Bewertung der dendritischen Verzweigung im Gyrus dentatus des Hippocampus-Region an der Maus

Wir beschreiben zwei Methoden zur Visualisierung und Quantifizierung der dendritischen Arborisierung im Hippocampus von Mausmodellen: Echtzeit- und erweiterte Tiefenschärfebildgebung. Während die erste Methode eine ausgefeilte topographische Verfolgung und Quantifizierung des Ausmaßes der Verzweigung ermöglicht, ermöglicht die zweite eine schnelle Visualisierung des dendritischen Baumes.

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, das Ausmaß der dendritischen Arborisation im Hippocampus eines Mausmodells zu untersuchen. Dies wird durch zwei verschiedene Methoden erreicht. Bei der ersten Methode werden die Dendriten manuell in Echtzeit über die gesamte Dicke jedes Abschnitts verfolgt.

Nach der Rückverfolgung kann der gesamte dendritische Baum rekonstruiert und analysiert werden. Mit Hilfe des Fächerdiagramms kann die Analyse verschiedener Fächerdiagramme, die von verschiedenen Mäusen abgeleitet wurden, als objektives Vergleichsmittel verwendet werden. Die zweite Methode besteht darin, die dendritische Arborisation mit erweiterter Tiefenschärfe-Bildgebung zu visualisieren.

Schließlich wird eine Panoramamethode verwendet, um mehrere Bilder mit hoher Vergrößerung zusammenzufügen, um ein hochauflösendes Kompositbild für die qualitative und quantitative Beurteilung von Dendriten in der gesamten interessierenden Region zu erhalten. Die AMI-Forschung fließt aus meinem Labor. Der Hauptvorteil dieser Techniken gegenüber bestehenden Metallen ist die Benutzerfreundlichkeit und die Geschwindigkeit der Erfassung und Datenerfassung.

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurobiologie zu beantworten, wie z.B. die Beurteilung der dendritischen Isierung in betroffenen Hirnregionen und die Bewertung der Auswirkungen verschiedener Therapien auf Dendriten. Bei diesem Verfahren legen Sie das Mäusegehirn einen Tag, nachdem es in 4%igem Paraformaldehyd fixiert wurde, für 48 Stunden bei vier Grad Celsius in Saccharoselösung zur Dehydratisierung. Entfernen Sie die Gehirne von der Saccharose und legen Sie sie direkt auf Kupferblöcke, die auf Trockeneis gelegt werden.

Füllen Sie den Block mit OCT und markieren Sie die Ausrichtung des Gehirns mit dem Riechkolben als Orientierungspunkt. Schneiden Sie 70 Mikrometer dicke Abschnitte bei minus 20 Grad Celsius mit einem Kryostaten und legen Sie sie in Kryoprotektivlösung und bewahren Sie sie bis zur Verwendung bei minus 20 Grad Celsius auf. Inkubieren Sie die Abschnitte 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in Wasserstoffperoxid in Methanol und erwärmen Sie sie anschließend eine halbe Stunde lang in TBS auf 37 Grad Celsius.

Inkubieren Sie die Schnitte mit 0,3 % Triton und normalem Pferdeserum für 45 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie am nächsten Tag mit dem DCX-Antikörper färben. Waschen Sie die Schnitte dreimal hintereinander in TBS und inkubieren Sie die Schnitte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur mit einem biotinylierten Pferdeantigo. Waschen Sie die Abschnitte dreimal hintereinander jeweils 10 Minuten lang in TBS und inkubieren Sie sie 1,5 Stunden lang mit einer B- und C-Lampe.

Bei Raumtemperatur wird der DAB-Lösung Wasserstoffperoxid zugesetzt und die Schnitte sofort fünf Minuten lang in dieser Lösung inkubiert und die Reaktion beendet, indem sie dreimal mit eiskaltem TBS gewaschen werden, gefolgt von einem. In TT BS bei Raumtemperatur waschen. Entwässern Sie die Abschnitte mit einer Reihe von Ethanollösungen.

