Name: Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Lernen Sie die Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie zur hochauflösenden Messung des Oberflächenpotentials von Bakterienzellen auf verschiedenen Substraten. Diese Methode ermöglicht präzise Einblicke in mikrobielle Adhäsion.

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Die Autoren danken dem Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, dem Ontario Ministry of Research and Innovation und der Canada Foundation for Innovation herzlich für die Finanzierung dieser Studie.

1. Herstellung der Glasgeschirr und Kulturen <ol><li> Bevor Sie mit diesem Experiment fortfahren, bereiten Blut-Agar (SBA) 5% Schafsplatten für den Anbau von MRSA. SBA Inkubation erfolgt während 24 Stunden bei 37 ° C. Nach dieser Zeit sollte einzelne, gut isolierte Kolonien vorhanden, um die anschließende Impfungen in flüssigen Medien verwendet werden können. Speicher strichen SBA-Platten mit Einzelkolonien bei 4 ° C für 1 - 2 Monate. HINWEIS: Schaf Blutagarplatten in vorgefertigte Pakete, die zwischen 20 kommen - 25 Platten auf der Basis der Hersteller, und bestehen typischerweise aus einer tryptischen Soja-Agar Basis mit der Zugabe von 5% w / v Schafsblut. </li><li> Stellen Sie 500 ml tryptische Sojabrühe (TSB) mit 1% Glucose und 0,1% NaCl ergänzt. Danach sammeln und reinigen 2 Probiergläser. Wenn autoklavierbarem Deckel nicht verfügbar für Reagenzgläser sind, verwenden Sie Aluminiumfolie als Deckel. Autoklav TSB und Reagenzgläsern mit einem Feld von 1 ml Pipettenspitzen. </li><li> Unter einer Biosicherheitswerkbank oder in der Nähe eines Bunsen-Brenner, Pipette 5 ml zuvor autoklaviert TSB in autoklavierten Reagenzgläser. Achten Sie darauf, dass genügend Zeit sicherzustellen, gegeben worden ist, um die TSB lassen und Reagenzgläser auf Zimmertemperatur abkühlen. Aus einer zuvor durchzogen von 5% SBA Platte, impfen eine einzelne Kolonie in 6 ml TSB Brühe. Man wird MRSA enthalten, und das zweite Teströhrchen werden als Negativkontrolle verwendet werden, um Sterilität zu gewährleisten. </li><li> Nehmen geimpften TSB Reagenzgläser und legen Sie sie in einer wechselseitigen Inkubator für 24 Stunden bei 37 ° C und bei 200 Umdrehungen pro Minute. Nach dieser Zeit sollte das mikrobielle Wachstum offensichtlich in der MRSA Reagenzglas, während kein Wachstum sollte sich im Kontroll Reagenzglas stattgefunden haben. </li><li> Nehmen Sie 1 ml von 24 Stunden Kultur und Pipette in 6 ml frischem TSB. Bei 37 ° C für 6 Stunden bei 200 rpm. </li><li> Je 1 ml einer 6 h Subkultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 3 Minuten bei 850 x g. Überstand entfernen und resuspendiere das Pellet in 1 ml entionisiertem H 2 O. Zentrifuge, zu wiederholen und erneut zu suspendieren. </li></ol><ol><li> Nehmen rostfreiem Stahl und Gold AFM Probenscheiben (20 mm und 10 mm Durchmesser jeweils) und sauber auf jeder Seite mit 5 ml entionisiertem H 2 O. Halten Probenscheiben in der dominanten Hand mit einer Pinzette und verwenden Sie die Subdominante Hand, um 5 ml auf jeder Seite der Probenplatte pipettieren. Nach Waschen beider Seiten, statt Probenscheiben in ein Becherglas mit 20 ml entionisiertem H 2 O, gefolgt von Ultraschallbehandlung für 1 min. </li><li> Nach der Beschallung Verwendung Pinzette Probenscheiben aus dem Becher zu entfernen. Platzieren der Scheiben, so dass sie lehnen an einem Winkel von 60º gegen die Kante eines offenen Petri Platte auf einem Papiertuch. Verwenden Sie den Deckel der Petrischale, um die Trockenplatten abdecken. Lassen Scheiben trocknen vollständig, bevor Sie fortfahren. 