Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Atmungskontrolle in Mitochondrien zu untersuchen, die aus biopsiertem Skelettmuskelgewebe isoliert wurden. Dies wird erreicht, indem zunächst eine kleine Menge Muskelgewebe mittels perkutaner Nadelbiopsie entnommen wird. Der zweite Schritt besteht darin, Mitochondrien aus dem biopsierten Muskelgewebe durch Homogenisierung zu isolieren.

Anschließend werden die isolierten Mitochondrien durch Zentrifugation und Durchlaufenlassen der Probe durch ein zusammengenähtes Mulltuch von nicht mitochondrialen Fraktionen gewaschen und getrennt. Der letzte Schritt besteht darin, die isolierten Mitochondrien einzuplatzieren, um eine respiratorische Analyse mittels extrazellulärer Fluss-Assays durchzuführen, um die Sauerstoffverbrauchsrate sichtbar zu machen. Letztendlich wird der Seahorse-Extrazellulär-Fluss-Analysator verwendet, um die Atmungskontrolle in isolierten Mitochondrien zu untersuchen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie eine minimale Menge an Muskelgewebe von nur 20 Milligramm erfordert und die Variabilität zwischen Experimenten begrenzt. Diese Merkmale machen die Technik für klinische Forschungsanwendungen geeignet. Die Anwendungsmöglichkeiten dieser Technik bestehen in der Diagnose von mitochondrialen Funktionsstörungen bei Patienten.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Muskelbiopsie und die Isolierung von Mitochondrien präzise Handgriffe erfordern, die visuell besser vermittelt werden können als allein schriftlich beschrieben. Um die Biopsie lokal durchzuführen, wird 1 % Lidocain verabreicht, wobei darauf geachtet werden muss, den Muskel nicht zu infiltrieren. Anschließend erfolgt eine Wartezeit von 10 Minuten.

Um eine ausreichende Betäubung zu ermöglichen, entnehmen Sie die Biopsien aus dem mittleren Muskelbereich zwischen Ansatz und Ursprung und vermeiden dabei subfasziale sowie myotendinöse Regionen. Gehen Sie hierfür zunächst perkutan mit einer Nadel vor und orientieren Sie sich an einem Fasziensprung oder am Widerstand der Faszie als Leitkriterium. Schätzen Sie die Tiefe mit der Anästhesienadel ab, tasten Sie diese dann mit der schmalen Skalpellklinge ab und führen Sie einen vier bis fünf Millimeter langen Schnitt durch die Faszie.

Führen Sie die Nadel durch den Einschnitt, bis sie in den Muskel eingeführt ist. Entnehmen Sie mehrere Proben, wobei das Fenster in verschiedene Richtungen gedreht wird. Wenden Sie kontinuierlichen Unterdruck mit einer 60-Kubikzentimeter-Spritze an, während Sie die Muskelproben zwei- bis viermal in verschiedene Richtungen vor- und zurückbewegen, um sie in die perkutane Nadel aufzunehmen.

Beenden Sie das Absaugen und entfernen Sie die Nadel. Lassen Sie einen Assistenten fünf Minuten lang festen Druck auf die Einstichstelle ausüben. Um die Blutstillung zu gewährleisten, trennen Sie die Nadel vom Absaugrohr und entnehmen Sie die Muskelproben vorsichtig durch das Fenster und aus dem Zylinder.

Führen Sie einen zweiten Durchgang durch, falls mehr Muskelgewebe benötigt wird, indem Sie dieses Verfahren wiederholen. Entfernen Sie sichtbare Blutgerinnsel aus der Muskelprobe mit einer Pinzette. Wiegen Sie die Probe anschließend und legen Sie sie unverzüglich in ein Gefäß mit Eis.

Kaltes, mit Phosphat gepuffertes Kochsalzlösung (ECCOs) oder DPBS. Entfernen Sie sichtbares Bindegewebe mit einer scharfen Schere und Pinzette gründlich. Waschen Sie die Proben drei- bis viermal mit eiskaltem DPBS-Puffer.

