Gebote und Verbote der Kryo-Elektronenmikroskopie: A Primer für Probenvorbereitung und High Quality Data Collection für Makromolekulare 3D-Rekonstruktion

Ziel des folgenden Experiments ist es, Makromoleküle in ihrem gefrorenen hydratisierten Zustand mit dem Transmissionselektronenmikroskop abbilden zu können. Dies wird erreicht, indem das Gitter mit der Probe im Blitz auf das Kryogen getaucht wird, um eine dünne verglaste Probe zu erhalten. In einem zweiten Schritt wird die Probe dem Elektronenstrahl ausgesetzt, der ein Projektionsbild der Makromoleküle erstellt.

Anschließend werden die Bilder am Computer verarbeitet, um die 3D-Rekonstruktion des Makromoleküls zu erhalten. Die Ergebnisse zeigen eine sehr detaillierte 3D-Struktur des Makromoleküls, seine Bestätigung und die 3D-Position seiner molekularen Partner. Es gibt einen Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden der Probenvorbereitung für die Elektromikroskopie.

Bei Kryo wird das Bild direkt von den Elektronen innerhalb des Makromoleküls gebildet. Dies spiegelt die fast indianische Struktur getreuer wider. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung.

Die Vorbereitung des Kryogitters und die Übertragung auf das Elektronenmikroskop sind aufgrund der zusätzlichen Komplikation bei der Arbeit bei kryogenen Temperaturen schwer zu erlernen. Der Aufwärmzyklus wird zu Beginn der Pumpsequenz und nach einer Kryo-EM-Sitzung verwendet. Um diesen Vorgang zu starten, setzen Sie den Kryohalter in einen der Pumpöffnungen der Pumpstation ein. Starten Sie die Option Aufwärmzyklus.

Öffnen Sie in der Kaltstufensteuerung die Absperrklappe V zwei, und wenn sich das Vakuum in der Turbopumpstation stabilisiert und 10 bis minus drei anzeigt, oder besser die Absperrklappe V eins öffnen. Sobald die Temperatur in der Halterung stabil über Raumtemperatur liegt und der Aufwärmzyklus abgeschlossen ist. Tieft V eins und stoppt den Zyklus.

Starten Sie als Nächstes die Option ze light cycle und wählen Sie die notwendige Zeit, um ein gutes Vakuum im Bereich von ein- bis zweimal 10 bis minus vier Tor zu erreichen. Wenn das Vakuum 10 bis minus drei erreicht, öffnen Sie das DU-Evakuierungsventil B drei und das Ventil am Kryohalter. Wenn der Zyklus abgeschlossen ist, heben Sie die Ventile in der entgegengesetzten Reihenfolge, in der sie geöffnet wurden.

Lassen Sie mit einer Pinzette ein Stück MICA zwei neue Oberflächen freilegen. Legen Sie die neuen freiliegenden Glimmeroberflächen mit der Vorderseite nach oben auf ein weißes Blatt Papier in eine Petrischale. Nachdem Sie die Petrischale in das Glas eines Kohleverdampfers gestellt haben, führen Sie die Abpumpsequenz durch, bis das Vakuum unter 10 bis minus sechs liegt, um den Glimmer mit einer dünnen Kohlenstoffschicht zu beschichten.

Übertragen Sie dann den dünnen Kohlenstoff auf das Gitter. Dass ein 0,5 mal einen Zentimeter großes Stück beschichteter Glimmer den Kohlenstoff auf die flache Oberfläche des gefilterten deionisierten Wassers abschwimmt. Lege mit der Pinzette die heilige Kohlenstoffseite des Gitters in Kontakt mit der Oberseite der schwimmenden Kohlenstoffschicht und nimm sie auf.

Legen Sie das Gitter mit der Carbonseite nach oben auf eine 7,5 x 2,5 Zentimeter große Glasschiene, die mit einer Power-Folie bedeckt ist. Setzen Sie dann den Glasschieber in die Kammer der Glimmentladeeinrichtung ein und schließen Sie die Kammer. Pumpen Sie die Glocke auf und leuchten Sie.

Entladen Sie 20 Sekunden lang bei 25 Milliampere und siebenmal 10 bis zu minus zwei Millibar. Schalten Sie zu diesem Zeitpunkt das Tauchgefriergerät ein. Ziehe den Ethan-Behälter nach unten, indem du den Behälter mit flüssigem Stickstoff füllst.

Sobald der flüssige Stickstoff aufhört zu sieden, setzen Sie die Spitze des Rohrs, das aus dem Ethan-Tank kommt, in die innere Kammer ein und öffnen Sie das Ventil sehr langsam. Verflüssigen Sie das Ethan in der inneren Kammer und füllen Sie es bis zu einem Millimeter von oben. Schalten Sie die Luftfeuchtigkeit ein.

