Eine ganze Zelle Bioreporter Ansatz für Transport und Bioverfügbarkeit von organischen Schadstoffen in Wasser Ungesättigte Systeme Bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Bio-Reporter-Assay zu erstellen, um den Einfluss von Myzelnetzwerken auf die Bioverfügbarkeit organischer Kontaminanten direkt zu überwachen. Dies wird erreicht, indem Bioreporterbakterien, die in Abhängigkeit von der Bioverfügbarkeit von Schadstoffen in der Schnecke ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein oder EGFP exprimieren, immobilisiert und auf einen geeigneten Objektträger aufgetragen werden. Als nächstes wird die Schadstoffquelle dem Aufbau in einem Schneckenring hinzugefügt, und der Myzelorganismus wird auf einem Schneckenpflaster darüber geimpft.

Dann wird der Mikrokosmos inkubiert, bis das Myzel den gesamten Aufbau überwuchert hat und die Verunreinigung entlang des Netzwerks translokalisiert werden kann. Abschließend werden die Bioreporterzellen mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie sichtbar gemacht. Letztendlich wird der Einfluss von Myzelnetzwerken auf die Bioverfügbarkeit von Fluor durch Quantifizierung der EGFP-Expression der Bioreporterzellen mit Hilfe von Bildanalysesoftware bewertet.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der chemischen PAK-Extraktion besteht darin, dass die Bioverfügbarkeit von Schadstoffen direkt in einem biologischen System und mit nur sehr geringem Materialverbrauch beurteilt werden kann. Diese Methode kann in Zukunft Aufschluss über die Bioverfügbarkeit von p hs in einer wasserungesättigten Umgebung wie dem Boden geben. Es kann auch für andere Chemikalien wie Pestizide und/oder unter Verwendung anderer Bakterien- und Pilzstämme verwendet werden.

Bereiten Sie zu Beginn das folgende Material für jeden Mikrokosmos vor. Eine 10 Zentimeter große Petrischale, Boden ein modifizierter Petrischale-Boden, der am Rand zugeschnitten wurde, um einen Objektträger mit einer Kantenlänge von 26 Millimetern aufzunehmen, ein Zählkammer-Objektträger mit drei Kavitäten und ein kleiner Petrischale-Deckel. Nach der Vorbereitung des Substrats für den Anbau von Pythium Ultima auf PDA-Platten und der Kultivierung, behold area sarti soli RP O 37 mg in minimalem Medium, gemäß dem Textprotokoll, messen Sie die OD 5 78 des behold area sarti soli Kultur.

Der erwartete OD beträgt etwa 0,2. Zentrifugieren Sie die Kultur bei 2000 g für 10 Minuten und resuspendieren Sie die Zellen in einer angemessenen Menge minimalen Mediums, um einen OD von 0,4 zu erreichen. Mischen Sie 50 Mikroliter der Zellsuspension mit 500 Mikrolitern warmer Flüssigkeit, minimaler mittlerer Schnecke oder MMA in zwei Milliliter-Röhrchen und lagern Sie sie bei 50 Grad Celsius bis zur Verwendung unter einem Durchflussschrank. Setzen Sie die gewünschte Anzahl an Petrischalen und Objektträgern 30 Minuten lang UV-Licht aus.

Lege dann die kleine Petrischale in die größere und stecke die Rutsche durch den Spalt der kleinen Petrischale. Geben Sie 150 Mikroliter der Warmzellensuspension in den mittleren Hohlraum jedes Objektträgers und lassen Sie sie fünf Minuten lang erstarren. Verwenden Sie einen einen Zentimeter großen Korkleiher, um kreisförmige Pflaster aus einer leeren PDA-Platte auszustanzen, um das Myzelwachstum zu fördern.

Legen Sie ein Pflaster in einem Abstand von zwei Millimetern zum MMA in die kleine Petrischale. Als nächstes schneiden Sie gebogene PDA-Patches als mechanische Barrieren. Verwenden Sie ein sauberes und steriles kleines Unterteil der Petrischale und drücken Sie es in eine PDA-Platte.

