Name: Eine ganze Zelle Bioreporter Ansatz für Transport und Bioverfügbarkeit von organischen Schadstoffen in Wasser Ungesättigte Systeme Bewerten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: Erfahren Sie einen ganzzelligen Bioreporter-Ansatz zur Bewertung der Bioverfügbarkeit organischer Schadstoffe wie Fluoren in wassergesättigten Systemen mit Burkholderia sartisoli RP037-mChe.

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Die Förderung durch die Deutsche Stiftung Umwelt (DBU) wird anerkannt. Die Autoren danken Ute Kuhlicke für die technische Hilfe bei der CLSM-Analyse und Birgit Würz, Rita Remer und Jana Reichenbach für die kompetente experimentelle Hilfe. Die Autoren danken insbesondere Prof. Jan Roelof van der Meer und Dr. Robin Tecon für die fruchtbare Diskussion und die Bereitstellung des Bioreporter-Stammes. Es beteiligt sich am Forschungsprogramm "Chemicals in the Environment" (CITE) der Helmholtz-Gemeinschaft.

1. Vorbereitung der Gerichte, Slides und Inkubationskammern <ol><li> Bereiten Sie das folgende Material für jeden Mikrokosmos: eine große Kunststoff-Petrischale unten (d = 10 cm), ein modifiziertes (siehe Schritt 1.2) kleine Kunststoff-Petrischale unten (d = 5 cm) mit Deckel und einer Zählkammer Rutsche mit drei Hohlräumen. </li><li> Nehmen Sie die gewünschte Anzahl von Petrischale Unterteile (d = 5 cm). Entfernen Sie Teil der Rand mit einer Säge passgenau einen Schieber (26 mm Kantenlänge). Um das System zu sterilisieren, genießen Petrischale Böden und Deckel in 70% Ethanol O / N und trocknen Sie sie für mindestens 2 Stunden in einem Strom Schrank unter UV-Licht. Speichern die Petrischalen in einem dicht verschlossenen Kunststoffbehälter, der auch UV-Licht 2 Stunden ausgesetzt worden waren. </li><li> Wischen Sie die gewünschte Anzahl der Folien mit 70% Ethanol und Klima trocknen. Wickeln Sie Folien in Aluminiumfolie und legen Sie sie in einem Muffelofen 5 h bei 450 ° C, um mögliche Verunreinigungen zu entfernen. </li&gt; <li> Bereiten Glas Inkubationskammern mit Deckel. Reinigen mit 70% Ethanol und freizulegen offenen Kammern mit UV-Licht für mindestens 2 h in einem Strömungsgehäuse. HINWEIS: Large Exsikkatoren (Durchmesser etwa 30 cm) mit Deckel kann zu diesem Zweck verwendet werden; jeder Exsikkator kann bis zehn Mikrokosmos Setups Haus auf. </li></ol> 2. Herstellung der Medien und Kultur <ol><li> So führen 20 parallel Mikrokosmen, erhalten 100 ml geändert Trypton-Hefe-Medium (MTY) 14, etwa 150 ml 21C-Minimalmedium 16 (MM), 5 ml Minimalmedium-Agar (MMA; 0,5% w / v), drei Kartoffel-Dextrose-Agar-Platten (PDA; 1,5%, w / v) für P. ultimum, vier leeren Platten, einer PDA-Platte, die 2 mg L -1 Cycloheximid vier Agaroseplatten (3% w / v), enthaltend 0,3 g ml -1 Aktivkohle und 40 mg FLU in 2 mg-Portionen. </li><li> Bereiten mty enthaltend 50 mg L -1 Kanamycin (Kanamycin ist required, um die eGFP Reporterplasmid) und MM mit 10 mM Acetat für bakterielle Anbau erhalten. Verwenden MM ohne Acetat auf 0,5% MMA zur Immobilisierung von Bakterien in den Mikrokosmen vorzubereiten und Platten gießen (jeweils 20 ml) von 1,5% PDA für den Anbau von Pythium ultimum und Mikrokosmos Setups. </li><li> Impfen Sie einige Hyphen von P. ultimum auf drei frische PDA-Platten und Inkubation im Dunkeln bei 25 ° C für etwa 72 Stunden. Stellen Sie anschließend sicher, dass die Platten überwuchert vollständig durch frische und flauschige Myzel. </li><li> Starten zwei Kulturen von B. sartisoli RP037-MCHe in 50 ml MTY aus einem Glycerin Lager. Inkubation bei 30 ° C mit 230 Umdrehungen pro Minute rotierenden Kolben Bewegung O / N. </li><li> Maßnahme Kultur optische Dichte (OD) bei 578 nm und die Zentrifuge bei 1000 × g für 10 min (für B. sartisoli RP037-MCHe ist die erwartete OD 578 etwa 1,0, und die Zellen sind in der exponentiellen Phase). Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren, die Zellenin einer angemessenen Menge von MM auf eine OD 578 von 0,4 zu erreichen. Impfen Sie 20 ml MM mit 50 mg L -1 Kanamycin mit 400 ul der resuspendierten Zellen. Inkubation bei 30 ° C mit 230 Umdrehungen pro Minute rotierenden Kolben Bewegung O / N. </li><li> Messen OD 578 der Kultur in MM (von B. sartisoli RP037-MCHe ist die erwartete OD 578 etwa 0,2, und die Zellen in der frühen exponentiellen Phase). Zentrifugenkultur bei 2.000 × g für 10 min und erneut die Zellen in einer geeigneten Menge an MM auf eine OD von 0,4 erreicht. Mischen Sie 50 ul der Zellsuspension mit 500 ul warme, flüssige MMA in 2-ml-Röhrchen und lagern bei 50 ° C bis zur Verwendung. Verwenden Sie 150 ul der Zellen in MMA für jedes Mikrokosmos. </li><li> Platten gießen Agarosegel Aktivkohle enthält. Schmelzen Agarose (3%, w / v) in doppelt destilliertem Wasser. Gründlich mischen mit Aktivkohle (0,3 g ml -1) und gießen Mischung in Kunststoffpetrischalen(D = 10 cm). </li></ol> 3. Mikrokosmos Montage . Hinweis: Die komplette Mikrokosmos Setup ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt, finden Sie in allen folgenden Einzelschritte Abbildung 1. Die folgenden Schritte beschreiben die Vorbereitung einer Probe (SAM) mit Myzel Transportvektoren und drei verschiedene Steuerungseinstellungen (CON AIR CON NEG, CON POS). Eine Zusammenfassung der verschiedenen Einstellungen können in Tabelle 1 gefunden werden. <ol><li> Nehmen gewünschte Anzahl von Petrischalen und Rutschen und deckt sie mit UV-Licht unter einem Strom Schrank für 30 min. </li><li> Setzen Sie den kleinen Petrischale in der großes und passen Sie die Folie durch den Spalt des kleinen Petrischale. Nehmen Sie eine Probe des warmen Zellsuspension in MMA und fügen Sie 150 ul in die Mitte Hohlraum eine Folie. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die mittleren Hohlräumen aller Folien sindmit MMA gefüllt. Warten Sie 5 Minuten für die MMA zu verfestigen. </li><li> Verwenden Sie eine 1 cm Korkbohrer aus einem leeren PDA Platte Punch-Out kreisförmigen Flecken. Legen Sie ein Patch in einem Abstand von 2 mm neben dem MMA in dem kleinen Petrischale. Fügen Sie diese auf Myzelwachstum im Setup (PDA 3 in Abbildung 1) zu fördern. </li><li> Schneiden gekrümmt PDA Patches als mechanische Barrieren. Verwenden Sie eine saubere und sterile kleine Petrischale Unterteil und drücken Sie sie in ein PDA-Platte. Verwenden Sie einen Spachtel, um einen anderen kleineren Ring in einem Abstand von 0,5 cm in den Agar, die in einem PDA-Ring führt zu schneiden. <ol><li> Schneiden Sie ein Stück, das passt genau in die Lücke des kleinen Petrischale im Mikrokosmos Setup und legen Sie sie in die Lücke an der Spitze der Folie. Sicherzustellen, dass der Abstand zwischen dem MMA und dem kreis PDA Barriere beträgt etwa 2 mm. Schließen Sie den Deckel des kleinen Petrischale leichten Druck in die PDA-Schranke. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.4.1 mit einem PDA-Platte mit 2 g L -1Cycloheximid. HINWEIS: Dies ist die Steuer Setup für Lufttransport (CON AIR) zu den Bioreporter Zellen, da Myzel durch Cycloheximid gehemmt und nicht überwuchern MMA. </li></ol></li><li> Verwenden Sie eine 1 cm Korkbohrer zu Punch-Out kreisförmigen Flecken von einem leeren PDA Platte. Verwenden Sie ein anderes 0,5 cm Korkbohrer zu schneiden Sie die Mitte der ersten Patch. Platzieren der resultierenden kleine PDA-Ring in einem Abstand von 1 mm neben dem PDA Barriere (PDA 1 in Abbildung 1). </li><li> In 2 mg FLU in das Loch des PDA 1. Verwenden Sie ein 1 cm Korkbohrer ausschneiden kreisförmigen Flecken von PDA-Platten überwuchert P. ultimum und stellen Sie einen Patch (PDA 2 in Abbildung 1) unten nach unten auf den PDA-Ring, so dass der Myzelmatte steht vor der Grippe-Kristallen. <ol><li> Wiederholen Sie diesen Schritt ohne Zusatz von FLU-Kristallen. HINWEIS: Dies ist die negative Kontrolle Setup (CON NEG), um festzustellen, HintergrundFluoreszenz Bioreporter Zellen. </li></ol></li><li> Verwenden Sie eine 1 cm Korkbohrer aus dem Agar mit Aktivkohle Punch-Out kreisförmigen Flecken. Zeigen vier Patches in jeder Mikrokosmos-Setup, um die gasförmigen FLU-Konzentration (Abbildung 1) weiter zu verringern. </li><li> Bereiten Sie eine positive Kontrolle (CON POS). Fügen Sie einige FLU Kristalle zu 200 ul Zellsuspension MMA und steckte es in einen Hohlraum einer leeren Folie. </li><li> Platzieren einer Petrischale (d = 10 cm) mit etwas Pulver aus Aktivkohle auf dem Boden der Inkubationskammer zu FLU Gaskonzentration in der Kammer zu minimieren. Auch legen vier vor fünf 50 ml-Bechergläser mit sterilem Wasser auf der Unterseite mit hoher Luftfeuchtigkeit in der Kammer aufrechtzuerhalten. <ol><li> Übertragen Mikrokosmos Setups in Inkubationskammern und Inkubation bei 25 ° C für 96 Stunden. Platz Proben nach dem Zufallsprinzip in den verschiedenen Wachstumskammern zur Lage Effekte auszuschließen. HINWEIS: Diese Inkubationszeit apLagen an den Oomyceten P. ultimum. Es könnte unterschiedlich für andere Organismen. </li></ol></li></ol> 4. konfokale Laser Scanning Mikroskopie <ol><li> Idealerweise verwenden Sie ein CLSM-Setup mit aufrechten Mikroskop. HINWEIS: Es kann mit herkömmlichen Lasern Angebot zB 488, 561 und 633 nm Linien zur Anregung oder mit Tunable White Laserquelle ausgestattet werden. </li><li> Verwenden Sie die folgenden Einstellungen für die Sammlung von Bildern: Anregung: 490 nm (eGFP) und 585 nm (mCherry) an der entsprechenden Laserintensität (simultane Anregung); Emissionsbereiche: 500 bis 550 nm (eGFP) und 605 bis 650 nm (mCherry); Objektiv: 63X NA 0,9 Wasser eintauchbar (aufgrund seiner großen Arbeitsabstand); Schrittweite für Z-Stapel: 0,5 um. </li><li> Öffnen Mikrokosmos Einrichtung und Verwendung eines Skalpells auf PDA 1, 2, 3 und den PDA Barriere zu entfernen. Setzen Sie ein Deckglas auf der Oberseite des MMA und drücken Sie sie vorsichtig, um Luftblasen zu entfernen. Montieren Sie gleiten auf Mikroskoptisch. Fügen Sie einen Tropfen Wasser auf der Oberseite des the Deckglas und benutzen mCherry Einstellungen Bioreporter Zellen in der Probe zu finden. </li><li> Holen Sie sich einen schnellen Überblick über die Probe und optimieren Rauschabstand mit einem Schein-über-unter Tabelle für rot (mCherry) und Grün (eGFP) Kanal. Wählen Sie eine zufällige Position auf der Probe zu Bioreporter Fluoreszenz analysiert. HINWEIS: Hyphen können Autofluoreszenz im Bereich von Bioreporter Emissions (zB grüne Autofluoreszenz) 17 zeigen. Achten Sie darauf, Bereiche ohne Hyphen wählen, wenn dies der Fall ist. </li><li> Definieren und notieren z-Stapel für jede Position im grünen (eGFP) und die rote (mCherry) Kanal. Vermeiden Ausbleichen der Probe von Long-Positionen in Epifluoreszenz Licht oder Laserlicht. <ol><li> Wiederholen Sie die vorherigen Schritt für zehn zufällig, gleichmäßig verteilte Positionen. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie alle Schritte mit den gleichen Einstellungen für alle Proben der Teststrecke (SAM), CON AIR CON NEG und CON POS. </li></ol&gt; 5. Bildanalyse HINWEIS: Um die rote (mCherry) und Grün (eGFP) Fluoreszenz in den z-Stapel aufgezeichnet Analyse wird unter anderem die kostenlose Software ImageJ 18 (http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html) kann verwendet. <ol><li> Achten Sie auf die logi_tool Plugin (http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10/) installieren. </li><li> Öffnen Sie die Datei in ImageJ. Wählen Sie &quot;aufgeteilt Kanäle&quot; und in der Nähe grünen Kanal. Verwenden Sie das Makro &#39;mCherry Bereich &quot;als Zusatzcode-Datei in Bereich der roten Fluoreszenz in Z-Stapel zu quantifizieren ist. Stellen Sie die gewünschten Einstellungen im Makro (fett gedruckt). <ol><li> Output ist eine Tabelle mit den gemessenen Pixel über dem Schwellenwert (und über dem festgelegten Mindestgröße) in z-Stack. Hinweis: Die Summe aller Werte ist die Gesamtzahl der roten Pixel (Bereich) in dem Stapel. </li></ol></li><li> Öffnen Sie die Datei in ImageJ. Wählen Sie &quot;aufgeteilt Kanäle&quot; und in der Nähe roten Kanal. Verwenden Sie den Makro<html> 216; eGFP int &#39;als Zusatzcode-Datei zur Verfügung gestellt, um die Intensität der grünen Fluoreszenz in z-Stapel zu quantifizieren. Stellen Sie die gewünschten Einstellungen im Makro (fett gedruckt). <ol><li> Die Ausgabe ist eine Tabelle mit den mittleren Intensitäten und Fläche aller grünen Gegenstände über der Schwelle (und über dem festgelegten Mindestgröße) in Z-Stapel. Um im Stapel berechnen die Gesamtintensität der grünen Pixel, multiplizieren jeweils mittlere Intensität durch die entsprechende Region. </li></ol></li><li> Berechnen Sie den prozentuellen eGFP Induktion (eGFP rel): <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/52334/52334eq1.jpg" width="300px" /> (1) Hinweis: Da mCherry konstitutiv exprimiert wird, ist der resultierende Wert von eGFP rel ein relatives Maß für die Menge an eGFP durch eine bestimmte Anzahl von Zellen ausgedrückt. Bitte auf Tabelle 3, um weitere Informationen über die Berechnung des eGFP rel verwiesen. </li></ol>tle &quot;&gt; 6. Chemical Quantifizierung HINWEIS: Mikrokosmos Konfigurationen können auch verwendet werden, um chemische Quantifizierung transloziert FLU Mengen mit oder ohne einem abiotischen Verunreinigung Körper auszuführen. <ol><li> Wickeln Sie 15 ml Glasfläschchen, 1 ml GC / MS-Fläschchen und Fremdbeilagen in Aluminiumfolie. Füllen Abdampfschalen mit Na 2 SO 4; stellen alle in Muffelofen 5 h bei 450 ° C, um mögliche Verunreinigungen zu entfernen. Lagern Sie das Na 2 SO 4 innerhalb eines aktivierten Exsikkator. </li><li> Schneiden PDMS beschichteten Glasfasern in 0,5 cm Länge. Fasern waschen durch Schütteln viermal 2 h in frischem Methanol. Wiederholen Sie die Schritte Waschen noch vier Mal mit Reinstwasser und speichern sauber Fasern in ultrareinem Wasser in einem verschlossenen Glasfläschchen. </li><li> Bereiten 1,5 l Toluol / Aceton (3: 1, v / v), enthaltend 10 ug L -1 Phenanthren-d 10. </li><li> Die Schritte 1, 2 und 3 des Protokolls. Bereiten Mikrokosmen ohne BIOR(-) und CON AIR (- SAM ()) eporter Zellen FLU Transport studieren und mit Bioreporter Zellen (SAM), um FLU Abbau zu überprüfen. <ol><li> Optional (ohne Bioreporter Zellen): Platz drei PDMS beschichteten Glasfasern (in der Regel für die SPME Experimente verwendet) als künstliche und messbaren Schadstoffwanne nach innen MMA von SAM (-) mit einer feinen Pinzette. </li><li> Entfernen Glasfasern mit feinen Pinzetten und übertragen jeweils ein in ein GC / MS-Fläschchen mit Einsatz. </li><li> Fügen Sie 200 ul Toluol und schütteln vertikal O / N und mittels GC / MS analysiert. Verwenden Sie die Einstellungen in der Tabelle 2 zur Verfügung gestellt. </li></ol></li><li> Übertragen MMA aus dem mittleren Hohlraum in eine 15 ml Glasphiole und etwa drei Spatel von Na 2 SO 4. Nach gründlichem Mischen mit einem Spatel und 10 ml Lösungsmittel. Vortex die Mischung und schütteln horizontal O / N im Dunkeln. <ol><li> Über 1001; l Probe in GC / MS-Fläschchen mit Einsatz. Zugabe von 10 ul Acenaphthylen-d 08 (10 mg L -1) und Analyse mittels GC / MS unter Verwendung desselben Programms wie in 6.4.3 beschrieben. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Holden, P. A., Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+processes+in+the+vadose+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Vadose+Zone+Journal%22%5BJournal%5D)">Microbial processes in the vadose zone.</a> Vadose Zone Journal. 4, 1-21 (2005).</li>
<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prokaryotes%3A+The+unseen+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Prokaryotes: The unseen majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6578-6583 (1998).</li>
<li>Kieft, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+abundance+and+activities+in+relation+to+water+potential+in+the+vadose+zones+of+arid+and+semiarid+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+ecology%22%5BJournal%5D)">Microbial abundance and activities in relation to water potential in the vadose zones of arid and semiarid sites.</a> Microbial ecology. 26, 59-78 (1993).</li>
<li>Wang, G., Or, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+films+limit+bacterial+cell+motility+and+colony+expansion+on+partially+saturated+rough+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Aqueous films limit bacterial cell motility and colony expansion on partially saturated rough surfaces.</a> Environ. Microbiol. 12, 1363-1373 (2010).</li>
<li>Griffin, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGriffin%2C+DM+%22Water+Potential+Relations+in+Soil+Microbiology+SSSA+Special+Publication%22">Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication</a>. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 141-151 (1981).</li>
<li>Papendick, R. I., Camprell, G. S. Water Potential Relations in Soil Microbiology SSSA Special Publication. Parr, J. F., Gardner, W. R., Elliott, L. F. , Soil Science Society of America. 1-22 (1981).</li>
<li>Boswell, G. P., Jacobs, H., Davidson, F. A., Gadd, G. M., Ritz, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+nutrient+translocation+in+mycelial+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of nutrient translocation in mycelial fungi.</a> J. Theor. Biol. 217, 459-477 (2002).</li>
<li>Jennings, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+solutes+in+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Rev.+Camb.+Philos.+Soc%22%5BJournal%5D)">Translocation of solutes in fungi.</a> Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 62, 215-243 (1987).</li>
<li>Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+root+exudates+in+rhizosphere+interactions+with+plants+and+other+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms.</a> Annu. Rev. Plant Biol. 57, 233-266 (2006).</li>
<li>Furuno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycelia+promote+active+transport+and+spatial+dispersion+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbons%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Mycelia promote active transport and spatial dispersion of polycyclic aromatic hydrocarbons.</a> Environ. Sci. Technol. 46, 5463-5470 (2012).</li>
<li>Gao, Y., Cheng, Z., Ling, W., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbuscular+mycorrhizal+fungal+hyphae+contribute+to+the+uptake+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+by+plant+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Arbuscular mycorrhizal fungal hyphae contribute to the uptake of polycyclic aromatic hydrocarbons by plant roots.</a> Bioresour. Technol. 101, 6895-6901 (2010).</li>
<li>Semple, K. T., Morriss, A. W. J., Paton, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioavailability+of+hydrophobic+organic+contaminants+in+soils%3A+fundamental+concepts+and+techniques+for+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Soil.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bioavailability of hydrophobic organic contaminants in soils: fundamental concepts and techniques for analysis.</a> Eur. J. Soil. Sci. 54, 809-818 (2003).</li>
<li>Tecon, R., Binggeli, O., vander Meer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-tagged+fluorescent+bacterial+bioreporter+for+the+study+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbon+diffusion+and+bioavailability%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability.</a> Environ. Microbiol. 11, 2271-2283 (2009).</li>
<li>Tecon, R., Wells, M., vander Meer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+green+fluorescent+protein-based+bacterial+biosensor+for+analysing+phenanthrene+fluxes%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A new green fluorescent protein-based bacterial biosensor for analysing phenanthrene fluxes.</a> Environ. Microbiol. 8, 697-708 (2006).</li>
<li>Schamfuss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+mycelia+on+the+accessibility+of+fluorene+to+PAH-degrading+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Impact of mycelia on the accessibility of fluorene to PAH-degrading bacteria.</a> Environ. Sci. Technol. 47, 6908-6915 (2013).</li>
<li>Smibert, R. M., Krieg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmibert%2C+RM+%22Manual+of+methods+for+general+bacteriology%22">Manual of methods for general bacteriology</a>. Gerhardt, P., Murray, R. G. E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., Phillips, G. B. 19, American Society for Microbiology. Washington, D.C. 409-443 (1981).</li>
<li>Wu, C. H., Warren, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+autofluorescence+in+fungi+and+its+correlation+with+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Natural autofluorescence in fungi and its correlation with viability.</a> Mycologia. 76, 1049-1058 (1984).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Pedersen, C., Sylvia, D. Ch. 8 Concepts in Mycorrhizal Research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPedersen%2C+C+%22Handbook+of+Vegetation+Science%22">Handbook of Vegetation Science</a>. Mukerji, K. G. Vol. 19, Springer. Netherlands. 195-222 (1996).</li>
<li>Furuno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+mycelia+allow+chemotactic+dispersal+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbon-degrading+bacteria+in+water-unsaturated+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fungal mycelia allow chemotactic dispersal of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria in water-unsaturated systems.</a> Environ. Microbiol. 12, 1391-1398 (2010).</li>
</ol>

