Name: Nicht-invasive Beurteilung der Wirksamkeit neuer Therapeutika für Darmpathologien Verwenden der seriellen endoskopische Bildgebung von lebenden Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Erfahren Sie die nicht-invasive endoskopische Überwachung therapeutischer Wirksamkeit bei Kolitis und Darmkrebs in lebenden Mäusen. Diese Methode ermöglicht die präzise Bewertung von Behandlungseffekten im Zeitverlauf.

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Wir möchten uns bei CSL Ltd. für die Unterstützung beim Kauf der Endoskopiegeräte bedanken. Die Forschung im Labor von ME wird vom Ludwig Institute for Cancer Research unterstützt, und die Laboratorien von TP und ME werden von der Victorian State Government Operational Infrastructure Support und dem National Health and Medical Research Council of Australia unterstützt. ME ist NHMRC Senior Research Fellow.

Die Walter und Eliza Hall-Institut für medizinische Forschung Tierethikkommission genehmigt jeder der in diesen Protokollen beschriebenen Verfahren. 1. Vorbereitung der experimentellen Mäuse <ol><li> Verfassen experimentellen Kohorten von mindestens 4 Geschlecht abgestimmt 6-8 Wochen alte C57BL / 6 Mäuse (M. musculus), die gezüchtet und in der gleichen spezifischen pathogenfreien (SPF) Tierhaltung / Zimmer untergebracht sind und mit autoklaviertem Nahrung und Wasser versorgt. Die Verwendung von weiblichen Mäusen wird co-Gehäuse von Mäusen aus verschiedenen Linien, Grenz Box-Nummern zu ermöglichen und zu reduzieren Käfig zu Käfig Variation. </li><li> Stellen Sie sicher, dass Mäuse, sind mindestens 6 Wochen alt sein, um die Endoskopie zur Verwendung des 3,0 mm Durchmesser Endoskopie Mantel zu ermöglichen. </li><li> Verwenden Sie Mäusen des gleichen genetischen Hintergrund und, wo möglich, aus den Käfigen auf dem gleichen Rack Variationen mit der Darmflora zu reduzieren gespeichert. Variationen in Mikroflora zwischen Tieranlagen sollte in Betracht whe genommen werdenn Bestimmung der geeigneten Kontrollmäusen und Genotypen für jedes Experiment 22. </li><li> Mark Mäusen durch Ohr / toe Ausschnitte, Tattoos, oder ähnlich wie für eine einfache Identifizierung ermöglichen. </li><li> Wiegen Mäusen am Tag 0, zum Ausgangs experimentellen Gewichte bestimmen. </li><li> Führen Endoskopie (siehe Abschnitt 5) von Mäusen am Tag 0 zum Ausgangswert Kolon Phänotypen aufzuzeichnen. </li></ol> 2. Präklinische Studie in einer Epithelschädigung und akute Colitis Modell <ol><li> Es wird eine Lösung des therapeutischen Mittels zu testen. Für Therapeutika durch orale Gabe (po) geliefert werden, werden die Lösungen auf ein Maximalvolumen von 100 ul. Für Therapeutika durch intraperitoneale (ip) Injektion verabreicht, werden die Lösungen zu einem maximalen Volumen von 200 ul. HINWEIS: Wiederholter ip oder po Verabreichung des Arzneimittels über längere Zeit kann zu veränderten Mausverhalten führen. Wechselt die IP-Injektionsstelle auf längere Beschwerden zu vermeiden. Für po Applikation bieten die Mäuse mit autoLlaved Sonnenblumenkerne als &quot;behandeln&quot; die negativen Zusammenhang mit der Magensonde Verfahren zu minimieren. </li><li> Am Tag 1 verwalten die therapeutische von Interesse (in Schritt 2.1 vorbereitet) und eine geeignete Fahrzeugsteuerungen. In dem Beispiel vorgesehen (6A), 5 ug des rekombinanten humanen (rh) iInterleukin (IL) -11-Protein wurde in 200 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und ip </li><li> Bestimmen Sie den Zeitpunkt und die Häufigkeit der Verwaltungen, die in Abhängigkeit von der pharmakokinetischen Profils des therapeutischen