Name: Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Lernen Sie zwei Methoden zur Bewertung dendritischer Verzweigung im Hippocampus der Maus: Echtzeit-Tracing und Extended Depth of Field Imaging. Diese Techniken ermöglichen detaillierte neuronale Analysen.

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Diese Forschung wurde durch Zuschüsse der LuMind Foundation, Research Down Syndrome und der Alzheimer's Association (AS) unterstützt. CP wurde teilweise durch ein Fakultätsentwicklungsstipendium des College of Nursing and Health Professions an der Arkansas State University unterstützt.

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den vom Ausschuss für Tierforschung an der Veterans Affairs Palo Alto Gesundheitswesen genehmigt ethischen Standards durchgeführt. 1. Golgi-Cox Färbung <ol><li> Gehirn-Extraktion und Färbung <ol><li> Am 1. Tag, tief betäuben Mäusen mit 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin vor euthanizing über Ausbluten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Schädeldach und sezieren das Gehirn. <ol><li> Entfernen Sie zuerst die Haut auf der Oberseite des Schädels, indem eine gekrümmte Schere an der Oberseite des Kleinhirns und sanft Messer durch die Schädeldach parallel zur zentralen Sulcus mit der Spitze der Schere spitz nach außen, bewegt sich in Richtung auf den Riechkolben. Wiederholen Sie diesen Vorgang auf beiden Seiten. </li><li> Verwenden Sie eine chirurgische Pinzette, um das Schädeldach heben und drehen Sie ihn in Richtung der Riechkolben und abbrechen. Dann drehen Sie den Schädel auf den Kopf und verwenden Sie eine Abholung durch den Wellenleiter geschnittenNerven und lösen das Gehirn. Schließlich verwenden die Abholung, das Gehirn aus dem Rückenmark in der Höhe des Foramen magnum trennen. </li></ol></li><li> Sofort tauchen das Gehirn in 15 ml im Handel erhältlichen, unverdünnt Golgi-Cox-Lösung. Lagern Sie das Gehirn in Golgi-Lösung in einem verschlossenen, 20 ml Glasflasche bei Raumtemperatur im Dunkeln. </li><li> Am 2. Tag, gießen Sie langsam die Lösung, und ersetzen sie durch 15 ml frisches Golgi-Cox-Lösung. Verschließen Sie die Flasche, die das Gehirn und lassen Sie ungestört für weitere 9 Tage im Dunkeln. </li></ol></li><li> Schnitte und Einbettung <ol><li> Am 11. Tag, legen Sie die Gehirne in 30% Saccharose-Lösung, in ddH 2 O für die Dehydratisierung vorbereitet. Ändern Sie die Lösung mit frisch zubereiteten 30% Saccharose nach 12 Stunden. Das Gehirn in einer 30% igen Saccharoselösung für 3 Tage Inkubation bei 4 ° C. </li><li> Am 14. Tag, füllen Sie das Reservoir des Vibratom mit einer 30% Saccharoselösung, bis die Klinge fallen. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 1 mm / s mit einer Amplitude von 0,95 mm. </li><li> Tupfen Sie die Gehirne mit einem Kimwipe um überschüssige Feuchtigkeit zu entfernen, und entfernen Sie das Kleinhirn mit einer Rasierklinge zu koronal geschnitten. </li><li> Fest montieren das gesamte Gehirn auf die Vibratom-Plattform mit Sekundenkleber und lassen Sie es für 2-4 min eingestellt. Legen Sie die Plattform mit dem halten Gehirn in den Behälter und stellen Sie die Klinge an die Spitze des Gehirns. </li><li> Mit dem Vibratom, schneiden das Gehirn in 150 &amp; mgr; m dicke Schnitte bei Raumtemperatur, daran zu denken, die Klinge nach jedem dritten Gehirn verändern. </li><li> Pick-up die Abschnitte aus dem Reservoir mit einem kleinen Pinsel gekippt und tauchen sie in eine Petrischale mit 0,3% Gelatine in ddH 2 O. gemacht Während die Abschnitte in der Petrischale bleibt, fügen Sie 0,5 ml 0,3% Gelatine auf jeder Folie und mit einer Bürste verteilen und Mantel Superfrost + Rutschen. </li><li> Vorsichtig holen die eingetauchten Abschnitte aus der Petrischale und legen Sie sie auf die verkleisterte Rutschen. Richten Sie die Hirnschnitten vonberühren sie nur an den Seiten und nicht an den Spitzen. </li><li> Nach etwa zehn Minuten, Mantel die Schnitte mit 30% Saccharose, bevor das Gewebe vollständig getrocknet ist. Danach lufttrocknen Präparate an einem dunklen Ort in einem Objektträgergestell für 3 Tage. </li><li> Verdünne Handel erhältlichen 10x Entwicklungslösung auf 1x mit ddH 2 O. Tauchen Sie die Folien in Entwicklungslösung für 7-10 min. Spülen Sie die Folien 3 mal in ddH 2 O. </li></ol></li><li> Entwässerung <ol><li> Es werden 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% und 95% Ethanol-Lösungen mit destilliertem ddH 2 O. </li><li> Weichen Sie die Folien in immer höheren Ethanollösungen für jede 10 min. </li><li> Weichen Sie die Folien in 100% Ethanol-Lösung 3 mal für jeweils 10 Minuten Zeit. </li><li> Weichen Sie die Folien in 100% Xylol 