8 h - Die Trocknungszeit kann zwischen 4 variieren. </li><li> Nach dem Trocknen verwenden Pinzette Probenscheiben in eine Petri-Schale legen. <ol><li> Optional funktionalisieren die Oberflächen der Probenscheiben mit jedem Material (zB Collagen, Hyaluronsäure, Silber-Nanopartikeln, etc.). </li><li> Für dieses Experiment verwendet Poly-L-Lysin zur Beschichtung der Substratoberfläche. Für poly-L-Lysin-Funktionalisierung Pipetten 200-400 ul 0,1% Poly-L-Lysin (in H 2 O) auf Probeplatten und ließ inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur in einer Petrischale. </li><li> Nach 1 Stunde verwenden Pinzette, um die Probenscheibe zu halten, und wäscht mit 1 ml entionisiertem H 2 O Trocknen lassen auf Küchenpapier, wie in Schritt 2.2 beschrieben. </li></ol></li><li> Nehmen Sie 2x gewaschen resuspendierten Zellen und Platte 200-400 ul auf Probenscheiben in einem biologischen Sicherheitsschrank. Wenn Probenplatten werden mit Poly-L-Lysin beschichtet sind, inkubiert 0,5 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Nach Inkubation der Zellen auf Probeplatten, Waschprobenscheiben vorsichtig mit 1 ml entionisiertem H 2 O. Lassen Platten über Nacht trocknen, bevor Bildgebung. </li></ol> 3. KPFM Imaging HINWEIS: Für dieses Experimentverwenden Sie ein Agilent 5500 Serie ILM-AFM. <ol><li> So starten AFM, schalten Sie Rechnereinheit zusammen mit der AFM HEB und MAC-III-Controller. Öffnen AFM-Imaging-Software (zB Agilent PicoView). Achten Sie darauf, wählen Sie zunächst ACAFM oder welcher Wert korrekte Bezeichnung ist auf der AFM für die Bildgebung im intermittierenden Kontaktmodus. </li><li> Mit AFM Pinzette in der dominanten Hand, halten Sie die gefederte Clip-Halter mit der Subdominante Hand öffnen, setzen Sie ein KPFM Freischwinger in den Kopfstück. Vorsicht beim Umgang mit und die Übertragung der AFM Kopfstück an die AFM, wie dieses Gerät (zumindest auf der ILM 5500-AFM) enthält die fragile Piezokristall Einheit, X, Y, und Z-Scanning Ausrichtungen steuert. HINWEIS: Die KPFM Auslegern in diesem Fall verwendet wurden, waren Mikromasch leitfähigen DPE (geräuscharm) Auskragungen mit durchschnittlichen Resonanzfrequenzen von 80 kHz und die Federkonstanten von 2,7 N / m. Ausleger mit diesen Resonanzfrequenzen und Federkonstanten wurden aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit ausgewählt.Ausleger mit größeren Federkonstanten und höhere Resonanzfrequenzen können auch für die Bildgebung verwendet werden. </li><li> Kopfstück vorsichtig laden in die AFM und schließen Sie die entsprechenden Leitungen (in diesem Fall zwei Leitungen müssen angeschlossen werden: Laserlicht und Bühnenliftmotor). </li><li> Richten Sie den Laser auf die Spitze des Auslegers. Einige Geräte enthalten eine Kamera-Funktionalität, die für eine einfachere Ausrichtung ermöglicht. Wenn Kamera-Funktionalität ist nicht auf AFM Derzeit richten auf die Cantileverspitze wie beschrieben weiter: <ol><li> Drehen Sie das Front-to-Back-Knopf im Uhrzeigersinn, um den Laser überragen Cantilever-Chip zu bewegen. Wenn der Laser den Chip erreicht sie blockiert und nicht mehr sichtbar sein. Nur Drehe ihn ein paar mal. </li><li> Drehen Sie das Front-to-Back-Knopf gegen den Uhrzeigersinn, bis der Laserpunkt erscheint wieder. Der Laser ist jetzt auf die Chiprand. </li><li> Drehen Sie den links-nach-rechts-Knopf, um den Laser auf den Ausleger zu positionieren. Da der Laser über den Ausleger gibt sie wird verschwinden und wieder erscheinen in schneller Folge. Der Laserpunkt sollte in der Milchglasabdeckung, wo der Photodiode Einheit wird später sitzen sichtbar sein. </li><li> Drehen Sie das Front-to-Back-Knopf gegen den Uhrzeigersinn, um den Ort auf der Cantilever zur Spitze hin bewegen, bis der Punkt auf dem Milchglas verschwindet. </li><li> Drehen Sie das Front-to-Back-Knopf im Uhrzeigersinn nur leicht, um den Laser so zu positionieren, dass es sitzt nur auf der Cantilever-Spitze. Der Laserpunkt wird auf dem Milchglas wieder. HINWEIS: Dies ist die Laser-Positionierung Methode zur Sprungbrett Ausleger. Für Dreiecksauslegern unterscheidet sich der Angleichungsprozess leicht. </li></ol></li><li> Nachdem der Laser ausgerichtet ist, halten Sie die Bühne Hubmotor in der Position &quot;offen&quot; für 10 Sekunden, um ausreichend Platz zwischen dem Cantilever und Probe zu gewährleisten, wenn die Befestigung der Probe auf die AFM. </li><li> Zeigen Probe auf dem Probentisch KPFM. Erden Sie die Probe mit einem Kupferdraht. Schließen Sie die entsprechenden Kabel von der AFM auf dem Probentisch. Schließen Sie die sTage an die AFM. In den meisten Fällen ist die Bühne mit Hilfe von Magneten an Ort und Stelle gehalten. </li><li> In der AFM-Software, Melodie beginnt der Ausleger und Ansatz des Auslegerspitze auf die Probe. Stellen Sie sicher, dass die