dosis von 0,5 mg / kg. </li><li> Nach dem Einspritzen der Anästhesie, legen Sie das Tier in einen separaten Käfig und warten Sie, bis es vollständig eingeschlafen. </li><li> Überprüfen Sie die Betäubung des Tieres durch helle Haut und Zehen Prise Prise, die Schäden an der Haut verursachen. Jeder beobachtete Bewegung zeigt an, dass das Tier nicht ausreichend betäubt eine Operation durchzuführen. Wenn dies geschieht, warten Sie eine couB. von Minuten länger, bis das Tier keine Anzeichen für eine Bewegung auf der Haut oder Zehen Prise zu zeigen. </li></ol> 6. Tierchirurgie <ol><li> Transfer narkotisiert Tieres aus dem Käfig auf einer sauberen Gewebes auf Heizkissen gelegt, auf 37 ° C vorgewärmt (2A, (1)). ANMERKUNG: Eine billigere Alternative ist es, elektrisch beheizten Decken benutzen. Es ist auch möglich, isotherme Pads, die in der Mikrowelle vor dem Tierchirurgie erwärmt werden muss verwenden. </li><li> Bewerben Augensalbe auf die Augen. </li><li> Rasieren Sie den unteren Rücken des Tieres mit einem elektrischen Rasierer. Entfernen Sie alle Tierhaare und übertragen Tier auf einem sauberen Tuch ab. Desinfizieren Sie die Haut (zB mit 1% Jod Isopropanol oder 0,5% Chlorhexidin in 70% Alkohol) und lassen Sie das desinfizierte Bereich für etwa 1 min trocknen (2A, (2)). </li><li> Einen kleinen Einschnitt in der Haut (eine auf der linken und auf der rechten Seite des Tieres) (ungefähr 0,5 &amp;# 8211; 1 cm) (2A, (3)). </li><li> Präparieren Sie die Unterhaut mit einer Schere auf zwei subkutanen Tunnel zu erstellen. Jeder Tunnel ist ca. 1,5 cm lang und 1 cm breit sein. </li><li> Legen Sie drei Katheterstücke, die zuvor mit Candida infiziert ist, in jeden Tunnel. Sicherzustellen, dass die Katheter liegen nebeneinander in einer horizontalen Anordnung und dass sie sich nicht gegenseitig abdecken, um die Implantation von sechs Katheter Fragmente insgesamt ermöglichen (2A, (4)). </li><li> Schließen Sie die Schnitte mit Nähten. Alternativ können Sie Dermabond, um die Wunde zu schließen. </li><li> Desinfizieren Sie die Wunde sehr vorsichtig mit 0,5% Chlorhexidin in 70% Alkohol oder mit Jod Isopropanol (1%). </li><li> Bewerben Lokalanästhetikum (Xylocain-Gel, 2%) direkt auf die Wunde. </li><li> Verabreichen Umkehr Anästhesie (Protokoll 5, Schritt 2): intraperitoneal 100 &amp; mgr; l pro 10 g Körpergewicht. </li><li> Übertragungs Tier in einen sauberen Käfig zuvor auf eine Heizplatte gelegt. Halten Sie das Tiergetrennte und warm, bis das Tier ganz wach. Inzwischen weiterhin mit dem Betrieb und Implantat der nächste Tier. Sobald alle operierten Tiere sind ganz wach. Transfer zu einem Käfig. Überwachen Tiere regelmäßig. </li></ol> 7. Biolumineszenz Imaging: Darstellung von Coelenterazin (CTZ), dem Substrat für G. princeps Luciferase <ol><li> Bereiten Sie frische Coelenterazin (CTZ) Stammlösung durch Auflösen von 5 mg / ml in CTZ angesäuert Ethanol oder nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bereiten 1,2 mM Arbeitslösung durch Verdünnen der Stammlösung 1:10 in steriler PBS. HINWEIS: Injizieren Sie 100 ul CTZ Arbeitslösungen subkutan in der Umgebung der Katheter. Verwenden Insulinspritzen zur subkutanen Injektion von CTZ. </li><li> Halten Sie CTZ im Dunkeln (zB decken Mikrozentrifugenröhrchen, die CTZ mit Aluminiumfolie). Speicherung der Stammlösung bei -80 ° C für die Dauer der Experimente. </li></ol&gt; 8. Biolumineszenz Imaging <ol><li> Initialisieren Sie die BLI-Kamera. </li><li> Betäuben die Tiere unter Verwendung eines Induktionsfeld. Verwenden eines Gasgemisches von Isofluran in Sauerstoff, N 2 O / O 2 oder Luft bei 2-3%. </li><li> Nach der Induktion, Aufrechterhaltung einer Narkose in der Induktionsfeld und in der Abbildungskammer bei 1,5-2%. </li><li> Vor dem Start des Bildgebungssitzung, legen Sie die Speicherfolie in Position A, die zu einem Sichtfeld von 10 cm entspricht. Stellen Sie sicher, dass die richtige Position der Anästhesie Stellen und Tier, indem Sie einen Schlaf Tier in der Box. </li><li> Nehmen einige Fotografien bis Tier in der gewünschten Abbildungsstellung, in der FOV direkt unter der Kamera. </li><li> Bereiten Sie zwei Insulinspritzen mit je 100 ul der CTZ Arbeitslösung. </li><li> Legen Sie ein Tier auf der Bank und halten Sie sie schläft mit Hilfe einer Nasenkegel Bereitstellung Gasnarkose. </li><li> Bringen Sie die Nadel der Spritze in einem Ort umgebenden Katheter subkutan und spritzenCTZ gleichzeitig auf der Oberseite der Katheter. </li><li> Unmittelbar nach der Injektion, legen Sie das Tier auf der Warmhalteplatte