3 Mal hintereinander für jeweils 5 min, wobei die Abschnitte in der endgültigen Lösung bis sie Cover-gerutscht sind. </li><li> Legen Sie eine großzügige Menge von DPX (Di-n-butylphthalat in Xylol) Eindeckmedium (abaus 1-1,5 ml) auf jeder Folie mit einem Kunststofftransferpipette. Vorsichtig Deck um Blasen zu vermeiden. </li><li> Luft trocknen Abdeckung glitt-Hirn Abschnitten horizontal für 3 Tage. </li></ol></li></ol> 2. Double Färbung <ol><li> Tief betäuben (siehe Schritt 1.1.1) die Tiere. </li><li> Führen Herzperfusion mit frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer 12 gebildet. </li><li> Extrahieren Sie die Gehirne (siehe 1.1.2) und speichern Sie in 45 ml 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C über Nacht auf einem Schüttler. </li><li> Übertragen Sie die Gehirne zu einer 30% igen Zuckerlösung und warten, bis die vollständige Dehydratisierung für 48 Stunden bei 4 ° C. Entfernen Sie die Gehirne aus Saccharose und legen Sie sie direkt auf Kupferblöcken auf Trockeneis platziert. </li><li> Füllen Sie den Block mit optimalen Schnitttemperatur (OAT) Verbindung, und markieren Sie die Ausrichtung des Gehirns mit dem Riechkolben als Wahrzeichen. </li><li> Mit einem Kryostaten geschnitten 70 Mikrometer dicke Abschnitte bei -20 ºC und legen Sie siein Cryoschutzstofflösung (25% Ethylenglykol, 25% Glycerin, in 0,05 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4) und halten bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Machen Sie eine Lösung von 50% Gefrierschutzmittel und 50% Methanol. Zu dieser Lösung werden 0,5% Wasserstoffperoxid (vol / vol). Inkubieren schwebenden Abschnitte für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Warm Abschnitte in 37 ºC in TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung) für 30-40 min, indem man sie in einem histologischen Ofen. </li><li> Inkubieren der Schnitte mit 0,3% Triton und 3% normalem Pferdeserum für 45 min bei Raumtemperatur vor der Immunofärbung. Inkubiere die Abschnitte bei 4 ºC über Nacht in 3 ml Lösung des DCX Antikörper, verdünnt 1: 500 in TBS mit 0,3% Triton und 1% normales Pferdeserum. </li><li> Am nächsten Tag waschen Sie die Abschnitte 3 Mal hintereinander in TBS (10 min jeweils). </li><li> Inkubieren Abschnitte mit biotinyliertem Pferde-anti-Ziege (1: 200 in TBS) für zwei Stunden bei Raumtemperatur. 3 Mal hintereinander in TBS waschen Sie die Abschnitte (10 min jeweils). </li><li> Inkubieren tSaum mit ABC Lite (1: 1000) für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Werden 5 ul 30% H 2 O 2 zu einer Tablette von 10 mg DAB (3,3 &quot;-Diaminobenzidine) in 15 ml von 1 M Tris-HCl (pH 7,6) gelöste Lösung. Die Abschnitte unmittelbar in dieser Lösung für 5 Minuten inkubieren. </li><li> Beenden Sie die Reaktion durch Waschen mit eiskaltem TBS dreimal, gefolgt von einem Waschen in TBS bei Raumtemperatur. </li><li> Entwässern Abschnitte mit einer Reihe von Ethanollösungen (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, jeweils 5 min), in Xylol klären und dann die Abdeckung Slip mit DPX wie in Schritt 1.3. </li></ol> 3. Visualisierung <ol><li> Nach vollständiger Trocknung der Teile, überschüssiges DPX oben auf den Folien mit einer scharfen Klinge, und legen Sie sie auf dem Scan-Tisch des Mikroskops. Das System besteht aus einem Mikroskop mit Scantisch, einen Joystick und einen 12-Bit-Farbkamera ausgestattet zusammensetzt. </li><li> Starten Sie das Programm. Öffnen Sie eine neue Datei. </li><li> Platzein Bezugspunkt auf dem Bildschirm, indem Sie mit dem Mauszeiger an jedem Ort. Dadurch werden alle Icons aus der Werkzeugpalette des Programmfensters zu aktivieren. </li><li> Klicken Sie auf das Symbol &quot;Joystick Free&quot; in der Symbolleiste und dann verwenden Sie den Joystick, um die Gyrus dentatus des Hippocampus im ersten Abschnitt zu finden. </li><li> Im Reiter im Programmfenster &quot;Extras&quot;, wählen Sie &quot;Serial Section Manager&quot;. Klicken Sie auf das Symbol &quot;Neuer Abschnitt&quot; in der linken unteren Ecke des Fensters. Das Fenster &quot;Serial Abschnitt Setup&quot; zu öffnen. </li><li> Wählen Sie die Serien Abschnitt Setup-Fenster und geben Sie die Gesamtzahl der Abschnitte, die Hippokampus-Regionen enthalten. Wählen Sie das Auswertungsintervall. Geben Sie im Abschnitt Schnittdicke (70 &amp; mgr; m für DCX und 150 &amp; mgr; m für die Golgi-gefärbten Schnitten). </li><li> Starten Verfolgung der Gyrus dentatus Region, indem Sie auf das Symbol &quot;Freihandkonturzeichnung&quot; in der Werkzeugleiste. Skizzieren Sie die dentatus körnige Zellschicht. &lt;/ Li&gt; <li> Wählen Sie &quot;100X&quot; aus dem Menü &quot;Vergrößerung&quot;. Fügen Sie einen Tropfen Immersionsöl auf der Strecke und schalten Sie das Ziel, 100X. Suchen Sie die dentatus Körnerzellkörpern und Dendriten im Rahmen dieses Ziels. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf einen ausgewählten Neuron, und klicken Sie auf das Symbol &quot;Neuron Tracing&quot; auf der Symbolleiste. Verfolgen Sie den Umfang des dentatus Körnerzellkörper. Wenn Verfolgung beendet der rechten Maustaste auf &quot;Fertigzellkörper&quot; zu wählen. </li><li> Starten Sie Verfolgen der Dendriten manuell in x, y und z-Richtung und folgen jeder Zweig mit dem Joystick und z-Motor-Regler. An einer Gabelung oder Trifurkation Knoten, wählen Sie die entsprechende Option im Dropdown-Menü auf der rechten Maustaste. Verfolgen Sie jeden der Zweige, die von diesen Knoten entstehen. Am Ende jeder Verzweigung rechten Maustaste und wählen Sie &quot;Beenden&quot; aus dem Dropdown-Menü. </li><li> Mit den Pfeiltastensymbole im Software-Fenster wählen Sie zufällig ein anderes dentatus Körnerzellen und folgen Sie dem gleichen Verfahren wie described in Schritt 3,9 bis 3,10. Speichern Sie die gesamte Ablaufverfolgung. </li><li> Starten Sie die neuronale Tracing-Software. </li><li> Öffnen Sie das erste NRX Datendatei von der ersten Maus der Versuchsgruppe. Hängen Sie den NRX-Datei des zweiten Maus der Versuchsgruppe. Fortfahren, bis alle NRX Dateien aus dieser Gruppe werden angehängt. </li><li> Unter der Registerkarte Analyse, wählen Sie &quot;Fan In-Diagramm&quot;. Es öffnet sich das Fan In-Analysefenster. Häkchen &quot;Dendriten&quot; und klicken Sie auf Anzeigen, die die Länge und Verzweigung Muster von Dendriten für diese Gruppe von Mäusen (Abbildung 1) zeigt. </li></ol> 4. EDFI Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht es dem Benutzer, schnell erfassen eine große Anzahl von Bildern durch die z-Achse von jedem Feld und erzeugt ein 2D-Bild, das alle fokussierten Punkte in der gesamten z-Achse enthält. Das Ergebnis wird ein zusammengesetztes Bild, das alle fokussierten Pixel aus gesammelten Bilder enthält. <ol><li> Schließen Sie das Mikroskop in ein digitales NockenÄra. Zeigen die Abschnitte zunächst auf dem Scantisch mit dem Mikroskop verbunden und dann zu einem 10X-Objektiv zu wechseln. Bewegen Sie die Bühne, um den Bereich von Interesse. </li><li> Starten Sie eine Video-Aufnahme-Programm. </li><li> Drücken Sie die Aufnahmetaste. Sobald der Aufnahmeknopf gedrückt wird, verwenden Sie das Makro-Fokus-Knopf, um von oben nach unten auf dem Abschnitt für insgesamt 4 Sekunden zu bewegen. Speichern Sie die Videodatei. </li><li> Verwenden ImageJ Freeware, um die AVI-Videodateien in einem unkomprimierten Format durch Öffnen der Datei und speichern Sie sie in unkomprimierte Dateiformat zu konvertieren. </li><li> Starten Sie eine Bildanalyse-Programm und öffnen Sie die AVI-Datei. Gehen Sie zum Menü &quot;Bearbeiten&quot; und klicken Sie auf &quot;Erweiterte Tiefenschärfe&quot;. Wählen Sie den entsprechenden Videodatei. Im &quot;Output&quot; Optionen wählen &quot;Geneverbund Bester-Fokus-Bild&quot;. </li><li> Im &quot;Focus Analysis&quot; Optionen, wählen Sie &quot;Normalized Illumination&quot; und &quot;Max Local Contrast&quot; Optionen. Wählen Sie dann &quot;Create &quot;. Das resultierende Bild repräsentiert alle fokussierten Punkte in der gesamten z-Achse (Figur 2). </li><li> Speichern Sie das resultierende Bild. </li></ol> 5. Generieren Extrem-Bilder mit hoher Auflösung HINWEIS: Diese Methode erlaubt es dem Benutzer, mit geringer Vergrößerung und extrem hochauflösende Bilder von hoher Vergrößerung-Bilder mit hoher Auflösung automatisch in einer automatisierten Weise. <ol><li> Zeigen die Abschnitte zunächst auf dem Scantisch mit dem Mikroskop verbunden. Das Mikroskop ist mit einer Digitalkamera verbunden ist. Bewegen Sie die Bühne, um den Bereich von Interesse. </li><li> Starten Sie eine Bildaufnahme-Programm. </li><li> Verwenden Sie einen 10X-Objektiv und zu erwerben, und speichern Sie hochauflösende (4076 x 3116) Bilder von der Region von Interesse achten Sie darauf, um mindestens 10% überlappen müssen. </li><li> Führen Image Composite Editor um Bilder zu nähen. </li><li> Gehen Sie zum Menü Datei, und klicken Sie auf &quot;Neues Panorama&quot;. Wählen Sie den Ordner, in dem die Bilder stverknüpft. Wählen Sie die Bilder, die auf der gleichen Region und drücken Sie &quot;OK&quot; gehören. </li><li> Drücken Sie auf &quot;Export to Disk&quot; und speichern Sie das Bild. Diese Abbildung stellt eine extrem hochauflösende Bild des Bereichs von Interesse, die für die Analyse und / oder Demonstrations (Figur 3) verwendet werden könnten. </li></ol>