Einschwingzeit bei nicht mehr als 10 ms eingestellt, und dass die Annäherungsgeschwindigkeit nicht 2,0 um / s, um Schäden zu vermeiden Spitze überschreiten. </li><li> Sobald die Cantileverspitze ist auf der Probenoberfläche, wählen Sie eine Bildfenstergröße und ideal Imaging-Bereich. Optimieren I und P Gewinnen zusammen mit dem Ausleger-Sollwert, so dass topographische Abbildung wird optimiert. <ol><li> Sobald topographischen Bild optimiert ist, schalten Sie KPFM Modul (UKW- oder AM-Modus, hier verwenden UKW-Modus). Es sei darauf hingewiesen, dass KPFM Bildgebung ist sehr anspruchs außerhalb von 5 &amp; mgr; m × 5 &amp; mgr; m-Abbildungsfenster werden. Auch für eine optimale KPFM Imaging, verwenden Sie eine Auflösung von 512 x 512 mit langsamen Scan-Geschwindigkeiten (0,02-0,05 Zeilen / sec). </li></ol></li><li> Für FM-KPFM Einstellungen (nicht ACAFM Einstellungen) Legen Sie das Laufwerk Prozent zwischen 5-10%. Stellen Sie den Ausleger frequency zwischen 1-5 kHz mit einer Bandbreite von 2 kHz. I und P Gewinne für die FM-KPFM Einstellungen auf 0,3%. <ol><li> Vary Signalbandbreite und I- und P-Gewinne zwischen Probenoberflächen. SP-Bildgebung zu optimieren, weiter anpassen Signalbandbreite und I- und P-Gewinne um optimale Bilder zu erhalten. Der empfohlene Bereich von I und P Gewinne von 0,22 bis 0,35%. </li></ol></li><li> Verarbeiten und zu analysieren mit post-Bildverarbeitungs-Software, um Daten zu sammeln SP gesammelt KPFM Bilder. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

KPFM wurde als ein neues Verfahren zur Gewinnung von elektrischer Oberflächendaten verwendet. Es wurde allgemein als ein Verfahren zur Untersuchung von Ladungsverteilung in der Chemie verwendet worden und hat erst seit kurzem für die Untersuchung von biologischen Systemen im Mikro- und Nano-Skalen angewendet werden. Aus den gesammelten Daten haben wir festgestellt, dass Mikroben schien nicht leicht befestigen zu reinigen Edelstahl und Gold-Oberflächen, auch nach 3 Stunden der statischen Inkubation. Poly-L-Lysin-funktion...

Biofilme auf Geräteoberflächen und in Hautwunden erzeugt ein Problem darstellen für die medizinische Industrie als Biofilme sind widerspenstig, um die Entfernung und kann zu einer erhöhten Rate der Übertragung von Krankheiten und die Antibiotikaresistenz führen. Befestigung ist der erste Schritt in der Biofilmbildung und ist der wichtigste Schritt aufgrund ihrer Reversibilität 1-3. Substratoberflächeneigenschaften spielen eine entscheidende Rolle bei mikrobiellen Anhaftung. Faktoren, wie Oberflächenhärte, Porosität, Rauhigkeit und Hydrophobie wurde gezeigt, dass die mikrobielle Anbringung zu bewirken; aber wenig Forschung Überprüfung der Rolle der Substratoberfläche Potential (SP) auf die mikrobielle Adhäsion getan wurde 4,5. Negativ geladenen Oberflächen verhindern die Anlagerung von Bacillus thuringiensis Sporen Glimmer, Silicium und Gold-6. Veränderungen der zellulären Membranpotential anzeigt, Veränderungen der zellulären Anhaftung und Motilität 5,7. Es ist, dass elektrisch hom beobachtetogeneous Oberflächen leichter zu fördern mikrobielle Adhäsion 5. Charakterisierung des Oberflächenpotentials von Bakterien im Nano einen neuen Weg, um die Haft Kinetik der Bakterien auf verschiedenen Oberflächen zu verstehen, bereitzustellen, und dadurch kann bei der Entwicklung von Anti-Biobewuchs-Strategien helfen. Im Gegensatz zu anderen Methoden zur Charakterisierung der elektro Kinetik der Bakterien, wie elektrophoretischen Lichtstreuung, Zeta-Potential und isoelektrischen Punktbestimmung verwendet wird, ermöglicht die Prüfung der Einzelzellen anstelle von ganzen Kulturen 8-11 Kelvin-Mikroskop (KPFM). Dies ist von Vorteil, wenn zu wollen Zell-Zell vergleichen oder Biofilm elektrischen Eigenschaften mit hoher Genauigkeit und Präzision. KPFM ist ein Modul der Rasterkraftmikroskopie (AFM). AFM wurde als eine direkte Folge des Rastertunnelmikroskops (STM) 12 entwickelt. Die ersten veröffentlichten Bilder mit STM wurden von Gerd Binnig und Heinrich Rorhrer 1982 12 gemacht </sup&gt;. Ihre Erfindung konnte atomaren Strukturen von Raster lösen Scannen eines scharfen leitfähigen Spitze über eine leitende Oberfläche in der Luft. Die