Um das Blut zu entfernen, halten Sie die Proben auf eiskaltem DPBS und verarbeiten Sie sie so schnell wie möglich. Innerhalb von 45 Minuten nach der Biopsie sollten Sie vorsichtig Sehnen oder Fettgewebe aus der Muskelprobe entfernen. Entfernen Sie eine kleine Menge des überschüssigen Gewebes zur Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.

Dies kann für andere Experimente wie Western Blots verwendet werden. Zerkleinern Sie das Muskelgewebe sofort in feine Stücke. Suspendieren Sie es unter Verwendung einer sterilen Schere in 500 Mikrolitern bis einem Milliliter eines Sistin-Protein-ACE-Hemmers, wie z. B. Nagars, das in CP1-Puffer in einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Gramm Gewebe gelöst ist.

Zerkleinern Sie die Probe, bis sie gut suspendiert erscheint. Anschließend erfolgt eine fünfminütige Inkubation bei Raumtemperatur, bevor die Probe auf Eis gegeben wird, wobei sichergestellt werden muss, dass der Homogenisator gründlich gespült wird. Zuvor. Homogenisieren Sie das mit Nagars behandelte zerkleinerte Gewebe.

Unter Verwendung eines automatisierten Homogenisators. Halten Sie die Probe während des gesamten Vorgangs auf Eis. Homogenisieren Sie jede Gewebeprobe viermal, jeweils mit einem Impuls von zwei Sekunden.

Platzieren Sie die Probe unter Verwendung des automatischen Homogenisators bei einer Drehzahl von 10.000 U/min zurück auf Eis. Spülen Sie die Sonde zwischen den Gewebeproben mit 70 %igem Ethanol und anschließend mit destilliertem Wasser. Waschen Sie das homogenisierte Gewebe nun mit einem gleichen Volumen an Chapel Perry One- oder CP-One-Puffer.

Anschließend das Gewebe mit der doppelten Menge CP-two-Puffer waschen. Den Gegengewichtsbehälter herstellen, indem Wasser in einem weiteren kegelförmigen Reagenzglas auf das gleiche Volumen aufgefüllt wird. Den Inhalt in einem Zentrifugenröhrchen sammeln und bei 600 × g und 4 °C zehn Minuten lang zentrifugieren. Den Molverfilter vorbenetzen, damit alle Partikel hindurchgehen und nicht im Tuch hängen bleiben.

Leiten Sie den Überstand durch ein gefaltetes Mulltuch, sammeln Sie das Filtrat und verwerfen Sie das Pellet, wodurch der Großteil der nicht mitochondrialen Fraktionen entfernt wird. Anschließend ultrazentrifugieren Sie den Überstand bei 10.000 ×g und 4 °C für 10 Minuten. Suspendieren Sie das Pellet in vier Milliliter CP2-Puffer, bevor Sie es ein zweites Mal auf die gleiche Weise zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in zwei Millilitern CP1-Puffer. An diesem Punkt geben Sie eine kleine Aliquot aus dieser Suspension in ein separates Reagenzglas, das für die Proteinbestimmung verwendet wird. Resuspendieren Sie die verbleibende Probe in CP1-Puffer und zentrifugieren Sie.

Wie zuvor zu beachten ist, sollte die Proteinplatte bereits während der früheren Zentrifugationsschritte mit den Standards vorbereitet werden. Schließlich das endgültige Pellet in einer minimalen Menge an mitochondrialer Assay-Lösung oder Masse resuspendieren. XF-Assays durchführen, um die Sauerstoffverbrauchsrate oder OCR in Pikomol Sauerstoff pro Minute oder die absoluten Sauerstoff- und pH-Werte darzustellen.

In der Datenausgabe. Geben Sie eine 10×-Konzentration der Verbindungen in einer X-Masse zu den Öffnungen A bis D des plattenbasierten Respirometers hinzu, um die im Textprotokoll angegebene Endkonzentration zu erreichen. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen der Verbindungen für die erforderliche Anzahl an Vertiefungen vor.

Verwenden Sie die zuvor gemessenen Proteinberechnungen, um die Konzentrationen der hinzuzufügenden Mitochondrien zu bestimmen. Ermitteln Sie die optimale Menge an Mitochondrien durch Titration von ein Mikrogramm, 2,5 Mikrogramm und fünf Mikrogramm Mitochondrien pro Mulde. Verwenden Sie die 24-Mulden-Platte, um die Variabilität zwischen den Mulden zu minimieren.