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Veröffentlichungskosten für diesen Artikel werden von MBF Bioscience gesponsert.

Hier wurden zwei Methoden beschrieben, um das Ausmaß der dendritischen Verzweigung in reifen und neugeborenen Neuronen mit herkömmlichen Färbemethoden in Verbindung mit RTI und EDFI quantifizieren. Die Übernahme von hochauflösenden Bildern von Neuronen ein extrem nützliches Verfahren zum Testen der schädlichen Wirkungen von neurodegenerativen Erkrankungen und wiederum stellt ein Mittel zur therapeutischen Strategien, Hippocampusneuronen Ziel beurteilen. Während die RTI-Methode wurde verwende...

Dynamische Veränderungen in der Anzahl und Struktur der Synapsen sind die Markenzeichen der Entwicklung, Alterung, und zahlreiche neurodegenerative Erkrankungen 1-3. Die Fähigkeit der Neuronen synaptische Informationen zu erhalten und zu integrieren, hängt von dendritischen Morphologie und dynamische Veränderungen synaptischer Verbindungen. Tatsächlich existiert eine positive Korrelation zwischen dendritischen Dorn und Synapsen Nummer, die sowohl die kognitiven Funktionen beeinflussen 4. So ist es nicht verwunderlich, dass Verringerungen in dendritischen Dorn Nummer haben mit kognitiven Störungen in einer Reihe von neurologischen Erkrankungen 5-7 in Verbindung gebracht, woraufhin ein großes Interesse an dendritischen Dorn Quantifizierung. Dennoch ist die Quantifizierung der Wirbelsäule Dichte bleibt eine zeitaufwendige und mühsame Aufgabe, die nützliche Informationen über die Topographie und die Verteilung von Synapsen auf der Dendritenbaum erzeugen ausfällt. Glücklicherweise Färbemethoden (zB Golgi-Cox und Double (DCX)) in Verbindungmit hoch entwickelten bildgebenden Verfahren kann eingesetzt werden, um Strombarrieren überwinden und hochaufgelöste Bilder von dendritischen Verzweigung in einem zuverlässigen und schnellen Weise. Während Golgi-Cox-Färbung eingesetzt werden kann, um den Zustand der dendritischen Verzweigung in allen Neuronen 8 beurteilen können DCX eingesetzt werden, um neugeborene Neuronen besonders im Gyrus dentatus und Subventrikularzone 9, eine wichtige Überlegung beschriften da die Neurogenese in beiden auftritt diese Regionen in der gesamten Lebensspanne 10,11. Nach der Färbung wurden zwei bildgebenden Verfahren eingesetzt werden, um dendritischen Eigenschaften zu bewerten: i) Echtzeit-Bildgebung (RTI) und ii) erweitert Schärfentiefe-Bildgebung (EDFI). Die FTI-Technik liefert eine mittlere zu verfolgen und zu quantifizieren, die Länge und die Reihenfolge der Verzweigung entlang der einzelnen dendritischen Segmente und Branchen. So ermöglicht sie es, die gesamte Fläche und Volumen von jedem dendritischen Baum besetzt schätzen. Mehr specifically im RTI Verfahren der Benutzer kontinuierlich identifiziert die Segmente und refokussiert iterativ das Neuron Spursoftware speichert die x, y und z-Koordinaten der dendritischen Struktur und rekonstruiert die Trajektorie der dendritische Struktur in 3D. Im Vergleich dazu bietet die EDFI-Methode eine ziemlich einfache und beschleunigten Mittel zur Bewertung dendritischen Dichte in ziemlich dicken Gewebeproben durch die Erzeugung eines zusammengesetzten Bildes, die Informationen über den gesamten Z-Achse. Dazu zeichnet der Anwender High-Definition-Video-Dateien über die Dicke des Abschnitts, und dann nutzt Software zu suchen, die Video-Frames, um Punkte zu identifizieren, wobei ein Pixel vollständig im Fokus. Anschließend werden die fokussierten Pixel zusammengeführt und in eine hochauflösende Bildverbund 2D integriert. Dieses zusammengesetzte Bild enthält alle Pixel, die In-Fokus unabhängig von ihrer Position in der z-Achse sind. Qualitative und quantitative Analyse dieser 2D-Bilder können anschließend verwendet werden, um die Dichte zu bestimmen,der dendritischen Verzweigungen in jedem Feld. Schließlich stellen wir ein Verfahren zum Erzeugen von Panorama extrem hochauflösende Bilder für die Analyse und Bewertung von Dendriten in einem gesamten Bereich von Interesse. Diese Technik kann eingesetzt werden, um den mangelnden Zugang zu sehr hochauflösende und teure Digitalkameras überwinden. Mit dieser Methode, eine fängt Serienbilder an verschiedenen Orten entlang der x- und y-Achsen und automatisch Stiche sie zusammen mit einer Freeware (zB Image Composite Editor). Bemerkenswerterweise kann dieses Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse der dendritischen Verzweigung nicht in einem weiten Bereich verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Modifizierte Golgi-cox-Färbelösung&nbsp;</td><td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>Geschäft bei 4&deg; C bis zur Verwendung</td></tr><tr><td>1x Entwicklungslösung (Lager 10x)</td><td>Weill Cornell Medical College</td><td>NA</td><td>Store at 4&deg; C bis zur Verwendung</td></tr><tr><td>30% Saccharose,</td> <td>Sigma</td><td>CAS # 57-50-1</td><td>frisch machen &nbsp; in ddH2O</td></tr><tr><td>0,3 % Gelatine</td><td>Sigma</td><td>CAS # 9000-70-8</td><td>NA</td></tr><tr><td>Graded Ethanol Solutions (20%, 30 %, 40 %, 50 %, 80 %, 90 %, 90 %, 90 %, 100 %)</td><td>Sigma</td><td>CAS 603-003-00-5</td><td>NA</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>CAS # 1330-20-7</td><td>NA</td></tr><tr><td>DPX Medium</td><td>EMS&nbsp;</td><td>#13510</td><td>NA</td></tr><tr><td>Superfrost (+) weiß</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 71869-10</td><td>NA</td></tr><tr><td>Deckglas 22x50mm (VWR #48393-059)</td><td>VWR&nbsp;</td><td>#4811-703</td><td>NA</td></tr><tr><td>DCX Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8066</td><td>4 C</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma</td><td>CAS-Nummer 91-95-2 &nbsp;</td><td>-20</td></tr> kg<tr><td>OCT</td><td>Tissue-tek</td><td>4583</td><td>NA</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>CAS-Nummer 77-86-1 &nbsp;</td><td>Na</td></tr><tr><td>ABC Lite</td><td>Vector</td><td>PK4000</td><td>NA</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Digitalkamera</td><td>Nikon</td><td>DS-Ri1</td><td></td></tr><tr><td>12 Bit Kamera&nbsp;</td><td>QImbsp&nbsp;</td><td>01 MBF2000RF-CLR-12</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida System</td><td>MBF Bioscience</td><td>V.10</td><td></td></tr><tr><td>Image Composite Editor</td><td>Microsoft</td><td>1.4.4.0</td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>F 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Image Pro Plus</td><td>Mediacy</td><td>Versin 7.00</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der dendritischen verzweigung im gyrus dentatus des hippocampus-region an der maus

