Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Veränderungen der Zellmembranladung nach der Anheftung an verschiedene Materialuntergründe zu beobachten. Dies wird erreicht, indem die Mikroorganismen in einem nährstoffreichen Medium kultiviert werden, um ihre Anzahl zu erhöhen. Anschließend werden die Materialoberflächen, an denen sich die Mikroorganismen anheften sollen, gereinigt und funktionalisiert, um optimale Anheftungsraten der Mikroben zu gewährleisten.

Anschließend werden die Mikroorganismen auf verschiedenen Materialsubstraten ausgestrichen, um die Kelvinsondenkraftmikroskopie oder KPFM-Bildgebung zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Art des Materialsubstrats und dessen inhärente Ladung einen Einfluss auf die Zellaktivität haben, wie durch Veränderungen in der Ladung der Zellmembran und der Zelladhärenz ersichtlich. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Elektrophorese, Lichtstreuung und der Bestimmung des isoelektrischen Punkts besteht darin, dass die KPFM die Untersuchung der Ladung einzelner Zellen und Biofilme anstelle ganzer Kulturen oder Kolonien ermöglicht.

Dies ist vorteilhaft, wenn man Zelle zu Zelle sowie elektrische Eigenschaften von Biofilmen mit hoher Genauigkeit und Präzision vergleichen möchte. Bereiten Sie zunächst 5% Schafsblut-Agar-Platten vor, streichen Sie die MRSA-Bakterien auf die vorbereiteten Platten und inkubieren Sie diese 24 Stunden bei 37 Grad Celsius, um einzelne, gut isolierte Kolonien zu erhalten. Stellen Sie 500 Milliliter Trypso-Soja-Brühe her, ergänzt mit 1% Glukose und 0,1% Natriumchlorid, autoklavieren Sie diese zusammen mit zwei sauberen Glasreagenzgläsern und einer Schachtel mit Ein-Milliliter-Pipettenspitzen.

Nachdem das Medium und die Reagenzgläser unter einem Sicherheitswerkbank oder in der Nähe einer Bunsenbrennerflamme abgekühlt sind, pipettieren Sie sechs Milliliter des TSB in jedes Reagenzglas. Inokulieren Sie mit einer der zuvor vorbereiteten Schafsblut-Agarplatten eine einzelne Kolonie von MRSA in eines der Röhrchen. Verwenden Sie das zweite Röhrchen als negativen Kontrollansatz, um Sterilität sicherzustellen, und inkubieren Sie die Röhrchen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 200 U/min in einem Rüttelinkubator.

Im MRSA-Röhrchen sollte Wachstum zu sehen sein, oder es sollte im Kontrollröhrchen kein Wachstum aufgetreten sein. Erstellen Sie anschließend eine Unterkeimung, indem Sie ein Milliliter der 24-Stunden-Kultur verwenden, um sechs Milliliter frische tryptische Sojabouillon zu beimpfen, und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 200 U/min für weitere sechs Stunden. Danach pipettieren Sie ein Milliliter der Kultur in ein füs-Röhrchen und zentrifugieren bei 850 × g für drei Minuten.

Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet zwei Mal mit Hilfe einer Pinzette in der dominanten Hand mit entionisiertem Wasser. Halten Sie eine 20 Millimeter große Edelstahl-FM-Probenplatte und reinigen Sie jede Seite mit fünf Millilitern entionisiertem Wasser. Legen Sie die gereinigten Platten in einen Becher mit entionisiertem Wasser und führen Sie eine Ultraschallbehandlung für eine Minute durch, nachdem die Sonifikation abgeschlossen ist.

Entnehmen Sie mit der Pinzette die Probenscheiben aus dem Becher und lehnen Sie sie in einem Winkel von etwa 60 Grad an den Rand einer offenen Petrischale, die auf einem Papierhandtuch steht, um sie vollständig trocknen zu lassen. Verwenden Sie den Deckel der Schale, um die trocknenden Scheiben abzudecken. Sobald sie trocken sind, überführen Sie die Scheibe in eine Petrischale, um die Oberfläche der Scheibe zu funktionalisieren. Pipettieren Sie 200 bis 400 Mikroliter einer 0,1 %igen Poly-L-Lysin-Lösung auf die Scheiben im Biosicherheitswerkbank und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, wobei Sie die Scheiben mit der Pinzette festhalten.

Spülen Sie sie mit entionisiertem Wasser, wie zuvor in diesem Video gezeigt. Als Nächstes pipettieren Sie 200 bis 400 Mikroliter resuspendierter Zellen, die zweimal gewaschen wurden, auf die beschichteten Probenscheiben. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten spülen Sie die Scheiben vorsichtig mit einem Milliliter entionisiertem Wasser ab.

Lassen Sie die Scheiben vor der Bildgebung über Nacht trocknen, um die Kelvin-Sonden-Kraftmikroskopie durchzuführen. Schalten Sie den Computer zusammen mit dem Rasterkraftmikroskop oder den AFMs, dem HEB und dem MAC Three-Controller ein. Öffnen Sie eine AFM-Bildgebungssoftware wie Ulence P ovu overview.

Wählen Sie A-C-A-F-M oder die korrekte Bezeichnung für die Bildgebung im intermittierenden Kontaktmodus. Platzieren Sie den A-K-P-F-M-Karren vorsichtig mit einer FM-Pinzette in der dominanten Hand und unter gleichzeitigem Halten des federbelasteten Clip-Halters in der anderen Hand in das Kopfstück. Laden Sie das Kopfstück vorsichtig in das A FM ein und verbinden Sie die Laserlicht- und Stellmotorleitung für den Objekttisch.

