Menschliche pluripotente Stammzelle Basierend Entwicklungstoxizität Assays für chemische Sicherheit Screening und Systembiologie Datengenerierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zwei in vitro Testsysteme für Entwicklungstoxizität zu beschreiben, die auf humanen embryonalen Stammzellen und Transkriptomstudien basieren. Dies wird erreicht, indem zunächst humane embryonale Stammzellen auf embryonalen Fibroblasten der Maus kultiviert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die menschlichen embryonalen Stammzellen entweder Embry-Körper bilden zu lassen, in denen sie Zellen aller drei Keimblätter erzeugen können, oder sie in neuroektodermale Vorläuferzellen zu differenzieren.

Als nächstes werden die Embryokörper oder neuroektodermalen Vorläuferzellen während der Differenzierung mit interessanten Verbindungen in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt. Die letzten Schritte bestehen darin, die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen und die RNA zu isolieren. Letztendlich wird die Transkriptom-Microarray-Analyse verwendet, um die Veränderungen in der RNA-Expression von Zellen zu zeigen, die mit einer Substanz von Interesse behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Basierend auf humanen neonischen Stammzellen und DNA-Makrobereichen haben wir eine In-vitro-Methodik etabliert, die die Überwachung der für den Menschen relevanten Entwicklungstoxizitätseffekte ermöglicht.

Die Methodik kann von der pharmazeutischen und chemischen Industrie zur Sicherheitsüberprüfung potenzieller Arzneimittel und Umweltgifte angewendet werden. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Entwicklungstoxizität zu beantworten, wie z.B. die Wirkung von Chemikalien auf die sehr frühe Neuroentwicklung. Zu Beginn tauen Sie das Stammzellmedium-Supplement bei Raumtemperatur auf und geben Sie 100 Milliliter davon in 400 Milliliter des basalen Stammzellmediums.

Als nächstes tauen Sie die Basalmembranmatrix auf Eis auf und geben Sie dann das ergänzte Volumen der Matrix in 24 Milliliter gekühltes dmm. F 12 Basalmedium, wie vom Hersteller empfohlen, eine Lösung durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mischen und dann zwei Milliliter der Mischung in 12 separate Sechs-Zentimeter-Platten geben. Inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur, während die Matrix die Platten bedeckt.

Entfernen Sie dann das Medium und fügen Sie zwei Milliliter Stammzellmedium hinzu. Entfernen Sie anschließend vier konfluente Platten aus dem Inkubator, in dem sich der menschliche Embryo befindet. H neun Zellen, die auf embryonalen Faserblasten-Feeder-Schichten der Maus gezüchtet werden, die wie im begleitenden Intext-Protokoll unter einem Stereoskop vorbereitet werden, verwenden eine Ein-Milliliter-Pipettenspitze und entfernen die differenzierten Kolonien von der Platte.

Undifferenzierte Kolonien haben gut definierte Grenzen und Zellen sind kompakt, während differenzierte Zellen beginnen, sich von den Grenzen aus zu vermehren und ihre Zellen größer sind. Aspirieren Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit vier Millilitern PBS. Fügen Sie dann zwei Milliliter Stammzellmedium mit der Acht eines Stereoskops hinzu.

Schneiden Sie die Kolonien mit einer 26-Gauge-Nadel in jeweils sechs bis neun Stücke und kratzen Sie die Klumpen mit einer Milliliter-Pipettenspitze ab. Sammeln Sie die geschnittenen Kolonien vorsichtig in einem 50-Milliliter-Falkenröhrchen und pelletieren Sie sie fünf Minuten lang bei 200 g. Als nächstes aspirieren Sie die Snat und resuspendieren die Zellen in 12 Millilitern Stammzellmedium.

Geben Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension auf einen Objektträger und zählen Sie die Anzahl der Klumpen unter dem Mikroskop. Stellen Sie eine Konzentration der Suspension auf 150 Klumpen pro Milliliter ein und geben Sie dann zwei Milliliter der Suspension in jede sechs Zentimeter große Platte. Bewegen Sie die Platten hin und her und von einer Seite zur anderen, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, und inkubieren Sie die Platten dann jeden zweiten Tag in einem Zellkultur-Inkubator.