Reagenz, das getestet wird aufgebaut sein wird. Abbildung 1 entnommen prophylaktische Behandlung mit zweimal täglich ip Injektionen im Laufe des Experiments. </li><li> Überwachen Sie, einschließlich Stuhlkonsistenz und das Vorhandensein von Blut, und wiegen jede Maus täglich. An den Tagen nach der Behandlung mit einem Gewicht sollte mit der Verabreichung des therapeutischen Arzneimittels übereinstimmen, um Stress für die Mäuse durch wiederholte Handhabung zu minimieren. </li&gt; <li> An Tag 3 wurden vorbereitet 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS-Lösung im Trinkwasser routinemßig den Mäusen durch die Tiereinrichtung vorgesehen. Etwa 5 ml / Maus / Tag von DSS-Lösung wird für das Experiment erforderlich ist. Der Verbrauch des DSS Wasser kann sich ändern, wenn die Umgebungstemperatur der Tieranlage schwankt. HINWEIS: DSS ist ein Reizmittel und sollten gemäß dem MSDS Anweisungen behandelt werden. </li><li> Für Frisch DSS an die Mäuse ad libitum in Reinwasserflaschen für 5 aufeinander folgenden Tagen. Am Abend des 5. Tag bieten normales Trinkwasser neben püriert Futterpellets und Proteinergänzung in kleinen Petrischalen (100 g Futterpellets / 10 g Protein-Shake / 10 ml Wasser) zur Verfügung gestellt. Dies verhindert das Austrocknen und hilft bei der Minimierung der schweren Gewichtsverlust. </li><li> Euthanize Mäuse durch CO 2 Rausch und sammelt Gewebe die anschließende histologische Untersuchung am Morgen des Tages 8, oder wenn die Mäuse auftreten ≥15% Gewichtsverlust von mehr als drei Consecutive Tage, je nachdem, was zuerst eintritt. HINWEIS: Stellen Sie die DSS-Dosis zwischen 1-4% (w / v) in Abhängigkeit von der Mikroflora der Tierhaltung und der Charge des DSS. Führen Sie Routinechargenprüfung, um die geeignete Dosierung und DSS umgehen Charge zu Charge Schwankungen zu etablieren. Die geeignete Dosierung hängt von Gewichtsverlust (von nicht mehr als 15% des ursprünglichen Gewichts) bezogen und bestätigt ulcerosa Histopathologie. </li></ol> 3. Präklinische Testversion in eine chronische Kolitis oder Colitis-assoziierten Cancer <ol><li> Für die chronische Kolitis Modell beginnen mit Schritt 3.7. </li><li> Für die Colitis-assoziierten Krebs (CAC) Modell, an Tag 1, injizieren jede Maus mit 10 mg / kg (w / w) Azoxymethan (AOM, 250 ul, ip). HINWEIS: AOM ist krebserregend und sollten gemäß dem MSDS Anweisungen behandelt werden. </li><li> Stammlösungen von AOM als 10 mg / ml-Aliquoten hergestellt und bei -20ºC gelagert. Am Tag der Injektion wird die AOM-Stammlösung aufgetaut und auf 1 mg / m verdünntenl in PBS. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen des AOM Stammlösung sollte vermieden werden. </li><li> Der AOM Dosis von 8-12 mg / kg eingestellt werden. Routine Chargenprüfung ist erforderlich, um die geeignete Dosierung AOM, um die Toxizität für Mäuse aufgrund von Charge zu Charge Variation umgehen herzustellen. </li><li> Während der Tage 1-7 folgende AOM Verwaltung Gewichte stabil sein wird und aus diesem Grund Gewichtsüberwachung kann bei Tage 1-7 weggelassen werden, um mit den Tieren, die zytotoxische Metabolite in ihrem Kot ausscheiden wird vermieden. </li><li> Am 7. Tag alle Betten geändert werden muss nach einer zytotoxischen Verfahren. Sobald der Betten Änderung abgeschlossen ist, werden die Tiere nicht mehr benötigen zytotoxische Behandlungsprozeduren, da sie nicht mehr sein Ausscheiden zytotoxische Metaboliten. </li><li> Am 8. Tag, bereiten 2,5% (2,5 g / 100 ml) DSS-Lösung (wie in Schritt 2.5 beschrieben) und bieten den Mäusen ad libitum. </li><li> Wiegen Mäuse täglich während des