Name: Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Lernen Sie die Immunhistochemie zur Visualisierung von Mikroglia und Neuronen in gefrorenen Rattenhirnschnitten. Dieses Protokoll zeigt eine zuverlässige Methode für die Neuroforschung.

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Die Autoren möchten Herrn Ryan Hart und Herrn Arriz Lucas für ihr unschätzbares Feedback zu dieser Mitteilung danken. Diese Arbeit wurde vom NIH NINDS R01 NS065052 und dem Phoenix Children's Hospital Mission Support Funds unterstützt.

HINWEIS: Alle Verfahren wurden in Einklang mit den institutionellen Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der Universität von Arizona durchgeführt. Eine Liste der empfohlenen Materialien und Geräte können in Tabelle 1 gefunden werden. 1. Gewebepräparation <ol><li> Perfusion <ol><li> Euthanize Nager mit einer Überdosis von Natriumpentobarbital (25 mg / kg, IP), und transkardial perfundiert mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), bis sie vollständig ausgeblutet (3-5 min) bei einer Flussrate von 8 ml / min. Für umfassende Perfusion Anweisungen finden Sie Gage et al 2012 9. </li><li> Unmittelbar im Anschluss an PBS spülen, fixieren Gewebe durch Perfusion mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 15-20 min bei einer Flussrate von 8 ml / min. </li><li> Entfernen Gehirn und in 4% Paraformaldehyd für 24 h, gefolgt von einer abgestuften Saccharoselösungen (15%, 30%, 30%, in der Reihenfolge, in Tris gepufferter Kochsalzlösung) auf 4 ° C. Übertragen Sie das Gehirn, um die nachfolgende Saccharoselösung only Nachdem sich das Gehirn in jeder Lösung versenkt. Anmerkung: Normalerweise, 5 Tage in jeder Lösung ist ausreichend Zeit für Gewebe zu sinken. </li></ol></li><li> Tissue Freezing und Kryoschneiden <ol><li> Platzieren des Gehirns in Einbettungsmedium, wie OCT-Verbindung und tauchen in Isopentan bei einer Temperatur von -35 ° C. Ermöglichen das Gehirn für ein Minimum von 10 min Einfrieren und dann bei -80 ° C lagern. Probleme können entstehen, wenn Fleiß Temperatur wird nicht übernommen; finden Sie Informationen zur Fehlerbehebung Diskussion. </li><li> Geschnitten serielle Kranzschnitte mit einer Dicke von 20 &amp; mgr; m und einer Temperatur von -20 ° C. Sammeln Gewebe auf positiv geladene Objektträger. Hirnschnitte können in einer Dia-Box in der Folie bei -80 ° C eingewickelt in einer Zip-Top-Tasche und dort zentral langfristig platziert werden. Diese Art der Lagerung verursacht einen doppelten Begrenzungs die Exposition gegenüber Luft und Frost zu verhindern. </li></ol></li></ol> 2. Gewebeverarbeitung HINWEIS: Beispiel Ausrüstung und Materialien rzur Färbung equired sind in Abbildung 3 dargestellt. Alternativen zur Verfügung stehen, jedoch werden diese Bilder zu unterstützen diejenigen, die mit immunhistochemischen Färbung geeignete Produkte vor dem Kauf zu visualisieren. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: Beispiel Produkte zur immunhistochemischen Färbung erforderlich Die in (A) gezeigt, Black Box ist ein idealer Feuchtigkeitskammer für Immunfluoreszenz, wie Objektträger werden vor Licht ohne die Notwendigkeit, auf Folie wickeln Sie das Feld geschützt.. Nach Schnitte können Folien in einer Box, wie die in (B) gezeigt, gelben Kasten gelagert werden. Wickeln Sie das Feld dicht in der Folie und Platzierung in einem zip-Top-Tasche vor dem Gefrier hilft den Gewebeproben von Gefrierbrand zu schützen. Ein Beispiel für Folien ist in (C), wobei in (D) dargestellt verschiedenen färbekasten und da (E </strong&gt;). Deckgläser können in Größe und Dicke (F) variieren jedoch 1,2 dicken Deckgläser bieten schöne Imaging-Ergebnisse auf den meisten aufrecht und konfokale Mikroskope. Ein Bleistift, wie die in (G) gezeigt ist, kann verwendet werden, um Folien zu markieren. Filzstiften sollte vermieden werden, da die Tinte ausgeführt werden kann, die sowohl die Färbung und die Fähigkeit