Menschliche pluripotente Stammzelle Basierend Entwicklungstoxizität Assays für chemische Sicherheit Screening und Systembiologie Datengenerierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, zwei in vitro-Testsysteme zur Erfassung entwicklungstoxikologischer Wirkungen basierend auf humanen embryonalen Stammzellen und Transkriptomstudien zu beschreiben. Dies wird erreicht, indem humane embryonale Stammzellen zunächst auf embryonalen Mausfibroblasten kultiviert werden. Im zweiten Schritt werden die humanen embryonalen Stammzellen entweder dazu gebracht, Embryoidkörper zu bilden, in denen sie Zellen aller drei Keimblätter generieren können, oder sie werden zu neuroektodermalen Vorläuferzellen differenziert.

Anschließend werden die Embryoidkörper oder neuroektodermalen Vorläuferzellen während der Differenzierung mit interessierenden Verbindungen in verschiedenen Konzentrationen behandelt. Die abschließenden Schritte bestehen in der Beurteilung der Zellviabilität und der Isolierung der RNA. Letztendlich kommt eine Transkriptom-Microarray-Analyse zum Einsatz, um die Veränderungen in der RNA-Expression von Zellen, die mit einer Verbindung von Interesse behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen darzustellen. Auf der Grundlage menschlicher neuraler Stammzellen und DNA-Makroareale haben wir eine In-vitro-Methodik etabliert, die die Überwachung von für den Menschen relevanten entwicklungstoxikologischen Effekten ermöglicht.

Die Methodik kann von der pharmazeutischen und chemischen Industrie für die Sicherheitsprüfung potenzieller Arzneimittel und umwelttoxischer Substanzen angewendet werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungstoxizität zu beantworten, beispielsweise die Wirkung von Chemikalien auf die sehr frühe Neuroentwicklung. Beginnen Sie damit, das Supplement für das Stammzellmedium bei Raumtemperatur aufzutauen, und geben Sie 100 Milliliter davon in 400 Milliliter des basalen Stammzellmediums.

Als Nächstes tauen Sie die Basalmembranmatrix auf Eis auf und geben anschließend das ergänzte Matrixvolumen in 24 Milliliter gekühltes DMM F12-Grundmedium, wie vom Hersteller empfohlen. Mischen Sie die Lösung vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren und geben Sie dann zwei Milliliter der Mischung in zwölf separate sechs Zentimeter große Platten. Inkubieren Sie die Platten eine Stunde bei Raumtemperatur, während die Matrix die Platten beschichtet.

Entfernen Sie dann das Medium und geben Sie zwei Milliliter Stammzellmedium hinzu. Entfernen Sie anschließend vier konfluente Platten aus dem Inkubator, die humane embryonale H9-Zellen enthalten, die auf Maus-embryonalen Fibroblasten-Füttererschichten kultiviert wurden, wie im begleitenden Textprotokoll unter dem Stereomikroskop beschrieben. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze und entfernen Sie die differenzierten Kolonien von der Platte.

Undifferenzierte Kolonien weisen scharf abgegrenzte Ränder auf und die Zellen sind dicht gepackt, während differenzierte Zellen beginnen, sich von den Rändern aus auszubreiten und größere Zellgrößen aufweisen. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit vier Millilitern PBS. Geben Sie anschließend zwei Milliliter Stammzellmedium mit acht unter einem Stereomikroskop hinzu.

Schneiden Sie die Kolonien mit einer 26-Gauge-Nadel in sechs bis neun Stücke und lösen Sie die Klumpen mit Pipettenspitzen für einen Milliliter ab. Sammeln Sie die geschnittenen Kolonien vorsichtig in einem 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen und pelletieren Sie sie fünf Minuten lang bei 200 ×g. Danach saugen Sie das Überstand ab und resuspendieren die Zellen in 12 Milliliter Stammzellmedium.

Geben Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension auf einen Objektträger und zählen Sie die Anzahl der Zellklumpen unter dem Mikroskop. Stellen Sie die Konzentration der Suspension auf 150 Klumpen pro Milliliter ein und geben Sie anschließend zwei Milliliter der Suspension in jede sechs Zentimeter große Petrischale. Bewegen Sie die Schalen vor und zurück sowie seitlich, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie die Schalen danach jeden zweiten Tag in einem Zellkultur-Inkubator.