in der Kamera Box und starten Sie die Bild Biolumineszenz Erwerb. </li><li> Erwerben aufeinanderfolgenden Scans mit Erfassungszeiten von 20 bis 60 s (abhängig von der Signalintensität), bis die maximale Signalintensität erreicht wird. Bei der Übernahme des nächsten Rahmens, messen Sie die BLI Signalintensität der zuvor erworbenen Rahmen, indem Sie einen ROI in jedem Katheter Trio und die Messung der Photonenfluss durch diese ROI. </li><li> Wiederholen Sie ab Schritt 7 für das nächste Tier (e). </li><li> Nach der Bilderzeugung zurück Tiere in ihren Käfig. Wiederholen BLI im Verlauf eines Experiments zur Längs, nicht-invasive Verfolgung von Biofilm-Bildung. </li><li> Analysieren Sie die BLI Daten mit Wohnzimmer Bild-Software. Legen Sie eine rechteckige ROI fester Größe auf jedem Katheter Trio und Messung der Photonenfluss (Ausstrahlung) durch jede ROI. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jedes Tier. </li><li> Berichtdie BLI-Signal Intensität jedes Katheters Trio als Photonenfluss pro Sekunde. Stellen die BLI-Daten auf einer logarithmischen Skala, indem die Mittelwerte und Standardabweichungen von der Photonenfluss pro Sekunde für jede Gruppe. Statistische Analyse an den log 10 transformierten Daten. </li></ol> 9. Katheter Explantation <ol><li> Bereiten Mikrozentrifugenröhrchen mit 1 ml PBS, eine für jede Kathetervorrichtung und halten sie auf Eis. </li><li> Euthanize die Tiere durch Genickbruch (2B) (1). </li><li> Desinfizieren Sie die Haut des Rückens mit 0,5% Chlorhexidin in 70% Alkohol oder mit Jod Isopropanol (1%). </li><li> Einen Einschnitt (ca. 3 cm) über den Katheter. </li><li> Schneiden subkutane Gewebe und entfernen Sie den Katheter Fragmente eins nach dem anderen unter Verwendung einer sterilen Pinzette das subkutane Gewebe (2B, (2)). </li><li> Griff Katheter vorsichtig in vertikaler Position und waschen Sie ihn zweimal mit 1 ml sterilem PBS. Setzen Sie jeden KatheterStück in ein separates Mikrozentrifugenröhrchen (hergestellt in Schritt 1). </li></ol> 10. Die Quantifizierung der Biofilm-assoziierte Zellen durch Koloniebildende Einheiten Count (KBE) und statistische Analysen der Ergebnisse <ol><li> Mit Ultraschall-Katheter zuvor in 1 ml PBS für 10 min bei 40.000 Hz in einem Wasserbad Beschallungsgerät platziert und sie auf Eis. </li><li> Nach der Ultraschallbehandlung kräftig für 30 Sekunden und Platz vortexen wieder auf Eis. </li><li> Bereiten Sie zwei weitere Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 ul PBS. </li><li> Achten 1:10 und 1: 100 Verdünnungen von Ihrem ursprünglichen Probe (die, die den Katheter enthält) und alle Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis zu halten. </li><li> Platte 100 ul der ursprünglichen Proben, 1:10 und 1: 100 Verdünnungen auf YPD-Agar-Platten in zweifacher Ausfertigung. </li><li> Inkubation erfolgt für 2 Tage bei 37 ° C und zählen KBE. </li><li> Zählen Sie die auf YPD-Agarplatten Kolonien (zählbare Menge von Kolonien, maximal 300 Kolonien / Platte) und multiplizieren Sie sie mit der richtigen DiluFaktors (1x-Original, 10x oder 100x Verdünnung). Ferner multiplizieren jedes Katheters Stück 10x, die der endgültigen Höhe der Kolonien in 1 ml Röhrchen mit dem Katheter entspricht. Bringen Sie die endgültige Höhe der Kolonien bis 10 Zellen / Katheterstück mit Standardabweichung (SD) anmelden. Express-Daten als Mittelwert ± SD. </li><li> Legen Sie alle Werte für jeden Katheters und spezifische Gruppe in eine Tabellenkalkulation und / oder statistischen Programms, um die oben erwähnten Berechnungen und statistischen Analysen durchzuführen. Geben Sie an, bestimmte Gruppen zu vergleichen, dh WT vs. Mutante oder 2 Tage vs. 6 Tage die Biofilmbildung und führen ungepaarter t-Test und ANOVA mit Tukey post-Test auf den log10-transformierten Daten. <ol><li> Express das Signifikanzniveau von einem p-Wert. In dieser Studie zeigen, Bedeutung, wenn p-Wert &lt;0,05, wie folgt vertreten: * p &lt;0,05, ** p &lt;0.005, *** p &lt;0,0005. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Verwendung von Tiermodellen und insbesondere Nagermodellen, für Studien zur mikrobiellen Biofilmen gewidmet ist sehr wichtig, da die Host-Immunsystem ist ein wesentlicher Faktor für die Bildung von Biofilmen, die in vitro-Modelle nicht erklären kann. In dieser Studie wurde eine relativ einfache subkutane C. beschreiben wir albicans Biofilm Mausmodell, die leicht in einem Forschungslabor angenommen werden kann und keine starke technische Fähigkeiten. Dieses Modell wurde ursprünglich entwick...

