Candida albicans Biofilm-Entwicklung über die medizinisch relevanten Fremdkörper in einem Maus-Modell durch subkutane Biolumineszenz Imaging Gefolgt

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Verwendung eines Luciferase-exprimierenden Stammes für die nicht-invasive Überwachung der in vivo Biofilmbildung durch Candida albican Zellen zu validieren. Dies wird durch die Implantation von Katheterfragmenten, die mit einem Luciferase-exprimierenden Stamm von Candida albicans besiedelt sind, in den Rücken einer Maus erreicht. Im zweiten Schritt lässt man die Hefe zu einer dicken Zellschicht heranwachsen, die in eine extrazelluläre Matrix eingebettet ist, wodurch ein reifer Biofilm auf der Innenseite der Katheter entsteht.

Als nächstes wird ein Substrat hinzugefügt, das durch das Luciferase-Enzym umgewandelt wird. Diese Reaktion erzeugt messbares Licht Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) wird dann verwendet, um die Bildung des Biofilms im lebenden Wirt aufzuzeichnen und zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen bestehenden Techniken, wie z. B. dem zentralen Venmo-System, besteht darin, dass wir bis zu sechs Biofilme in einem Tier testen können, wodurch die Anzahl der Tiere, die wir für die statistische Analyse benötigen, erheblich reduziert wird.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der Biofilmbildung von Candida albicans, da unsere Methode das einfache Testen bestehender und neuartiger antimykotischer Komponenten ermöglicht. Diese Methode kann auch Einblicke in Candida albicans, Pilzbiofilme, geben. Es kann auch auf andere Mikroben wie Bakterien oder andere lustige Spezies angewendet werden.

Die vorgeschlagenen Verfahren sind in jedem Labor, das Zugang zu einer Tiereinrichtung hat, leicht umzusetzen: 24 Stunden vor dem chirurgischen Eingriff wird die Packung mit den dreilumigen Kathetern in einer biologischen Sicherheitswerkbank geöffnet. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um alle unnötigen Teile zu entfernen, und ein steriles Skalpell, um den am Katheter befestigten Teil zu schneiden. Legen Sie dann ein Lineal unter die Kunststoffverpackung und schneiden Sie den Polyurethan-Katheter in einen Zentimeter lange Stücke.

Füllen Sie anschließend jeden Katheter mit etwa 1,8 Millilitern 100 % fötalem Rinderserum und inkubieren Sie die Stücke über Nacht bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie am nächsten Morgen jedes mit Serum beschichtete Katheterstück in einzelne 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und kratzen Sie C albicans von der A YPD-Platte in einen Milliliter PBS in einem separaten Mikrozentrifugenröhrchen in einer Verdünnung von eins bis 100. Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von fünfmal 10 bis zu den vierten Zellen pro Milliliter.

Und fügen Sie jedem der mit Serum beschichteten Katheterstücke einen Milliliter Zellen hinzu. Lassen Sie die Zellen 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius an den Kathetern haften. Halten Sie dann die Röhrchen mit einer sterilen Pinzette in einer vertikalen Position.

Spülen Sie jedes Stück zweimal vorsichtig mit einem Milliliter PBS durch das Lumen, um die Katheter zu platzieren. Beginnen Sie damit, den unteren Rücken einer acht Wochen alten weiblichen anästhesierten Maus zu rasieren, die auf einem Heizkissen positioniert ist. Desinfizieren Sie dann die Haut und machen Sie einen kleinen Schnitt von 0,5 bis einem Zentimeter auf jeder Seite des Tieres.

Als nächstes präparieren Sie den Subcu mit einer Schere, um zwei subkutane Tunnel von etwa 1,5 Zentimetern Länge und einem Zentimeter Breite zu erhalten. Führen Sie drei Katheterstücke in jeden Tunnel ein und achten Sie darauf, dass die Teile in horizontaler Anordnung nebeneinander liegen, ohne sich zu überlappen. Verschließen Sie die Schnitte mit Nähten und reinigen Sie die Wunden anschließend ganz sanft mit einem Desinfektionsmittel.