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Dendritische Arborisation hat sich als zuverlässiger Marker für die Untersuchung der strukturellen und funktionellen Integrität von Neuronen erwiesen. In der Tat korreliert die Komplexität und das Ausmaß der dendritischen Arborisation gut mit der synaptischen Plastizität in diesen Zellen. Eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der dendritischen Arborisation ist erforderlich, um die schädlichen Auswirkungen neurologischer Erkrankungen auf diese Strukturen zu charakterisieren und die Auswirkungen therapeutischer Interventionen zu bestimmen. Die Quantifizierung dieser Strukturen hat sich jedoch angesichts ihrer komplexen und dynamischen Natur als eine gewaltige Aufgabe erwiesen. Glücklicherweise können ausgefeilte bildgebende Verfahren mit herkömmlichen Färbemethoden kombiniert werden, um den Zustand der dendritischen Arborisation zu beurteilen, was ein zuverlässigeres und schnelleres Mittel zur Beurteilung bietet. Im Folgenden finden Sie ein Beispiel dafür, wie diese bildgebenden Verfahren mit Färbemethoden kombiniert wurden, um die dendritische Arborisation bei Wildtyp-Mäusen zu charakterisieren. Diese komplementären bildgebenden Verfahren können zur qualitativen und quantitativen Beurteilung der dendritischen Arborisation verwendet werden, die sich über einen relativ großen Bereich innerhalb der Hippocampusregion erstrecken.

Das Ausmaß der Verzweigung, die aus vorhandenen und neu geboren dentatus Körnerzellen in Wildtyp-Mäusen entweder mit Golgi-Cox oder DCX-Färbung (Abbildung 1) analysiert. Dendritische Segmente DCX-positiven Zellen gefunden wurden 13-36 Micron lang. Die Normalverteilung der dendritischen Länge wurde mit Kolmogorov-Smirnov-Test geprüft (D = 0,1217, p &lt;0,01, Liliefors p &lt;0,001; Figuren 4 und 5). Bei der Analyse der Länge der Segmente pro B...