Schneide dann mit einem Spachtel einen weiteren Kreis mit einem Durchmesser von etwa 0,5 Zentimetern kleiner aus, um einen PDA-Ring herzustellen. Schneiden Sie ein Stück des Schlangenrings aus, das genau in den Spalt der kleinen Petrischale im Mikrokosmos passt, und platzieren Sie es in dem Spalt oben auf der Rutsche. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen dem MMA und der kreisförmigen PDA-Barriere etwa zwei Millimeter beträgt.

Schließen Sie den Deckel der kleinen Petrischale, drücken Sie sie vorsichtig in die PDA-Barriere als Kontrollaufbau für den Transport in der Luft zu den Bioreporterzellen, bereiten Sie eine mechanische PDA-Barriere mit einer PDA-Platte vor, die zwei Gramm pro Liter Cycloheide enthält. Verwenden Sie einen einen Zentimeter großen Korkleiher, um kreisförmige Flicken einer leeren PDA-Platte auszustanzen. Mit einem weiteren 0,5 Zentimeter großen Korkburschen die Mitte des ersten Flecks ausschneiden.

Platzieren Sie den resultierenden kleinen PDA-Ring in einem Abstand von einem Millimeter von der PDA-Barriere. Gib nun zwei Milligramm PAK Fluor in das Loch von PDA one. Schneiden Sie dann mit einem einen Zentimeter großen Korkburschen kreisförmige Flecken aus PDA-Platten aus, die mit Pythium-Ultimo bewachsen sind, und legen Sie ein Pflaster mit der Unterseite nach unten auf den PDA-Ring, so dass die Myzelmatte den Fluorkristallen zugewandt ist.

Bereiten Sie eine Negativkontrolle ohne Fluorkristalle vor, um die Hintergrundfluoreszenz von Bioreporterzellen auf ähnliche Weise zu bestimmen. Schneiden Sie einen Zentimeter große, kreisförmige Pflaster aus der Schnecke mit Aktivkohle aus und platzieren Sie vier Pflaster in jedem eingerichteten Mikrokosmos, um die gasförmige Fluorkonzentration weiter zu senken. Um eine Positivkontrolle vorzubereiten, geben Sie Fluorkristalle zu 200 Mikrolitern MMA-Zellsuspension und geben Sie sie in einen Hohlraum eines leeren Objektträgers.

Stellen Sie eine Petrischale mit etwas Aktivkohlepulver auf den Boden der Inkubationskammer, um die Konzentration gasförmiger Fluore in der Kammer zu minimieren. Stellen Sie dann vier oder fünf 50-Milliliter-Becher mit sterilem Wasser auf den Boden, um eine hohe Luftfeuchtigkeit in der Kammer aufrechtzuerhalten. Übertragen Sie die Mikrokosmos-Setups in die Inkubationskammern und platzieren Sie die Proben nach dem Zufallsprinzip in den verschiedenen Wachstumskammern, um Standorteffekte für Pythium Ultimo auszuschließen.

Inkubieren Sie nach dem Aufstellen des konfokalen Mikroskops 96 Stunden lang bei 25 Grad Celsius. Anhand der im Textprotokoll beschriebenen Richtlinien öffnen Sie ein Mikrokosmos-Setup. Verwenden Sie ein Skalpell, um die PDAs 1, 2, 3 und die PDA-Barriere zu entfernen.

Legen Sie eine Glasabdeckung auf das MMA und drücken Sie vorsichtig darauf, um Luftblasen zu entfernen. Montieren Sie den Objektträger auf dem Mikroskoptisch. Geben Sie ein Tröpfchen Wasser auf das Deckglas und verwenden Sie die Kirscheinstellungen, um Bioreporterzellen in der Probe zu finden.

Wählen Sie als Nächstes eine zufällige Position auf der Stichprobe, um einen schnellen Überblick zu erhalten. Verwenden Sie dann eine Glow-Over-Under-Lookup-Tabelle für den roten und grünen Kanal und optimieren Sie das Signal-Rausch-Verhältnis. Definieren und protokollieren Sie dann Z-Stacks für jede Position im grünen und roten Kanal.