Tragen Sie dann ein Lokalanästhetikum direkt auf die Schnitte auf und verabreichen Sie ein Narkosereversiermittel, um die Tiere zu überwachen, bis sie sich vollständig erholt haben. Um die Biofilmbildung zum geeigneten experimentellen Zeitpunkt abzubilden, injizieren Sie 100 Mikroliter frisch zubereitete Spirale und Terezin subkutan in jeden Bereich, der die Katheter enthält, bei einem anästhesierten Tier. Erfassen Sie dann aufeinanderfolgende Scans mit Erfassungszeiten von 20 bis 60 Sekunden, bis die maximale Signalintensität erreicht ist.

Platzieren Sie während der Aufnahme des nächsten Frames einen interessierenden Bereich über jedem Kathetertrio, um die biolumineszierende Bildgebung oder die BLI-Signalintensität der zuvor aufgenommenen Frames zu messen. Platzieren Sie einen rechteckigen Bereich von Interesse mit fester Größe ebenfalls auf einem Kontrollbereich, um das Hintergrundsignal in einer Lebendigbildsoftware zu messen. Messen Sie den Photonenfluss durch die interessierenden Bereiche für jedes Kathetertrio sowie für den Hintergrund.

Nach Wiederholung dieser Messungen für jedes Tier und zu verschiedenen Zeitpunkten während der Biofilmbildung wird die BLI-Signalintensität jedes Kathetertrios als Photonenfluss pro Sekunde gemessen. Die Daten können kopiert und direkt in ein Tabellenkalkulationsprogramm eingefügt werden. Am Ende des Längsschnittversuchs wird jedes Tier, das durch das Unterhautgewebe geschnitten wurde, geopfert und mit einer sterilen Pinzette die Katheterfragmente nacheinander entfernt.

Waschen Sie die Katheter zweimal in einem Milliliter PBS, wie gerade gezeigt. Dann beschallen Sie die Stücke in einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen in einem Milliliter frischem PBS bei 40.000 Hertz in einem Wasserbad. Nach 10 Minuten beschallen, die Röhrchen mit den Kathetern auf Eis legen und 100 Mikroliter der Originalproben in einer Verdünnung von eins zu 10 und einer zu 100 auf YPD-Agarplatten auffüllen.

In doppelter Ausfertigung. Zeichnen Sie schließlich den Mittelwert und die Standardabweichung der koloniebildenden Einheiten auf. Und BLI-Signal für jedes Tier auf einer logarithmischen Skala.

In diesem Bild ist ein repräsentatives Tier zu sehen, das das Biolumineszenzsignal zeigt, zusammen mit einer Region von Interesse, die sechs Tage nach der Biofilmentwicklung bezeichnet wird. Beachten Sie das Fehlen einer Signalübertragung im Hintergrundbereich der Kontroll, was die Beschränkung des Biofilms auf die Bereiche unmittelbar neben den Candida-beschichteten Kathetern bestätigt. In diesem repräsentativen Experiment kann ein deutliches BLI-Signal beobachtet werden, das von den Luciferase-exprimierenden Biofilmen erzeugt wird, während nur das Hintergrundsignal vom Wildtyp-Stamm erzeugt zu werden scheint.

Diese Zunahme des Signals folgt dem gleichen Trend wie die Zunahme der koloniebildenden Einheiten pro Biofilm und die Messungen des Photonenflusses für jede Gruppe von Tieren zusammen. Diese Daten zeigen, dass BLI eine leistungsfähige Technik zur Überwachung und Quantifizierung der Bildung von reifen C albicans-Biofilmen in einem subkutanen Mausmodell in vivo ist. Nach der Beherrschung kann die Infektion von Geräten mit Candida-Zellen zwei Stunden dauern, während die Katheterimplantation in 10 Minuten pro Maus durchgeführt werden kann.

Die BLI-Bildgebung kann in fünf Minuten pro Maus durchgeführt werden. Der große Vorteil der Verwendung von BLI besteht darin, dass Sie die Entwicklung von Biomasse und Biofilm bei ein und demselben Tier wiederholt überwachen können. Im Laufe der Zeit Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie MRT oder CT Aufschluss über die genaue Position der Kathedrale geben.

Diese Informationen können dann für die Quantifizierung in komplexeren Modellen wie dem Kathedralenmodell der tiefen Vene verwendet werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein sehr gutes Verständnis dafür haben, wie man in vivo, subkutanen Biofilm, ss bei Mäusen durchführt, und dies kann die Grundlage für eine weitere eingehende Analyse der Interaktionen zwischen Wirtserregern und Wirten bilden.