Die Verfasser erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die vorgestellte Mikrokosmos Setup als geeignet, um die Bioverfügbarkeit von räumlich getrennten Chemikalien abbauenden Organismen nach der Aufnahme und den Transport von Myzel zu studieren. Potenzielle Gasphasentransport von teilweise flüchtigen Verbindungen verhindert und bakterielle Bioreporter Zellen können ohne aufwändige Probenvorbereitung mit minimaler Störung des sensiblen System visualisiert und somit werden. Gleichzeitig kann die chemische Analyse der Probe leicht durchgeführt werden was eine gute Kontrolle de...

Boden ist dicht mit einer Vielzahl von Mikroorganismen, wie Bakterien 1,2 besiedelt. Jedoch Bedingungen in diesem Lebensraum sind anspruchsvoll, vor allem in Bezug auf die Verfügbarkeit von Wasser 3. Bakterien dauerhaft müssen für optimale Bedingungen in heterogenen Umgebungen 4 suchen, aber das Fehlen von kontinuierlichen Wasser Filmen führt zu eingeschränkter Mobilität 5 behindern sie frei verteilen. Auch sind Diffusionsraten von gelösten Stoffen (zB Nährstoffe) unter ungesättigten Bedingungen 6 gesenkt. So werden Bakterien und Nährstoffe oft physisch getrennt und Nährstoff Zugänglichkeit begrenzt ist 3. Als Folge könnte ein Transportvektor für chemische Verbindungen, die nicht einen kontinuierlichen Wasserphase erfordern, hilft, diese Einschränkungen zu überwinden. In der Tat haben viele Mikroorganismen wie Pilze und Oomyceten ein filamentöses Wachstum bilden damit sie durch luftgefüllten Porenraum wächst dadurch erreichen und mobi entwickeltlizing auch körperliche getrennt Nährstoffe 7 und 8 kohlenstoffhaltigen Substanzen über lange Distanzen. Sie können sogar als biologische Transportvektoren, die Zucker und andere Energiequellen, um Bakterien 9 liefern zu handeln. Aufnahme und dem Transport in Myzel Organismen wurde auch für hydrophobe organische Schadstoffe, wie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) in Pythium ultimum 10 oder in arbuskulären Mykorrhizapilzen 11 gezeigt. Seit PAH sind allgegenwärtig und schlecht wasserlöslichen Verunreinigungen 12 im Boden könnte Mycel-vermittelten Transport helfen, Verunreinigung Bioverfügbarkeit für potenzielle Bakterien Abbauern erhöhen. Während der Gesamtbetrag der Schadstofftransport direkt durch chemische quantifizieren Mittel 10, die Bioverfügbarkeit von Schadstoffen durch Myzel zu abbauenden Bakterien und anderen Organismen transportiert nicht leicht zu beurteilen. Das folgende Protokoll stellt eine Methode vor, um die Auswirkungen myce evaluierenlia auf Schadstoff Bioverfügbarkeit um bakterielle Abbauern in direkter Weise; sie ermöglicht das Sammeln von Informationen über die räumlich-zeitliche Auswirkungen von Schadstoffen auf die mikrobielle Ökosysteme. Wir beschreiben, wie Sie eine ausführliche ungesättigten Mikrosystem imitiert Luft-Wasser-Grenzflächen in Böden durch die Verknüpfung von ein physikalisch getrennt PAH Punktquelle mit PAK-abbauenden Bakterien Bioreporter über Myzel Transportvektoren. Weil Luftverkehr ausgeschlossen ist, kann die Wirkung der Myzel-basierten Transport auf PAH Bioverfügbarkeit für Bakterien in einer isolierten Art und Weise untersucht werden. Im Einzelnen wurden drei-Ring PAK Fluoren, das Myzel Organismus Pythium ultimum und die Bioreporter Bakterium Burkholderia sartisoli RP037-MCHe 13 in den beschriebenen Mikrokosmos Setups angewendet. Das Bakterium B. sartisoli RP037-MCHe wurde ursprünglich konstruiert, Phenanthren Flüsse an die Zelle 14 zu untersuchen und exprimiert enhanced green fluorescent protein (eGFP) als ein Ergebnis der PAH Flußmitteldie Zelle, während die rot fluoreszierende mCherry konstitutiv exprimiert wird. Detaillierte Informationen zu dem Reporter Bau von Tecon et al. 13 In Vorversuchen gegeben, zeigte das Bakterium keine Schwimmen und nur sehr langsam Schwarmfähigkeit. Es konnte sich langsam auf Hyphen von Pythium ultimum wandern, wenn als dichte Suspension wurde auf den Hyphen aufgebracht. Da Bakterien wurden in Agarose in dem folgenden Protokoll eingebettet ist, hat Migration auf Hyphen nicht auftritt. Mit Hilfe der konfokalen Laserrastermikroskopie (CLSM) können die Bioreporter Bakterien direkt in den Mikrokosmen visualisiert werden und die Expression des eGFP kann in Bezug auf die Menge von Zellen (proportional zur mCherry Signal) mit Hilfe der Software ImageJ quantifizieren. Dies ermöglicht den Vergleich der Bioverfügbarkeit qualitativ in verschiedenen Szenarien (dh höher oder niedriger). FLU gefunden bioverfügbar nach Myzel Transport von P. zu sein ultimum (dh eshöher war als bei einer negativen Kontrolle). Außerdem wird das Protokoll beschreibt, wie die Gesamtmenge der Myzelien-vermittelte Transport über chemische Mittel zu quantifizieren und Verunreinigung Bioverfügbarkeit Überprüfung mittels silikonbeschichteten Glasfasern (SPME-Fasern) in identischen Mikrokosmen. Ergebnisse mit diesem Mikrokosmos Setup veröffentlicht wurden und für die Kombination von P. diskutiert ultimum, Fluoren und B. sartisoli RP037-MCHe 15. Hier liegt der Fokus auf einer detaillierten Beschreibung und Methode der Identifizierung von möglichen Gefahren des Protokolls, dieses Wissen für mögliche weitere Anwendungen. Weitere Anwendungen kann es sich um verschiedene Pilz-, Bakterien- Spezies (zB von verunreinigten Standorten), und andere Verunreinigungen (zB Pestizide) oder schadstoffVersorgung (zB, im Alter von Böden).