Wechseln Sie das Medium vorsichtig. Nachdem Sie die differenzierten Kolonien entfernt haben, geben Sie 40 Mikroliter einer sterilen 5%-Blockcopolymer-Lösung in jedes Loch einer Vbo-96-Loch-Platte und lassen Sie die Platte 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entnehmen Sie eine konfluente Platte mit Kolonien aus dem Inkubator und entfernen Sie mithilfe einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze unter dem Stereomikroskop alle differenzierten Kolonien. Danach saugen Sie das Medium von der Platte ab und waschen die Zellen vorsichtig mit vier Millilitern PBS.

Fügen Sie anschließend zwei Milliliter zufälliges Differenzierungsmedium zu jeder Platte hinzu. Verwenden Sie das Passagierungswerkzeug, um die H nine-Zellkolonien in Klumpen einheitlicher Größe zu schneiden. Schaben Sie die Klumpen mit einem Zellabstreifer ab und sammeln Sie sie vorsichtig in ein 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen für die Zentrifugation.

Die Kolonien werden bei 200 G fünf Minuten lang zentrifugiert und anschließend der Überstand abgesaugt. Die Zellen werden in Differenzierungsmedium mit zufälliger Zusammensetzung resuspendiert, wobei eine Dichte von 1000 Kolonien pro Milliliter eingestellt wird. Danach wird das Blockcopolymer aus der V-förmigen 96-Loch-Platte abgesaugt. Mithilfe einer Mehrkanalpipette werden 100 Mikroliter der Koloniensuspension in jedes Loch gegeben. Die Kolonien werden durch Zentrifugation der Platte bei vier Grad Celsius für vier Minuten bei 400 G am Boden der V-förmigen Vertiefungen aggregiert. Anschließend wird die Platte vier Tage lang in den Inkubator gestellt, wobei Pipettenspitzen mit größerem Durchmesser (200 Mikroliter) verwendet werden. Die Embryoidkörper werden aus der 96-Loch-Platte entnommen und in eine sterile quadratische Petrischale mit 122 Millimeter Durchmesser überführt.

Verwenden Sie anschließend eine sterile 10-Milliliter-Serologiepipette, um die Embryoidkörper von der quadratischen Platte in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen zu überführen. Lassen Sie die Embryoidkörper zwei Minuten lang sedimentieren und aspirieren Sie dann den Überstand. Waschen Sie die Embryoidkörper mit fünf Millilitern PBS. Warten Sie erneut zwei Minuten, bis die Embryoidkörper abgesetzt haben, und aspirieren Sie anschließend den Überstand.

Resuspendieren Sie diesmal die Embryonalkörper in fünf Millilitern zufälligem Differenzierungsmedium. Überführen Sie anschließend die Embryonalkörper in eine 10 cm große bakteriologische Platte und geben Sie zusätzlich 10 Milliliter zufälliges Differenzierungsmedium hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5 %CO2 auf einem horizontalen Schüttler.

Bei 50 U/min werden die repräsentativen Embryoidkörper für Tag fünf, Tag neun und Tag 14 gezeigt. Wechseln Sie das Medium vorsichtig alle zwei Tage, wobei Sie alle 15 Milliliter durch frisches Zufallsdifferenzierungs-Medium ersetzen. Um einen Arzneimittelinfluss auf die Differenzierung zu untersuchen, fügen Sie ab Tag fünf wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben zehn Tage lang das Arzneimittel dem Medium hinzu.

Sammlen Sie mit einer sterilen Pipette die Embryoidkörper von den 10 cm-Platten in einem 15 ml-Falcon-Röhrchen. Lassen Sie sie zwei Minuten lang absetzen und ziehen Sie dann den Überstand ab. Waschen Sie sie mit fünf Millilitern PBS und überführen Sie sie in ein nukleasefreies 1,5-ml-Röhrchen.