Vorsichtiger Wechsel des Mediums Nach dem Entfernen der differenzierten Kolonien werden 40 Mikroliter einer sterilen 5%igen Blockcopolymerlösung in jede Vertiefung einer Vbo 96-Well-Platte gegeben und 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nehmen Sie eine konfluente Platte mit Kolonien aus dem Inkubator und wählen Sie alle differenzierten Kolonien unter einem Stereomikroskop mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze aus. Saugen Sie dann das Medium aus der Platte ab und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit vier Millilitern PBS.

Geben Sie als Nächstes zwei Milliliter zufälliges Differenzierungsmedium auf jede Platte. Verwenden Sie das Durchgangswerkzeug, um die neunzelligen Kolonien von H in Klumpen von einheitlicher Größe zu schneiden. Kratzen Sie die Klumpen mit einem Zellschaber ab und sammeln Sie sie vorsichtig in einer 50-Milliliter-Falcon-Tube-Zentrifuge.

Die Kolonie verklumpt fünf Minuten lang bei 200 G, aspiriert dann die Snat und resuspendiert die Zelle und das zufällige Differenzierungsmedium bei 1000 Klumpen pro Milliliter. Als nächstes aspirieren Sie das Blockcopolymer aus der unteren 96-Well-Platte mit V. Geben Sie mit Hilfe einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter die Koloniesuspension in jede Vertiefung und aggregieren Sie die Klumpen auf den Boden der V-förmigen Vertiefungen, indem Sie die Platte vier Minuten lang bei 400 G bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nehmen Sie die Embryokörper aus der 96-Well-Platte und legen Sie sie in eine sterile quadratische 122-Millimeter-Platte.

Verwenden Sie anschließend eine sterile serologische 10-Milliliter-Pipette, um die Embryokörper von der quadratischen Platte in ein 15-Milliliter-Falkenröhrchen zu übertragen. Lassen Sie die Embryokörper zwei Minuten lang ruhen, saugen Sie dann die Schlinge ab und waschen Sie die Embryokörper mit fünf Millilitern PBS. Warten Sie auch hier zwei Minuten, bis sich die Embryokörper beruhigt haben, und aspirieren Sie dann den Überstand.

Diesmal resuspendieren Sie die Embryokörper in fünf Millilitern zufälligem Differenzierungsmedium. Übertragen Sie dann die Embryokörper in eine 10 Zentimeter große bakteriologische Platte und fügen Sie weitere 10 Milliliter zufällige Differenzierung hinzu. Mittel. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 auf einem horizontalen Shaker.

Bei 50 U/min werden die repräsentativen Embryokörper für den fünften, neunten und 14. Tag gezeigt. Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag vorsichtig und ersetzen Sie alle 15 Milliliter durch frische Zufallsdifferenzierung. Mittel. Um die Wirkung eines Arzneimittels auf die Differenzierung zu beurteilen, beginnen Sie mit der Zugabe des Arzneimittels zum Medium am fünften Tag für 10 Tage, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.

Entnehmen Sie mit einer sterilen Pipette die Embryokörper aus den 10-Zentimeter-Platten in ein 15-Milliliter-Falkenröhrchen. Lassen Sie sie zwei Minuten ruhen und saugen Sie dann den Überstand an. Waschen Sie sie mit fünf Millilitern PBS und geben Sie sie in ein nukleasefreies 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Lassen Sie sie sich absetzen und saugen Sie den Snat-Raise an. Suspendieren Sie die Embryokörper in einem Milliliter Triolreagenz und geben Sie eine Lösung etwa 15 Mal durch eine 24-Gauge-Nadel mit einer Ein-Milliliter-Spritze, um die Zellen aufzubrechen. Fügen Sie anschließend jeder Probe 200 Mikroliter Chloroform hinzu.

