Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Änderungen der Zellmembranladung nach Adhärenz an verschiedenen Materialsubstraten zu beobachten. Dies wird erreicht, indem die Mikroorganismen in nährstoffreichem Medium kultiviert werden, um ihre Anzahl zu erhöhen. Als nächstes werden die Materialoberflächen, an denen die Mikroorganismen haften, gereinigt und funktionalisiert, um eine optimale mikrobielle Anheftungsrate zu erzielen.

Dann werden die Mikroorganismen auf die verschiedenen Materialsubstrate plattiert, um eine Kelvin-Sondenkraftmikroskopie oder KPFM-Bildgebung zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass der Materialsubstrattyp und seine inhärente Ladung einen Einfluss auf die Zellaktivität haben, was sich in Veränderungen der Zellmembranladung und der Zelladhärenz zeigt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Elektrophoretik, Lichtstreuung und isoelektrischer Punktbestimmung besteht darin, dass KPFM die Untersuchung der Ladung einzelner Zellen und Biofilme anstelle ganzer Kulturen oder Kolonien ermöglicht.

Dies ist von Vorteil, wenn die elektrischen Eigenschaften von Zelle zu Zelle sowie von Biofilm mit hoher Genauigkeit und Präzision verglichen werden sollen. Bereiten Sie zunächst 5%ige Agarplatten aus Schafsblut vor, streichen Sie die MRSA-Bakterien auf die vorbereiteten Platten und inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um einzelne, gut isolierte Kolonien zu erzeugen. Stellen Sie 500 Milliliter Triptychon-Sojabrühe her, ergänzt mit 1 % Glukose- und 0,1 % Natriumchlorid-Autoklav, zusammen mit zwei sauberen Glasreagenzgläsern und einer Schachtel mit einem Milliliter Pipettenschlucken.

Nachdem Sie das Medium und die Reagenzgläser unter einer Biosicherheitswerkbank oder in der Nähe eines Brötchens und eines Brenners abkühlen gelassen haben, pipettieren Sie sechs Milliliter TSB in jedes Reagenzglas. Mit einer der zuvor vorbereiteten Agarplatten aus Schafsblut wird eine einzelne Kolonie MRSA in eines der Röhrchen geimpft. Verwenden Sie das zweite Röhrchen als Negativkontrolle, um die Sterilität zu gewährleisten: Inkubieren Sie die Röhrchen 24 Stunden lang in einem reziproken Inkubator bei 37 Grad Celsius und 200 U/min.

Das MRSA-Röhrchen sollte Wachstum zeigen oder im Kontrollreagenzglas sollte nichts gewachsen sein. Erstellen Sie als Nächstes eine Subkultur, indem Sie einen Milliliter aus der 24-Stunden-Kultur verwenden, um sechs Milliliter frische tryptische Sojabrühe zu impfen und weitere sechs Stunden bei 37 Grad Celsius und 200 U/min zu inkubieren. Pipettieren Sie dann einen Milliliter der Kultur in ein Afus-Röhrchen und zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 850 mal G.

Entfernen Sie das Supinat und waschen Sie das Pellet mit entionisiertem Wasser zweimal mit einer Pinzette in der dominanten Hand. Halten Sie eine 20-Millimeter-FM-Probenscheibe aus Edelstahl fest und verwenden Sie fünf Milliliter entionisiertes Wasser, um jede Seite zu reinigen. Legen Sie die sauberen Scheiben in ein Becherglas mit deionisiertem Wasser und beschallen Sie sie nach der Beschallung eine Minute lang.

Entnehmen Sie die Probenscheiben mit der Pinzette aus dem Becherglas und lehnen Sie sie in einem Winkel von ca. 60 Grad gegen den Rand einer geöffneten Petrischale auf einem Papiertuch. Um die Trocknungsscheiben vollständig zu trocknen, verwenden Sie den Deckel der Schale, um die Trockenscheiben abzudecken. Sobald die Scheibe getrocknet ist, geben Sie sie in eine Petrischale, um die Oberfläche der Scheibe zu funktionalisieren. Pipettieren Sie 200 bis 400 Mikroliter 0,1 %iges Polyollysin auf die Scheiben in einer Biosicherheitswerkbank und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, wobei Sie die Scheiben mit einer Pinzette halten.

Verwenden Sie deionisiertes Wasser, um sie zu waschen, wie weiter oben in diesem Video gezeigt. Als nächste Platte 200 bis 400 Mikroliter resuspendierte Zellen, die zweimal auf die beschichteten Probenscheiben gespült wurden. Nachdem Sie die Scheiben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, verwenden Sie vorsichtig einen Milliliter entionisiertes Wasser, um sie zu waschen.

Lassen Sie die Discs über Nacht trocknen, bevor Sie die Bildgebung durchführen, um die Kelvin Probe Force-Mikroskopie durchzuführen. Schalten Sie den Computer zusammen mit dem Rasterkraftmikroskop oder den AFMs, HEB und MAC mit drei Controllern ein. Öffnen Sie eine A FM-Imaging-Software, z. B. Ulence P ovu overview.

Wählen Sie A-C-A-F-M oder die richtige Bezeichnung für die Bildgebung im intermittierenden Kontaktmodus. Mit einer FM-Pinzette in der dominanten Hand und dem federbelasteten Cliphalter in der anderen Hand den federbelasteten Cliphalter offen haltend, platzieren Sie A-K-P-F-M Ausleger vorsichtig in das Genickstück. Laden Sie das Kopfstück vorsichtig in den A FM und schließen Sie die Kabel des Laserlichts und des Bühnenliftmotors an.