<table><tbody><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>TCS SP5X, LAS AF - Version 2.6.1; oder gleichwertig CLSM</td></tr><tr><td>GC HP 7890 Serie GC und Agilent 5975C MSD</td><td>Agilent</td><td></td><td>kann ein gleichwertiger GC/MS verwendet werden</td></tr><tr><td>GC Kapillarsäule J& W 121-5522&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Korkbohrer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12863952</td><td>oder andere</td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Marienfeld</td><td>107222</td><td>High Performance, No.1.5H</td></tr><tr><td>GC/MS insterts</td><td>WICOM</td><td>WIC 47080</td><td></td></tr><tr><td>GC/MS Fläschchen 2 ml</td><td>WICOM</td><td>WIC 41150</td><td></td></tr><tr><td>Deckel / Septen für Fläschchen mit Schraubverschluss</td><td>DIONEX</td><td>49463 / 049464&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Deckel für GC/MS-Fläschchen</td><td>WICOM</td><td>WIC 43948/B</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Menzel</td><td></td><td>gewöhnliche</td></tr><tr><td>PDMS-beschichtete Glasfasern</td><td>Polymicro Technologies, Inc.</td><td></td><td>V (PDMS) = 13,55&nbsp; &plusmn; &nbsp; 0.02&nbsp; &Mikro; l&nbsp; m-1</td></tr><tr><td>Petrischalen klein / groß</td><td>Greiner</td><td>633-102 / 628-102</td><td></td></tr><tr><td>Fläschchen mit Schraubverschluss 40 ml</td><td>DIONEX</td><td>48783</td><td>andere Glasfläschchen können verwendet werden</td></tr><tr><td>Fläschchen mit Schraubverschluss 60 ml</td><td>DIONEX</td><td>48784</td><td>andere Glasfläschchen können verwendet werden</td></tr><tr><td>Acenaphthylen d08</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>C 20510100</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Carl Roth</td><td>9372.2</td><td></td></tr><tr><td>Aktivkohle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>242276-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth</td><td>2267.4</td><td></td></tr><tr><td>Fluoren</td><td>Fluka</td><td>46880</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Carl Roth</td><td>T832.2</td><td>50 mg L-1</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth</td><td>P7171<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4"><stark>Minimal Medium:</stark> 100 ml <stark>Lösung 1</stark> + 25 ml <stark>Lösung 2</stark> + 5 ml <stark>Lösung 3</stark> ad. 1.000 ml aqua dest</td></tr><tr><td colspan="4"><stark>Lösung 1</stark></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Carl Roth</td><td>3746.1</td><td>5 g L-1&nbsp; </td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid x 6&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td>1 g L-1</td></tr><tr><td>Calciumnitrat x 4&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>P740.1</td><td>0,5 g L-1<</td></tr><tr>td colspan="4">Lösung 2</stark></td></tr><tr><td>Dinatriumphosphat</td><td>Carl Roth</td><td>P030.1</td><td>55,83 g L-1</td></tr><tr><td>Monokaliumphosphat</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td>20 g L-1<</td></tr><tr>td colspan="4">Lösung 3</stark> (pH 6,0)</td></tr><tr><td>Dinatrium-EDTA</td><td>MERCK</td><td>1084180250</td><td>0,8 g L-1</sup</td></tr><tr><td>>Eisen(II)-chlorid x 4&nbsp; H2</td><td>O MERCK</td><td>1038610250</td><td>0,3 g L-1</td></tr><tr><td>Cobalt(II)-chlorid x 6&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>T889.3</td><td>4 mg L-1</td></tr><tr><td>Mangan(II)-chlorid x 1&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4320.2</td><td>10 mg L-1</td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat</td><td>Carl Roth</td><td>P023.1</td><td>1 mg L-1</td></tr><tr><td>Natriummolybdat x 2&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>0274.1</td><td>3 mg L-1</td></tr><tr><td>Zinkchlorid</td><td>MERCK</td><td>1088160250</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Lithiumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>P007.1</td><td>0,5 mg L-1</td></tr><tr><td>Zinn(II)-chlorid x 2&nbsp; H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4473.1</td><td>0,5 mg L-1</td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Riedel-de-Haen&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>11606</td><td>1 mg L-1</td></tr><tr><td>Kaliumbromid</td><td>Carl Roth</td><td>A137.1</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Kaliumiodid</td><td>Carl Roth</td><td>6750.1</td><td>2 mg L-1</td></tr><tr><td>Bariumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>4453.1</td><td>0,5 mg L-1</td></tr><tr><td>MMA</td><td></td><td></td><td>Minimales Medium + Agarose 0,2%</td></tr><tr><td>Phenanthren d10</td><td>Dr. Ehrenstorfer</td><td>C 20920100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kartoffel-Dextrose-Agar:</stark> 24 g L-1 Brühe + Bacto-Agar 1,5%; pH 6,8</td></tr><tr><td>Kartoffel-Dextrose-Brühe</td><td>Difco/ Beckton Dickinson</td><td>254920</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco/ Beckton Dickinson</td><td>214040</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetat x 3 hydr.</td><td>Carl Roth</td><td>6779.1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfat</td><td>MERCK</td><td>1066495000</td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td>MERCK</td><td>1083252500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">mTY medium: 3 g&nbsp; L-1 Hefeextrakt, 5&nbsp; g&nbsp; L-1 Bacto Trypton und 50 mM NaCl</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Merck</td><td>1037530500</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Serva</td><td>4864702</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ mit logi tool plugin</td><td></td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html und http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10</td></tr><tr><td>Pythium ultimum Stamm 67-1</td><td></td><td></td><td>Gewonnen aus dem Labor von Dr. Christoph Keel; Departement für Fundamentale Mikrobiologie, Universität Lausanne, Schweiz</td></tr><tr><td>Burkholderia sartisoli RP037-mChe</td><td></td><td></td><td>Gewonnen aus dem Labor von Prof. Jan Roelof van der Meer; Institut für fundamentale Mikrobiologie, Universität Lausanne, Schweiz</td></tr></tbody></table>