Den Inhalt kurz vorziehen und dann die Proben bei 12.000 g 15 Minuten lang zentrifugieren. Bei vier Grad Celsius den Überstand in 1,5-Milliliter-Röhrchen auffangen, ohne eine der anderen Schichten zu stören. Geben Sie dann die gleiche Menge gekühltes 70%iges Ethanol in den Überstand und mischen Sie den Inhalt vorsichtig durch Schütteln. Übertragen Sie 700 Mikroliter des Gemisches in eine Mini-Spin-Säule und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um die RNA im letzten Elutionsschritt aufzureinigen.

Geben Sie 22 Mikroliter nukleasefreies Wasser auf die Spin-Säule und zentrifugieren Sie die Röhrchen eine Minute lang bei 12.000 g. Entfernen Sie dann das Entnahmeröhrchen und legen Sie die RNA auf Eis. Fügen Sie einen Milliliter vorgewärmten Scheibenraum pro konfluentem T-25-Kolben mit H neun Zellen hinzu und inkubieren Sie den Kolben neun Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie dann zwei Milliliter Vorwärmen hinzu. Waschen Sie das Medium auf die verdrängten behandelten Zellen und pipettieren Sie vorsichtig fünfmal mit einer Fünf-Milliliter-Pipette auf und ab. Übertragen Sie die Zelllösung in ein Falkenröhrchen.

Anschließend wird der Kolben mit neun Millilitern Waschmittel gewaschen und in das Röhrchen mit den Zellen gegeben. PT die Ernte der Zellen für dreieinhalb Minuten bei 500 G. Entfernen Sie dann die Schlinge und resuspendieren Sie die Zellen in 10 Millilitern Waschmedium. PT die Zellen erneut dreieinhalb Minuten lang bei 500 G, dann entfernen Sie das Präparat und resuspendieren Sie die Zellen in vier Millilitern humanem embryonalem Stammzellmedium, fügen Sie 0,5 Milliliter der Zellsuspension und 4,5 Milliliter frisches Medium in einen frischen PBS-gewaschenen T-25-Kolben hinzu, der mitotisch inaktivierte embryonale Fibroblasten der Maus enthält.

Wechseln Sie das Medium im Kolben täglich. Eine 10 Zentimeter große Schale mit 0,1 % Gelatine in PBS bestreichen und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Dann entnehmen Sie eine humane embryonale Stammzelle, indem Sie das Medium entfernen und einen Milliliter Acuta in den T 25-Kolben geben, während sich die Zellen ablösen.

Fügen Sie 6,6 Milliliter kaltes Medium zu 330 Mikrolitern gefrorener Basalmembranmatrix hinzu. Filtrieren Sie die Lösung durch ein 40-Mikrometer-Zellensieb und verwenden Sie einen Milliliter der gefilterten Lösung, um jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte abzudecken. Die Zellen werden später nach der 30-minütigen Inkubation der menschlichen embryonalen Zellen mit Accutane auf den beschichteten Platten plattiert, stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 1,5 Millilitern Hess-Medium.

Kratzen Sie die Zellen aus dem Kolben und fügen Sie weitere acht Milliliter Hess-Medium hinzu. Stellen Sie eine Einzelzelllösung her, indem Sie die Zellen vorsichtig mit einer 10-Milliliter-Pipette durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb auf und ab pipettieren und dann die Zellen drei Minuten lang zentrifugieren. Bei 500 g den S-Überstand entfernen und die Zellen in 10 Millilitern Zellen mit mittlerem Spin erneut drei Minuten lang bei 500 G resuspendieren. Die Zellen werden in 10 Millilitern Hess S Medium, das den Gesteinsinhibitor Y 2 7 6 3 2 enthält, in einer Endkonzentration von 10 μmolar suspendiert.

Als nächstes entfernen Sie den Überstand von der mit Gelatine überzogenen Schüssel, die Zellsuspension auf der mit Gelatine überzogenen Schale und inkubieren genau eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Während dieser Schritte setzt sich der Hypoplast auf den mit Gelatine überzogenen Platten ab, wo die menschlichen embryonalen Stammzellen frei bleiben. Die Gleitzeit ist entscheidend, da eine lange Inkubation zu einer Verklumpung der Stammzellen führt und eine kurze Inkubation nur wenige dieser Fibroblasten entfernt, wenn sich die Fibroblasten anheftet haben.