Auswirkungen der Verwirklichung hochauflösenden Bildern erregt Biologen, die schnell versucht, STM für Bild in getrockneten Proben von DNA, Proteinen und Viren 12 zu verwenden. STM kann auch in Flüssigkeiten mit speziellen Sondenspitzen 13 durchgeführt werden. Dies wurde von Lindsay et al., Die STM und AFM Bild DNA-Moleküle in 10 mM HClO 4 in Wasser, auf Goldelektroden 13 verwendet, gezeigt. KPFM hat bei der Bestimmung der Oberflächenpotentiale von DNA- und Protein-Analyse 25 und Biomolekülen Interaktion mit Liganden 26 gezeigt. KPFM arbeitet durch Messung des Kontaktpotentialdifferenz (CPD) zwischen einem leitenden AFM Cantilever-Spitze und einer ideal leitenden Probe (Abbildung 1, i) 14,15. Proben nicht notwendigerweise leitend (dh biologischen sampl seinn). Imaging kann auf Glimmer, Glas und Siliziumoberflächen (nicht leitend), solange der nicht-leitenden Oberfläche ist dünn, und es ist eine darunterliegende leitende Material 6,7 durchgeführt werden. Die CPD ist äquivalent zu der Oberflächenpotential-Spannung und kann als die Differenz der Austrittsarbeiten zwischen der Spitze (φ Spitze) und der Probe (φ Probe), dividiert durch die negativen Elektronenladung beschrieben (- e). Wenn ein AFM-Spitze in der Nähe einer Probenoberfläche gebracht (getrennt durch Entfernung d) eine elektrostatische Kraft (F s) erzeugt wird infolge des Unterschieds in Fermi Energien (1, II, a) 15. An diesem Punkt sind die Vakuum Energien der Spitze und der Probe (E v) im Gleichgewicht sind und ausgerichtet. Auf die Spitze nach näher an der Probenoberfläche, wobei die Spitze und der Probenoberfläche in elektrischen Kontakt und als Parallelplattenkondensatoren (1, II, b kommen </strong&gt;) 14,15. An der Stelle, die Fermi Energie der Spitze und der Probenoberfläche ausgerichtet werden und erreichte ein stationäres Gleichgewicht (1, II, b). Die Spitze und Probenoberfläche berechnet und eine V CPD bilden sich aufgrund einer Differenz in E v &#39;s und Arbeitsfunktionen. A F es wirkt auf die elektrische Kontaktfläche auf Grund der gebildeten V CPD. Diese Kraft wird nachfolgend durch die Anwendung eines externen V DC bis zur Spitze, die die gleiche Größenordnung wie der gebildete V CPD hat aufgehoben (Abbildung 1, ii, c). Das angelegte Gleichspannung eliminiert Oberflächenladung im Bereich der elektrischen Kontaktierung und der Betrag V DC erforderlich, die F n der V CPD beseitigen gleich der Differenz in den Arbeitsfunktionen zwischen sample Oberfläche und Spitze 15. Es sei darauf hingewiesen, daß die Arbeitsfunktion der Spitze bekannt ist und es wird von den Herstellern zur Verfügung gestellt werden. In allen KPFM Verfahren wird eine Wechselspannung (V AC, etwa 100 - 500 mV) ist auch an der Spitze, um die oszillierenden elektrischen Kräfte zwischen der Spitze und der Probe 14 zu erzeugen. Dies ermöglicht eine bessere Auflösung bei der Messung von Veränderungen der V CPD und / oder F n. In dieser Hinsicht können Änderungen in der Frequenz oder Amplitude der elektrischen Schwingung von V DC korrigiert werden und das Oberflächenpotential Karten erzeugt werden. Daten aus bestimmten Bereichen dieser Karten können weiter analysiert werden, um elektrische Informationen über bestimmte topographische Merkmale bieten. (1) Hub-Modus, (2) eine Amplitudenmodulation (AM) Modus, und (3) die Frequenzmodulation (FM) Modus 14,16: KPFM kann in drei Betriebsarten betrieben werden. Lift-Modus war der ursprüngliche incarnation von KPFM. Hub-Modus beruht auf einem Zwei-Durchgangs-Verfahren, in dem eine in Schwingungen versetzte Spitze wird über die Oberfläche gezogen, um ein topographisches Bild zu erhalten. Für den zweiten Durchlauf die Spitze einen vorgegebenen Abstand über der Probe erhöht (von 10 bis 100 nm) und zurück über die gleiche Fläche gescannt. Durch diese beiden Pass Verfahren, Lift-Modus, im Vergleich zu AM- und FM-KPFM dauert die längste Zeit für die Bildaufnahme. Die Anhebung der Spitze von der Oberfläche sorgt dafür, dass nur langfristige F es gemessen wird. Auch wird das Übersprechen zwischen Topographie und Oberflächenpotentialmessungen auf Kosten der erhöhten lateralen Auflösung und Empfindlichkeit entkoppelt. AM-KPFM verbessert laterale Auflösung