Jeweils fünf Minuten, klar und Xylol und dann Deckglas mit DPX. Nachdem die Schnitte vollständig getrocknet sind, reinigen Sie überschüssiges DPX mit einer scharfen Klinge auf den Objektträgeroberflächen und legen Sie sie nacheinander auf den Scantisch des Mikroskops. Das Visualisierungssystem besteht aus einem Mikroskop, das mit einem Scanning-Tisch-Joystick und einer 12-Bit-Farbkamera ausgestattet ist.

Starten Sie als Nächstes das Programm neuro lucita und öffnen Sie eine neue Datendatei. Platzieren Sie einen Referenzpunkt auf dem Bildschirm, indem Sie mit dem Mauszeiger auf eine beliebige Stelle klicken, um alle Symbole aus dem Toolpanel des Programmfensters zu aktivieren. Klicken Sie dann auf das Joystick-Frei-Symbol in der Symbolleiste und verwenden Sie den Joystick, um den Gyrus dentatus des Hippocampus zu lokalisieren.

Wählen Sie im ersten Abschnitt auf der Registerkarte "Werkzeuge" des Programmfensters die Option "Serial Section Manager" aus. Klicken Sie auf das Symbol für einen neuen Abschnitt in der unteren linken Ecke des Fensters, um das Setup-Fenster für den Serienbereich zu öffnen. Wählen Sie anschließend das Setup-Fenster für serielle Abschnitte aus und geben Sie die Gesamtzahl der Abschnitte ein, die Hippocampusregionen enthalten.

Wählen Sie dann das Auswertungsintervall aus und geben Sie die Dicke des Schnitts ein. Beginnen Sie mit der Nachzeichnung der Gyrus dentatus, indem Sie auf das Symbol für die Freihand-Konturzeichnung in der Symbolleiste klicken. Umreißen Sie anschließend die gezähnte körnige Zellschicht.

Wählen Sie 100 x aus dem Vergrößerungsmenü. Geben Sie dann einen Tropfen Immersionsöl auf die Sektion und schalten Sie das Objektiv auf 100 x. Lokalisieren Sie die gezähnten Körnerzellkörper und Dendriten unter diesem Ziel.

Konzentrieren Sie sich als Nächstes auf ein ausgewähltes Neuron und klicken Sie auf das Symbol für die Neuronenverfolgung. Zeichnen Sie in der Symbolleiste den Umfang des gezähnten Körnerzellkörpers nach. Wenn Sie mit der Nachzeichnung fertig sind, klicken Sie mit der rechten Maustaste, um Zellenkörper fertigstellen auszuwählen.

Beginnen Sie nun, die Dendriten manuell und in X-, Y- und Z-Richtung zu verfolgen, und folgen Sie jedem Zweig mit dem Joystick und dem Z-Motorknopf. Wählen Sie an einem Bifurkations- oder Trifurkationsknoten die entsprechende Option aus. Verfolgen Sie im Dropdown-Menü jeden der Verzweigungen, die sich aus diesen Knoten am Ende jedes Zweigs ergeben. Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Ende aus dem Dropdown-Menü.

Verwenden Sie die Pfeiltastensymbole im Softwarefenster. Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip eine andere gezähnte Körnerzelle aus und wiederholen Sie das Tracing-Verfahren wie gerade gezeigt. Speichern Sie die gesamte Ablaufverfolgung.

Starten Sie nun den neuro lucita explorer für die Neuronenanalyse. Öffnen Sie die erste NRX-Datendatei mit der ersten Maus der experimentellen Gruppe. Hängen Sie die NRX-Datei der zweiten Maus der experimentellen Gruppe an und fahren Sie fort, bis alle NRX-Dateien aus dieser Gruppe angehängt sind.

Wählen Sie auf der Registerkarte Analyse die Option Fächer im Diagramm aus, um das Fenster Fächer in der Analyse zu öffnen, aktivieren Sie Dendriten und klicken Sie auf Anzeige, um die Verknüpfungen und Verzweigungsmuster der Dendriten für diese Gruppe von Mäusen anzuzeigen. Schließen Sie bei diesem Vorgang das Mikroskop an eine Digitalkamera an. Platzieren Sie einen Schnitt auf dem Scantisch, der mit dem Mikroskop verbunden ist, und wechseln Sie zu einem 10-fach-Objektiv.