Richten Sie dann den Laser auf die Spitze des Auslegers aus. Zum Ausrichten des Lasers auf die Spitze des Auslegers. Drehen Sie den vorderen und den hinteren Knopf einige Male im Uhrzeigersinn, um den Laser auf dem Cantilever-Chip zu bewegen.

Wenn der Laser den Chip erreicht, wird er blockiert und ist nicht mehr sichtbar. Drehen Sie dann den Drehknopf von vorne nach hinten gegen den Uhrzeigersinn, bis der Laserpunkt wieder erscheint. Der Laser befindet sich nun auf der Kante des Chips.

Drehen Sie den Drehknopf von links nach rechts, um den Laser auf dem Ausleger zu positionieren. Wenn der Laser über den Ausleger fährt, verschwindet er und taucht in schneller Folge wieder auf. Der Laserspot sollte in der Milchglasabdeckung sichtbar sein, wo später die Fotodiodeneinheit sitzen wird.

Drehen Sie den Knopf von vorne nach hinten gegen den Uhrzeigersinn, um den Fleck über den Ausleger nach unten in Richtung Spitze zu bewegen, bis der Fleck auf dem Milchglas verschwindet. Drehen Sie nun den vorderen nach hinteren Knopf nur leicht im Uhrzeigersinn, um den Laser so zu positionieren, dass er gerade auf der Cantilever-Spitze sitzt, der Laserpunkt erscheint wieder auf dem Milchglas. Sobald der Laser ausgerichtet ist, halten Sie den Tischhebermotor 10 Sekunden lang in der geöffneten Position, um genügend Platz zwischen dem Ausleger und der Probe zu gewährleisten.

Wenn Sie die Probe an den A FM anschließen, legen Sie die Probe nun auf den KPFM-Tisch. Verwenden Sie Kupferdraht, um die Probe zu erden, und verbinden Sie die entsprechenden Drähte vom A FM mit dem Probentisch. Verbinden Sie dann die Bühne mit dem A FM in der A FM Software.

Stellen Sie sicher, dass die Einstellzeit nicht mehr als 10 Millisekunden beträgt und dass die Annäherungsgeschwindigkeiten zwei Mikrometer pro Sekunde nicht überschreiten. Um eine Beschädigung der Spitze zu vermeiden, stimmen Sie dann den Cantilever-Hebel und bewegen Sie die Cantilever-Spitze in Richtung der Probe. Sobald die Cantilever-Spitze eine Probenoberfläche erreicht, wählen Sie die Größe des Bildgebungsfensters und den idealen Bildgebungsbereich, optimieren Sie die Augen- und P-Verstärkungen zusammen mit dem Cantilever-Sollwert, um die topografische Bildgebung zu optimieren.

Wenn die topografische Darstellung optimiert ist, schalten Sie das KPFM-Modul im FM-Modus ein. Stellen Sie das Bildgebungsfenster auf fünf Mikrometer x fünf Mikrometer mit einer Auflösung von fünf 12 x fünf 12 oder langsamen Scangeschwindigkeiten ein. Stellen Sie für FM KPFM-Einstellungen den Antrieb zwischen fünf und 10 % einStellen Sie die Antriebsfrequenz auf einen Wert zwischen einem und fünf Kilohertz mit einer Bandbreite von zwei Kilohertz ein.

Stellen Sie die Eisen-NP-Verstärkung für das F-M-K-P-F-M auf 0,3 % einVerwenden Sie nach der Aufnahme von KPFM-Bildern eine Post-Imaging-Verarbeitungssoftware, um die Bilder zu analysieren und SP-Daten mit den in dieser Videodemonstration beschriebenen Einstellungen zu sammeln. KPFM-Bilder wurden an 15 MRSA-Zellen sowohl auf Edelstahl- als auch auf Goldoberflächen aufgenommen. Hier sind die Arten von Bildern aufgeführt, die gesammelt wurden.

Da KPFM mit dualen Frequenzen arbeitet, wurden gleichzeitig topografische Bilder und elektrische Daten der Zelloberfläche gesammelt. Thermische Filter wurden auf Oberflächenpotentialkarten angewendet, um kleine Änderungen des Oberflächenpotenzials leichter erkennen zu können. In diesem Diagramm wurden Bilder analysiert, um das Oberflächenpotenzial der mikrobiellen Membran zu bestimmen, und dann zum Vergleich des Wachstums auf verschiedenen Substraten verwendet.

Oberflächenpotential-Scans der blanken Edelstahl- und blanken Goldsubstrate zeigten insgesamt negative Oberflächenpotentiale. Polyol-Lysin-beschichteter Edelstahl und Goldscheiben zeigten beide eine Verschiebung hin zu positiven Oberflächenpotentialen. Die Potentiale der MRSA-Zellmembran variierten zwischen der Edelstahl- und der Goldoberfläche.

Dabei weist der Edelstahl ein signifikant größeres positives Membranoberflächenpotenzial für Zellen auf, verglichen mit MRSA-Zellen auf dem Goldsubstrat, die negative Oberflächenpotentiale aufwiesen. Um die vollen Fähigkeiten von KPFM zu demonstrieren, sehen wir hier ein Beispiel für ein Stufenhöhendiagramm von MRSA auf Edelstahl. Dies zeigt die Differenz des Oberflächenpotentials zwischen der Substratoberfläche und der mikrobiellen Membran.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Kelvin-Sondenkraftmikroskopie verwenden, um die Auswirkungen elektrischer Ladung auf die Anhaftung und Aktivität mikrobieller Zellen auf verschiedenen Materialsubstratoberflächen zu untersuchen.