Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mithilfe der Immunhistochemie Proteine von Interesse sichtbar zu machen. In diesem Beispiel sind dies IBA1 für Mikroglia und pan-neuronale Marker für Neuronen. Dazu werden vorbereitete Schnitte zunächst in eine Blockierungslösung gegeben, um unspezifische Bindungen zu verhindern.

Als zweiten Schritt werden Antikörper, die die beiden verschiedenen Proteine von Interesse erkennen, über Nacht auf die Schnitte aufgebracht. Anschließend werden die Schnitte gewaschen und mit sekundären Antikörpern inkubiert, um die primären Antikörper mit fluoreszenten Markern zu versehen. Die Ergebnisse der Doppelfärbung können Mikroglia-Färbungen innerhalb neuronaler Felder aufzeigen.

Allgemein haben Personen, die neu in dieser Technik sind, anfangs Schwierigkeiten, da viele Variablen angepasst werden müssen. Hazel May, eine Studierende in unserem Labor, wird diese Technik heute demonstrieren. Beginnen Sie damit, Nagetiergehirne vorsichtig gemäß dem begleitenden Textprotokoll zu fixieren und zu schneiden, und lagern Sie sie anschließend sorgfältig bei minus 80 Grad Celsius, bis sie benötigt werden.

Wenn Sie bereit sind, mit dem Protokoll fortzufahren, nehmen Sie die Objektträger aus dem Gefrierschrank und lassen Sie sie bei Raumtemperatur auftauen. Nach dem Auftauen legen Sie die Objektträger in einen Halter und waschen Sie dreimal in PBS, jeweils fünf Minuten lang. Ab diesem Zeitpunkt dürfen die Schnitte nicht austrocknen.

Trocknen Sie die Ränder der Objektträger und ziehen Sie mit einem Pap-Pen einen flüssigkeitsabweisenden Rand um die Kante des Objektträgers, um eine gleichmäßige Benetzung der Flüssigkeit sicherzustellen und Randeffekte zu reduzieren. Blockieren Sie anschließend die Schnitte, indem Sie 300 µL Serum in PBS auf jeden Objektträger geben. Das Serum sollte von der Art stammen, in der der sekundäre Antikörper hergestellt wurde.

In diesem Fall wurde Essserum verwendet. Stellen Sie sicher, dass die Blockierungslösung bis zum Rand des Objektträgers reicht und das Gewebe vollständig bedeckt. Um eine ungleichmäßige Färbung zu vermeiden, legen Sie die Objektträger zur Inkubation bei Raumtemperatur für eine Stunde in eine Feuchtkammer.

Während der Inkubation bereiten Sie die Primärantikörper vor, indem Sie das IBA1-Antikörper auf 1:5.000 und das pan-neuronale Antikörper auf 1:500 in einer Mischung aus 1 % Eselserum in PBS verdünnen. Entfernen Sie die Blockierungslösung und geben Sie 300 Mikroliter der Antikörperlösung hinzu, die beide Antikörper enthält. Bereiten Sie außerdem drei Kontrollpräparate vor.

Geben Sie 300 Mikroliter der IVA, jeweils eine Verdünnung allein auf einen Objektträger, 300 Mikroliter der pan-neuronalen Antikörperverdünnung allein auf einen zweiten Objektträger und 300 Mikroliter 1 % Essserum in PBS auf einen dritten Objektträger. Legen Sie alle Objektträger in eine Feuchtkammer und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am folgenden Morgen waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS.

Bereiten Sie die fluoreszierende Sekundärantikörpermischung vor, indem Sie beide im Verhältnis 1 zu 250 in 1 % Essserum in PBS verdünnen. Geben Sie 300 Mikroliter der Mischung auf jeden Objektträger und legen Sie die Objektträger für 60 Minuten bei Raumtemperatur in eine lichtundurchlässige Feuchtekammer. Waschen Sie anschließend die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS und spülen Sie sie abschließend mit doppelt destilliertem Wasser.

Schützen Sie die Objektträger während des Waschens vor Licht. Geben Sie in PBS einige Tropfen eines wässrigen Eindeckmediums, das zur Erhaltung der Fluoreszenzsignalintensität beiträgt, auf jeden Objektträger. Decken Sie dann ab, schieben Sie den Deckgläser auf und entfernen Sie verbliebene Luftblasen mit einem mit Watte abgeschlossenen Applikator, um das Eindeckmedium auf den Objektträgern zu versiegeln und ein Austrocknen der Schnitte zu verhindern.

Bestreichen Sie die Ränder mit Nagellack. Die Objektträger werden eine Stunde lang flach in einer lichtgeschützten Box getrocknet, bevor sie in einem lichtundurchlässigen Behälter, der mit Folie umwickelt ist, bei vier Grad Celsius gelagert werden. Sobald der Nagellack getrocknet ist, bringen Sie die Objektträger in den Mikroskopieraum, um sie abzubilden.

Bereiten Sie den Raum vor, indem Sie das Deckenlicht ausschalten und alle anderen externen Lichtquellen abdunkeln. Schalten Sie das Mikroskop, die Fluoreszenzlichtquelle und den Bildgebungsrechner ein. Anschließend platzieren Sie eine Objektträgerplatte auf dem Mikroskoptisch und fokussieren sie.

Stellen Sie mithilfe der beigefügten Software die Belichtung für jede Wellenlänge separat ein. Vermeiden Sie es, das Präparat über längere Zeiträume starkem Licht auszusetzen, um eine Photobleiche des Probenmaterials zu verhindern. Anschließend nehmen Sie die Bilder in jedem Kanal auf, ohne den Schnitt zu verschieben oder die Fokussierung zu verändern.

Kombinieren Sie die Bilder mithilfe der Bildgebungssoftware und speichern Sie sie für die spätere Bildanalyse. Mit dem soeben beschriebenen Färbeprotokoll lassen sich fluoreszierende Bilder wie die hier gezeigten einfach im roten Kanal erhalten, wobei IBA1-positive Mikroglia deutlich sichtbar sind, und im grünen Kanal heben sich pan-neuronale positive Neuronen deutlich vom Hintergrund ab. Die Kontrollbilder für beide Antikörperfärbungen sind dargestellt.

Doppelmarkierung im Dunkelfeld mit IBA1 und einem pan-neuronalen Marker zeigt hier überwiegend ramifizierte Mikrogliazellen mit langen, feinen neuronalen Fortsätzen, die in allen kortikalen Schichten sichtbar sind. Färbungsergebnisse wie die hier gezeigten können auch bei schlechter Gewebequalität auftreten. Eine schlechte Gewebequalität zeigt sich durch das Fehlen klar definierter Zellkörper sowie fragmentierte mikrogliale und neuronale Fortsätze.

Es liegt eine unklare Mikroglia-Färbung und ein vollständiger Mangel an Neuronen-Färbung vor, wodurch das überlagerte Bild bei Anwendung dieser Technik nicht aussagekräftig ist. Es ist wichtig, die Schnitte gleichmäßig zu bedecken und darauf zu achten, dass sie zwischen den Schritten nicht austrocknen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis einführender immunhistochemischer Techniken haben.