Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in Escherichia coli

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Identifizierung von Membranproteinen, die in SIA coli exprimiert werden, für strukturelle und funktionelle Analysen. Zuerst werden die Bakterien geerntet, ausgelegt und mittels SDS-Seite analysiert, um die korrekt gefalteten GFP-Proteine mittels Ingel-Fluoreszenz sichtbar zu machen. Im zweiten Schritt wird die Produktion der E-coli, die zur Expression der interessierenden Membranproteine bestimmt sind, hochskaliert und nach der Induktion der Proteinexpression eine Gesamtmembranfraktion aus den Zellen hergestellt.

Schließlich wird die gesamte Membranfraktion in vier verschiedenen Detergenzien und die Monodispergität des Detergens gelöst. Solubilisiert. GFP-Proteine werden mittels Größenausschlusschromatographie analysiert. Letztendlich können die Proteine durch Fluoreszenz überwacht und die elucianischen Profile aufgetragen werden, um die Aggregationsmonodispersität und das freie GFP in den Proben zu bewerten.

Die Herstellung rekombinanter Membranproteine für strukturelle und funktionelle Studien bleibt aufgrund ihrer geringen Löslichkeit technisch anspruchsvoll und sie erben Instabilität, sobald sie in Detergenzien extrahiert werden. Die Erfahrung hat gezeigt, dass das Screening mehrerer Varianten von Membranproteinen, wie z. B. Orthologe verschiedener Spezies, die Erfolgsrate der Membranproteinexpression verbessern kann. Fusion mit grün fluoreszierenden Proteinen, die verwendet werden, um eine authentische Faltung zu melden.

Der erste Schritt in unserem GFP-basierten Protokoll für das Expressionsscreening von Membranproteinen und E-Coli ist die Verwendung der Ingelfluoreszenz von Detergenslysaten aus ganzen Zellen, um die Membranproteinkonstrukte für die weitere Analyse basierend auf dem Expressionsgrad im Screening zu identifizieren. Das Verhalten bei der Auswahl von Membranproteinen und verschiedenen Detergenzien wird dann mit Hilfe der Fluoreszenzdetektion in Verbindung mit der Größenausschlusschromatographie bewertet. Dies gibt Aufschluss über die Monodispersität der detergenden Proteinkomplexe. Um die IPTG-induzierte bakterielle Expression zu analysieren, beginnen Sie mit dem Transfer eines Milliliters IPTG-behandeltem E-Colin-Duplikat aus 24 Deep-Well-Blöcken über Nacht in 96 Deep-Well-Blöcke, versiegeln Sie die Blöcke und schleudern Sie die Zellen dann 10 Minuten lang bei 6.000-fachem G bei Raumtemperatur herunter.

Drehen Sie anschließend den Block um, um das Medium zu dekantieren, indem Sie vorsichtig auf ein Papiertuch klopfen, um die restliche Flüssigkeit abzulassen. Verschließen Sie die Platte wieder und lagern Sie die Zellen nach mindestens 20 Minuten bei minus 80 Grad Celsius. Tauen Sie die Pellets 20 Minuten lang bei Raumtemperatur auf und verwenden Sie dann eine Mehrkanalpipette, um die Zellen in 200 Mikrolitern Lysepuffer vollständig zu resuspendieren.

Behandeln Sie die Zellen mit 20 Mikrolitern DLPI-Lösung, die 10 Minuten lang bei 1000 U/min und vier Grad Celsius zitterte. Geben Sie dann 25 Mikroliter 10%doda multiside in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen weitere 60 Minuten lang unter Schütteln. Nach der DDM-Behandlungszentrifuge verstopfen die Deep-Well-Zentrifuge und übertragen Sie dann 10 Mikroliter des geklärten Lysats auf eine Mikrotiterplatte und fügen Sie 10 Mikroliter SDS-Page-Gel-Ladepuffer hinzu.

Beladen Sie nun das Gel mit 10 Mikrolitern der Lysatpufferlösung pro Vertiefung und lassen Sie das Gel bei konstanter Spannung zwischen 100 und 120 Volt in einem Kühlraum für zwei bis 2,5 Stunden laufen, wenn die Membran den Boden erreicht. Legen Sie das Gel auf einen Imager mit einem Blaulichtfilter, um die Fusionsproteine zu erkennen und die Zellkulturen zu vergrößern. Nachdem Sie ein Eloqua aus kompetenten E-Coli verwandelt haben, pflücken Sie eine Kolonie in 10 Milliliter Power-Brühe für das Wachstum über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Morgen verdünnen Sie fünf Milliliter der Nachtkultur in 500 Milliliter Power-Brühe und züchten Sie die Kulturen unter Schütteln bei 250 U/min und 37 Grad Celsius weiter. Wenn der OD bei 595 Nanometern etwa 0,5 beträgt, induzieren Sie die Expression, indem Sie IPTG bis zu einer Endkonzentration von einem Millimolar hinzufügen, und stellen Sie die Kultur dann über Nacht bei 20 Grad Celsius wieder in den Shaker. Am nächsten Morgen ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation und lagern die Pellets bei minus 80 Grad Celsius.