Dann richten Sie den Laser auf die Spitze des Cantilevers aus. Um den Laser auf die Spitze des Cantilevers auszurichten, drehen Sie die vordere bis hintere Verstellschraube mehrmals im Uhrzeigersinn, um den Laser über dem Cantilever-Chip zu positionieren.

Wenn der Laser den Chip erreicht, wird er blockiert und nicht mehr sichtbar sein. Drehen Sie dann den vorderen hinteren Knopf gegen den Uhrzeigersinn, bis der Laserpunkt wieder erscheint. Der Laser befindet sich nun am Rand des Chips.

Drehen Sie den von links nach rechts verlaufenden Knopf, um den Laser auf dem Cantilever zu positionieren. Während der Laser über den Cantilever wandert, verschwindet und erscheint er nacheinander rasch. Der Laserpunkt sollte auf der mattierten Glasabdeckung sichtbar sein, auf der später die Photodiodeneinheit sitzt.

Drehen Sie den Vorder- zu Hinterknopf gegen den Uhrzeigersinn, um den Lichtpunkt entlang des Auslegers in Richtung der Spitze zu bewegen, bis der Punkt auf dem Mattglas verschwindet. Drehen Sie nun den Vorder- zu Hinterknopf nur leicht im Uhrzeigersinn, um den Laser so zu positionieren, dass er gerade auf der Ausleger Spitze sitzt; der Laserpunkt wird dann erneut auf dem Mattglas erscheinen. Sobald der Laser ausgerichtet ist, halten Sie den Stufenhubmotor in geöffneter Position für 10 Sekunden, um ausreichend Abstand zwischen Ausleger und Probe sicherzustellen.

Wenn Sie die Probe am A FM befestigen, platzieren Sie die Probe nun auf dem KPFM-Prüfstand. Erden Sie die Probe mit Kupferdraht und schließen Sie die entsprechenden Kabel vom A FM an den Probenhalter an. Schließen Sie anschließend den Halter im A FM-Softwareprogramm an das A FM an.

Stellen Sie sicher, dass die Einstellzeit maximal 10 Millisekunden beträgt und dass die Annäherungsgeschwindigkeiten zwei Mikrometer pro Sekunde nicht überschreiten. Um eine Beschädigung der Spitze zu vermeiden, stimmen Sie anschließend den Hebel ab und beginnen Sie, die Hebelspitze in Richtung der Probe zu bewegen. Sobald die Hebelspitze die Probenoberfläche erreicht, wählen Sie eine geeignete Bildfenstergröße und einen idealen Bildbereich aus und optimieren Sie die Einstellungen für Augen- und P-Verstärkung sowie den Hebel-Sollwert, um die topografische Abbildung zu optimieren.

Wenn die topografische Abbildung optimiert ist, schalten Sie das KPFM-Modul im FM-Modus ein. Stellen Sie das Abbildungsfenster auf fünf Mikrometer mal fünf Mikrometer mit einer Auflösung von 12 mal 12 oder langsamen Scan-Geschwindigkeiten ein. Für die FM-KPFM-Einstellungen stellen Sie die Anregung zwischen fünf und 10 % ein. Setzen Sie die Anregungsfrequenz zwischen ein und fünf Kilohertz mit einer Bandbreite von zwei Kilohertz.

Stellen Sie die Verstärkung der Eisen-NP für F-M-K-P-F-M auf 0,3 % ein. Nach der Aufnahme der KPFM-Bilder verwenden Sie eine Software zur Nachbearbeitung, um die Bilder zu analysieren und SP-Daten mithilfe der in diesem Demonstrationsvideo beschriebenen Einstellungen zu erfassen. KPFM-Bilder wurden von 15 MRSA-Zellen sowohl auf Edelstahl- als auch auf Goldoberflächen aufgenommen. Hier werden die Arten der aufgenommenen Bilder gezeigt.

Da die KPFM mit zwei Frequenzen arbeitet, wurden topografische Bilder und elektrische Daten der Zelloberfläche simultan erfasst. Thermische Filter wurden auf die Oberflächenpotenzialkarten angewendet, um kleine Änderungen des Oberflächenpotenzials leichter erkennen zu können. In dieser Grafik wurden die Bilder analysiert, um das Oberflächenpotenzial der mikrobiellen Membran zu bestimmen, und anschließend verwendet, um den Wachstumsvergleich auf unterschiedlichen Substraten durchzuführen.

Oberflächenpotentialspektren der unbehandelten Edelstahl- und unbehandelten Goldsubstrate zeigten insgesamt negative Oberflächenpotentiale. Polyol-Lysin-beschichtete Edelstahl- und Golddiscs wiesen beide eine Verschiebung zu positiven Oberflächenpotentialen auf. Die Membranpotentiale von MRSA-Zellen variierten zwischen den Edelstahl- und Goldoberflächen.

Da der Edelstahl im Vergleich zu MRSA-Zellen auf dem Goldsubstrat, das negative Oberflächenpotentiale zeigte, ein deutlich größeres positives Membranoberflächenpotential für die Zellen aufweist. Um die vollen Fähigkeiten der KPFM zu demonstrieren, ist hier ein Beispiel eines Schritthöhenprofils von MRSA auf Edelstahl dargestellt. Dies zeigt den Unterschied im Oberflächenpotential zwischen der Substratoberfläche und der mikrobiellen Membran.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Kelvinsondenkraftmikroskopie verwendet wird, um die Auswirkungen elektrischer Ladung auf die Anheftung und Aktivität mikrobieller Zellen an verschiedenen Materialoberflächen zu untersuchen.