Candida albicans ist ein kommensalen Organismus, der an verschiedenen Stellen von gesunden Personen auf der Haut oder als ein Teil des Magen-Darm- und Vaginalflora gefunden werden kann, zum Beispiel. Jedoch bei stationär und insbesondere immungeschwächten Patienten kann es zu einer Vielzahl von Infektionen 1. In solchen Individuen, ermöglicht die Schwächung des Immunsystems Candida-Zellen in die Blutbahn zu verbreiten und die tieferen Gewebe eindringen verursacht lebensbedrohliche Infektionen. Darüber hinaus ist die Anwesenheit von abiotischen Substrate wie zentralvenöse und Blasenkathetern kann künstliche Herzklappen und Gelenke eine Nische für Candida Anlage 2. Die Haftung an solchen Substraten ist eine Voraussetzung für die weitere Entwicklung von Biofilmen, die eine Schicht aus Hefe und Hyphenzellen in extrazellulären polymeren Material eingebettet darstellt, die hauptsächlich aus Polysacchariden. 2 C. albicans Katheter-assoziierte Infektionensind mit hohen Sterblichkeit verbunden. Ein allgemeines Merkmal von Biofilmen ist ihre verminderte Empfindlichkeit gegenüber bekannten Antimykotika, wie Azole 3,4. Nur neuere Klassen von Antimykotika, wie Echinocandine und liposomale Formulierung von Amphotericin B bewiesen gegen Katheter-assoziierten Infektionen 5-7 aktiv zu sein. Aufgrund der Biofilm Widerstandsfähigkeit gegenüber Antimykotika, therapeutische Ansätze sehr begrenzt, oft Katheterentfernung und die anschließende Austausch als alleinige Lösung führt. Die meisten unserer aktuellen Verständnis C. albicans Biofilmentwicklung aus in vitro-Untersuchungen über abiotischen Substrate wie Polystyrol oder Kunststoffen zur Herstellung von oben genannten Geräte, das heißt, Silikon, Polyurethan 2 verwendet. Diese Modelle sind schon recht weit fortgeschritten und versuchen, die Situation in vivo so eng wie möglich zu imitieren. Allerdings sind diese Systeme nicht den kontinuierlichen Blutfluss und t bedeutener das Immunsystem des Wirts. Dies führte zur Entwicklung von in-vivo-Modellsysteme, wie beispielsweise die Zentralvenenkatheter (CVC) Modell 8-10, der Prothesenstomatitis Modell orale Candidiasis 11 und einem Mausmodell für katheterassoziierten Candidurie 12. Zusätzlich C. albicans Biofilmentwicklung wurde in vivo an den Schleimhautoberflächen, wie sie aus der Scheide 13 und der Mundhöhle 14 untersucht. Unser Labor trug mit der Einrichtung einer subkutanen C. albicans Biofilm Modell, das auf dem Implantat von infizierten Katheters Stücke auf der Rückseite des Sprague-Dawley-Ratten 15 basiert. Dieses Modell wurde erfolgreich im Labor verwendet, um Biofilmanfälligkeit Fluconazol testen und Echinocandin Arzneimittel 5,16, um die Wirkung der kombinatorischen Behandlung von Diclofenac und Caspofungin 17 zu studieren. In jüngerer Zeit hat dieses System, angepasst zur Verwendung in BALB / c-Mäusen, 18,19. InVergleich mit anderen in-vivo-Modellen ist der Hauptvorteil dieser subkutanen Modell die Möglichkeit, mehrere Biofilmen pro Tier innerhalb des Lumens des Katheters implantiert Stücke entwickelt studieren. Um die Anzahl der Versuchstiere zu reduzieren, haben wir dieses Modell, um die Entwicklung von C studieren angepasst albicans Biofilme nicht-invasiv mit Hilfe Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) 18,19. Dieses Verfahren erwies sich als ein leistungsfähiges Verfahren, das verwendet werden kann, um Biofilme durch Messung der spezifischen BLI Signal an dem interessierenden Bereich (in diesem Fall der Bereich des implantierten Katheter) zu quantifizieren, die Vermeidung Tier zu opfern. Im Vergleich zu Bakterien, die sowohl das Gen als auch das für die Biolumineszenz-Reaktion erforderlich Substrat aufgrund der Einführung eines spezifischen lux-Operon 20 exprimieren kann, werden die meisten eukaryotischen Organismen, einschließlich C. albicans, sind abhängig von der heterologen Expression eines Luciferase-Gens in Verbindung mit derexterne Verabreichung eines spezifischen Substrats, wie D-Luciferin oder Coelenterazin 21. Wahrscheinlich aufgrund der Gegenwart der pilzlichen Zellwand und C. albicans Morphogenese, die intrazelluläre Abgabe des Substrats für die Luciferase-Enzym war eine Hauptaufgabe 21. Um dieses Problem zu lösen, Enjalbert et al. 22 entwickelt eine Spannung, wo ein synthetisches C. albicans codon-optimierte Version des Gens für das natürlich sezerniert Gaussia princeps Luciferase (Gluc) wurde zu der C verschmolzen albicans PGA59 Gen, verankert ein GPI-Zellwandprotein. Wegen der Anwesenheit von Luciferase in der Zellwand, könnte Probleme hinsichtlich der intrazellulären Verfügbarkeit des Substrats vermieden werden. Dieses spezielle System wurde verwendet, um oberflächliche Infektionen durch C. verursacht studieren albicans 22. Vor kurzem BLI wurde auch verwendet, um das Fortschreiten von oropharyngealen Candidosen und seine possibl folgene-Behandlung 23. Diese Ergebnisse unterstützen die Verwendung von BLI als vielversprechende Technik, um Infektionen, die durch frei lebende Zellen, sondern auch geräteassoziierte Infektionen verursacht studieren. In dieser Studie beschreiben wir die C. albicans Biofilmentwicklung auf Polyurethankatheterstücke in BALB / c-Mäuse und ihre Quantifizierung mittels BLI. Wir stellen ein ausführliches Protokoll der in vitro Besiedlung von Polyurethankathetern während der Dauer der Anhaftung, gefolgt von der Implantation in Mäuse und anschließende Entwicklung von Biofilmen in lebenden Tieren. Neben der Messung der BLI-Signal von der C emittiert albicans-Zellen, ermitteln wir die Kolonie bildenden Einheiten für den Vergleich mit der Standardtechnik zur Biofilmpilzbelastung Quantifizierung.