eine ganze zelle bioreporter ansatz für transport und bioverfügbarkeit von organischen schadstoffen in wasser ungesättigte systeme bewerten

A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems

Die Bioverfügbarkeit von Schadstoffen ist eine Voraussetzung für ihren effektiven biologischen Abbau im Boden. Die durchschnittliche Massenkonzentration eines Kontaminanten ist jedoch kein geeignetes Maß für seine Verfügbarkeit; Die Bioverfügbarkeit hängt vielmehr von dem dynamischen Zusammenspiel des potentiellen Stofftransports (Flusses) einer Verbindung zu einer mikrobiellen Zelle und der Fähigkeit dieser ab, die Verbindung abzubauen, ab. In wasserungesättigten Teilen des Bodens haben Myzelien gezeigt, dass sie Einschränkungen der Bioverfügbarkeit überwinden, indem sie organische Verbindungen aktiv über einen Zentimeterbereich transportieren und mobilisieren. Während das Ausmaß des Myzel-basierten Transports mit chemischen Mitteln leicht quantifiziert werden kann, erfordert der Nachweis der Schadstoff-Bioverfügbarkeit für Bakterienzellen eine biologische Methode. Um diese Einschränkung zu beheben, wählten wir das PAK-Fluoren (FLU) als Modellverbindung und entwickelten einen wasserungesättigten Modellmikrokosmos, der eine räumlich getrennte FLU-Punktquelle und das FLU-abbauende Bioreporter-Bakterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe durch ein Myzelnetzwerk von Pythium ultimum verbindet. Da der Bioreporter eGFP als Reaktion des PAK-Flusses auf die Zelle exprimiert, könnte die bakterielle FLU-Exposition und der Abbau direkt im Mikrokosmos mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) überwacht werden. CLSM- und Bildanalysen zeigten einen signifikanten Anstieg der eGFP-Expression in Gegenwart von P. ultimum im Vergleich zu Kontrollen ohne Myzel oder FLU, was auf die Bioverfügbarkeit von FLU für Bakterien nach Myzel-vermitteltem Transport hinweist. Die CLSM-Ergebnisse wurden durch chemische Analysen in identischen Mikrokosmen unterstützt. Der entwickelte Mikrokosmos erwies sich als geeignet, die Bioverfügbarkeit von Kontaminanten zu untersuchen und gleichzeitig die beteiligten Bakterien-Myzel-Wechselwirkungen sichtbar zu machen.

Die hier vorgestellten Ergebnisse wurden bereits früher 15 veröffentlicht. Bitte auf den Artikel für detaillierte mechanistische und Umweltdiskussion verweisen. Nach Bildaufzeichnung über CLSM kann ein Maximum Intensity Projection mit dem entsprechenden Mikroskop-Software oder ImageJ, um einen ersten visuellen Eindruck von der Probe und die Bedienelemente (Abbildung 2) zu gewinnen durchgeführt werden. Später können die Datensätze unterschiedlich, um sinnvolle Funk...

