Genomweite Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Screening Protein-Fragment Komplementierungsassay (PKA) in lebenden Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Proteininteraktionspartner eines Proteins von Interesse mit dem DI-Hydro-Folat-Reduktase-Proteinfragment-Komplementationsassay oder D-H-F-R-P-C-A zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die DH FFR F drei Sammlungen oder Lobeshymnen auf Kolonie-Arrays mit hoher Dichte kondensiert werden. Als nächstes wird der Köderstamm mit dem Array des Lobes auf Rich Medium hergestellt.

Im letzten Schritt werden die aus diesen Paarungen resultierenden Diploiden selektiert. Letztendlich wird die Rekonstitution des DHFR durch Messung der Koloniegrößen auf selektivem PCA-Medium quantifiziert, was ein Signal gibt, das proportional zur Menge des in den Zellen rekonstituierten Köderbeutekomplexes ist. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Krankheiten wie Krebs, da sie durch die Neuverdrahtung von Proteininteraktionsnetzwerken erfolgt.

Dass Mutationen zu solchen Krankheiten führen können. Sterilisieren Sie die Roboterplattform am Morgen des Eingriffs, indem Sie die PIN-Werkzeuge zunächst fünfmal für 10 Sekunden in der Wasserbadstation einweichen, um alle Zellklumpen zu entfernen. Weichen Sie dann das PIN-Werkzeug zweimal in der Bürstenstation hin und her und zweimal in der So-Cater-Station für jeweils 20 Sekunden ein, um alle verbleibenden Zellen zu entfernen, während die PIN-Werkzeuge gereinigt werden.

Schalten Sie die UV-Lampe fünf Minuten lang ein, um einen Roboter zu sterilisieren. Trocknen Sie die PIN-Werkzeuge nach dem letzten Waschen 25 Sekunden lang in der Lufttrocknerstation. Kondensieren Sie hier die A-D-H-F-R-Sammlung auf 16 Arrays mit 384 Stämmen.

Ein 384-Array kann in vier Quadranten mit gleichem Abstand unterteilt werden, die jeweils aus 96 Positionen in einem Matrixlayout von zwei mal zwei für insgesamt vier Quadranten bestehen. Um dies für jedes 384-Array zu tun, drucken Sie vier Glycerinplatten auf die vier Quadranten eines Omni-Tabletts, das YPD plus 250 Mikrogramm pro Milliliter enthält. Hygromycin B führt dazu unter Verwendung des 96-Pin-Werkzeugs 4 96-Well-Platten mit der LDH FFR F 3-Negativkontrolle zwischen die 60 Glycerinplatten aus der DHFR-3-Sammlung ein, um einen endgültigen Satz von 64 Platten zu erhalten, die genau vier 1.536-Arrays füllen.

Setzen Sie dann 4 96-Well-Platten mit dem LDH FFR F und drei Negativkontrollen zwischen die 60 anderen Platten ein, um einen endgültigen Satz von 64 Platten zu erhalten, die genau 4 15 bis 36 Arrays füllen, bevor Sie Zellen zu den Quellplatten hinzufügen. Benetzen Sie die sterilisierten Pins mit 35 Millilitern sterilem Wasser in einem Omni-Tablett in der Nassstation. Inkubieren Sie die Arrays zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius und kondensieren Sie die Sammlung dann in vier Arrays mit 1.536 Stämmen. Drucken Sie vier Arrays mit 384 Stämmen auf jede der vier Zielplatten.

Mit dem 384-Pin-Werkzeug. Sterilisieren des PIN-Tools zwischen jedem Replikationszyklus, wie gerade nach einer weiteren zweitägigen Inkubation gezeigt. Standardisieren Sie die Koloniegröße, indem Sie die vier Arrays auf dem ausgewählten YPD-Medium mit einem 1.536-Pin-Tool replizieren und die Platten weitere 48 Stunden lang inkubieren.

Für einen hohen Durchsatz. D-H-F-R-P-C-A inokulieren zunächst eine Kultur des Köderstamms in 20 Milliliter flüssiges YPD plus CIO-Rizin in einem 50-Milliliter-Röhrchen und inkubieren die Zellen zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius unter Schütteln bei 250 U/min. Wenn die Kultur die Sättigung erreicht hat.