<table><tbody><tr><td>Hefeextrakt granuliert</td><td>Merck</td><td>MERC1.03753.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriologisches Pepton</td><td>Oxoid</td><td>LP037B</td><td></td></tr><tr><td>Agar granuliert</td><td>Difco</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Fluka</td><td>49159-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Im Labor</td><td></td> hergestellt <td>für 1L von 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4, 2,4 g KH2PO4</td></tr><tr><td>RPMI1640 mit L-Glutamin und ohne Natriumcarbonat&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R6504-1L</td><td>Bereiten Sie sich gemäß dem Protokoll für Candida albicans-Empfindlichkeitstests vor.</td></tr><tr><td>3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS)</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>MOPS wird verwendet, um den pH-Wert des RPMI-Mediums (pH 7,0)</td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Polyurethan-Kuttel-Lumen intravenöses Katheterstück (2,4 mm Durchmesser, Certofix Trio S730) einzustellen</td><td>BBraun</td><td>CV-15703</td><td>Polyurethan-Teil in 1 cm große Stücke geschnitten</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Fagron SAS, Frankreich</td><td>611139</td><td>Immunsuppressivum (Stammlösung 10 mg/ml)</td></tr><tr><td>Ampicillin&nbsp;</td><td>Duchefa Biochemie, Niederlande</td><td>A0104</td><td>Antibakterielle Prophylaxe</td></tr><tr><td>Ketamin 1000</td><td>Pfizer</td><td>804 119</td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Domitor</td><td>Pfizer</td><td>134737-1</td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Antisedan</td><td>Pfizer</td><td>134783-2</td><td>Umkehrung der Anästhesie</td></tr><tr><td>Xylocain Gel (2%) - das ist Linisol</td><td>AstraZeneca</td><td>352 1206</td><td>Lokalanästhetikum für die Haut</td></tr><tr><td>Terramycin/ Polymyxin-b Augensalbe Zur Vorbeugung</td><td></td><td></td><td>von Austrocknung und Infektion der Augen</td></tr><tr><td>Coelenterazin&nbsp;</td><td>Prolume (Nanolicht)</td><td>NF-CTZ-FB</td><td>Lichtempfindliches Mittel (muss im Dunkeln aufbewahrt werden)</td></tr><tr><td>Jodisopropanol (1%)</td><td>3M&trade; DuraPrep&Handel; &nbsp;</td><td></td><td>Desinfektionsmittel für die Haut</td></tr><tr><td>0,5 % Chlorhexidin in 70 % Alkohol. &nbsp;</td><td>Cedium</td><td></td><td>Desinfektionsmittel für die Haut</td></tr><tr><td>Ausrüstung</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellzählkammer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulinspritzen (0,3 ml)</td><td>Terumo Myjector 29G</td><td>324826</td><td>Zur Injektion von Coelenterazin</td></tr><tr><td>Elektrischer Rasierer</td><td></td><td></td><td>Für Kleintiere</td></tr><tr><td>Sterile chirurgische Instrumente</td><td></td><td></td><td>Schere, 2 Paar Pinzetten, </td></tr><tr><td>Skalpell Heizkissen</td><td>Leica</td><td>14042321474</td><td></td></tr><tr><td>Hautnaht</td><td>Johnson& Johnson</td><td>K890H</td><td>Chirurgischer Faden, Nadel</td></tr><tr><td>Wasserbad-Ultraschallgerät</td><td>Branson 2210</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BLI Kamera (IVIS Spectrum)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Alameda</td><td>IVISSPE</td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Alameda</td><td></td><td>(Version 4.2)&nbsp;</td></tr></tbody></table>