Whole-Cell-Assay mit Bioreporter Burkholderia sartisoli RP037-MCHe wurde entwickelt, um Bruchteile einer organischen Verunreinigung (dh fluoren) nach den aktiven Transport von Myzelien Überbrückungsluftgefüllten Poren in einer wasser ungesättigten Modellsystem für bakteriellen Abbau verfügbar zu detektieren.

Eine ganze Zelle Bioreporter Ansatz für Transport und Bioverfügbarkeit von organischen Schadstoffen in Wasser Ungesättigte Systeme Bewerten

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Bio-Reporter-Assay zu erstellen, um den Einfluss von Myzelnetzwerken auf die Bioverfügbarkeit organischer Kontaminanten direkt zu überwachen. Dies wird erreicht, indem Bioreporterbakterien, die in Abhängigkeit von der Bioverfügbarkeit von Schadstoffen in der Schnecke ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein oder EGFP exprimieren, immobilisiert und auf einen geeigneten Objektträger aufgetragen werden. Als nächstes wird die Schadstoffquelle dem Aufbau in einem Schneckenring hinzugefügt, und der Myzelorganismus wird auf einem Schneckenpflaster darüber geimpft.Dann wird der Mikrokosmos inkubiert, bis das Myzel den gesamten Aufbau überwuchert hat und die Verunreinigung entlang des Netzwerks translokalisiert werden kann. Abschließend werden die Bioreporterzellen mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie sichtbar gemacht. Letztendlich wird der Einfluss von Myzelnetzwerken auf die Bioverfügbarkeit von Fluor durch Quantifizierung der EGFP-Expression der Bioreporterzellen mit Hilfe von Bildanalysesoftware bewertet.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der chemischen PAK-Extraktion besteht darin, dass die Bioverfügbarkeit von Schadstoffen direkt in einem biologischen System und mit nur sehr geringem Materialverbrauch beurteilt werden kann. Diese Methode kann in Zukunft Aufschluss über die Bioverfügbarkeit von p hs in einer wasserungesättigten Umgebung wie dem Boden geben. Es kann auch für andere Chemikalien wie Pestizide und/oder unter Verwendung anderer Bakterien- und Pilzstämme verwendet werden.Bereiten Sie zu Beginn das folgende Material für jeden Mikrokosmos vor. Eine 10 Zentimeter große Petrischale, Boden ein modifizierter Petrischale-Boden, der am Rand zugeschnitten wurde, um einen Objektträger mit einer Kantenlänge von 26 Millimetern aufzunehmen, ein Zählkammer-Objektträger mit drei Kavitäten und ein kleiner Petrischale-Deckel. Nach der Vorbereitung des Substrats für den Anbau von Pythium Ultima auf PDA-Platten und der Kultivierung, behold area sarti soli RP O 37 mg in minimalem Medium, gemäß dem Textprotokoll, messen Sie die OD 5 78 des behold area sarti soli Kultur.Der erwartete OD beträgt etwa 0,2. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 2000 g für 10 Minuten und resuspendieren Sie die Zellen in einer angemessenen Menge minimalen Mediums, um einen OD von 0,4 zu erreichen. Mischen Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension mit 500 Mikrolitern warmer Flüssigkeit, minimaler mittlerer Schnecke oder MMA in zwei Milliliter-Röhrchen und lagern Sie sie bei 50 Grad Celsius bis zur Verwendung unter einem Durchflussschrank. Setzen Sie die gewünschte Anzahl an Petrischalen und Objektträgern 30 Minuten lang UV-Licht aus.Lege dann die kleine Petrischale in die größere und stecke die Rutsche durch den Spalt der kleinen Petrischale. Geben Sie 150 Mikroliter der Warmzellensuspension in den mittleren Hohlraum jedes Objektträgers und lassen Sie sie fünf Minuten lang erstarren. Verwenden Sie einen einen Zentimeter großen Korkleiher, um kreisförmige Pflaster aus einer leeren PDA-Platte auszustanzen, um das Myzelwachstum zu fördern.Legen Sie ein Pflaster in einem Abstand von zwei Millimetern zum MMA in die kleine Petrischale. Als nächstes schneiden Sie gebogene PDA-Patches als mechanische Barrieren. Verwenden Sie ein sauberes und steriles kleines Unterteil der Petrischale und drücken Sie es in eine PDA-Platte.Schneide dann mit einem Spachtel einen weiteren Kreis mit einem Durchmesser von etwa 0,5 Zentimetern kleiner aus, um einen PDA-Ring herzustellen. Schneiden Sie ein Stück des Schlangenrings aus, das genau in den Spalt der kleinen Petrischale im Mikrokosmos passt, und platzieren Sie es in dem Spalt oben auf der Rutsche. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen dem MMA und der kreisförmigen PDA-Barriere etwa zwei Millimeter beträgt.Schließen Sie den Deckel der kleinen Petrischale, drücken Sie sie vorsichtig in die PDA-Barriere als Kontrollaufbau für den Transport in der Luft zu den Bioreporterzellen, bereiten Sie eine mechanische PDA-Barriere mit einer PDA-Platte vor, die zwei Gramm pro Liter Cycloheide enthält. Verwenden Sie einen einen Zentimeter großen Korkleiher, um kreisförmige Flicken einer leeren PDA-Platte auszustanzen. Mit einem weiteren 0,5 Zentimeter großen Korkburschen die Mitte des ersten Flecks ausschneiden.Platzieren Sie den resultierenden kleinen PDA-Ring in einem Abstand von einem Millimeter von der PDA-Barriere. Gib nun zwei Milligramm PAK Fluor in das Loch von PDA one. Schneiden Sie dann mit einem einen Zentimeter großen Korkburschen kreisförmige Flecken aus PDA-Platten aus, die mit Pythium-Ultimo bewachsen sind, und legen Sie ein Pflaster mit der Unterseite nach unten auf den PDA-Ring, so dass die Myzelmatte den Fluorkristallen zugewandt ist.Bereiten Sie eine Negativkontrolle ohne Fluorkristalle vor, um die Hintergrundfluoreszenz von Bioreporterzellen auf ähnliche Weise zu bestimmen. Schneiden Sie einen Zentimeter große, kreisförmige Pflaster aus der Schnecke mit Aktivkohle aus und platzieren Sie vier Pflaster in jedem eingerichteten