Geben Sie fünf Milliliter der Zellsuspension auf ein YPD plus Mücken-Omni-Tablett und lassen Sie die Zellen nach fünf bis 10 Minuten an der Oberfläche einziehen, entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit und inkubieren Sie die Kultur nach zwei Tagen bei 30 Grad Celsius. Verwenden Sie das 1.536-Pin-Werkzeug, um den Köderstamm auf 12 YPD-Platten zu drucken, wobei Sie mit jedem Zellenrasen nicht mehr als viermal verwenden. Drucken Sie dann mit dem 1.536-Pin-Werkzeug erneut das entsprechende Array für die DHFR F 3-Sammlung auf die Köderzellen.

Lassen Sie die Stämme sich während einer weiteren zweitägigen Inkubation paaren und wählen Sie dann die diploiden Zellen aus, indem Sie die Kolonien auf Omni-Tabletts drucken, die YPD plus Hydro, Mycin, B und Norton enthalten. Inkubieren Sie die Diploiden für zwei weitere Tage bei 30 Grad Celsius und wiederholen Sie dann die Selektion, wie gerade einen Tag nach Beginn der Inkubation gezeigt. Gießen Sie am nächsten Tag Platten mit Medien, die Methotrexat enthalten.

Verwenden Sie das 1.536-Pin-Werkzeug, um diploide Zellen auf das Methotrexatmedium zu drucken, und inkubieren Sie die Platten weitere vier Tage lang in Plastiktüten, um die Kulturen vor dem Austrocknen zu schützen. Am dritten Tag der Inkubation. Gießen Sie eine zweite Charge von Omni-Trays mit MTX-Medium ein, wie gerade am nächsten Tag demonstriert, schalten Sie das Roboterlicht ein und verwenden Sie eine Roboterplattform, um die Platten abzubilden, um das Hintergrundwachstum der PCA-Stämme zu verringern und die quantitative Auflösung zu erhöhen, replizieren Sie die Zellen auf der zweiten Charge von MTX-Medien, um eine zweite Runde der MTX-Auswahl durchzuführen, wie gerade gezeigt.

Nachdem Sie Bilder von der zweiten Gruppe von Platten aufgenommen haben, analysieren Sie die Kolonie-Arrays mit der entsprechenden Software und sammeln Sie die Informationen zur Koloniegröße für jede Position jedes Arrays. Der mit den LDH FFR F drei Kontrollen definierte Schwellenwert kann als empirischer Schwellenwert zur Bestimmung der Treffer mit hohem Konfidenzniveau verwendet werden. Die bekannten physikalischen Interaktoren des Köders können dann aus Datenbanken wie Biogrid abgerufen und mit den Daten überlagert werden.

Zum Beispiel wurden hier fünf von acht Treffern mit hoher Konfidenz zuvor als NUP 82-Interaktoren gemeldet, unter denen andere NUP 16 und NUP 1 59 als Teil des NUP 82-Unterkomplexes bestimmt wurden. Die Daten deuten auch darauf hin, dass das approximale Membranprotein PEX 30 eine neue physikalische Interaktion von Nup 82 darstellen könnte, wie mit D-H-F-R-P-C-A bei niedrigem Durchsatz bestätigt wurde, wie zwei der anderen detektierten Interaktionspartner bestätigt wurden. Es wurde festgestellt, dass die neuen 20 und die neuen 85 nicht Teil des neuen 82-Subkomplexes sind, was die Fähigkeit von D-H-F-R-P-C-A veranschaulicht, die Wechselwirkungen innerhalb und zwischen den Unterkomplexen größerer Komplexe zu erkennen.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, Freshly Report-Medien zu verwenden, um eine Fehlerbehebung bei den Druckschritten zu vermeiden, und die erforderlichen Kontrollen einzuschließen, um sicherzustellen, dass das endgültige PCA-Medium nur das Wachstum von Zellen ermöglicht, die eine DHFR-Komplementation aufweisen.