zu bestimmen, welche die Probe. Ein Mini-pap pen, wie sie in (H) gezeigt, ermöglicht eine abstoßende Grenze auf Objektträger gezogen werden. <ol><li> Slide Vorbereitung <ol><li> Folien aus dem Gefrierschrank und Tauwetter entfernen bei Raumtemperatur. <ol><li> Optional: Wenn Abschnitte wurden zuvor von Dias schwebte, legen Sie aufgetaut Dias in einem Ofen bei 60 ° C für nicht mehr als 4 Stunden, um zu verhindern, dass Gewebeschnitte von schwimmenden off Folien. </li></ol></li><li> Die Objektträger in einem Objektträgergestell und entsprechenden Gericht. </li><li> Wasch gleitet dreimal in PBS für jeweils 5 Minuten, Ändern Lösung zwischen Wäschen. Von diesem Schritt nach vorn, zu vermeiden, dass Abschnitons ohne Flüssigkeit über längere Zeiträume. Hinweis: Sofern Teile trocknen, wird die Hintergrundfärbung erhöht und aussagekräftige Daten nicht zuverlässig erreicht werden. </li></ol></li><li> Gewebefärbung <ol><li> In einem lichtdichten Box Färbung, erstellen Sie eine &quot;feuchte Kammer&quot; mit fusselfreien Gewebe mit VE-Wasser eingeweicht. </li><li> Trocknen Sie die Ränder der Objektträger mit einem fusselfreien Tuch, verwenden Sie einen Mini pap Stift, um eine flüssigkeitsabweisende Grenz ganz am Rand des Objektträgers zu machen, weg von Gewebeschnitten. Diese Grenze sollte ausreichend Raum zwischen dem Meniskus der Flüssigkeit und dem Rand des Gewebes, so dass die Oberflächenspannung nicht beeinflusst Markierung sicherzustellen. HINWEIS: Der Pap pen abweisende Grenz kann vor 2.1.3 angelegt, wenn die Antikörper von Interesse nicht Mikrowelle Antigen-Retrieval verlangen. Wenn der PAP-Stift wurde vor dem Waschen in PBS aufzuerlegen, ist die Integrität der flüssigkeitsabweisenden Grenze bei diesem Schritt geprüft. Verwenden Sie ein Mini-pap Stift, um in Öffnungen in der Grenze zu füllen. </li><li&gt; Mit Dias horizontal gelegt, Block nicht-spezifische Antigen-Bindung durch Inkubation in 4% v / v Serum in PBS (Blocklösung). Pipette 300 ul Block Lösung pro Objektträger für 1 h bei Raumtemperatur. Sicherzustellen, dass der Block-Lösung erstreckt sich zu dem pap Stift an der Kante der Folie und das Gewebe vollständig abdeckt ungleichmäßige Anfärbung durch Oberflächenspannung in der Nähe des Gewebes zu vermeiden. <ol><li> Verwenden Serum von der gleichen Spezies in dem sekundären Antikörper durchgeführt wird. Anmerkung: In diesem Verfahren werden die sekundären Antikörper in Esel gemacht und damit Eselsserum verwendet. Wenn Sekundärantikörper aus zwei oder mehr verschiedenen Arten verwendet werden, umfassen Serum von jeder Spezies. </li></ol></li><li> Pipette primären Antikörper auf Objektträger. Hinweis: Antikörperkonzentrationen für diese Färbung haben bei 1 optimiert: 5000 und 1: 500 für Iba1 und Pan-neuronalen sind. Diese Konzentrationen haben sich als sinn Färbung mit einer Abwesenheit von Hintergrundfärbung zu zeigen. <ol><li> Verdünnen Block Lösung1% Serum in PBS und fügen primären Antikörper. Pipette 300 ul primären Antikörperlösung in 1% Serum pro Folie. Wieder zu beachten, die Flüssigkeit an der Kante des pap Stift. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Fügen Sie drei Kontrollobjektträger: eine, die weder Iba1 noch Pan-neuronalen Antikörper enthält, eine mit Iba1 ohne Pan-neuronalen Antikörpers und eines mit Pan-neuronalen Antikörper ohne Iba1. Fleck diese Folien in der gleichen Flucht mit den gleichen Lösungen, aber die primären Antikörper weggelassen werden, um die nicht-spezifische Bindung der sekundären Antikörper zu testen. </li></ol></li><li> Am nächsten Morgen, Wasch gleitet dreimal in PBS für jeweils 5 Minuten, Ändern Lösung zwischen den Waschgängen. </li><li> Fluoreszierende Antikörper sind lichtempfindlich, daher von dieser Schritt nach vorn, Lichtexposition zu minimieren, indem sichergestellt Waschbehälter werden in Folie eingewickelt und Hybridisierung Kästen sind entweder schwarz oder im Dunkeln