gesamten Experiments und auf Zeichen von Krankheit, einschließlich gekräuselten fur, gebeugt, Blut im Stuhl und reduzierte Bewegung. </li><li> Am Tag 13, nehmen Sie die DSS-Lösung und stellen die Mäuse mit normalem Trinkwasser bis Tag 28. Tage 8-28 bilden eine &quot;Zyklus&quot; der chronische Kolitis / CAC-Protokoll. </li><li> An den Tagen 13 bis 28, wenn die Mäuse normales Trinkwasser gegeben, stellen die Mäuse mit gestampften Futterpellets und eine Proteinergänzung in kleinen Petrischalen (100 g Futterpellets / 10 g Protein-Shake / 10 ml Wasser) zur Verfügung gestellt. Dies verhindert das Austrocknen und hilft bei der Minimierung der schweren Gewichtsverlust. HINWEIS: Die Proteinergänzungen in Maische nicht zur Verfügung gestellt werden, wenn die Mäuse erhalten DSS haltigen Trinkwasser, um die Konsistenz in DSS Verbrauch zu gewährleisten. </li><li> An Tag 20 führen die zweite endoskopische Untersuchung, einzelne Maus Gesundheit zu überwachen (siehe Abschnitt 5). </li><li> An Tag 29 Wiederholung der DSS-Zyklus (Zyklus 2: 2,5% (w / v) DSS während der Tage 29 bis 33 und normales Trinkwasser während der Tage 34 bis 50 zur Verfügung gestellt). </li><li> An Tag 40 führen die third endoskopische Untersuchung, einzelne Maus Gesundheit zu überwachen und festzustellen, Tumorlast (siehe Abschnitt 5). </li><li> Wenn keine Tumore sichtbar sind durch Endoskopie an Tag 40, beginnt eine dritte DSS Zyklus an den Tagen 50-72 (Zyklus 3: 2,5% (w / v) DSS während der Tage 50-55 und normales Trinkwasser während der Tage 56-72 gestellt). Im Allgemeinen sind Tumoren bis zum Tag 40 sichtbar und daher in den dritten Zyklus DSS kann entfallen. </li><li> Sobald Tumoren werden durch endoskopische Untersuchung sichtbar, weisen Sie jeder Maus eine endoskopische Tumor Score (siehe Abschnitt 5) und weisen Sie einzelnen Mäusen zu Kohorten mit ähnlichen Ausgangstumorbelastungen. </li><li> An Tag 42 (oder bei Tumoren sind sichtbar), die Verwaltung der therapeutischen Verbindung oder relevante Fahrzeugsteuerung (siehe Abschnitt 2.2). Das Timing der Dosierung wird abhängig von der Pharmakokinetik der therapeutisch. Ein Beispiel für einen Eingriff Behandlung ip injiziert dreimal wöchentlich in Mäusen mit etablierten Tumoren vorgesehen ist (Figur 2). </li><li> Führen Sie endoscopic Prüfungen einmal wöchentlich über die Dauer der therapeutischen Behandlung zu überwachen Tumorlast. Im Allgemeinen ist von 4 Wochen nach einer therapeutischen Behandlung ausreichend, um ein objektives Ansprechen auf die Behandlung zu beobachten. Nach Beendigung der Behandlung wird eine Gruppe von Mäusen kann auch durch Endoskopie zur Tumorrückfall beobachtet werden. </li><li> Euthanize Mäuse durch CO 2 Rausch und sammeln Gewebe für biochemische und / oder histologische Analyse am Morgen des Tag 72 oder, wenn Mäuse erleben ≥15% Gewichtsverlust von mehr als drei aufeinander folgenden Tagen, je nachdem, was zuerst eintritt. </li></ol> 4. Präklinische Testversion in eine sporadische Darmkrebs-Modell <ol><li> Am Tag 1 injizieren jede Maus ip mit 10 mg / kg AOM (siehe Schritt 3.2). Der AOM Dosis von 8-12 mg / kg eingestellt werden. Routine Chargenprüfung ist erforderlich, um die geeignete Dosierung AOM, um die Toxizität für Mäuse aufgrund von Charge zu Charge Variation umgehen herzustellen. </li><li> Ist die Einspritzung am ersten Tag jeder Wochefür die folgenden 5 Wochen (Abbildung 3). Die Mäuse sollten entsprechend zytotoxischen Sicherheitsverfahren für den gesamten 6 Wochen behandelt. </li><li> Wiegen Sie jede Maus am Tag der AOM Injektion, dass Ängste auf die Mäuse durch