Laden Sie als Nächstes ein Gitter auf eine Pinzette und laden Sie drei bis fünf Mikroliter Probe auf die Kohlenstoffoberfläche des heiligen Gitters. Nachdem Sie darauf gewartet haben, dass die Probe in das Gitter eingezogen ist, führen Sie ein Blotting durch Um ein dünnes Rouge der Flüssigkeitsschicht zu erzielen, frieren Sie das Gitter ein, indem Sie es in das flüssige Ethan tauchen. Entfernen Sie vorsichtig die Pinzettengitterbaugruppe aus dem flüssigen Ethan und geben Sie sie in die äußere Kammer mit flüssigem Stickstoff.

Übertragen Sie dann den Rost in eine kleine Gitterbox, die in den flüssigen Stickstoff eingetaucht ist. Setzen Sie zu diesem Zeitpunkt den Kryohalter in die Kryotransfer-Workstation ein. Füllen Sie den Macher des Kryohalters und das Workstation-Gefäß mit flüssigem Stickstoff.

Übertragen Sie schnell die Kryo-Gitterbox mit dem gefrorenen hydratisierten Gitter in den flüssigen Stickstoff in der Workstation. Nehmen Sie nach dem Öffnen der Kryo-Gitterbox das gefrorene hydratisierte Gitter und legen Sie es in den Probenhalterschlitz. Platzieren Sie dann den Clipring auf dem Gitter und drücken Sie ihn vorsichtig mit dem stumpfen Ende des Clipringwerkzeugs an, bis er fest sitzt.

Schließen Sie dann den Kryo-Shutter. Füllen Sie das TEM-Antikontaminat mit flüssigem Stickstoff auf. Kippen Sie den Mikroskoptisch wieder auf minus 60 Grad.

Starten Sie anschließend den PrepU-Schleusenzyklus am Mikroskop. Sobald die Sequenz der Pumpenschleuse beendet ist, setzen Sie den Chorhalter in die Schleuse ein und verbinden Sie das Steuerkabel der Kaltstufe mit der Halterung, um die Temperatur zu überwachen. Nachdem das rote Licht erloschen ist, drehen Sie den Halter in die Null-Grad-Position, um ihn in die Hochvakuumsäule des T EM einzusetzen.

Ziehen Sie den Kryoverschluss ein und öffnen Sie die Säulenventile. Aktivieren Sie das Niedrigdosis-Programm im Suchmodus. Zentrieren Sie den Tisch und stellen Sie die zentrische Höhe mit dem Alpha-Wobbler ein, um den Tisch um plus/minus 15 Grad zu schaukeln, wählen Sie ein geeignetes Loch aus und platzieren Sie es mit dem XY-Tischregler in der Mitte des Feldes.

Wechseln Sie in den Fokusmodus und fokussieren Sie das Bild. Dann unter Schärfe das Bild zwischen 0,5 und 4,5 Mikrometern. Wechseln Sie in den Belichtungsmodus und nehmen Sie das Bild auf.

Kehren Sie schließlich in den Suchmodus zurück, um das nächste Loch auszuwählen und die Sequenz zu wiederholen. Mikroskopische Bilder, die mit den Methoden der Negativfärbung und Kryo-EM von vier repräsentativen Proben mit unterschiedlichen Strukturmerkmalen erhalten wurden, werden hier verglichen: Negativ gefärbte Adeno-assoziierte Viruskapside zeigen virusähnliche Partikel und Kryo-EM zeigt, dass sie leer sind. Bilder des Tabakmosaikvirus zeigen spiralförmige Stäbchen, bei denen der zentrale Kanal in der Negativfärbung mit Fleck gefüllt und in den Kryo-EM-Bildern leer ist.

KLH assembliert in charakteristischen Zylindern, die sowohl in der Negativfärbung als auch in Kryo-EM-Bildern sechs Streifen zeigen. Rechteckige Seitenansichten und kreisförmige und aufliegende Ansichten zeigen eine leere Struktur durch Kryo-EM im Odrezeptor. Komplizierte Oberflächenmerkmale wie ein zentrales Kreuz und eine zentrale Vertiefung manifestieren sich als Fleckenakkumulation durch negative Färbung und als Regionen mit geringerer Dichte durch Kryo-em.

Typische Beispiele für Kryo-EM-Artefakte sind kristallines Eis, Eiskontamination, Astigmatismus und netzartige Strukturen. Die Einzelpartikelanalyse und die 3D-Rekonstruktion des gefrorenen hydratisierten Rezeptors zeigen seine vierfache symmetrische Struktur. Die zytoplasmatische Domäne bildet ein quadratisches Prisma und enthält mehrere reproduzierbare gulare Domänen, die eine gerüstartige Struktur bilden.

Bei einer Auflösung von 10 Ångström ist es möglich, alpha HELOCs in 3D zu visualisieren. Difference Mapping kann die Position wichtiger Liganden aufzeigen. Bestätigende Änderungen bieten eine dynamische Sicht auf das Makromolekül.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man qualitativ hochwertige Kryo-EM-Proben vorbereitet. Kryo-EM in Kombination mit Bildverarbeitung hat es den Forschern ermöglicht, die Struktur, die Organisation der Untereinheiten und die Konformationsdynamik makromolekularer Maschinen zu erforschen.