inkubiert. Pipettieren Sie die entsprechenden Sekundärantikörper auf allen Folien und Inkubation für60 min bei Raumtemperatur in einer Konzentration von 1: 250 in Blocklösung (siehe Schritt 2.2.3) in einer lichtdichten &quot;feuchte Kammer&quot; (siehe Schritt 2.2.1). <ol><li> Verwenden Sekundärantikörper unterschiedlicher Wellenlängen. Hier für den primären Antikörper Kaninchen-anti-Iba1 Verwenden Esel anti- Kaninchen 594 als geeigneter sekundärer Antikörper. Für den primären Antikörper Maus-Anti-Pan-neuronalen Verwenden Esel-anti-Maus 488 als geeigneter sekundärer Antikörper. Alternativ können Sie Anti-Kaninchen-488 und Anti-Maus-594. </li></ol></li><li> Wasch gleitet dreimal in PBS für jeweils 5 min. </li><li> Optional: durchführen Kernfärbung. <ol><li> Platz in Hoechst (oder andere Kernfärbung) in einer Konzentration von 0,03 ug / ml in doppelt destilliertem H 2 0 für genau 60 sec. </li><li> Wasch gleitet dreimal in PBS für jeweils 5 min. </li></ol></li><li> In ddH 2 0 waschen. </li></ol></li><li> Eindecken <ol><li> Deckglasobjektträger mit einer wässrigen Einschlussmittel, wie beispielsweise Fluoromount-G oder ProlongGold. Achten Sie darauf, um alle Blasen mit einem Wattestäbchen entfernen. Hinweis: Andere Befestigungsmittel verwendet werden könnte, hat sich jedoch hohe Durchschlag zwischen den Farbstoffen, die durch einige wenige Tage nach Eindecken festgestellt worden. </li><li> Verwenden klarem Nagellack, um die Kanten zu versiegeln, verhindern, dass die Abschnitte vor dem Austrocknen durch Verdunstung. Lassen Sie Nagellack auf eine lichtdichte Behälter trocken, während in flachen Folien und bei Raumtemperatur bleiben, und dann in einem lichtdichten Behälter in Folie bei 4 ° C eingewickelt zu speichern. </li></ol></li></ol> 3. Abbilden der gefärbten Gewebe <ol><li> Mikroskopie <ol><li> Lassen Sie den Nagellack, um für mindestens eine Stunde trocknen vor Beginn der Mikroskopie, welche in einem abgedunkelten Raum stattfinden sollte. </li><li> Erwerben Mikrophotographien mit einem konfokalen oder Forschungsmikroskop mit einer fluoreszierenden Lichtquelle und einer digitalen Kamera Anhaftung. Mit Hilfe der beiliegenden Software, stellen Sie die Belichtung für jede Wellenlänge - 405, 488, und 594 - getrennt. Hinweis: Tiefenabbildungsanweisungen sollten Online vom Mikroskop-Hersteller zur Verfügung. </li><li> Erwerben Mikroaufnahmen in jedem Kanal, ohne die Teile oder Einstellung des Fokus. Nehmen Sie Bilder in Farbe, in Graustufen oder alternativ und konvertieren, um danach zu färben. Hinweis: Farb- oder Graustufenbilder von jedem Kanal können in der Nachbearbeitung zusammengetragen werden. </li><li> Sicherzustellen, dass die Gewebeabschnitte nicht auf Umgebungslicht oder Licht mikroskopisch für lange Zeit ausgesetzt, als Photobleich der Abschnitte auftritt. Um dies zu vermeiden, erhöhen Sie die Belichtungszeit, anstatt die Licht- / Laserintensität. </li><li> Schalten Sie nicht die Fluoreszenzlichtquelle innerhalb von 30 Minuten eingeschaltet. Hinweis: Schalten Sie die Quelle an und aus kurz hintereinander kann die Lebensdauer der Leuchtstofflampe zu verringern. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Marrack, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+of+antigens+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemistry of antigens and antibodies.</a> Nature. 134, 468-469 (1934).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das übergeordnete Ziel dieser Mitteilung war die Immunhistochemie Verfahren für den Leser einzuführen. Hierzu wird das Beispiel der Doppelmarkierung mit Iba1 und Pan-neuronale Antigene an Mikroglia und Neuronen in Paraformaldehyd perfundiert beobachten, wurde Saccharose kryogeschützt, gefriergeschnitten Rattenhirn verwendet. Diese Technik lässt sich an endlosen Zwecken dienen werden. Ein Array von verschiedenen Antigenen in einer Vielzahl von Gewebetypen, wie beispielsweise, jedoch nicht dar...