und Empfindlichkeit durch Verwendung von Dual-Frequenzen, um gleichzeitig die Probentopographie und Oberflächenpotential (One-Pass-Scan) 14. Im AM-Modus wird der Ausleger mechanisch oszilliert, in der Regel 5% unter dem ersten Resonanzfrequenz (f 0), und elektrisch oszilliert (turch einen V AC) an seinem zweiten Resonanzfrequenz (f 1). Änderungen in der Amplitude von f 0 führen zur Erzeugung von topographischen Daten, während die Änderungen in der Amplitude der f 1, aufgrund von Änderungen in F n und V CPD geben Oberflächenpotentialmessdaten. f 0 und f 1 des Auslegers sind durch erhebliche Frequenzen und Energien, die Übersprechen minimiert 14 Signal getrennt. Der Kopf der E-Box (HEB) der AFM trennt die zwei Signale sowohl topographische zu geben und Oberflächenpotential Daten gleichzeitig in einem Scan. FM-KPFM verbessert die Auflösung noch weiter als AM-KPFM auf biologischen Oberflächen 14. FM-KPFM funktioniert anders als AM-KPFM, dass es Veränderungen in der elektrostatischen Kraft Gradienten anstatt elektrostatische Kraft (F n) 15 misst. Wie AM-Modus nutzt UKW-Modus Dual-Frequenzen und eine singlE-Pass Scan-Mechanismus topographischen zu erhalten und das Oberflächenpotential Daten gleichzeitig 14. Im UKW-Modus, wird der Ausleger mechanisch f 0 in Schwingung versetzt und bei einer niedrigen Frequenz geändert elektrisch in Schwingung versetzt (f mod, in der Regel 1-5 kHz). Bei der elektrostatischen Wechselwirkungen, f 0 und f MOD MIX zu Seitenbändern f 0 ± f mod zu erzeugen. Diese Seitenbänder sind sehr empfindlich auf Veränderungen der elektrostatischen Kraft und kann von f 0 durch die AFM HEB getrennt werden. Da FM-KPFM misst die Entwicklung elektrostatische Kraft Abstufungen, die Spitzen Spitze Form und seine Wartung / Integrität spielen eine entscheidende Rolle in der Gesamtoberflächenpotential Auflösung 14, 15. Oberflächenpotential Auflösung mit AM- und FM-Modi sind im Bereich von 1 nm seitlich 14 -16. Es sei darauf hingewiesen, dass KPFM Bildgebung kann in unpolaren Flüssigkeiten durchgeführt werden, und in jüngerer Zeit hat sich gezeigt, in niedriger Ionen (&lt;10 mM) polare Flüssigkeiten durchgeführt werden (in seinOpen-Loop KPFM Modi, die keine ein Vorspannungs-Rückkoppelungs, erübrigt die Anwendung einer DC-Vorspannung) wie MilliQ Wasser; jedoch KPFM Bildgebung noch auf lebende Zellen in polaren Lösungen 17-20 durchgeführt werden. Zusätzliche Herausforderungen SP Abbildungs ​​flüssig verbunden ist, ist, dass die Lösungen üblicherweise zur Aufrechterhaltung Zellen verwendet (dh, phosphatgepufferte Kochsalzlösung) haben hohe Konzentrationen an beweglichen Ionen, die Faraday-Reaktionen, Bias induzierten Ladungsdynamik und Ionendiffusion / Umverteilungs 20 führen würde. So kann dieses Experiment Messungen wurden von getrockneten und toten MRSA Zellen auf Poly-L-lysin funktionalisiertes Stahl und Gold-Oberflächen aus rostfreiem unter Umgebungsbedingungen gemacht. Imaging kann in Luft oder Vakuum an biologischen Proben, die zuvor getrocknet worden sind, oder auf Oberflächen immobilisiert 20 durchgeführt werden. Feuchten Bedingungen haben auch gezeigt, dass KPFM Bildgebung Flächen 6 beeinflussen. In dieser Studie verwendeten wir FM-KPFMund AFM, die Rolle von SP über das Anbringen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus USA100 (MRSA), um Poly-L-lysin funktionalisiertes rostfreiem Stahl und Gold-Oberflächen zu untersuchen. MRSA kurzem erhielt Status als multiresistente (MDR) &quot;Superbazillus&quot; aufgrund ihrer natürlich ausgewählt Beständigkeit gegen viele β-Lactam-Antibiotika und Cephalosporine 21. MRSA-Infektionen sind heute anspruchsvoller, schwer und gewaltig zu behandeln, was zur Verwendung von härteren antimikrobielle Mittel, wie Vancomycin oder Oxazolidinone, die höhere Toxizität beim Menschen, und kann daher nicht als langfristige Behandlungen 22 verwendet werden. Edelstahl wurde wegen ihrer medizinischen Bedeutung und allgemeinem Verwendung als Material in Injektionsnadeln, Bettpfannen, Türgriffe, Waschbecken etc. Gold wurde als Vergleichs verwendete Metall gewählt. FM-KPFM wurde eingesetzt, um zu untersuchen, ob mikrobielle Membran SP ändert sich beim Anbringen an den Substraten.