Zunächst verdünnen Sie 10 x Mitochondrien in kaltem, ein-fachem Mass plus Substrat. Anschließend geben Sie 50 Mikroliter dieser Suspension in jedes Loch. Lassen Sie dabei vier Löcher, die nur 50 Mikroliter Mass enthalten, für Hintergrundmessungen frei.

Platzieren Sie die vorab eingeweichte Kalibrierplatte zusammen mit der oberen Kartusche von zuvor im Respirometer, um die Gerätekalibrierung durchzuführen. Zum Vorbereiten des Testplattenlaufs zentrifugieren Sie die Platte bei 2000 ×g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation.

Geben Sie vorsichtig 450 Mikroliter einer x-fachen Masse, ergänzt mit Succinat und Ratten bekannt, zu jeder Probe hinzu. Überprüfen Sie die Mitochondrien unter dem Mikroskop, um eine homogene Anheftung an die Vertiefung vor der Übertragung der Platte in den XF-Analysator sicherzustellen. Nacheinander messen Sie die mitochondriale Atmung in Echtzeit mithilfe des Respirometers, indem Sie es gemäß den im Textprotokoll angegebenen Einstellungen programmieren. Die hier gezeigten Profile sind typische respirometrische Profile, die durch Komplex zwei angetrieben werden, unter Verwendung von einem Mikrogramm, 2,5 Mikrogramm und fünf Mikrogramm Mitochondrien, wie erwartet.

Insgesamt ist die OCR bei höheren Mengen an Mitochondrien erhöht. Das berechnete respiratorische Kontrollverhältnis oder RCR für diesen Assay beträgt 7,95 und zeigt an, dass die mitochondriale Präparation von hoher Qualität ist, um die Konsistenz der Ergebnisse beim Profilieren verschiedener Mitochondrienmengen zu vergleichen. Die Analyse von Varianten oder Inova wurde durchgeführt und die Quadratsumme wurde berechnet. Die Quadratsumme oder SS wird für Zustand zwei, Zustand drei, Zustand drei, entkoppeltes Antimycin A sowie für RCR bei den Messungen von Zustand zwei und Zustand drei einseitig dargestellt.

Innova war statistisch signifikant, ebenso wie ANTIMYCIN und RCR. Zwischen den Gruppen wurde kein signifikanter Unterschied im Zustand drei entkoppelt beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass fünf Mikrogramm Mitochondrien pro Mulde im Vergleich zu anderen Konzentrationen die niedrigste SS ergab.

Diese Darstellung dient als Leitfaden, um anzuzeigen, wie viel mitochondriales Protein basierend auf der ursprünglichen Muskelprobenmenge erwartet werden kann. Wie erwartet besteht eine starke Korrelation zwischen der Menge des aufgearbeiteten Muskelgewebes und dem gesamten Gehalt an mitochondrialem Protein der Endprobe. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in weniger als drei Stunden abgeschlossen werden.

Nach der Muskelbiopsie ist es wichtig sicherzustellen, dass der Patient in den nächsten drei Tagen kein Aspirin, Ibuprofen oder andere rezeptfreie nichtsteroidale Medikamente einnimmt, um eine gute Heilung der biopsierten Gewebe zu gewährleisten. Als Nächstes sollten wir sicherstellen, dass er oder sie in den nächsten anderthalb Tagen keine anstrengende körperliche Aktivität ausführt, also nichts, was Erschütterungen verursacht, wie Basketball oder Trampolinspringen. Normale alltägliche Aktivitäten sind jedoch erlaubt.

Wir bitten sie außerdem, die Stelle 24 Stunden lang trocken zu halten, wobei der erste Kontakt mit Wasser idealerweise unter der Dusche erfolgen soll, damit eventuell auf der Haut verbliebene Bakterien, die wir nicht entfernt haben, nicht in den Schnitt gelangen. Nach Anschauung dieses Videos sollten Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie man eine Biopsie des seitlichen Skelettmuskels durchführt, Mitochondrien isoliert und die Atmungskontrolle misst.