<html> Immunohistochemie ist ein Verfahren zum Nachweis von Antigenen (dh Proteine) in Gewebeschnitten unter Verwendung von primären Antikörpern, die spezifisch gegen die Antigene von Interesse binden. Immunhistochemie wurde von JR Marrack 1934 Pionierarbeit geleistet, als er festgestellt, dass Antikörper könnten Antigene mit großer Spezifität 1 zu lokalisieren. Ab 1942 einige der ersten in-vitro-Studien unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern immunhistochemisch visualisieren veröffentlicht wurden 2,3, wonach die erste in vivo histochemische Studie veröffentlicht 4. Während der 1960er drei Jahrzehnte nach dem Beginn des immunhistochemische Verfahren begann, Enzym-konjugierten Antikörper als sekundäre Reagentien verwendet werden. Diese Methoden wurden gleichzeitig und unabhängig voneinander in Frankreich und in den USA 5,6 entwickelt. Heute, ein breites Spektrum von Antikörpern bietet unendlich viele Möglichkeiten für die Immunhistochemie Studien 7. &quot;&gt; Das übergeordnete Ziel dieser Korrespondenz ist es, eine kurze Einführung in immunhistochemischen Färbung bereitzustellen; es ist nicht als eine umfassende und abschließende Bewertung dieser Technik werden in der Methode beschrieben werden immunhistochemischen Techniken für zwei Antigene präsentiert (Marker für die Mikroglia und. Neuronen) für die Färbung von Paraformaldehyd perfundiert beginnt Saccharose kryogeschützt, gefriergeschnitten Rattenhirn. Die immunhistochemische Färbung mit Blockierungs unspezifische Antigen-Bindung an die Hintergrundfärbung zu reduzieren. Als nächstes wird die Inkubation mit dem primären Antikörper können zur Bindung an ein spezifisches Antigen im Gewebe. Im Anschluss an die primären Antikörper, ein anderer Antikörper, bezeichnet als sekundärer Antikörper, aufgebracht wird, um den primären Antikörper auf einen konjugierten Visualisierungssignal 8 zu verknüpfen. Der sekundäre Antikörper zielt auf das Immunglobulin G (IgG) Domäne spezifisch für die Spezies, in denen das primäre Antikörper gezüchtet wurde. Der sekundäre Antikörper verstärkt das Signal, des primären Antikörpers, da die Fab Regionen ter sekundären Antikörper binden sich an mehreren Stellen auf dem IgG-Domäne des primären Antikörpers. Entweder Enzymen oder fluoreszierenden Moleküle an die Fc-Bereiche der sekundären Antikörper konjugiert ermöglichen Visualisierung. Beispielsweise ist ein Kaninchen-Anti-Iba1 Primärantikörper ein Kaninchen-IgG-Molekül spezifisch für Iba1. Wenn Esel-Anti-Kaninchen-IgG als sekundärer Antikörper verwendet, wird es zu erkennen und zu mehreren Regionen des Kaninchen-Anti-Iba1 IgG (siehe 1), zu binden. Der Esel-Antikörper kann durch verschiedene Verfahren sichtbar gemacht werden. Diese Entsprechung konzentriert sich auf Erfassung eines Fluorophors an den sekundären Antikörper, der den primären Antikörper erkennt, zur Sichtbarmachung durch Fluoreszenzmikroskopie konjugiert. In fluoreszierenden Immunhistochemie kann eine Kernfärbung wie Hoechst oder DAPI verwendet, um alle Kerne zu visualisieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: SchEmatic Darstellung direkte vs. indirekte Antikörper-Markierungstechniken. Antikörper binden an das Antigen von Interesse und kann durch sekundäre Antikörper, die gegen die Spezies des primären Antikörper erzeugt amplifiziert werden. Diese Technik kann durchgeführt werden unter Verwendung von Avidin-Biotin-Komplex (ABC) zur Verstärkung und DAB zur Visualisierung (A) oder einem direkt konjugierten fluoreszierenden Sekundärantikörper (B). Alternativ können primäre Antikörper direkt mit vielen verschiedenen Tags, einschließlich Biotin oder ein Fluorophor (C) konjugiert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Ein alternatives Verfahren zur Visualisierung von immunhistochemischen Färbung verwendet 3,3&#39;-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB; siehe 1 und 2). Dies unterscheidet sich von Fluoreszenz, die durch Verwendung eines biotinylierten oderMeerrettich-Peroxidase (HRP) konjugierten Sekundärantikörper, die ein Enzym, um DAB zu einem Niederschlag, der unter Hellfeldmikroskopie sichtbar zu konvertieren bietet. In Fällen, in denen eine einzige Antigen von Interesse ist oder Färbung ist erforderlich, langlebig zu sein, kann DAB besser geeignet als Fluoreszenzfärbung ist. Allerdings DAB-Färbung nicht zur Differenzierung zwischen mehreren Markern gut geeignet, vor allem, wenn zwei nukleäre Antigene von Interesse. Informationen zur DAB Materialien und Protokoll Änderungen, wenden Tabelle 1. Alternativ Nitroblautetrazoliumchlorid / 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (NBT / BCIP) kann verwendet werden, um eine alkalische Phosphatase (AP) konjugierten sekundären visualisieren Antikörper. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52293/52293fig2highres.jpg" /> Abb. 2: Repräsentative Bilder von Nickel-verstärkten DAB einfach markierten Rattenhirngewebeschnitten Rattenhirn-sections, die mit Nickel-verstärkten DAB für Iba1 (A) und Pan-neuronalen (B) markiert sind, ermöglichen eine lang anhaltende Analyse von Mikrogliazellen oder Neuronen allein. Maßstabsleiste 20 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52293/52293fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Man muß bedenken die geschätzte Häufigkeit des Antigens von Interesse innerhalb des Gewebes analysiert. Indirekten Methoden (wie oben beschrieben) sind nützlich für Ziele mit geringer Häufigkeit. Wenn das Antigen von Interesse in besonders hoher Zahl, können direkte Verfahren aufgebracht werden. Direkte Verfahren umfassen einen primären Antikörper, der direkt an ein Visualisierungssignal konjugiert ist, und damit keine sekundären Antikörpers erforderlich ist. Diese Methode vereinfacht die Färbung Prozess, aber beseitigt die durch indirekte Methoden erreicht Verstärkung. Mit Hilfe eines direkt konjugierten primären Antikörper beseitigt auch Kreuzreaktivität Sekundärantikörperals Doppelmarkierung. Diese Mitteilung beschreibt die Protokoll für Doppelmarkierung mit Iba1 und Pan-neuronalen (Details in Tabelle 1). Iba1 Flecken Mikroglia-Aktivierung in vielen Staaten, darunter verzweigte, hyperverzweigte, aktiviert, amoeboid und Stange. Pan-neuronalen Flecken neuronalen Axonen, Dendriten, und Soma. Seit Iba1 Flecken meisten Mikroglia und Pan-neuronalen Ziele das Neuron ist diese Kombination von Flecken nützlich gewinnen ein umfassendes Verständnis von Mikroglia-Neuron-Interaktionen. Zusammengefasst beruht die immunhistochemische Färbung auf die sorgfältige Auswahl von Antikörpern. Da die Fragestellung wird präziser können Antikörper, Antigene, um alternative angehoben wünschen übrig. Um einen bestimmten Mikrogliaaktivierung Staaten abzielen, kann man sich dafür entscheiden, CD45 oder CD68-Antikörper verwenden, anstatt Iba1. Ferner wird bei der Arbeit mit Mäusen, F4 / 80 können die erforderlichen Ergebnisse zu liefern. In ähnlicher Weise kann die neuronale Elemente spezifisch mit Antikörpern ra gezieltsierten gegen den Zellkern, synapse (Pre- oder Post), Axon, und Wachstumskegel. Darüber hinaus gibt es andere Markierungen, die das Alter des Neurons (Doppel-Cortin, NeuN) unterscheiden und neuronalen Regeneration (GAP-43).