wiederholte Handhabung zu minimieren. HINWEIS: AOM ist krebserregend und sollten gemäß dem MSDS Anweisungen behandelt werden. </li><li> Alle Tiere sollten nach zytotoxischen Sicherheitsverfahren für die 6 Wochen AOM ip Injektionen für dieses Protokoll erforderlich behandelt werden. </li><li> Während der Woche 8 endoskopische Untersuchung für neue Tumoren (siehe Abschnitt 5) zu überwachen. Die endoskopische Untersuchung durchgeführt werden sollte alle zwei Wochen, bis Tumore sichtbar werden. Im Allgemeinen beginnen Wildtyp C57BL / 6 Tieren Tumore um ca. 40 Wochen nach der ersten Verabreichung von AOM zu entwickeln. </li><li> Sobald Tumoren werden durch endoskopische Untersuchung sichtbar, eine endoskopische Tumor Punktzahl weisen Sie jeder Maus (siehe Abschnitt 5) und weisen Sie einzelnen Mäusen zu einer Kohorte mit ähnlichen<html> Tumorbelastung vor dem Beginn der therapeutischen Behandlung. </li><li> Während der Woche 40 (oder bei Tumoren sind erste sichtbare), zur Verwaltung der therapeutischen Verbindung oder die entsprechende Fahrzeugsteuerung. </li><li> Das Timing der Dosierung wird abhängig von der Pharmakokinetik der therapeutisch sein (siehe Schritt 2.1). Ein Beispiel für einen Eingriff Behandlung ip injiziert 3mal wöchentlich in Mäusen mit etablierten Tumoren vorgesehen ist (Figur 3). </li><li> Endoskopische Untersuchung wöchentlich für die Dauer der therapeutischen Behandlung Perioden Tumorbelastung zu überwachen. Im Allgemeinen ist von 4 Wochen nach einer therapeutischen Behandlung ausreichend für eine objektive Ansprechen auf die Behandlung. Nach Absetzen der Behandlung, eine Gruppe von Mäusen können auch durch Endoskopie zur Tumorrückfall überwacht werden. </li><li> Euthanize Mäuse durch CO 2 Rausch und sammeln Gewebe für biochemische und / oder histologische Analyse des Dickdarms und Tumore in Woche 45, oder nach 4 Wochen der Therapie. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 5. Endoskopische Untersuchungen <ol><li> Die Endoskopiegeräte sollten nach Standardverfahren 16 zusammengebaut werden. </li><li> Sterilisieren und Reinigen der Endoskopsonde mit 70% Ethanol oder einem antibakteriellen Gleitmittel. </li><li> Videos können mit einem Laptop oder Desktop-Computer und Standard-Media-Software, wie iMovie aufgezeichnet werden. Ein Standard-Computer-Monitor, anstatt ein Monitor medizinischer Qualität, ist ausreichend, um den Darm während der Endoskopieverfahren (Figur 4) zu visualisieren. </li><li> Anesthetize Gruppen von 5-6 Mäusen gleichzeitig in einer Kammer mit 3% Isofluran in 100% O 2 bei einer Rate von 0,2-0,4 l / min. Nachdem die Mäuse anästhesiert, die vom Zehenklemm bestätigt wird; die Isofluran Ebenen sollten auf 0,5-2% für die Wartung geändert werden. </li><li> Entfernen Sie eine individuelle Maus aus der Kammer, und legen Sie sie Bauchseite nach oben mit dem Kopf in einem Nasenkegel gesichert. Vollnarkose sollte überwacht werden, und die Hinterbeine sollte so eingestellt werden, dass sie shinter der Maus tretched. </li><li> Legen Sie einen Tierarzt Salbe auf die Augen der Mäuse bis zur Trockenheit zu verhindern. </li><li> Halten Sie den Schwanz der Maus, wo es die untere Wirbelsäule trifft zu zeigen deutlich den Anus. Legen Sie die starren Endoskophülle in ein Becherglas mit Wasser und stellen Sie den Luftstrom um die Freilassung einer kleinen Luftblase in einer Zeit zu ermöglichen. </li><li> Der Luftstrom wird der Doppelpunkt erlauben, sich aufzublasen. Wenn der Luftstrom zu stark ist, wird Luft in den Magen der Maus gepumpt werden. Keine zusätzliche Schmierung erforderlich. </li><li> Die