Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Atemkontrolle in Mitochondrien zu untersuchen, die aus biopsiertem Skelettmuskelgewebe isoliert wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst eine kleine Menge Muskel durch perkutane Nadelbiopsie gewonnen wird. Der zweite Schritt besteht darin, Mitochondrien durch Homogenisierung aus dem biopsierten Muskel zu isolieren.

Als nächstes werden die isolierten Mitochondrien gewaschen und von den nicht-mitochondrialen Fraktionen durch Zentrifugation getrennt, wobei die Probe durch ein verheiratetes Käsetuch geleitet wird. Der letzte Schritt besteht darin, isolierte Mitochondrien zu platten, um eine respirometrische Analyse durch extrazelluläre Flussassays durchzuführen, um die Sauerstoffverbrauchsrate zu visualisieren. Letztendlich wird der extrazelluläre Flussanalysator des Seepferdchens verwendet, um die Atemkontrolle in isolierten Mitochondrien zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie eine minimale Menge an Muskelgewebe von nur 20 Milligramm erfordert und die interexperimentelle Variabilität einschränkt. Diese Eigenschaften machen diese Technik für Anwendungen in der klinischen Forschung geeignet. Die Implikationen für diese Technik sind die Diagnose einer mitochondrialen Dysfunktion bei Patienten.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Muskelbiopsie und die mitochondriale Isolierung präzise Manipulationen erfordern, die am besten visuell demonstriert und nicht nur im Text beschrieben werden. Um die Biopsie lokal durchzuführen, verabreichen Sie 1% Lidocain und achten Sie darauf, den Muskel nicht zu infiltrieren. Darauf folgt eine Wartezeit von 10 Minuten.

Um eine ausreichende Betäubung zu ermöglichen, entnehmen Sie die Biopsien aus dem mittleren Bereich des Muskels zwischen Ansatz und Ursprung, wobei subfasziale und myo-Sehnenbereiche vermieden werden. Um dies zu erreichen, verwenden Sie zunächst eine perkutane Nadel und folgen Sie als Leitfaden einem faszialen Pop oder Widerstand der Faszie. Schätzen Sie die Tiefe mit der Narkosenadel, fühlen Sie sie dann mit der schmalen Skalpellklinge und machen Sie einen vier bis fünf Millimeter großen Schnitt durch die Faszie.

Schieben Sie die Nadel durch den Schnitt, bis sie in den Muskel eingeführt wird. Sammeln Sie mehrere Proben, wobei das Fenster in verschiedene Richtungen gedreht ist. Wenden Sie eine kontinuierliche Absaugung mit einer 60 Kubikzentimeter Spritze an, während Sie Muskelproben zwei- bis viermal in verschiedene Richtungen in die perkutane Nadel schieben und zurückziehen.

Unterbrechen Sie das Saugen und entfernen Sie die Nadel. Lassen Sie einen Assistenten fünf Minuten lang festen Druck auf die Einstichstelle ausüben. Um eine Blutstillung herzustellen, trennen Sie die Nadel vom Saugschlauch und entnehmen Sie vorsichtig die Muskelproben aus dem Fenster und dem Zylinder.

Machen Sie einen zweiten Durchgang, wenn mehr Muskeln benötigt werden, indem Sie diesen Vorgang wiederholen. Entfernen Sie sichtbare Blutgerinnsel aus der Muskelprobe mit einer Pinzette. Wiegen Sie dann die Probe und geben Sie sie sofort in ein Röhrchen mit Eis.

Kalte ECCOs, phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder DPBS. Entfernen Sie sichtbares Bindegewebe aus der Probe mit einer scharfen Schere und Pinzette. Gründlich. Waschen Sie die Proben drei- bis viermal mit eiskaltem DPBS-Puffer.

Um Blut zu entfernen, bewahren Sie die Proben auf eiskaltem DPBS auf und verarbeiten Sie sie so schnell wie möglich. Treffen Sie innerhalb von 45 Minuten nach der Biopsie Vorsichtsmaßnahmen, um Sehnen oder Fettgewebe vorsichtig aus der Muskelprobe zu entfernen. Entfernen Sie einen kleinen Teil des überschüssigen Gewebes für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.