<table><tbody><tr><td>5500ILM Rasterkraftmikroskop</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9435S</td><td></td></tr><tr><td>AFM/STM Probenscheiben aus Metall</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16219</td><td>Edelstahl-Probenscheiben</td></tr><tr><td>DPE (Low-Noise) leitfähige SPM-Sonden</td><td>Mikromasch</td><td>#HQ:DPE-XSC11</td><td>Pro Chip gibt es 4 Pt-beschichtete Ausleger. Wir haben den Ausleger B für Experimente verwendet.</td></tr><tr><td>PELCO Goldbeschichtete AFM/STM-Probenscheiben aus Metall</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>#16218-G</td><td>Gold-Probenscheiben</td></tr><tr><td>PicoView Software</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797B</td><td>5500ILM Rasterkraftmikroskop Bildgebungssoftware</td></tr><tr><td>Pico Image Software (Pico Image Basic)</td><td>Agilent Technologies</td><td>#N9797AU-1FP</td><td>5500 ILM Rasterkraftmikroskop Nachbearbeitungssoftware</td></tr><tr><td>Scilogex D3024 Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifuge</td><td>Thomas Scientific</td><td>#91201513</td><td>Zentrifuge, die in Zellwaschschritten verwendet wird, um Zellen (Pellets) von Medien zu trennen</td></tr><tr><td>Trypticase-Soja-Agar mit 5 % Schafsblut</td><td>BD</td><td>#221261</td><td>Vorgefertigte</td></tr><tr><td>Platten Tryptische Sojabrühe</td><td>BD</td><td>#257107</td><td>Kommt als trockenes Pulver. Anleitung, wie man auf den Behälter kommt.</td></tr></tbody></table>

oberflächenpotentialmessung von bakterien mit kelvin-sonde kraftmikroskopie

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Oberflächenpotential ist ein häufig übersehen physikalische Eigenschaft, die eine dominante Rolle bei der Adhäsion von Mikroorganismen an Substratoberflächen spielt. Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie (KPFM) ist ein Modul der Rasterkraftmikroskopie (AFM), die die Kontaktpotentialdifferenz zwischen Oberflächen im Nanoskala misst. Die Kombination KPFM mit AFM ermöglicht die gleichzeitige Erzeugung von Oberflächenpotential und topographische Karten von biologischen Proben, wie Bakterienzellen. Hier beschäftigen wir KPFM um die Auswirkungen des Oberflächenpotentials auf die mikrobielle Anhaftung an medizinisch relevanten Oberflächen wie rostfreiem Stahl und Gold zu untersuchen. Oberflächenpotential Karten zeigte Unterschiede in der Oberflächenpotential für mikrobielle Membranen auf unterschiedliche Materialuntergründen. Ein Stufenhöhen Graph wurde erzeugt, um die Differenz des Oberflächenpotentials an einer Grenzfläche zwischen der Substratoberfläche und Mikroorganismen zeigen. Änderungen der zellulären Membranoberflächenpotential haben mit Veränderungen in Verbindung gebracht wordens in den Zellstoffwechsel und Beweglichkeit. Daher stellt KPFM ein mächtiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die Änderungen der mikrobiellen Zelloberflächenpotential auf Haftung auf verschiedenen Substratoberflächen zu untersuchen. In dieser Studie zeigen wir, das Verfahren um das Oberflächenpotential der einzelnen Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus USA100 Zellen auf rostfreiem Stahl und Gold mit KPFM charakterisieren.

Die Fähigkeit, SP zu messen mit KPFM beruht auf dem Prinzip, dass sowohl die Probenoberfläche und Cantileverspitze leitend zu einem gewissen Grad. Edelstahl und Gold diente als leitende Oberflächen, auf die MRSA wurden angebracht. KPFM Bilder wurden von 15 MRSA-Zellen auf beiden Oberflächen mit 512 x 512 Auflösungen mit Scanbereiche im Bereich von 5 x 5 &amp; mgr; m bis 10 x 10 &amp; mgr; m genommen, und. Abtasten erfolgte mit Liniengeschwindigkeiten im Bereich von 0,02 Zeilen / Sekunde auf 0,05 Zeilen / Sekunde durchge...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die Verwendung der Kelvin-Sondenkraftmikroskopie als Werkzeug zur Erzeugung hochauflösender nanoskaliger Oberflächenpotentialkarten erklärt. Dieses Tool wurde eingesetzt, um die Rolle des Oberflächenpotentials auf die Bindungskapazität von Mikroorganismen an Substratoberflächen zu bewerten.

Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Veränderungen der Zellmembranladung nach der Anheftung an verschiedene Materialuntergründe zu beobachten. Dies wird erreicht, indem die Mikroorganismen in einem nährstoffreichen Medium kultiviert werden, um ihre Anzahl zu erhöhen. Anschließend werden die Materialoberflächen, an denen sich die Mikroorganismen anheften sollen, gereinigt und funktionalisiert, um optimale Anheftungsraten der Mikroben zu gewährleisten.Anschließend werden die Mikroorganismen auf verschiedenen Materialsubstraten ausgestrichen, um die Kelvinsondenkraftmikroskopie oder KPFM-Bildgebung zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Art des Materialsubstrats und dessen inhärente Ladung einen Einfluss auf die Zellaktivität haben, wie durch Veränderungen in der Ladung der Zellmembran und der Zelladhärenz ersichtlich. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Elektrophorese, Lichtstreuung und der Bestimmung des isoelektrischen Punkts besteht darin, dass die KPFM die Untersuchung der Ladung einzelner Zellen und Biofilme anstelle ganzer Kulturen oder Kolonien ermöglicht.Dies ist vorteilhaft, wenn man Zelle zu Zelle sowie elektrische Eigenschaften von Biofilmen mit hoher Genauigkeit und Präzision vergleichen möchte. Bereiten Sie zunächst 5% Schafsblut-Agar-Platten vor, streichen Sie die MRSA-Bakterien auf die vorbereiteten Platten und inkubieren Sie diese 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, um einzelne, gut isolierte Kolonien zu erhalten. Stellen Sie 500 Milliliter Trypso-Soja-Brühe her, ergänzt mit 1% Glukose und 0,1% Natriumchlorid, autoklavieren Sie diese zusammen mit zwei sauberen Glasreagenzgläsern und einer Schachtel mit Ein-Milliliter-Pipettenspitzen.Nachdem das Medium und die Reagenzgläser unter einem Sicherheitswerkbank oder in der Nähe einer Bunsenbrennerflamme abgekühlt sind, pipettieren Sie sechs Milliliter des TSB in jedes Reagenzglas. Inokulieren Sie mit einer der zuvor vorbereiteten Schafsblut-Agarplatten eine einzelne Kolonie von MRSA in eines der Röhrchen. Verwenden Sie das zweite Röhrchen als negativen Kontrollansatz, um Sterilität sicherzustellen, und inkubieren Sie die Röhrchen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 200 U/min in einem Rüttelinkubator.Im MRSA-Röhrchen sollte Wachstum zu sehen sein, oder es sollte im Kontrollröhrchen kein Wachstum aufgetreten sein. Erstellen Sie anschließend eine Unterkeimung, indem Sie ein Milliliter der 24-Stunden-Kultur verwenden, um sechs Milliliter frische tryptische Sojabouillon zu beimpfen, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für weitere sechs Stunden. Danach pipettieren Sie ein Milliliter der Kultur in ein füs-Röhrchen und zentrifugieren bei 850 × g für drei Minuten.Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zwei Mal mit Hilfe einer Pinzette in der dominanten Hand mit entionisiertem Wasser. Halten Sie eine 20 Millimeter große Edelstahl-FM-Probenplatte und reinigen Sie jede Seite mit fünf Millilitern entionisiertem Wasser. Legen Sie die gereinigten Platten in einen Becher mit entionisiertem Wasser und führen Sie eine Ultraschallbehandlung für eine Minute durch, nachdem die Sonifikation abgeschlossen ist.Entnehmen Sie mit der Pinzette die Probenscheiben aus dem Becher und lehnen Sie sie in einem Winkel von etwa 60 Grad an den Rand einer offenen Petrischale, die auf einem Papierhandtuch steht, um sie vollständig trocknen zu lassen. Verwenden Sie den Deckel der Schale, um die trocknenden Scheiben abzudecken. Sobald sie trocken sind, überführen Sie die Scheibe in eine Petrischale, um die Oberfläche der Scheibe zu funktionalisieren. Pipettieren Sie 200 bis 400 Mikroliter einer 0,1 %igen Poly-L-Lysin-Lösung auf die Scheiben im Biosicherheitswerkbank und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, wobei Sie die Scheiben mit der Pinzette festhalten.Spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser, wie zuvor in diesem Video gezeigt. Als Nächstes pipettieren Sie 200 bis 400 Mikroliter resuspendierter Zellen, die zweimal gewaschen wurden, auf die beschichteten Probenscheiben. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten spülen Sie die Scheiben vorsichtig mit einem Milliliter entionisiertem Wasser ab.Lassen Sie die Scheiben vor der Bildgebung über Nacht trocknen, um die Kelvin-Sonden-Kraftmikroskopie durchzuführen. Schalten Sie den Computer zusammen mit dem Rasterkraftmikroskop oder den AFMs, dem HEB und dem MAC Three-Controller ein. Öffnen Sie eine AFM-Bildgebungssoftware wie Ulence P ovu overview.Wählen Sie A-C-A-F-M oder die korrekte Bezeichnung für die Bildgebung im intermittierenden Kontaktmodus. Platzieren Sie den A-K-P-F-M-Karren vorsichtig mit einer FM-Pinzette in der dominanten Hand und unter gleichzeitigem Halten des federbelasteten Clip-Halters in der anderen Hand in das Kopfstück. Laden Sie das Kopfstück vorsichtig in das A FM ein und verbinden Sie die Laserlicht- und Stellmotorleitung für den