<table><tbody><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus Glas-Objektträger&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td>Zur Gewebebefestigung (1.2.2)</td></tr><tr><td>Ofen</td><td>Thermo Scientific</td><td>51028112</td><td>Zur Gewebetrocknung (2.1.1)</td></tr><tr><td>Mini Pap Pen</td><td>Life Technologies</td><td>00-8877</td><td>Zur Verwendung in Schritt 2.2.2</td></tr><tr><td>Andwin Scientific Tissue-tek Objektträger-Färbeschale</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-149-429</td><td>Wird für alle Wäschen während der Färbung (2.2) sowie für die Hoechst-Stufe (2.2.8) verwendet&nbsp;</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666-A</td><td>Wird zum Trocknen von Objektträgern verwendet (2.2)</td></tr><tr><td>Black Staining Box</td><td>Ted Pella</td><td>21050</td><td>Wird zum Blockieren und Färben von Schritten verwendet (2.2)</td></tr><tr><td>Normales Eselserum</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-413-253</td><td>Wird für die Block- und Antikörperinkubation verwendet (2.2)</td></tr><tr><td>Maus & alpha;-Panneuronale</td><td>Millipore</td><td>MAB2300</td><td>Wird für Primärantikörper verwendet (2.2.4)</td></tr><tr><td>Kaninchen &alpha;-Iba1</td><td>Wako Chemical</td><td>019-19741</td><td>Zur Verwendung als Primärantikörper (2.2.4)</td></tr><tr><td>Esel &alpha;-Kaninchen 594</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>Zur Verwendung als Sekundärantikörper (2.2.6)</td></tr><tr><td>Esel & Alpha-Maus 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-545-150</td><td>Zur Verwendung als Sekundärantikörper (2.2.6)</td></tr><tr><td>Caterer's foil</td><td>Beliebig</td><td>N/A</td><td>Wird in den Schritten 1.2.2 und 2.3.2 verwendet</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Wird zum Eindecken verwendet (2.2.8)</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>Wird zum Eindecken verwendet (2.2.8)</td></tr><tr><td>Klarer Nagellack&nbsp;</td><td>Alle</td><td>N/A</td><td>Wird für Deckgläser verwendet (2.2.8)</td></tr><tr><td>Axio Observer.Z1 und LSM 710 (Laserscanning, konfokal)</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Wird für die Bildgebung verwendet (3)</td></tr><tr><td>Axioskop A2</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Wird für die Bildgebung verwendet (3)</td></tr><tr><td>CitriSolv&nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td></td><td>Für DAB-Protokoll</td></tr><tr><td>ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td>Für DAB-Protokoll</td></tr><tr><td>DAB-Peroxidase-Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Für DAB-Protokoll</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Pferd &Alpha;-Kaninchen IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1100</td><td>Für DAB-Protokoll</td></tr><tr><td>Biotinyliertes Pferd &Alpha;-Maus IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-2001</td><td>Für DAB-Protokoll</td></tr><tr><td>30 % Wasserstoffperoxid</td><td>FisherScientific</td><td>H325-500</td><td>Für DAB-Protokoll</td></tr><tr><td>Wheaton-Objektträgergestelle und Färbeschalen</td><td>TedPella</td><td>21043</td><td>Für DAB-Protokoll</td></tr><tr><td>Masterflex Perfusionspumpe und -schläuche</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td>Wird für die Perfusion verwendet (1.1.1 und 1.1.2)</td></tr><tr><td>Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT Verbindung (12 Stück)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td>Zum Einfrieren von Gewebe (1.2.1)</td></tr><tr><td>Thermometer (-50 bis 50 C)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-059-228</td><td>Zum Einfrieren von Gewebe (1.2.1)</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM3500S</td><td>Zur Verwendung für Gewebeschnitte (1.2.2)</td></tr><tr><td>Färbeschale, Kunststoff mit 2 Deckeln</td><td>Grale Scientific</td><td>353</td><td>Für Antigen-Retrimm</td></tr><tr><td>20 Platz Färbegestell, Objektträger Horizontal</td><td>Grale Scientific</td><td>354</td><td>Für Antigen-Retrimm</td></tr><tr><td>Mikrowelle</td><td>Beliebig</td><td>N/A</td><td>Für Antigen-Retrimm</td></tr></tbody></table>