Dies kann für andere Experimente wie Western Blots verwendet werden. Hacken Sie das Muskelgewebe sofort in feine Stücke. Unter Verwendung einer sterilen Schere wird dann in 500 Mikrolitern bis zu einem Milliliter eines Sixtin-Protein-ACE-Hemmers, wie z. B. Nagars, ein Puffer in einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Gramm Gewebe suspendiert.

Die Probe fein hacken, bis sie gut suspendiert erscheint. Anschließend eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur durchführen, bevor Sie ihn auf Eis stellen, wobei Sie darauf achten müssen, dass der Homogenisator gründlich gewaschen wird. Vorher. Homogenisieren Sie das mit Nagars behandelte zerkleinerte Gewebe.

Mit einem automatisierten Homogenisator. Bewahren Sie die Probe während des gesamten Prozesses auf Eis auf. Homogenisieren Sie jede Gewebeprobe viermal für einen Impuls von zwei Sekunden.

Legen Sie die Probe mit dem automatisierten Homogenisator bei einer Geschwindigkeitseinstellung von 10.000 U/min wieder auf Eis. Waschen Sie die Sonde mit 70 % Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser zwischen den Taschentüchern. Waschen Sie nun das homogenisierte Gewebe mit einem gleichen Volumen Chapel Perry One oder CP One Puffer.

Waschen Sie dann das Tuch mit dem doppelten Volumen von CP zwei Puffer. Füge das Ausgleichsrohr hinzu, indem du Wasser auf das gleiche Volumen in ein anderes konisches Rohr bringst. Sammeln Sie den Inhalt in einem Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 600 GS, vier Grad Celsius oder 10 Minuten das Käsetuch, damit alle Partikel durchdringen und sich nicht auf dem Tuch verfangen können.

Führen Sie den Überstand durch ein vermähltes Käsetuch, sammeln Sie das Filtrat und verwerfen Sie das Pellet, wodurch der Großteil der nicht-mitochondrialen Fraktionen entfernt wird. Dann wird der Überstand bei 10.000 GS vier Grad Celsius für 10 Minuten ultrazentrifugiert. Das Pellet wird in vier Millilitern CP-Zwei-Puffer suspendiert, bevor es nach dem Zentrifugieren ein zweites Mal auf die gleiche Weise zentrifugiert.

Den Überstand verwerfen und die Pastete in zwei Millilitern CP-1-Puffer resuspendieren. Geben Sie zu diesem Zeitpunkt ein kleines Aliquot aus dieser Suspension in ein separates Reagenzglas, das für die Proteinschätzung verwendet wird. Wiederbelebung, die verbleibende Probe in CP, einen Puffer suspendieren und zentrifugieren.

Beachten Sie, dass die Proteinplatte wie zuvor bei früheren Zentrifugationsschritten mit den Standards aufgebaut werden sollte. Zum Schluss resuspendieren Sie das endgültige Pellet in einer minimalen Menge mitochondrialer Testlösung oder -masse. Führen Sie XF-Assays durch, um die Sauerstoffverbrauchsrate oder OCR in Pikomol Sauerstoff pro Minute oder den absoluten Sauerstoff- und pH-Wert zu visualisieren.

In der Datenausgabe. Geben Sie eine 10-fache Konzentration der Verbindungen in einer X-Masse zu den Anschlüssen A bis D des plattenbasierten Respirometers, um eine Endkonzentration zu erhalten, wie im Textprotokoll aufgeführt. Bereiten Sie eine ausreichende Menge an Verbindungen für die erforderliche Anzahl von Vertiefungen vor.

Verwenden Sie die zuvor gemessenen Proteinberechnungen, um die Konzentrationen der hinzuzufügenden Mitochondrien zu bestimmen. Bestimmen Sie die optimale Menge an Mitochondrien, indem Sie ein Mikrogramm, 2,5 Mikrogramm und fünf Mikrogramm Mitochondrien pro Vertiefung titrieren. der 24-Well-Platte, um die Variabilität zwischen den Wells zu minimieren.