Wir beschreiben zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der dendritischen Arborisierung im Hippocampus von Mausmodellen: Echtzeit- und erweiterte Tiefenschärfebildgebung. Während die erste Methode eine ausgefeilte topographische Verfolgung und Quantifizierung des Ausmaßes der Verzweigung ermöglicht, ermöglicht die zweite eine schnelle Visualisierung des dendritischen Baumes.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das Ausmaß der dendritischen Verzweigung im Hippocampus eines Mausmodells zu untersuchen. Dies wird durch zwei verschiedene Methoden erreicht. Bei der ersten Methode werden die Dendriten in Echtzeit manuell über die gesamte Dicke jedes Schnitts hindurch verfolgt.Nach der Verfolgung kann der gesamte dendritische Baum rekonstruiert und analysiert werden. Mithilfe der Fächeregrammanalyse können verschiedene aus unterschiedlichen Mäusen gewonnene Fächeregramme als objektives Vergleichsmittel verwendet werden. Die zweite Methode besteht darin, die dendritische Verzweigung mittels Abbildung mit erweiterter Schärfentiefe zu visualisieren.Abschließend wird eine Panoramamethode verwendet, um mehrere hochauflösende Einzelbilder zu einem einzigen hochauflösenden Gesamtbild zusammenzufügen, das der qualitativen und quantitativen Beurteilung von Dendriten in der gesamten interessierenden Region dient. Diese Prozedur wird von GI mobi demonstriert. AMI-Forschungsabläufe aus meinem Labor. Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber bestehenden Methoden liegt in der einfachen Handhabung sowie der schnellen Datenaufnahme und -erfassung.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Neurobiologie beantworten, wie beispielsweise die Beurteilung der Dendritenbildung in betroffenen Hirnregionen und die Evaluierung der Wirkung verschiedener Therapien auf Dendriten. In diesem Verfahren wird das Gehirn der Maus einen Tag nach der Fixierung in 4% Paraformaldehyd für 48 Stunden bei vier Grad Celsius in einer Zuckerslösung zur Dehydrierung platziert. Entfernen Sie die Gehirne aus der Zuckerslösung und legen Sie sie direkt auf Kupferblöcke, die auf Trockeneis platziert sind.Füllen Sie den Block mit OCT und markieren Sie die Orientierung des Gehirns unter Verwendung des Riechkolbens als Orientierungspunkt. Schneiden Sie 70&nbsp;Mikrometer dicke Schnitte bei minus 20&nbsp;Grad Celsius mit einem Kryostaten und legen Sie sie in kryoprotektive Lösung; lagern Sie bei minus 20&nbsp;Grad Celsius bis zur Verwendung. Inkubieren Sie die Schnitte 30&nbsp;Minuten bei Raumtemperatur in Wasserstoffperoxid in Methanol, gefolgt von einer Erwärmung in TBS bei 37&nbsp;Grad Celsius für eine halbe Stunde.Die Schnitte vor der Färbung mit dem DCX-Antikörper am folgenden Tag 45 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,3 % Triton und normalem Pferdeserum inkubieren. Die Schnitte dreimal nacheinander in TBS waschen und zwei Stunden bei Raumtemperatur mit einem biotinylierten Pferdeantikörper inkubieren. Die Schnitte dreimal nacheinander jeweils zehn Minuten in TBS waschen und anschließend 1,5 Stunden mit B, C-Licht inkubieren.Bei Raumtemperatur Wasserstoffperoxid zur DAB-Lösung hinzufügen und die Schnitte sofort fünf Minuten lang in dieser Lösung inkubieren. Die Reaktion durch dreimaliges Waschen mit eiskaltem TBS beenden, gefolgt von einem weiteren Waschschritt. Waschen Sie in TTBS bei Raumtemperatur. Die Schnitte durch eine Reihe von Ethanol-Lösungen dehydrieren.Jeweils fünf Minuten in frischem und Xylol, danach mit DPX decken. Nachdem die Schnitte vollständig getrocknet sind, überschüssiges DPX auf den Objektträgern mit einer scharfen Klinge entfernen und sie nacheinander auf die Scanebene des Mikroskops setzen. Das Visualisierungssystem besteht aus einem Mikroskop, das mit einem Joystick für die Scanebene und einer 12-Bit-Farbkamera ausgestattet ist.Als Nächstes starten Sie das Neuro Lucita-Programm und öffnen eine neue Datendatei. Setzen Sie einen Referenzpunkt auf dem Bildschirm, indem Sie an einer beliebigen Stelle mit dem Mauszeiger klicken, um alle Symbole aus der Werkzeugleiste des Programmfensters zu aktivieren. Klicken Sie dann auf das Joystick-frei-Symbol in der Symbolleiste und verwenden Sie den Joystick, um den Gyrus dentatus des Hippocampus zu lokalisieren.Wählen Sie im ersten Abschnitt auf der Registerkarte „Tools“ des Programmfensters den Serienschnitt-Manager aus. Klicken Sie auf das Symbol „Neuer Abschnitt“ in der unteren linken Ecke des Fensters, um das Fenster zur Einrichtung von Serienschnitten zu öffnen. Danach wählen Sie das Fenster zur Einrichtung von Serienschnitten aus und geben die Gesamtanzahl der Abschnitte ein, die hippocampale Regionen enthalten.Wählen Sie dann das Auswertungsintervall aus und geben Sie die Dicke des Schnitts ein. Beginnen Sie mit der Konturierung der Gyrus-dentatus-Region, indem Sie auf das Symbol für die manuelle Konturzeichnung in der Symbolleiste klicken. Umreißen Sie anschließend die granuläre Zellschicht des Gyrus dentatus.Wählen Sie 100x aus dem Vergrößerungsmenü. Geben Sie dann einen Tropfen Immersionsöl auf den Schnitt und wechseln Sie das Objektiv auf 100x. Suchen Sie unter diesem Objektiv die Granulazellkörper und -dendriten des Gyrus dentatus.Als Nächstes fokussieren Sie sich auf ein ausgewähltes Neuron und klicken Sie auf das Neuronen-Rekonstruktions-Symbol. Verfolgen Sie auf der Werkzeugleiste den Umfang des Zellkörpers der dentaten Granulazelle. Wenn die Kontur vollständig nachgezeichnet ist, klicken Sie mit der rechten Maustaste, um die Zellkörper-Rekonstruktion abzuschließen.Verfolgen Sie nun die Dendriten manuell in X-, Y- und Z-Richtung und nutzen Sie dazu Joystick und Z-Motorknopf, um jedem Ast zu folgen. An einem Bifurkations- oder Trifurkationsknoten wählen Sie die entsprechende Option aus. Verfolgen Sie aus dem Dropdown-Menü heraus jeden der aus diesen Knoten hervorgehenden Äste bis zum Ende jedes Astes. Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie im Dropdown-Menü „Ende“ aus.Verwenden Sie die Pfeiltastensymbole im Softwarefenster. Wählen Sie zufällig eine weitere Dendritengranuszelle aus und wiederholen Sie den Abbildungsprozess, wie gerade gezeigt. Speichern Sie die gesamte Abbildung.Starten Sie nun Neuro Lucita Explorer zur Neuronenanalyse. Öffnen Sie die erste NRX-Datei des ersten Mäuses der Versuchsgruppe. Fügen Sie die NRX-Datei des zweiten Mäuses der Versuchsgruppe an und fahren Sie fort, bis alle NRX-Dateien dieser Gruppe angehängt sind.Wählen Sie unter der Registerkarte Analyse den Lüfter im Diagramm aus, um das Analysefenster für den Lüfter zu öffnen, aktivieren Sie Dendriten mit einem Häkchen und klicken Sie auf Anzeigen, um die Verbindungen und Verzweigungsmuster der Dendriten für diese Mausgruppe darzustellen. Schließen Sie in diesem Verfahren das Mikroskop an eine digitale Kamera an. Legen Sie einen Schnitt auf die mit dem Mikroskop verbundene Scanning-Bühne und wechseln Sie zu einer 10x-Objektivlinse.Bewegen Sie als Nächstes den Objekttisch in den Bereich von Interesse. Starten Sie ein Programm zur Videoaufnahme und drücken Sie die Aufnahmetaste. Sobald die Aufnahmetaste gedrückt wurde, verwenden Sie den Grob-Fokus-Regler, um sich innerhalb von insgesamt vier Sekunden vom oberen zum unteren Rand des Schnitts zu bewegen. Bevor Sie die resultierende Videodatei speichern, verwenden Sie nun die kostenlose Software Image J, um die VI-Videodateien in ein unkomprimiertes Format umzuwandeln.Starten Sie ein Bildanalyseprogramm und öffnen Sie die VI-Datei. Gehen Sie zum Menü „Prozess“ und klicken Sie auf „Erweiterte Tiefenschärfe“. Wählen Sie die entsprechende Videodatei in den Ausgabeoptionen aus.Wählen Sie in den Fokus-Analyseoptionen „zusammengesetztes Bild mit bestem Fokus generieren“ aus. Aktivieren Sie die Optionen „normalisierte Beleuchtung“ und „maximaler lokaler Kontrast“. Klicken Sie anschließend auf „Erstellen“, um ein resultierendes Bild zu erzeugen, das alle fokussierten Pixel entlang der Z-Achse darstellt.Anschließend speichern Sie das resultierende Bild. In diesem Schritt bringen Sie einen Abschnitt auf der mit dem Mikroskop verbundenen Scanning-Bühne an. Bewegen Sie die Bühne in den Bereich von Interesse.Starten Sie dann das Bildaufnahmeprogramm mit einem 10x-Objektiv, nehmen Sie hochauflösende Bilder des interessierenden Bereichs auf und speichern Sie diese, wobei sichergestellt werden muss, dass die Bilder mindestens 10 % Überlappung aufweisen. Führen Sie danach den Bildkomposit-Editor aus, um die Bilder zusammenzufügen. Gehen Sie zum Dateimenü und klicken Sie auf „Neue Panoramaansicht“.Wählen Sie den Ordner aus, in dem die Bilder gespeichert sind. Wählen Sie anschließend die Bilder aus, die zum selben Bereich gehören, und klicken Sie auf „Okay“. Drücken Sie die Schaltfläche „Exportieren auf Datenträger“ und speichern Sie das Bild.Dieses Bild stellt eine extrem hochauflösende Aufnahme des interessierenden Bereichs dar, die für die Analyse verwendet werden könnte. Diese Abbildung zeigt die Visualisierung der dendritischen Verzweigung mit und ohne EDFI-Methoden. Die herkömmliche Methode zur Bestimmung der optimalen Fokusebene wurde mit EDFI verglichen und ergab signifikant höhere Werte der dendritischen Fläche.Mithilfe der EDFI-Methode wurden gefunden. Die Quantifizierung der Länge und des Volumens, das von Dendriten in verschiedenen Verzweigungsordnungen eingenommen wird, ist hier dargestellt. Die maximale Länge und das maximale Volumen wurden in der ersten Ordnung erreicht.Hier ist ein Histogramm der dendritischen Länge von Dentatgranulazellen. Der Großteil der dendritischen Segmente von DCX-gefärbten DDRs war 13 bis 26 lang. Diese rote gestrichelte Linie zeigt die Normalverteilung der hier dargestellten Daten nach Durchführung dieses Verfahrens.Andere klassische Methoden wie Neuro Lucid könnten verwendet werden, um zusätzliche Fragen bezüglich des Volumens und der Fläche, die von Dendriten eingenommen werden, zu beantworten. Diese hier gezeigte Technik wird Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie enorm helfen, nicht nur die Ausdehnung neuronaler Strukturen zu beurteilen, sondern auch nicht-neuronale kleine Strukturen wie Mikroglia in dicken Gehirnschnitten zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das Ausmaß neuronaler Projektionen in relativ kurzer Zeit beurteilen kann.