Verschieben Sie als Nächstes die Bühne in den Interessenbereich. Starten Sie ein Videoaufnahmeprogramm und drücken Sie die Aufnahmetaste. Sobald die Aufnahmetaste gedrückt wird, verwenden Sie den Makrofokus-Knopf, um insgesamt vier Sekunden lang vom oberen zum unteren Rand des Abschnitts zu wechseln. Bevor Sie die resultierende Videodatei speichern, verwenden Sie nun die Freeware Image J, um die Videodateien in ein unkomprimiertes Format zu konvertieren.

Starten Sie ein Bildanalyseprogramm und öffnen Sie die VI-Datei. Gehen Sie zum Prozessmenü und klicken Sie auf erweiterte Schärfentiefe. Wählen Sie in den Ausgabeoptionen die entsprechende Videodatei aus.

Wählen Sie in den Optionen für die Fokusanalyse die Option Zusammengesetztes Bild mit bestem Fokus generieren aus. Wählen Sie die Optionen für normalisierte Beleuchtung und maximalen lokalen Kontrast aus. Klicken Sie dann auf Erstellen, um ein resultierendes Bild zu generieren, das alle fokussierten Pixel auf der gesamten Z-Achse darstellt.

Speichern Sie anschließend das resultierende Bild. Platzieren Sie in diesem Schritt einen Schnitt auf dem Scantisch, der mit dem Mikroskop verbunden ist. Verschieben Sie die Bühne in den Interessenbereich.

Starten Sie dann das Bildaufnahmeprogramm mit einem 10-fach-Objektiv, erfassen und speichern Sie hochauflösende Bilder aus dem interessierenden Bereich, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Bilder mindestens 10 % überlappen. Führen Sie dann den Bildkompositionseditor aus, um die Bilder anschließend zusammenzufügen. Gehen Sie zum Dateimenü und klicken Sie auf Neues Panorama.

Wählen Sie den Ordner aus, in dem die Bilder gespeichert sind. Wählen Sie als Nächstes die Bilder aus, die zur gleichen Region gehören, und drücken Sie OK. Drücken Sie die Schaltfläche Auf Disc exportieren und speichern Sie das Bild.

Dieses Bild stellt ein extrem hochauflösendes Bild des interessierenden Bereichs dar, das für die Analyse verwendet werden könnte. Diese Abbildung zeigt die Visualisierung der dendritischen Arborisation mit und ohne EDFI-Methoden. Die traditionelle Methode, die beste Fokusebene zu finden, wurde mit EDFI und signifikant höheren Werten der dendritischen Fläche verglichen.

Unter Verwendung der EDFI-Methode wurden gefunden. Die Quantifizierung der Länge und des Volumens, das von Dendriten in verschiedenen Verzweigungsordnungen eingenommen wird, wird hier gezeigt. Die maximale Länge und das maximale Volumen wurden in der Bestellung eins erreicht.

Hier ist ein Histogramm der dendritischen Länge von gezähnten Körnerzellen. Die Mehrzahl der dendritischen Segmente von DCX-Flecken-DDRs war 13 bis 26 lang. Diese rot gestrichelte Linie zeigt die Normalverteilung der Daten, die nach diesem Verfahren dargestellt werden.

Andere klassische Methoden wie Neuro Lucid könnten verwendet werden, um zusätzliche Fragen bezüglich des Volumens und der von Dendriten eingenommenen Fläche zu beantworten. Diese Technik, die wir Ihnen hier gezeigt haben, wird Forschern auf dem Gebiet der Neurobiologie enorm helfen, nicht nur die Ation neuronaler Strukturen zu beurteilen, sondern auch nicht-neuronale kleine Strukturen wie Mikroglia in dicken Hirnschnitten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Ausmaß neuronaler Projektionen in relativ kurzer Zeit beurteilen können.