Zuerst 10 x Mitochondrien kalt verdünnen, eine x Masse plus Substrat. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter dieser Suspension in jede Vertiefung. Übrig blieben vier Vertiefungen mit nur 50 Mikrolitern Masse, die als Hintergrundmesswerte verwendet werden konnten.

Legen Sie die vorgetränkte Kalibrierplatte zusammen mit der oberen Kartusche von vorhin in das Respirometer, um die Instrumentenkalibrierung durchzuführen. Zur Vorbereitung des Testplattenlaufs zentrifugieren Sie die Platte bei 2000 GS für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation.

Fügen Sie vorsichtig 450 Mikroliter einer x Masse plus Succinat und faules hinzu, die jedem bekannt sind. Betrachten Sie die Mitochondrien unter dem Mikroskop, um eine homogene Haftung an der Vertiefung zu gewährleisten, bevor Sie die Platte in den XF-Analysator übertragen. Der Reihe nach. Messen Sie die mitochondriale Atmung in Echtzeit mit dem Respirometer, indem Sie es mit den Einstellungen für das Respirometer programmieren, die in dem hier gezeigten Textprotokoll bereitgestellt sind, sind typische metrische Respiro-Profile, die von komplexen zwei mit einem Mikrogramm, 2,5 Mikrogramm und fünf Mikrogramm Mitochondrien wie erwartet gesteuert werden.

Insgesamt ist die OCR mit höheren Mengen an Mitochondrien erhöht. Das berechnete Atemkontrollverhältnis oder RCR für diesen Assay beträgt 7,95, was darauf hinweist, dass die mitochondriale Präparation von hoher Qualität ist, um die Konsistenz der Ergebnisse bei der Profilierung verschiedener Mengen an Mitochondrien zu vergleichen. Es wurde eine Analyse der Varianten oder Inova durchgeführt und die Summe der Quadrate berechnet. Die Summe der Quadrate oder SS wird für den Zustand zwei, den dritten Zustand, den dritten Zustand, das ungekoppelte Antimycin A und RCR für den zweiten und den dritten Zustand in eine Richtung dargestellt.

Innova war sowohl für ANTIMYCIN als auch für RCR statistisch signifikant. Für den dritten ungekoppelten Zustand zwischen den Gruppen wurde kein signifikanter Unterschied festgestellt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass fünf Mikrogramm Mitochondrien pro Vertiefung im Vergleich zu anderen Konzentrationen die niedrigste SS ergaben.

Dieses Diagramm dient als Anhaltspunkt, um anzugeben, wie viel mitochondriales Protein basierend auf der anfänglichen Muskelstichprobengröße zu erwarten ist. Erwartungsgemäß besteht eine starke Korrelation zwischen der Menge der verarbeiteten Muskeln und dem gesamten mitochondrialen Proteingehalt der endgültigen Probe. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als drei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nach der Muskelbiopsie ist es wichtig sicherzustellen, dass der Patient in den nächsten drei Tagen kein Aspirin oder Ibuprofen oder andere rezeptfreie nichtsteroidale Mittel einnimmt, um sicherzustellen, dass das Gewebe, das wir biopsiert haben, gut heilt. Der nächste Punkt ist, dass wir sicherstellen wollen, dass sie auch in den nächsten anderthalb Tagen keine anstrengenden Aktivitäten ausführen, also nichts wie Erschütterungen. Das wäre eine Basketball-Trampolin-Illerie, aber sie können ihren eigenen normalen Aktivitäten nachgehen.

Wir bitten sie auch, den Bereich 24 Stunden lang trocken zu halten, aber wenn er zum ersten Mal nass wird, um zu duschen, damit keine Arten von Bakterien, die sich auf der Haut befinden könnten, die wir nicht gereinigt haben, in den Schnitt gelangen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie man S laterales Skelettmuskelgewebe biopsiert, Mitochondrien isoliert und die Atemkontrolle misst.