Methode Isolated Ex vivo Lung Perfusion in einem Rattenmodell: Lehren aus Entwicklung einer Ratte EVLP Programm gelernt

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein konsistentes Ex-vivo-Lungenperfusionsmodell für Ratten zu erstellen, das reproduzierbare Ergebnisse liefert. Der erste Schritt besteht darin, die Luftröhre zu kanülieren und mit der mechanischen Beatmung zu beginnen. Als nächstes werden die Lungenarterie und der linke Vorhof kanüliert.

Der letzte Schritt besteht darin, den Herz-Lungen-Block aus der Brusthöhle zu entfernen und in den ex vivo Lungenperfusionskreislauf zu legen. Letztendlich werden Drucksensoren, Gewichtsmessköpfe und ein Blutgasanalysator verwendet, um den Zustand der Lunge in Echtzeit anzuzeigen, indem der pulmonalarterielle Druck und andere Parameter gemessen werden. Die Ex-vivo-Lungenprofusion ist eine bemerkenswerte Technologie, die es uns ermöglicht hat, den Spenderpool für Lungentransplantationen zu erweitern.

Wir gehen davon aus, dass wir durch diese Technologie, die als Plattform für die Organbewertung dient, die Qualität der Organe, die zur Transplantation gebracht werden, und die allgemeinen Transplantationsergebnisse verbessern können. Hier im Kupferlabor haben wir den Ausdruck "Bewaffnung des Organs" geprägt, d. h. das Organ bewerten, umbauen oder reparieren und dann modifizieren, um die Qualität und damit die Transplantationsergebnisse zu verbessern. Wir haben ein robustes und reproduzierbares Kleintier-Rattenmodell der ex vivo Lungenperfusion entwickelt.

In diesem Video zeigen wir Ihnen die wichtigsten und entscheidenden Schritte zur Entwicklung dieses ex vivo Lungenperfusionsmodells, das dann als Plattform für die Perfusions- und Transplantationsforschung dienen kann. Beginnen Sie mit der Einrichtung des EVLP-Stromkreises und der Zirkulation der Warmdurchblutung Acht im gesamten System. Stellen Sie das Warmwasserbad, den Wärmetauscher und den künstlichen Thorax auf 37 Grad Celsius ein.

Lassen Sie ein Desoxysauerstoffgas durch den PERFUSE acht in den Gasfilter laufen, um sicherzustellen, dass er etwa 6 % gelösten Sauerstoff für das Experiment enthält. Schließen Sie nach dem Öffnen des Datenerfassungsprogramms den Druckwandler der Lungenarterien, die Luftröhre, den Differenzdruckwandler, den Atemfluss, den Differenzdruckwandler, den Lungengewichtswandler und den Pumpendrehzahlwandler an die Analog-Digital-Wandlerbox an. Stellen Sie abschließend den Operationstisch auf und bereiten Sie alle für den Eingriff erforderlichen Operationswerkzeuge und Verbrauchsmaterialien vor.

Nachdem Sie die Sedierung mit der Zehe überprüft haben, kneifen Sie das anästhesierte Tier in Rückenlage auf den Operationstisch. Beginnen Sie mit der Datenaufzeichnung mit dem Datenerfassungsprogramm. Wenn Sie fertig sind, dringen Sie in die Bauchhöhle ein und injizieren Sie Heparin in die untere Hohlvene.

Befolgen Sie die Standardverfahren, kanülieren Sie die Luftröhre und schließen Sie die Kanüle an einen Beatmungskreislauf an. Schalten Sie das mechanische Beatmungsgerät ein, um mit der mechanischen Beatmung der Lunge zu beginnen. Ziehen Sie dann die Brusthöhle zurück, um die Lungen freizulegen, und achten Sie darauf, sie nicht zu berühren.

Entfernen Sie den Thymus und verschieben Sie den Bauchinhalt zur Seite, um entweder die Vena cava inferior oder die Vena mesenterica freizulegen. Legen Sie nach der Euthanasie eine Seidennaht hinter die Lungenarterie und die Aorta. Zur Vorbereitung der Sicherung der Lungenarterienkanüle wird ein zwei bis drei Millimeter großer Schnitt an der vorderen Fläche des rechtsventrikulären Ausflusstrakts vorgenommen und die Kanüle in die Lungenhauptarterie eingeführt.

Entfernen Sie mit einer Seidennaht die Gerinnsel aus dem Lungengefäßsystem, indem Sie etwa 15 Milliliter einer kaliumarmen positiven Elektrolytlösung durch die Lungenarterie und durch die Herzspitze perfundieren. Positionieren Sie als Nächstes eine Seidennaht hinter dem Herzen und um die Herzkammern. Um die Mitralklappe zu erweitern und die Kanülierung zu erleichtern, führen Sie eine kleine chirurgische Zange durch die Mitralklappe in die Spitze und in den linken Vorhof ein.