primer für die immunhistochemie auf gefriergeschnitten rat brain tissue: beispiel färbung für mikroglia und neuronen

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Erfassung der Anwesenheit, den Ort und die relative Häufigkeit von Antigenen in situ. Dieser Einführungs Level-Protokoll beschreibt die Reagenzien, Geräte und Techniken erforderlich, um die immunhistochemische Färbung von Hirngewebe von Nagern zu vervollständigen, mit Markern für Mikrogliazellen und neuronale Elemente als Beispiel. Genauer gesagt, dieses Papier ist ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für fluoreszierende Visualisierung von Mikroglia und Neuronen über die Immunhistochemie für Iba1 und Pan-neuronalen sind. Fluoreszenzdoppelmarkierung ist besonders nützlich für die Lokalisierung mehrerer Proteine ​​innerhalb der gleichen Probe, die Bereitstellung der Möglichkeit, genau zu beobachten Wechselwirkungen zwischen Zelltypen, Rezeptoren, Liganden und / oder der extrazellulären Matrix in Relation zueinander sowie Protein Co- Lokalisierung innerhalb einer einzelnen Zelle. Im Gegensatz zu anderen Visualisierungstechniken kann Fluoreszenz Immunhistochemie Färbeintensität Abnahmedie Wochen bis Monate nach Färbung, es sei denn, entsprechende Vorkehrungen getroffen werden. Trotz dieser Einschränkung in vielen Anwendungen Fluoreszenzdoppelmarkierung über Alternativen wie 3,3&#39;-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) oder alkalische Phosphatase (AP) bevorzugt, da die Fluoreszenz zeiteffizienter und ermöglicht genauere Unterscheidung zwischen zwei oder mehr Marker. Die Diskussion enthält Tipps zur Fehlerbehebung und Beratung zum Erfolg zu fördern.

Diese Färbung Protokoll führt Rattenhirngewebeschnitten, die Mikroglia fluoreszenz im Kanal 594 (rot) markiert sind und Neuronen in dem Kanal 488 markiert (grün; siehe Abbildung 4). Wenn eine Kernfärbung durchgeführt wurde, wird es in der 405-Kanal (blau) zeigen. Bilder können in verschiedenen Kanälen zwischen zwei beliebigen Kanälen aufgenommen werden und überlagert zum direkten Vergleich der drei Kanäle oder. Viele digitale Erfassungssoftware Suiten verfügen diese Funktionalität. Doppelmarkierung mit ...

Dieses Einführungsprotokoll beschreibt die Reagenzien, Geräte und Techniken, die erforderlich sind, um die immunhistochemische Färbung von Nagetiergehirnen durchzuführen, am Beispiel von Markern für Mikroglia und neuronale Elemente.

Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe der Immunhistochemie Proteine von Interesse sichtbar zu machen. In diesem Beispiel sind dies IBA1 für Mikroglia und pan-neuronale Marker für Neuronen. Dazu werden vorbereitete Schnitte zunächst in eine Blockierungslösung gegeben, um unspezifische Bindungen zu verhindern.Als zweiten Schritt werden Antikörper, die die beiden verschiedenen Proteine von Interesse erkennen, über Nacht auf die Schnitte aufgebracht. Anschließend werden die Schnitte gewaschen und mit sekundären Antikörpern inkubiert, um die primären Antikörper mit fluoreszenten Markern zu versehen. Die Ergebnisse der Doppelfärbung können Mikroglia-Färbungen innerhalb neuronaler Felder aufzeigen.Allgemein haben Personen, die neu in dieser Technik sind, anfangs Schwierigkeiten, da viele Variablen angepasst werden müssen. Hazel May, eine Studierende in unserem Labor, wird diese Technik heute demonstrieren. Beginnen Sie damit, Nagetiergehirne vorsichtig gemäß dem begleitenden Textprotokoll zu fixieren und zu schneiden, und lagern Sie sie anschließend sorgfältig bei minus 80 Grad Celsius, bis sie benötigt werden.Wenn Sie bereit sind, mit dem Protokoll fortzufahren, nehmen Sie die Objektträger aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen legen Sie die Objektträger in einen Halter und waschen Sie dreimal in PBS, jeweils fünf Minuten lang. Ab diesem Zeitpunkt dürfen die Schnitte nicht austrocknen.Trocknen Sie die Ränder der Objektträger und ziehen Sie mit einem Pap-Pen einen flüssigkeitsabweisenden Rand um die Kante des Objektträgers, um eine gleichmäßige Benetzung der Flüssigkeit sicherzustellen und Randeffekte zu reduzieren. Blockieren Sie anschließend die Schnitte, indem Sie 300 µL Serum in PBS auf jeden Objektträger geben. Das Serum sollte von der Art stammen, in der der sekundäre Antikörper hergestellt wurde.In diesem Fall wurde Essserum verwendet. Stellen Sie sicher, dass die Blockierungslösung bis zum Rand des Objektträgers reicht und das Gewebe vollständig bedeckt. Um eine ungleichmäßige Färbung zu vermeiden, legen Sie die Objektträger zur Inkubation bei Raumtemperatur für eine Stunde in eine Feuchtkammer.Während der Inkubation bereiten Sie die Primärantikörper vor, indem Sie das IBA1-Antikörper auf 1:5.000 und das pan-neuronale Antikörper auf 1:500 in einer Mischung aus 1 % Eselserum in PBS verdünnen. Entfernen Sie die Blockierungslösung und geben Sie 300 Mikroliter der Antikörperlösung hinzu, die beide Antikörper enthält. Bereiten Sie außerdem drei Kontrollpräparate vor.Geben Sie 300 Mikroliter der IVA, jeweils eine Verdünnung allein auf einen Objektträger, 300 Mikroliter der pan-neuronalen Antikörperverdünnung allein auf einen zweiten Objektträger und 300 Mikroliter 1 % Essserum in PBS auf einen dritten Objektträger. Legen Sie alle Objektträger in eine Feuchtkammer und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am folgenden Morgen waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS.Bereiten Sie die fluoreszierende Sekundärantik&ouml;rpermischung vor, indem Sie beide im Verh&auml;ltnis 1 zu 250 in 1&nbsp;% Essserum in PBS verd&uuml;nnen. Geben Sie 300 Mikroliter der Mischung auf jeden Objekttr&auml;ger und legen Sie die Objekttr&auml;ger f&uuml;r 60 Minuten bei Raumtemperatur in eine lichtundurchl&auml;ssige Feuchtekammer. Waschen Sie anschlie&szlig;end die Objekttr&auml;ger dreimal f&uuml;r jeweils f&uuml;nf Minuten in PBS und sp&uuml;len Sie sie abschlie&szlig;end mit doppelt destilliertem Wasser. Schützen Sie die Objektträger während des Waschens vor Licht. Geben Sie in PBS einige Tropfen eines wässrigen Eindeckmediums, das zur Erhaltung der Fluoreszenzsignalintensität beiträgt, auf jeden Objektträger. Decken Sie dann ab, schieben Sie den Deckgläser auf und entfernen Sie verbliebene Luftblasen mit einem mit Watte abgeschlossenen Applikator, um das Eindeckmedium auf den Objektträgern zu versiegeln und ein Austrocknen der Schnitte zu verhindern.Bestreichen Sie die Ränder mit Nagellack. Die Objektträger werden eine Stunde lang flach in einer lichtgeschützten Box getrocknet, bevor sie in einem lichtundurchlässigen Behälter, der mit Folie umwickelt ist, bei vier Grad Celsius gelagert werden. Sobald der Nagellack getrocknet ist, bringen Sie die Objektträger in den Mikroskopieraum, um sie abzubilden. Bereiten Sie den Raum vor, indem Sie das Deckenlicht ausschalten und alle anderen externen Lichtquellen abdunkeln. Schalten Sie das Mikroskop, die Fluoreszenzlichtquelle und den Bildgebungsrechner ein. Anschließend platzieren Sie eine Objektträgerplatte auf dem Mikroskoptisch und fokussieren sie.Stellen Sie mithilfe der beigefügten Software die Belichtung für jede Wellenlänge separat ein. Vermeiden Sie es, das Präparat über längere Zeiträume starkem Licht auszusetzen, um eine Photobleiche des Probenmaterials zu verhindern. Anschließend nehmen Sie die Bilder in jedem Kanal auf, ohne den Schnitt zu verschieben oder die Fokussierung zu verändern.Kombinieren Sie die Bilder mithilfe der Bildgebungssoftware und speichern Sie sie für die spätere Bildanalyse. Mit dem soeben beschriebenen Färbeprotokoll lassen sich fluoreszierende Bilder wie die hier gezeigten einfach im roten Kanal erhalten, wobei IBA1-positive Mikroglia deutlich sichtbar sind, und im grünen Kanal heben sich pan-neuronale positive Neuronen deutlich vom Hintergrund ab. Die Kontrollbilder für beide Antikörperfärbungen sind dargestellt.Doppelmarkierung im Dunkelfeld mit IBA1 und einem pan-neuronalen Marker zeigt hier überwiegend ramifizierte Mikrogliazellen mit langen, feinen neuronalen Fortsätzen, die in allen kortikalen Schichten sichtbar sind. Färbungsergebnisse wie die hier gezeigten können auch bei schlechter Gewebequalität auftreten. Eine schlechte Gewebequalität zeigt sich durch das Fehlen klar definierter Zellkörper sowie fragmentierte mikrogliale und neuronale Fortsätze.Es liegt eine unklare Mikroglia-Färbung und ein vollständiger Mangel an Neuronen-Färbung vor, wodurch das überlagerte Bild bei Anwendung dieser Technik nicht aussagekräftig ist. Es ist wichtig, die Schnitte gleichmäßig zu bedecken und darauf zu achten, dass sie zwischen den Schritten nicht austrocknen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis einführender immunhistochemischer Techniken haben.