Lassen Sie sie absetzen und aspirieren Sie den Überstand. Suspendieren Sie die Embryokörper in einem Milliliter Triol-Reagenz und führen Sie die Lösung etwa 15 Mal durch eine 24-Gauge-Nadel mit einer Ein-Milliliter-Spritze, um die Zellen zu lysieren. Geben Sie danach 200 Mikroliter Chloroform zu jeder Probe hinzu.

Versetzen Sie die Inhalte kurz durch Vortexen und zentrifugieren Sie die Proben anschließend 15 Minuten bei 12.000 G bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie den Überstand in 1,5-Milliliter-Röhrchen, ohne die anderen Schichten zu stören. Geben Sie dann ein äquivalentes Volumen kalten 70 %igen Ethanol zum Überstand und mischen Sie die Inhalte vorsichtig durch Schütteln. Überführen Sie 700 Mikroliter der Mischung in eine Mini-Spin-Säule und befolgen Sie die Herstelleranweisungen, um die RNA im letzten Elutionsschritt zu reinigen.

Geben Sie 22 Mikroliter nukleasefreies Wasser auf die Säule und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 12.000 ×g für eine Minute. Entfernen Sie dann das Sammelröhrchen und stellen Sie die RNA auf Eis. Fügen Sie ein Milliliter vorgewärmtes Diskraum-Medium pro konfluentes T-25-Fläschchen mit H-9-Zellen hinzu und inkubieren Sie das Fläschchen für neun Minuten bei 37 Grad Celsius.

Gebe anschließend zwei Milliliter vorgewärmtes Waschmedium zu den behandelten, dissoziierten Zellen und pipettieren Sie fünfmal vorsichtig auf und ab mit einer Fünf-Milliliter-Pipette. Überführen Sie die Zellsuspension in ein Falcon-Röhrchen.

Als Nächstes spülen Sie den Kolben mit neun Millilitern Waschmedium aus und geben Sie es in das Gefäß mit den Zellen. Zentrifugieren Sie die Ernte ihrer Zellen drei Minuten und dreißig Sekunden bei 500 × g. Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern Waschmedium. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut drei Minuten und dreißig Sekunden bei 500 × g, entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in vier Millilitern humanem embryonalen Stammzellmedium. Geben Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension und 4,5 Milliliter frisches Medium in einen frischen, mit PBS ausgespülten T-25-Kolben, der mit mitotisch inaktivierten embryonalen Mausfibroblasten beschichtet ist.

Wechseln Sie das Medium im Kolben jeden Tag. Beschichten Sie eine 10 cm große Petrischale mit 0,1 % Gelatine in PBS und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Anschließend gewinnen Sie humane embryonale Stammzellen, indem Sie das Medium entfernen und einem T-25-Kolben ein Milliliter Acuta zusetzen, während sich die Zellen lösen.

Geben Sie 6,6 Milliliter kaltes Medium zu 330 Mikroliter gefrorenem Basalmembran-Matrix. Filtern Sie die Lösung durch einen 40-Mikrometer-Zellfilter und verwenden Sie ein Milliliter der filtrierten Lösung, um jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte zu bedecken. Die Zellen werden später auf die beschichteten Platten ausgesät, nachdem die 30-minütige Inkubation der humanen embryonalen Zellen mit Accutane erfolgt ist; stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 1,5 Milliliter Hess-Medium.

Schaben Sie die Zellen aus dem Kolben und geben Sie anschließend acht Milliliter Hess-Medium hinzu. Erstellen Sie eine Einzelzelllösung, indem Sie vorsichtig mit einer 10-Milliliter-Pipette mehrmals auf- und abpipettieren, filtern Sie die Zellen durch einen 40-Mikrometer-Zellfilter, und zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten bei 500 × g. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter Medium. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut drei Minuten bei 500 × g. Entfernen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Milliliter Hess-S-Medium, das den ROCK-Inhibitor Y 27632 in einer Endkonzentration von 10 µM enthält.

Als Nächstes entfernen Sie den Überstand von der mit Gelatine beschichteten Schale, die Zellsuspension auf der mit Gelatine beschichteten Schale, und inkubieren Sie genau eine Stunde bei 37 Grad Celsius. Während dieses Schritts wird sich das Hypoblast auf den mit Gelatine beschichteten Platten absetzen, während die humanen embryonalen Stammzellen frei bleiben. Die Schwimmzeit ist entscheidend, da eine zu lange Inkubation zur Agglomeration der Stammzellen führt und eine zu kurze Inkubation nur wenige dieser Fibroblasten entfernt, nachdem die Fibroblasten angeheftet haben.