Wenn Sie fertig sind, führen Sie eine Kanüle durch die Mitralklappe in die Spitze und in den linken Vorhof ein. Befestigen Sie die linke Vorhofkanüle mit der Seidennaht. Verbinden Sie anschließend die Lungenarterienkanüle mit dem EVLP-Kreislauf.

Stellen Sie sicher, dass die aus dem Kreislauf kommende Zuflussleitung mit Perfuse acht grundiert ist. Um zu verhindern, dass Luft in Herz und Lunge gelangt, schalten Sie die Hauptperistaltikpumpe ein und stellen Sie sie auf eine niedrige Drehzahl ein. Dadurch kann Perfundus acht durch die Lungenarterie und aus dem linken Ventrikel in die Brusthöhle verlaufen.

Überwachen Sie den Druck der Lungenarterie, um sicherzustellen, dass er nicht ansteigt, was auf eine Verstopfung oder eine schlechte Kanülierung hinweist. Wenn Sie fertig sind, schalten Sie die Schlauchpumpe aus. Verbinden Sie die Lungenarterienkanüle mit dem ex vivo Lungenperfusionskreislauf

Schließen Sie die linke Vorhofkanüle erst dann an den Kreislauf an, wenn der Herz-Lungen-Block aus dem Körper entfernt wurde. Entfernen Sie den Herz-Lungen-Block, indem Sie die Speiseröhre mit einem Blutstiller einklemmen und unter die Klemme schneiden, so dass die Speiseröhre verwendet werden kann, um die Herz-Lungen-Strukturen stumpf anzuheben, das umliegende Gewebe zu präparieren und die absteigende Aorta und die Hilfsgefäße zu durchtrennen, um den Herz-Lungen-Block zu befreien, während Sie ihn über die Speiseröhre anheben. Durchtrennen Sie die Luftröhre, um den Herz-Lungen-Block zu befreien, und platzieren Sie ihn an der dafür vorgesehenen Stelle im EVLP-Kreislauf.

Verbinden Sie dann die linke Vorhofkanüle mit der Abflussleitung und starten Sie die Schlauchpumpe. Um Lüftungsdaten aufzuzeichnen und den Druck zu überwachen, entfernen Sie schnell die Belüftungsleitung von der Oberseite des EVLP-Geräts und befestigen Sie das Gehäuse mit den Drucksensoren. Führen Sie anschließend die Belüftungsleitung wieder auf das EVLP-Gerät ein.

Stellen Sie sicher, dass die Blasenfalle ausreichend mit Perfunde acht gefüllt ist. Um zu vermeiden, dass während der ersten 15 Minuten Luftblasen in die Lunge gelangen, ändern Sie die Beatmungs- und Perfusionseinstellungen langsam auf die gewünschten experimentellen Niveaus. Erhöhen Sie die Perfusionsflussrate auch in dieser ersten Anlaufphase auf die gewünschte Geschwindigkeit und den gewünschten Druck.

Es wird empfohlen, das Beatmungsgerät so zu programmieren, dass es intermittierende Seitenatmungen erzeugt, um die Bewegung der Flüssigkeit aus dem Lungenraum zu erleichtern und das Auftreten von Ödemen zu verzögern. Definieren Sie den Zeitpunkt Null als den Zeitpunkt, an dem die Beatmungsparameter bei einem Atemzugvolumen von vier Millilitern pro Kilogramm positiv sind. Beenden Sie den Exspirationsdruck bei zwei Zentimetern.

Die H2O- und Perfusionsparameter liegen auf dem erwarteten Niveau und bleiben konstant. Falls gewünscht, entnehmen Sie acht Proben aus dem Schockfrost des Probenanschlusses in flüssigem Stickstoff und notieren Sie den Zeitpunkt der Probenentnahme. Wenn das Experiment abgeschlossen ist, isolieren Sie alle notwendigen anatomischen Teile für die Entnahme und frieren Sie sie entweder in flüssigem Stickstoff ein oder legen Sie sie für weitere Studien in eine Fixierlösung.

Das Lungengewicht männlicher Sprague-Dolly-Ratten veränderte sich während der 60-minütigen ex vivo-Lungenperfusion nach den ersten 10 Minuten nicht signifikant. Auch der pulmonalarterielle Druck veränderte sich nicht. In ähnlicher Weise wurde der pulmonale Gefäßwiderstand während der gesamten Dauer der Studie nicht verändert.

Nach einstündiger Beatmung bei hohen Tidalvolumina und hohem Peep waren die proinflammatorischen Zytokinkonzentrationen in der PERFUSE acht erhöht, während die antiinflammatorischen Zytokinkonzentrationen unverändert blieben. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis der wichtigsten Schritte haben, die erforderlich sind, um ein Ex-Viva-Lungenprofusionsmodell für Kleintiere bei Ratten in Ihrem Labor zu etablieren.