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Forschung

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Immunfärbung von fluoreszenzmarkierten Astrozyten in einem Schnitt aus einem Gewebeschnitt aus dem Gehirn einer Maus

Quelle: Evilsizor, M. N., et. al., Primer für Immunhistochemie an kryogeschnittenem Hirngewebe von Ratten: Beispielfärbung für Mikroglia und Neuronen. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt ein schrittweises immunhistochemisches Färbeverfahren an kryosektioniertem Hirngewebe von Ratten, um die räumliche Anordnung von Mikroglia und Neuronen zu visualisieren.

Immunhistochemische Färbung von Kryoschnitten aus koronalem Gewebe der Ratte auf Mikroglia und Neuronen

Wir präsentieren hier ein optimiertes, detailliertes Protokoll für die Doppelimmunfärbung in Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitten des Zentralnervensystems (ZNS) und des peripheren Lymphknotens (LN) von Ratten.

Immunhistochemische Analyse im Rat des Zentralnervensystems und peripheren Lymphknoten Gewebeschnitte

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Gleichzeitige Kryoschneiden mehrere Nagetier Gehirne

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das nahezu infrarote Farbstoffe in Verbindung mit Immunhistochemie und hochauflösendem Scannen verwendet, um Proteine in Hirnregionen zu untersuchen.

Einsatz von Infrarot-Fluoreszenz und hochauflösendem Scannen zur Messung des Protein-Expression im Rodentrains

Dieses Protokoll beschreibt einen schrittweisen Workflow für die immunfluoreszierende Costainierung von IBA1 und TMEM119, zusätzlich zur Analyse der mikrogliaalen Dichte, Verteilung und Morphologie sowie der peripheren myeloischen Zellinfiltration im Gehirngewebe der Maus.

Immunfluoreszenzfärbung mit IBA1 und TMEM119 für Mikroglia-Dichte, Morphologie und periphere Myeloid-Zellinfiltrationsanalyse im Maushirn

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Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

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Frei schwebende Immunfärbung von Mausgehirnen

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Bewertung der Zelltodsignalisierung durch Immunfluoreszenz in einem Rattenmodell für ischämische Schlaganfälle

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Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Ein Open-Source-, benutzerfreundliches Werkzeug zur quantitativen Analyse der Mikrogliamorphologie

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Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

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