candida albicans biofilm-entwicklung über die medizinisch relevanten fremdkörper in einem maus-modell durch subkutane biolumineszenz imaging gefolgt

Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging

Candida albicans Biofilm Entwicklung auf biotischen und / oder abiotischen Oberflächen stellt eine besondere Bedrohung für Krankenhaus-Patienten. Bisher C. albicans Biofilme überwiegend in vitro untersucht worden, aber es ist eine dringende Notwendigkeit für ein besseres Verständnis dieser Dynamik unter in vivo-Bedingungen. Wir entwickelten eine in vivo subkutanen Rattenmodell zu studieren C. albicans Biofilm-Bildung. In unserem Modell mehrere (bis zu 9) Candida infizierten Vorrichtungen zum Hinterteil des Tieres implantiert. Das gibt uns einen großen Vorteil gegenüber der zentralen Venenkatheter Modellsystem, da es erlaubt uns, mehrere unabhängige Biofilmen in ein Tier zu studieren. Vor kurzem hat dieses Modell, um C zu studieren wir angepasst albicans Biofilmentwicklung in BALB / c Mäusen. In diesem Modell reifen C. albicans Biofilme entwickeln innerhalb von 48 Stunden und zeigen die typische dreidimensionale Biofilmarchitektur. Die Quantifizierung von Pilz BiofilmTraditionell untersucht post mortem und erfordert Host Opfer. Da dies erfordert die Verwendung von vielen Tieren, um kinetische Untersuchungen durchzuführen, wandten wir nicht-invasiv Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) in Längsrichtung folgen in vivo reifen C. albicans Biofilme entwickeln in unserem Unterhautmodell. C. albicans-Zellen wurden entwickelt, um die Gaussia princeps Luciferasegen (Gluc) an die Zellwand gebunden auszudrücken. Die Biolumineszenz-Signal wird von der Luciferase, die das zugegebene Substrat Coelenterazin in Licht, das gemessen werden kann, wandelt hergestellt. Die BLI-Signal glich Zellzahlen aus explantierten Katheter erhalten. Nicht-invasive Bildgebung zur Quantifizierung von in vivo die Bildung von Biofilmen bietet sofortigen Anwendungen für das Screening und Validierung von Antimykotika unter in vivo Bedingungen, als auch für Studien, die auf Wirt-Pathogen-Interaktionen, hiermit einen Beitrag zu einem besseren Verständnising der Pathogenese der Katheter-assoziierten Infektionen.