Mikrokosmos, um die gasförmige Fluorkonzentration weiter zu senken. Um eine Positivkontrolle vorzubereiten, geben Sie Fluorkristalle zu 200 Mikrolitern MMA-Zellsuspension und geben Sie sie in einen Hohlraum eines leeren Objektträgers.Stellen Sie eine Petrischale mit etwas Aktivkohlepulver auf den Boden der Inkubationskammer, um die Konzentration gasförmiger Fluore in der Kammer zu minimieren. Stellen Sie dann vier oder fünf 50-Milliliter-Becher mit sterilem Wasser auf den Boden, um eine hohe Luftfeuchtigkeit in der Kammer aufrechtzuerhalten. Übertragen Sie die Mikrokosmos-Setups in die Inkubationskammern und platzieren Sie die Proben nach dem Zufallsprinzip in den verschiedenen Wachstumskammern, um Standorteffekte für Pythium Ultimo auszuschließen.Inkubieren Sie nach dem Aufstellen des konfokalen Mikroskops 96 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Anhand der im Textprotokoll beschriebenen Richtlinien öffnen Sie ein Mikrokosmos-Setup. Verwenden Sie ein Skalpell, um die PDAs 1, 2, 3 und die PDA-Barriere zu entfernen.Legen Sie eine Glasabdeckung auf das MMA und drücken Sie vorsichtig darauf, um Luftblasen zu entfernen. Montieren Sie den Objektträger auf dem Mikroskoptisch. Geben Sie ein Tröpfchen Wasser auf das Deckglas und verwenden Sie die Kirscheinstellungen, um Bioreporterzellen in der Probe zu finden.Wählen Sie als Nächstes eine zufällige Position auf der Stichprobe, um einen schnellen Überblick zu erhalten. Verwenden Sie dann eine Glow-Over-Under-Lookup-Tabelle für den roten und grünen Kanal und optimieren Sie das Signal-Rausch-Verhältnis. Definieren und protokollieren Sie dann Z-Stacks für jede Position im grünen und roten Kanal.Wiederholen Sie die Zack-Erfassung für 10 zufällige, gleichmäßig verteilte Positionen mit Bild J Öffnen Sie gemäß dem Textprotokoll einen Stapel von Bildern, wählen Sie geteilte Kanäle aus und schließen Sie den grünen Kanal. Verwenden Sie das Makro M cherry area, das als ergänzende Codedatei bereitgestellt wird, um den Bereich der roten Fluoreszenz im Z-Stapel zu quantifizieren, und die Ausgabetabelle wird mit den gemessenen Pixeln über dem Schwellenwert im Z-Stapel generiert, wobei die Summe aller Werte die Gesamtzahl der roten Pixel im Stapel darstellt. Schließen Sie anschließend bei geöffneter Datei den roten Kanal.Verwenden Sie das Makro E-G-F-P-I-N-T, das als ergänzende Codedatei bereitgestellt wird, um die Intensität der grünen Fluoreszenz im Z-Stack zu quantifizieren. Die Ausgabe ist eine Tabelle mit den mittleren Intensitäten und der Fläche aller grünen Objekte über dem Schwellenwert im Z-Stapel. Um die Gesamtintensität der grünen Pixel im Stapel zu berechnen, multiplizieren Sie jede mittlere Intensität mit der entsprechenden Fläche.Berechnen Sie die relative EGFP-Induktion anhand der folgenden Formel und beziehen Sie sich auf das Textprotokoll für zusätzliche Optionen zur chemischen Quantifizierung von Fluormengen. Nach der Präparation von Mikrokosmen mit und ohne Bio-Reporterzellen werden drei zuvor gereinigte PDMS-beschichtete Glasfasern als künstliche und quantifizierbare Schadstoffsenken in das MMA der Samin-Mikrokosmen gelegt. Nach einer Inkubation von 96 Stunden wird die Glasfaser mit einer Pinzette entfernt und jede einzelne in ein Gaschromatographie-Massenspektrometrie- oder GCMS-Fläschchen mit Einsatz überführt, den Proben Toluol hinzugefügt und über Nacht inkubiert.Verwenden Sie abschließend GCMS, um die Proben zu analysieren. Es kann eine Projektion mit maximaler Intensität erzeugt werden, um einen ersten visuellen Eindruck von der Probe und den Bedienelementen zu gewinnen, wie hier gezeigt. Die positive Kontrollpause zeigt eine ausgeprägte EGFP-Induktion, während die Airborne Control Con Air nur eine EGFP-Hintergrundfluoreszenz aufweist. Diese Panels zeigen, dass die EGFP-Fluoreszenz in der Testprobe Sam im Vergleich zum Con error erhöht zu sein scheint, aber nicht so ausgeprägt wie con ps.Die M-Kirschfluoreszenz ist unabhängig vom PAK-Abbau und daher für alle Proben für die untersuchten Mikrokosmen ähnlich. Ergänzt wurde die visuelle Inspektion durch eine Bildanalyse und die Berechnung der relativen EGFP-Induktion, wie hier unter den gegebenen Bedingungen gezeigt. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen Coneg und Con air festgestellt werden, so dass ein Fluortransport in der Dampfphase zu den Bioreporterzellen in Gegenwart von Myzelien und Fluor ausgeschlossen ist.EGFP war in den Zellen im Vergleich zu den Negativkontrollen signifikant induziert. Allerdings ist die EGFP-Induktion im Vergleich zur Positivkontrolle relativ gering. Diese Abbildung zeigt, dass Mycelia Trans etwa 25 Nanogramm Fluor innerhalb von 96 Stunden lokalisierte, Kontrollen in Abwesenheit von Mycelia Conair minus jedoch einen gasförmigen Fluortransport in das MMA im Bereich von nur zwei Nanogramm innerhalb von 96 Stunden.Bei diesem Verfahren ist es sehr wichtig, sich daran zu erinnern, dass BioPort-Bakterien sehr empfindlich auf die Gasphasenkonzentrationen von Fluor reagieren. Daher ist es sehr wichtig, den Gasphasentransport so weit wie möglich zu minimieren und das Fehlen eines Gasphasentransports durch die chemische Extraktion von MMA zu überprüfen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Mikrokosmos zusammenbaut und wie man die visuelle Inspektion mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie durchführt.Man sieht auch, dass die Mikrokosmen für verschiedene mikrobielle Stämme und verschiedene Chemikalien geeignet sind.

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Forschung

JoVE Journal

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