Zur Vorbereitung der Zellmembranen. Das dritte Pellet bei Raumtemperatur wird in fünf Millilitern PBS pro Gramm Zellpellet resuspendiert und das Volumen nach Bedarf erhöht, bis die Viskosität auf eine flüssige Konsistenz abnimmt. Geben Sie dann Magnesiumchlorid bis zu einer Endkonzentration von einem Millimolar DNAs bis zu einer Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter und eine vorverpackte Proteasehemmer-Tablette pro 20 Gramm Zellpellet zu den Zellen.

Brechen Sie anschließend die Zellen mit einem gekühlten Zelldisruptor bei einem Druck von 30 KPSI auf und pelletieren Sie dann die unbeschädigten Zellen und Trümmer 15 Minuten lang bei 30.000 mal G und vier Grad Celsius. Übertragen Sie das Supinat in ein Ultrazentrifugationsröhrchen und sammeln Sie die gesamte Membranfraktion, indem Sie das Supinat eine Stunde lang bei 200.000 G und vier Grad Celsius herunterschleudern. Verwenden Sie dann den Zellhomogenisator, um das Membranpellet in 10 Millilitern eiskaltem PBS wieder zu suspendieren, um die Membranen für jedes zu verwendende Reinigungsmittel zu lösen.

Aliquotieren Sie 900 Mikroliter der Membransuspension in ein 1,5-Milliliter-Polyzentrifröhrchen. Geben Sie dann 100 Mikroliter jedes frisch zubereiteten Waschmittels in die entsprechenden 1,5-Milliliter-Röhrchen und inkubieren Sie die Mischungen bei vier Grad Celsius mit milder Vegetation. Nach einer Stunde pelletieren Sie das Reinigungsmittel und die löslichen Fraktionen mit einer Tisch-Ultrazentrifuge, wobei Sie sicherstellen, dass die Röhrchen mindestens zur Hälfte gefüllt sind und das Rückenlagemittel für die fluoreszierende detektierte Größenausschlusschromatographie oder FEC-Analyse zurückbleibt.

Als nächstes eine Äquatorgrößenausschlusssäule mit einem breiten Fraktionierungsbereich mit laufendem Strömungspuffer mit einer Rate von 0,3 Millilitern pro Minute. Injizieren Sie dann 100 Mikroliter einer solubilisierten Membranprobe mit der gleichen Durchflussrate auf die Säule und überwachen Sie das elucianische Profil mit Hilfe der Fluoreszenzoptik. Importieren Sie abschließend das eluzische Volumen und die Fluoreszenzintensitätsdaten in ein Tabellenkalkulationsprogramm zur grafischen Darstellung und analysieren Sie das verbleibende gelöste Membranmaterial durch Ingelfluoreszenz.

Wie bereits gezeigt, ist diese Proteinfamilie essentiell für die bakterielle Zellteilung. In diesen Bildern ist ein Vertreter in der Gelfluoreszenzvisualisierung von 24 OUTTA 47 genannten Konstrukten dargestellt. Die Intensität der Bänder gibt einen Hinweis auf den Grad des Ausdrucks.

Zum Beispiel wird das Fusionsprotein in der vierten Spurszene in beiden Stämmen gut exprimiert. Die zusätzlichen Banden mit niedrigerem Molekulargewicht deuten jedoch darauf hin, dass das Protein in vielen Lanes teilweise abgebaut wird. Es gibt ein Band, das in der Größe nur GFP entspricht.

So werden z.B. G vier und H vier bei der C 41 DE drei P liegt S Dehnung vollständig zu freiem GFP zerlegt. Während im LEMO 21 DE drei einige intakte Proteine in diesen Diagrammen zu sehen sind. Die Analyse von zwei Konstrukten, die im primären Screening durch Fluoreszenz nachgewiesenen Größenausschluss gut abgeschnitten haben, zeigt, wie sich die Proteine unterschiedlich verhalten, je nachdem, welches der vier Detergenzien getestet wurde.

Zum Beispiel ergab dieses Protein nur einen symmetrischen Peak mit Streuaggregation in Dool Multiside, was es zum Waschmittel der Wahl für die anschließende Reinigung macht. Im Gegensatz dazu zeigte das andere Fusionsprotein bei allen getesteten Detergenzien ein ähnliches Profil. Dieses Protokoll kann leicht erweitert werden, um beispielsweise verschiedene E-Coli-Stämme einzubeziehen, die unter unterschiedlichen Expressionsbedingungen gezüchtet wurden, und zusätzliche Abschreckungsmittel sowohl in primären als auch in sekundären Screenings.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Hauptzweck dieses Protokolls darin besteht, eine große Anzahl von Membranproteinen hinsichtlich ihrer Expression und Detergenzisierung zu screenen, um Kandidaten für die weitere Analyse zu identifizieren.