In dieser Studie zeigen wir, das chirurgische Verfahren der Katheter-Implantat und Explantat während der in vivo C. albicans Biofilmentwicklung in einer Maus. Darüber hinaus zeigen wir die Quantifizierung der reife Biofilme nicht nur durch klassische KBE Aufzählung, sondern auch von BLI. Wie in 1A gezeigt, wurden nicht-phosphoreszierend Polyurethankatheter in Stücke von 1 cm geschnitten Vorrichtungen und anschließend mit Serum beschichtet. Dieser Schritt ist sehr wi...

Wir präsentieren ein experimentelles Verfahren zur Entwicklung von Candida albicans-Biofilmen in einem subkutanen Mausmodell. Die Quantifizierung der Pilzbiofilme erfolgte durch Bestimmung der Anzahl der koloniebildenden Einheiten und durch eine nicht-invasive Biolumineszenzbildgebung, bei der die Menge des erzeugten Lichts der Anzahl der lebensfähigen Zellen entspricht.

Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt

Candida albicans biofilm development on biotic and/or abiotic surfaces represents a specific threat for hospitalized patients. So far, C. albicans ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Verwendung eines Luciferase-exprimierenden Stammes für die nicht-invasive Überwachung der in vivo Biofilmbildung durch Candida albican Zellen zu validieren. Dies wird durch die Implantation von Katheterfragmenten, die mit einem Luciferase-exprimierenden Stamm von Candida albicans besiedelt sind, in den Rücken einer Maus erreicht. Im zweiten Schritt lässt man die Hefe zu einer dicken Zellschicht heranwachsen, die in eine extrazelluläre Matrix eingebettet ist, wodurch ein reifer Biofilm auf der Innenseite der Katheter entsteht.Als nächstes wird ein Substrat hinzugefügt, das durch das Luciferase-Enzym umgewandelt wird. Diese Reaktion erzeugt messbares Licht Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) wird dann verwendet, um die Bildung des Biofilms im lebenden Wirt aufzuzeichnen und zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Techniken, wie z. B. dem zentralen Venmo-System, besteht darin, dass wir bis zu sechs Biofilme in einem Tier testen können, wodurch die Anzahl der Tiere, die wir für die statistische Analyse benötigen, erheblich reduziert wird.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der Biofilmbildung von Candida albicans, da unsere Methode das einfache Testen bestehender und neuartiger antimykotischer Komponenten ermöglicht. Diese Methode kann auch Einblicke in Candida albicans, Pilzbiofilme, geben. Es kann auch auf andere Mikroben wie Bakterien oder andere lustige Spezies angewendet werden.Die vorgeschlagenen Verfahren sind in jedem Labor, das Zugang zu einer Tiereinrichtung hat, leicht umzusetzen: 24 Stunden vor dem chirurgischen Eingriff wird die Packung mit den dreilumigen Kathetern in einer biologischen Sicherheitswerkbank geöffnet. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um alle unnötigen Teile zu entfernen, und ein steriles Skalpell, um den am Katheter befestigten Teil zu schneiden. Legen Sie dann ein Lineal unter die Kunststoffverpackung und schneiden Sie den Polyurethan-Katheter in einen Zentimeter lange Stücke.Füllen Sie anschließend jeden Katheter mit etwa 1,8 Millilitern 100 % fötalem Rinderserum und inkubieren Sie die Stücke über Nacht bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie am nächsten Morgen jedes mit Serum beschichtete Katheterstück in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und kratzen Sie C albicans von der A YPD-Platte in einen Milliliter PBS in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen in einer Verdünnung von eins bis 100. Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von fünfmal 10 bis zu den vierten Zellen pro Milliliter.Und fügen Sie jedem der mit Serum beschichteten Katheterstücke einen Milliliter Zellen hinzu. Lassen Sie die Zellen 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius an den Kathetern haften. Halten Sie dann die Röhrchen mit einer sterilen Pinzette in einer vertikalen Position.Spülen Sie jedes Stück zweimal vorsichtig mit einem Milliliter PBS durch das Lumen, um die Katheter zu platzieren. Beginnen Sie damit, den unteren Rücken einer acht Wochen alten weiblichen anästhesierten Maus zu rasieren, die auf einem Heizkissen positioniert ist. Desinfizieren Sie dann die Haut und machen Sie einen kleinen Schnitt von 0,5 bis einem Zentimeter auf jeder Seite des Tieres.Als nächstes präparieren Sie den Subcu mit einer Schere, um zwei subkutane Tunnel von etwa 1,5 Zentimetern Länge und einem Zentimeter Breite zu erhalten. Führen Sie drei Katheterstücke in jeden Tunnel ein und achten Sie darauf, dass