Verwenden Sie das Medium in der Platte, um die nicht-anklebenden Stammzellen vorsichtig von der Platte abzuwaschen. Waschen Sie die Platte ein zweites Mal mit 10 Milliliter Hess-Medium, sammeln Sie die Zellen, zentrifugieren Sie diese drei Minuten bei 500 ×g, entfernen Sie das resultierende Überstand-Supernatant und resuspendieren Sie die Zellen in etwa vier Milliliter konditioniertem Medium, das 10 Mikromolar des ROCK-Inhibitors Y 2,7,6,3,2 und 10 Nanogramm pro Milliliter Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 enthält. Anschließend mischen Sie die Zellen mit Trypanblau und zählen Sie auf einer Hämozytometer-Platte.

18.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf die Platte vor der Basalmembran. Membranbeschichtete Platten mit 1,5 Milliliter Medium pro Vertiefung über die Zellen geben und bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach 24 Stunden das Medium erneuern. Nach weiteren 24 Stunden das Medium durch frisches konditioniertes Medium ersetzen, das nur mit 10 Nanogramm pro Milliliter Fibroblastenwachstumsfaktor 2 ergänzt ist, und 72 Stunden lang inkubieren.

Nach der Aussaat der Zellen wechseln Sie das Medium in ein Knockout-Serumersatzmedium. Dieser Zeitpunkt wird als Tag null der Differenzierung bezeichnet. Erneuern Sie täglich für die nächsten drei Tage das Medium.

Wenn am vierten und fünften Tag das Medium gewechselt wird, fügen Sie ein Medium hinzu, das aus 25 % N zwei supplementiertem Medium und 75 % Knockout-Serumersatz besteht. Am sechsten Tag sammeln Sie die Zellen zur Analyse. Die Embryoidkörper können für zahlreiche verschiedene Untersuchungen verwendet werden.

Hier ist ein Beispiel für eine Zytotoxizitätsstudie, die den Effekt unterschiedlicher Konzentrationen von Methylquecksilber auf die Zellviabilität zeigt. Aus dieser Grafik ergab sich, dass eine Konzentration von 24 µM nach 14-tägiger Exposition eine Zelltodrate von 10 % und eine Konzentration von 1,61 µM eine Zelltodrate von 50 % verursachte. RNA, isoliert aus Embryoidkörpern von drei Behandlungsgruppen mit Methylquecksilber, wurde in einem Microarray analysiert, um eine Vielzahl von Biomarkern zu untersuchen.

Diejenigen, die einer Konzentration von 0,25 µM Quecksilber ausgesetzt waren, sind rot dargestellt. Diejenigen, die einer Konzentration von 1 µM Methylquecksilber ausgesetzt waren, sind blau dargestellt, und die Kontroll-RNA ist grün dargestellt. Diese Hauptkomponentenanalyse zeigt, dass sich die genetischen Merkmale jeder Behandlungsgruppe signifikant voneinander unterscheiden; bei insgesamt mehr als 276 Genen wurde eine mehr als zweifache Modifikation beobachtet, nachdem sie der Konzentration von 1 µM Methylquecksilber ausgesetzt waren.

30 dieser Gene wurden außerdem durch die Gruppe mit niedrigerer Konzentration bei 25 µM verändert. Auf dieser Wärmekarte ist ersichtlich, dass 233 der Gene, die in der Behandlungsgruppe mit einem µM verändert wurden, Gene waren, die durch die Behandlung herunterreguliert wurden, während nur 43 hochreguliert wurden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Triazolen oder Entwicklungsantagonisten äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzbrille, chemikalienbeständigen Handschuhen sowie die Durchführung aller triazolbezogenen Arbeiten in einer Abzugshaube stets berücksichtigt werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie Färbungen oder Ferros-Formation, die Ihre Röhrenbildung beeinflussen können, durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie die phänotypische Verankerung zu beantworten.