Objekttisch.Dann richten Sie den Laser auf die Spitze des Cantilevers aus. Um den Laser auf die Spitze des Cantilevers auszurichten, drehen Sie die vordere bis hintere Verstellschraube mehrmals im Uhrzeigersinn, um den Laser über dem Cantilever-Chip zu positionieren.Wenn der Laser den Chip erreicht, wird er blockiert und nicht mehr sichtbar sein. Drehen Sie dann den vorderen hinteren Knopf gegen den Uhrzeigersinn, bis der Laserpunkt wieder erscheint. Der Laser befindet sich nun am Rand des Chips.Drehen Sie den von links nach rechts verlaufenden Knopf, um den Laser auf dem Cantilever zu positionieren. Während der Laser über den Cantilever wandert, verschwindet und erscheint er nacheinander rasch. Der Laserpunkt sollte auf der mattierten Glasabdeckung sichtbar sein, auf der später die Photodiodeneinheit sitzt.Drehen Sie den Vorder- zu Hinterknopf gegen den Uhrzeigersinn, um den Lichtpunkt entlang des Auslegers in Richtung der Spitze zu bewegen, bis der Punkt auf dem Mattglas verschwindet. Drehen Sie nun den Vorder- zu Hinterknopf nur leicht im Uhrzeigersinn, um den Laser so zu positionieren, dass er gerade auf der Ausleger Spitze sitzt; der Laserpunkt wird dann erneut auf dem Mattglas erscheinen. Sobald der Laser ausgerichtet ist, halten Sie den Stufenhubmotor in geöffneter Position für 10 Sekunden, um ausreichend Abstand zwischen Ausleger und Probe sicherzustellen.Wenn Sie die Probe am A FM befestigen, platzieren Sie die Probe nun auf dem KPFM-Prüfstand. Erden Sie die Probe mit Kupferdraht und schließen Sie die entsprechenden Kabel vom A FM an den Probenhalter an. Schließen Sie anschließend den Halter im A FM-Softwareprogramm an das A FM an.Stellen Sie sicher, dass die Einstellzeit maximal 10 Millisekunden beträgt und dass die Annäherungsgeschwindigkeiten zwei Mikrometer pro Sekunde nicht überschreiten. Um eine Beschädigung der Spitze zu vermeiden, stimmen Sie anschließend den Hebel ab und beginnen Sie, die Hebelspitze in Richtung der Probe zu bewegen. Sobald die Hebelspitze die Probenoberfläche erreicht, wählen Sie eine geeignete Bildfenstergröße und einen idealen Bildbereich aus und optimieren Sie die Einstellungen für Augen- und P-Verstärkung sowie den Hebel-Sollwert, um die topografische Abbildung zu optimieren.Wenn die topografische Abbildung optimiert ist, schalten Sie das KPFM-Modul im FM-Modus ein. Stellen Sie das Abbildungsfenster auf fünf Mikrometer mal fünf Mikrometer mit einer Auflösung von 12 mal 12 oder langsamen Scan-Geschwindigkeiten ein. Für die FM-KPFM-Einstellungen stellen Sie die Anregung zwischen fünf und 10 % ein. Setzen Sie die Anregungsfrequenz zwischen ein und fünf Kilohertz mit einer Bandbreite von zwei Kilohertz.Stellen Sie die Verstärkung der Eisen-NP für F-M-K-P-F-M auf 0,3 % ein. Nach der Aufnahme der KPFM-Bilder verwenden Sie eine Software zur Nachbearbeitung, um die Bilder zu analysieren und SP-Daten mithilfe der in diesem Demonstrationsvideo beschriebenen Einstellungen zu erfassen. KPFM-Bilder wurden von 15 MRSA-Zellen sowohl auf Edelstahl- als auch auf Goldoberflächen aufgenommen. Hier werden die Arten der aufgenommenen Bilder gezeigt.Da die KPFM mit zwei Frequenzen arbeitet, wurden topografische Bilder und elektrische Daten der Zelloberfläche simultan erfasst. Thermische Filter wurden auf die Oberflächenpotenzialkarten angewendet, um kleine Änderungen des Oberflächenpotenzials leichter erkennen zu können. In dieser Grafik wurden die Bilder analysiert, um das Oberflächenpotenzial der mikrobiellen Membran zu bestimmen, und anschließend verwendet, um den Wachstumsvergleich auf unterschiedlichen Substraten durchzuführen.Oberflächenpotentialspektren der unbehandelten Edelstahl- und unbehandelten Goldsubstrate zeigten insgesamt negative Oberflächenpotentiale. Polyol-Lysin-beschichtete Edelstahl- und Golddiscs wiesen beide eine Verschiebung zu positiven Oberflächenpotentialen auf. Die Membranpotentiale von MRSA-Zellen variierten zwischen den Edelstahl- und Goldoberflächen. Da der Edelstahl im Vergleich zu MRSA-Zellen auf dem Goldsubstrat, das negative Oberflächenpotentiale zeigte, ein deutlich größeres positives Membranoberflächenpotential für die Zellen aufweist. Um die vollen Fähigkeiten der KPFM zu demonstrieren, ist hier ein Beispiel eines Schritthöhenprofils von MRSA auf Edelstahl dargestellt. Dies zeigt den Unterschied im Oberflächenpotential zwischen der Substratoberfläche und der mikrobiellen Membran.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Kelvinsondenkraftmikroskopie verwendet wird, um die Auswirkungen elektrischer Ladung auf die Anheftung und Aktivität mikrobieller Zellen an verschiedenen Materialoberflächen zu untersuchen.

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Forschung

JoVE Journal

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Biotechnik

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Bakterielle Immobilisierung für Imaging von Atomic Force Microscopy

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