die Teile in horizontaler Anordnung nebeneinander liegen, ohne sich zu überlappen. Verschließen Sie die Schnitte mit Nähten und reinigen Sie die Wunden anschließend ganz sanft mit einem Desinfektionsmittel.Tragen Sie dann ein Lokalanästhetikum direkt auf die Schnitte auf und verabreichen Sie ein Narkosereversiermittel, um die Tiere zu überwachen, bis sie sich vollständig erholt haben. Um die Biofilmbildung zum geeigneten experimentellen Zeitpunkt abzubilden, injizieren Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete Spirale und Terezin subkutan in jeden Bereich, der die Katheter enthält, bei einem anästhesierten Tier. Erfassen Sie dann aufeinanderfolgende Scans mit Erfassungszeiten von 20 bis 60 Sekunden, bis die maximale Signalintensität erreicht ist.Platzieren Sie während der Aufnahme des nächsten Frames einen interessierenden Bereich über jedem Kathetertrio, um die biolumineszierende Bildgebung oder die BLI-Signalintensität der zuvor aufgenommenen Frames zu messen. Platzieren Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse mit fester Größe ebenfalls auf einem Kontrollbereich, um das Hintergrundsignal in einer Lebendigbildsoftware zu messen. Messen Sie den Photonenfluss durch die interessierenden Bereiche für jedes Kathetertrio sowie für den Hintergrund.Nach Wiederholung dieser Messungen für jedes Tier und zu verschiedenen Zeitpunkten während der Biofilmbildung wird die BLI-Signalintensität jedes Kathetertrios als Photonenfluss pro Sekunde gemessen. Die Daten können kopiert und direkt in ein Tabellenkalkulationsprogramm eingefügt werden. Am Ende des Längsschnittversuchs wird jedes Tier, das durch das Unterhautgewebe geschnitten wurde, geopfert und mit einer sterilen Pinzette die Katheterfragmente nacheinander entfernt.Waschen Sie die Katheter zweimal in einem Milliliter PBS, wie gerade gezeigt. Dann beschallen Sie die Stücke in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen in einem Milliliter frischem PBS bei 40.000 Hertz in einem Wasserbad. Nach 10 Minuten beschallen, die Röhrchen mit den Kathetern auf Eis legen und 100 Mikroliter der Originalproben in einer Verdünnung von eins zu 10 und einer zu 100 auf YPD-Agarplatten auffüllen.In doppelter Ausfertigung. Zeichnen Sie schließlich den Mittelwert und die Standardabweichung der koloniebildenden Einheiten auf. Und BLI-Signal für jedes Tier auf einer logarithmischen Skala.In diesem Bild ist ein repräsentatives Tier zu sehen, das das Biolumineszenzsignal zeigt, zusammen mit einer Region von Interesse, die sechs Tage nach der Biofilmentwicklung bezeichnet wird. Beachten Sie das Fehlen einer Signalübertragung im Hintergrundbereich der Kontroll, was die Beschränkung des Biofilms auf die Bereiche unmittelbar neben den Candida-beschichteten Kathetern bestätigt. In diesem repräsentativen Experiment kann ein deutliches BLI-Signal beobachtet werden, das von den Luciferase-exprimierenden Biofilmen erzeugt wird, während nur das Hintergrundsignal vom Wildtyp-Stamm erzeugt zu werden scheint.Diese Zunahme des Signals folgt dem gleichen Trend wie die Zunahme der koloniebildenden Einheiten pro Biofilm und die Messungen des Photonenflusses für jede Gruppe von Tieren zusammen. Diese Daten zeigen, dass BLI eine leistungsfähige Technik zur Überwachung und Quantifizierung der Bildung von reifen C albicans-Biofilmen in einem subkutanen Mausmodell in vivo ist. Nach der Beherrschung kann die Infektion von Geräten mit Candida-Zellen zwei Stunden dauern, während die Katheterimplantation in 10 Minuten pro Maus durchgeführt werden kann.Die BLI-Bildgebung kann in fünf Minuten pro Maus durchgeführt werden. Der große Vorteil der Verwendung von BLI besteht darin, dass Sie die Entwicklung von Biomasse und Biofilm bei ein und demselben Tier wiederholt überwachen können. Im Laufe der Zeit Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie MRT oder CT Aufschluss über die genaue Position der Kathedrale geben.Diese Informationen können dann für die Quantifizierung in komplexeren Modellen wie dem Kathedralenmodell der tiefen Vene verwendet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man in vivo, subkutanen Biofilm, ss bei Mäusen durchführt, und dies kann die Grundlage für eine weitere eingehende Analyse der Interaktionen zwischen Wirtserregern und Wirten bilden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt die Entwicklung eines in vivo Mausmodells zur Untersuchung der Biofilmbildung von Candida albicans im Unterhautgewebe. Bei dem Experiment werden Candida-infizierte Geräte in die Rückenregion des Tieres implantiert, um einen Biofilm zu bilden.