Wiederholen Sie die Zack-Erfassung für 10 zufällige, gleichmäßig verteilte Positionen mit Bild J Öffnen Sie gemäß dem Textprotokoll einen Stapel von Bildern, wählen Sie geteilte Kanäle aus und schließen Sie den grünen Kanal. Verwenden Sie das Makro M cherry area, das als ergänzende Codedatei bereitgestellt wird, um den Bereich der roten Fluoreszenz im Z-Stapel zu quantifizieren, und die Ausgabetabelle wird mit den gemessenen Pixeln über dem Schwellenwert im Z-Stapel generiert, wobei die Summe aller Werte die Gesamtzahl der roten Pixel im Stapel darstellt. Schließen Sie anschließend bei geöffneter Datei den roten Kanal.

Verwenden Sie das Makro E-G-F-P-I-N-T, das als ergänzende Codedatei bereitgestellt wird, um die Intensität der grünen Fluoreszenz im Z-Stack zu quantifizieren. Die Ausgabe ist eine Tabelle mit den mittleren Intensitäten und der Fläche aller grünen Objekte über dem Schwellenwert im Z-Stapel. Um die Gesamtintensität der grünen Pixel im Stapel zu berechnen, multiplizieren Sie jede mittlere Intensität mit der entsprechenden Fläche.

Berechnen Sie die relative EGFP-Induktion anhand der folgenden Formel und beziehen Sie sich auf das Textprotokoll für zusätzliche Optionen zur chemischen Quantifizierung von Fluormengen. Nach der Präparation von Mikrokosmen mit und ohne Bio-Reporterzellen werden drei zuvor gereinigte PDMS-beschichtete Glasfasern als künstliche und quantifizierbare Schadstoffsenken in das MMA der Samin-Mikrokosmen gelegt. Nach einer Inkubation von 96 Stunden wird die Glasfaser mit einer Pinzette entfernt und jede einzelne in ein Gaschromatographie-Massenspektrometrie- oder GCMS-Fläschchen mit Einsatz überführt, den Proben Toluol hinzugefügt und über Nacht inkubiert.

Verwenden Sie abschließend GCMS, um die Proben zu analysieren. Es kann eine Projektion mit maximaler Intensität erzeugt werden, um einen ersten visuellen Eindruck von der Probe und den Bedienelementen zu gewinnen, wie hier gezeigt. Die positive Kontrollpause zeigt eine ausgeprägte EGFP-Induktion, während die Airborne Control Con Air nur eine EGFP-Hintergrundfluoreszenz aufweist. Diese Panels zeigen, dass die EGFP-Fluoreszenz in der Testprobe Sam im Vergleich zum Con error erhöht zu sein scheint, aber nicht so ausgeprägt wie con ps.

Die M-Kirschfluoreszenz ist unabhängig vom PAK-Abbau und daher für alle Proben für die untersuchten Mikrokosmen ähnlich. Ergänzt wurde die visuelle Inspektion durch eine Bildanalyse und die Berechnung der relativen EGFP-Induktion, wie hier unter den gegebenen Bedingungen gezeigt. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen Coneg und Con air festgestellt werden, so dass ein Fluortransport in der Dampfphase zu den Bioreporterzellen in Gegenwart von Myzelien und Fluor ausgeschlossen ist.

EGFP war in den Zellen im Vergleich zu den Negativkontrollen signifikant induziert. Allerdings ist die EGFP-Induktion im Vergleich zur Positivkontrolle relativ gering. Diese Abbildung zeigt, dass Mycelia Trans etwa 25 Nanogramm Fluor innerhalb von 96 Stunden lokalisierte, Kontrollen in Abwesenheit von Mycelia Conair minus jedoch einen gasförmigen Fluortransport in das MMA im Bereich von nur zwei Nanogramm innerhalb von 96 Stunden.

Bei diesem Verfahren ist es sehr wichtig, sich daran zu erinnern, dass BioPort-Bakterien sehr empfindlich auf die Gasphasenkonzentrationen von Fluor reagieren. Daher ist es sehr wichtig, den Gasphasentransport so weit wie möglich zu minimieren und das Fehlen eines Gasphasentransports durch die chemische Extraktion von MMA zu überprüfen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Mikrokosmos zusammenbaut und wie man die visuelle Inspektion mit der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie durchführt.

Man sieht auch, dass die Mikrokosmen für verschiedene mikrobielle Stämme und verschiedene Chemikalien geeignet sind.