Verwenden Sie das Medium in der Platte, um die nicht adhärenten Stammzellen vorsichtig von der Platte zu waschen. Waschen Sie die Platte ein zweites Mal mit 10 Millilitern Hess-Medium und poolen Sie die Zellen, zentrifugieren Sie die Zellen drei Minuten lang bei 500 G, entfernen Sie den resultierenden S-Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in etwa vier Millilitern konditioniertem Medium, das 10 Mikromolare des Gesteinsinhibitors Y 2, 7, 6, 3, 2 und 10 Nanogramm pro Milliliter Fiberblast-Wachstumsfaktor zwei enthält. Als nächstes mischen Sie die Zellen mit Trianblau und zählen sie in einer Hämozytometerplatte.

18.000 Zellen pro Quadratzentimeter auf der Platte vor dem Keller. Membranbeschichtete Platten bedecken die Zellen mit 1,5 Millilitern Medium pro Vertiefung und inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Nach 24 Stunden das Medium auffrischen Nach weiteren 24 Stunden wechseln Sie das Medium zu einem frischen konditionierten Medium, das mit nur 10 Nanogramm pro Milliliter Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 72 Stunden ergänzt wird.

Nachdem Sie die Zellen ausgesät haben, wechseln Sie das Medium auf Knockout-Serum-Ersatzmedium. Dieser Zeitpunkt wird als Tag Null der Differenzierung bezeichnet. Erfrischen Sie die Zellen in den nächsten drei Tagen täglich mit frischem Medium.

Wenn Sie das Medium am vierten und fünften Tag wechseln, fügen Sie einen bestehend aus 25%N zwei supplementierten Medium und 75% Knockout-Serumersatz hinzu. Medium am sechsten Tag ernten Sie die Zellen für die Analyse. Die Embryokörper können für viele verschiedene Studien verwendet werden.

Hier ist ein Beispiel für eine Zytotoxizitätsstudie, die die Wirkung unterschiedlicher Konzentrationen von Methylquecksilber auf die Lebensfähigkeit der Zellen zeigt. Aus diesem Diagramm wurde bestimmt, dass Punkt 24 Mikromolar nach 14-tägiger Exposition einen Zelltod von 10 % und eine Konzentration von 1,61 Mikromolar einen Zelltod von 50 % verursachte. RNAs, die aus Embryokörpern von drei Methylquecksilber-Behandlungsgruppen isoliert wurden, wurden auf einem Microarray laufen lassen, um eine Vielzahl von Biomarkern zu untersuchen.

Personen, die mikromolarem Quecksilber Punkt 25 ausgesetzt sind, sind rot dargestellt. Diejenigen, die einem mikromolaren Methylquecksilber ausgesetzt waren, sind blau dargestellt, und die Kontroll-RNA ist grün dargestellt. Diese Karte der Hauptkomponentenanalyse zeigt, dass sich die genetischen Eigenschaften jeder Behandlungsgruppe signifikant von der anderen unterscheiden: Insgesamt wurden mehr als 276 Gene mehr als doppelt so verändert, wenn sie einer mikromolaren Konzentration von Methylquecksilber ausgesetzt wurden.

30 dieser Gene wurden auch durch die niedrigere Konzentrationsgruppe bei Punkt 25 mikromolar modifiziert. Auf dieser Heatmap kann man sehen, dass 233 der Gene, die in der einen mikromolaren Behandlungsgruppe modifiziert wurden, Gene waren, die durch die Behandlung herunterreguliert wurden, und nur 43 hochreguliert wurden. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Triazol oder Entwicklungsameisen äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer Septi-Schutzbrille, chemikalienbeständige Handschuhe und die Durchführung aller Triol-bezogenen Arbeiten im Abzug bei der Durchführung dieses Verfahrens immer berücksichtigt werden sollten.

Befolgen Sie dieses Verfahren. Andere Methoden wie Färben, Ferosbildung, die Ihre Röhrenbildung vermischen können, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie phänotypische Verankerung zu beantworten.