Candida albicans Biofilmbildung in einem in vivo Mausmodell

Hier beschreiben wir eine neuartige diabetische Mausmodell nutzt haarlose Mäusen für Echtzeit-, nicht-invasive Überwachung der Biofilm Wundinfektionen der Biolumineszenz Pseudomonas Aeruginosa. Diese Methode lässt sich die Infektion anderer Bakterienarten und genetisch veränderten Mikroorganismen, einschließlich Multi-Spezies Biofilme und testen die Wirksamkeit von Antibiofilm Strategien anpassen.

Besuchen Sie die Licht-Seite: In Vivo Monitoring von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Infektionen bei chronischen Wunden in einer diabetischen haarlose Mausmodell

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Geräts anpassbare automatisierte mikrofluidischen Biofilmbildung in Candida Albicans unter physiologischen Bedingungen Host zu visualisieren.

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Der Zweck dieses Protokolls ist es, Candida albicans Zellform und Lokalisation im Magen-Darm-Trakt des Säugetiers zu visualisieren.

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Um die internen Merkmale von Candida albicans Biofilmen zu sehen und zu quantifizieren, bereiten wir feste intakte Proben vor, die durch Brechungsindex-Matching geklärt werden. Dann kann die optische Schnittmikroskopie verwendet werden, um dreidimensionale Bilddaten durch die volle Dicke des Biofilms zu erhalten.

Klärende und Bildgebung Candida albicans Biofilme

Dieses Manuskript beschreibt die intravesikale Verabreichung  von uropathogenen Bakterien mit einem Lux-Operon zur Induktion einer Harnwegsinfektion bei Mäusen und die anschließende longitudinale In-vivo-Analyse der Bakterienbelastung mittels Biolumineszenzbildgebung.

Longitudinale Nachsorge von Harnwegsinfektionen und deren Behandlung bei Mäusen mittels Biolumineszenz-Bildgebung

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum Screening mittelgroßer Candida albicans-Mutantenbibliotheken auf Morphogenesephänotypen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt mittels nicht-invasiver konfokaler Mikroskopie.

Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt

Periprothetische Gelenkinfektionen (PJI), die durch gefährliche Krankheitserreger verursacht werden, sind in der klinischen Orthopädie weit verbreitet. Bestehende Tiermodelle können die tatsächliche Situation von PJI nicht genau simulieren. Hier haben wir ein Candida albicans-Biofilm-assoziiertes PJI-Mausmodell etabliert, um neue Therapeutika für PJI zu erforschen und zu entwickeln.

Ein periprothetisches Gelenk-Candida albicans-Infektionsmodell in der Maus

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Ein katheterbezogenes Candida albicans-Infektionsmodell in der Maus

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (aPDT) in einem Mausmodell der oralen Candidiasis. aPDT wurde mit einer wasserlöslichen Mischung aus Curcuminoiden und blauem LED-Licht durchgeführt.

Curcuminoid-vermittelte antimikrobielle photodynamische Therapie an einem Mausmodell der oralen Candidiasis

Dieses Protokoll beschreibt ein einzigartiges experimentelles Modell implantatbedingter Infektionen, das die gleichzeitige Inkubation von zwei Implantaten mit Bakterien unter identischen Bedingungen innerhalb einer einzigen Maus ermöglicht. Es ermöglicht auch eine präzise Beurteilung der Biofilmbildung auf Implantatoberflächen mit optimierten vergleichenden Analysemethoden und demonstriert fortschrittliche Techniken zur Bewertung der antimikrobiellen Eigenschaften von Biomaterialien.

Ein einzigartiges Mausmodell zur quantitativen Beurteilung der Biofilmbildung auf chirurgischen Implantaten bei subkutanem Abszess

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Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt (Video) | JoVE Journal

Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt

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