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Ein Dissektionstechnik zur Entfernung des Gyrus dentatus aus adulten Maus unter einem Stereomikroskop wurde in diesem Video aufgezeichnet Protokoll demonstriert.

Dissection der hippocampalen von erwachsenen Maus

Wir beschreiben ein Immunhistochemie Protokoll, um das Profil Hippocampus-Neuronen Aktivierung nach Exposition gegenüber einer räumlichen Lernaufgabe in einem Maus-Modell gekennzeichnet durch kognitive Defizite der Neuroentwicklungs Ursprung zu studieren. Dieses Protokoll kann sowohl genetische oder pharmakologische Mausmodellen, gekennzeichnet durch kognitive Defizite angewendet werden.

Immunhistochemische Visualisierung von Hippocampus-Aktivität nach Spatial Learning in einem Mausmodell für neurologische Entwicklungsstörungen

Hier stellen wir ein Golgi-Cox-Protokoll ausführlich vor. Diese zuverlässige Gewebe-Fleck-Methode ermöglicht eine qualitativ hochwertige Beurteilung der Cytoarchitektur im Hippocampus und im gesamten Gehirn mit minimaler Fehlersuche.

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Ein Protokoll für die präzise Identifizierung und Analyse von Synapsen im Hippokampus Scheiben mit Immunfluoreszenz ist in diesem Artikel beschrieben.

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

Dieses Protokoll zeigt, wie eine zuverlässige HFS-Methode bei Mäusen einrichten. Neuronen in der hippocampal dentate Gyrus werden durch HFS direkt und indirekt in Vivoelektrisch stimuliert. Neuronale Aktivität und molekulare Signale werden vom c-fos und Notch1 immunofluorescent Färbung, geprüft; Neurogenese wird durch Bromodeoxyuridine Assay Kennzeichnung quantifiziert.

Eine Invasive Methode zur Aktivierung der Maus Dentate Gyrus durch hochfrequente Stimulation

Diese Methode beschreibt eine chronische Zubereitung, die den optischen Zugang zum Hippocampus lebender Mäuse ermöglicht. Dieses Präparat kann verwendet werden, um längsinale optische Bildgebung der neuronalen strukturellen Plastizität und aktivitätsbeschworenen zellulären Plastizität über einen Zeitraum von mehreren Wochen durchzuführen.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Dies ist ein Protokoll zur akuten Scheibenpräparation von erwachsenen und alternden Maus Hippocampi, die Vorteile der transkardialen Perfusion und Schneiden schneiden mit eiskalten NMDG-aCSF nutzt, um hypoxische Schäden am Gewebe zu reduzieren. Die resultierenden Scheiben bleiben über viele Stunden gesund und eignen sich für Langzeit-Patch-Clamp- und Field-Recordings.

Minimierung der Hypoxie in Hippocampal Scheiben von erwachsenen und alternden Mäusen

Wir stellen ein Protokoll zur Vorbereitung von Akutscheiben aus dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus von Mäusen vor. Wir vergleichen dieses transversale Präparat mit koronalen Schnitten in Bezug auf die Qualität der Aufnahmen und die Erhaltung morphologischer Merkmale aufgezeichneter Neuronen.

Vorbereitung von akuten Scheiben aus dem Dorsal Hippocampus für die Ganzzellaufnahme und neuronale Rekonstruktion im Dentate Gyrus von erwachsenen Mäusen

Das Protokoll beschreibt eine Modifikation der schnellen Golgi-Methode, die an jeden Teil des Nervensystems angepasst werden kann, zur Färbung von Neuronen im Hippocampus und im medialen präfrontalen Kortex der Ratte.

Schneller Golgi-Fleck für die Visualisierung der dendritischen Wirbelsäule im Hippocampus und im präfrontalen Kortex

Der Gyrus dentatus des Hippocampus erfüllt wesentliche und unterschiedliche Funktionen beim Lernen und Gedächtnis. Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe robuster und effizienter Verfahren für die in vivo Calciumbildgebung von Körnerzellen im Gyrus dentatus bei frei beweglichen Mäusen.

In vivo Calcium-Bildgebung von Körnerzellen im Gyrus dentatus des Hippocampus bei Mäusen 

Lernen Sie zwei Methoden zur Bewertung dendritischer Verzweigung im Hippocampus der Maus: Echtzeit-Tracing und Extended Depth of Field Imaging. Diese Techniken ermöglichen detaillierte neuronale Analysen.

Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

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