starre Endoskophülle in den Mastdarm vorsichtig. Im allgemeinen kann das Endoskop bis zu 3 cm, an welchem ​​Punkt der Doppelpunkt in Mäusen Kurven und nicht zugänglich ist starren Endoskops eingeführt werden kann. </li><li> Eine häufige Schwierigkeit während der Endoskopie Verfahren ist Sperrung des Zugangs zu dem Lumen des Kolons durch Fäkalien. Vermeiden Sie dies, indem sanft massiert dem Bauch der Mäuse vor dem Eingriff, um Stuhlgang zu fördern, oder vorsichtig manövrieren des Endoskops um die Fecal Sache während des Verfahrens. Peristaltik kann auch auftreten, während der das Endoskop sollte in Position gehalten werden, bis das Colon Muskulatur relaxiert. </li><li> Initiieren Videoaufzeichnung in jedem Stadium des Endoskopieverfahren. Disease Scoring können von einem erfahrenen Assistenten während des Verfahrens aufgezeichnet werden, oder zu einem späteren Zeitpunkt aus den Videodateien. </li><li> Nach der endoskopischen Untersuchung, geben die Mäuse in ihren Käfig und während der Erholung aus der Narkose zu überwachen. Tiere sind in der Regel wach und mobil innerhalb von 2 Minuten nach der Entnahme aus dem Isofluran verabreicht Nasenkegel. </li><li> Stellen Sie sicher, dass diese Verfahren werden von einem erfahrenen Wissenschaftler durchgeführt. Jedes Endoskopie Verfahren dauert etwa 2 Minuten pro Maus zu nehmen. </li></ol> 6. Krankheits Scoring <ol><li> Um ulcerosa überwachen, Score Videos zur Murine Endoskopische Index von Colitis Severity (MEICS) 16, die Veränderungen in der (i) dokumentiert die Dicke der Darmwand durch Transparenz gekennzeichnet, (Ii) Stuhlkonsistenz, (iii) Blutgefäß Integrität und Präsenz, (iv) Geschwüre und Bereiche der Regeneration, die in ein kompakter Form zu präsentieren, (v) Blutungen durch Fibrinablagerungen (5a) angezeigt. </li><li> Um Tumorlast zu überwachen, Score Videos für Tumorinzidenz und Größe. Die Tumorgröße wird durch den Durchmesser der Darmlumen durch den Tumor 16 (Figur 5b) besetzt bestimmt. Es ist üblich, beide ulcerosa und Tumor-Scoring-Parameter für eine einzelne Maus. Mit Endoskopie, einzelne Tumoren und die Gesundheit der Darmschleimhaut kann über längere Zeit beobachtet werden, was ein Auslesen für den Erfolg neuer Therapeutika bei einem Tier. </li><li> (Optional) Standbilder können von den Videos zur Erzeugung von repräsentativen Zahlen (Abbildung 6) extrahiert werden. </li></ol>

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<li>Kerr, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sodium+sulfate+inhibition+of+real-time+polymerase+chain+reaction+amplification%3A+a+poly-A+purification+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Dextran sodium sulfate inhibition of real-time polymerase chain reaction amplification: a poly-A purification solution.</a> Inflamm Bowel Dis. 18, 344-348 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die drei Protokolle, die beschriebenen Gliederung Methoden der zuverlässigen und reproduzierbaren Induktion von Dickdarmerkrankung Pathologie in Mäusen. Wenn mit routinemäßigen endoskopischen Überwachung und die Interventionsstrategien hier skizzierten kombiniert, werden diese Protokolle bieten leistungsstarke präklinischen Einblick in die Wirksamkeit von Therapeutika. Unsere Labors routinemäßig alle diese Protokolle, um den Erfolg neuer Therapeutika 10,23,24 überwachen. Es gibt eine Reihe von Überlegungen bei der Auswahl eines vorklinischen Tiermodell, um neue Therapeutika zu testen. Dazu zählen Relevanz des Modells auf die menschliche Krankheit, und der Beitrag der Tumor-Mikroumgebung auf die vorgeschlagene Maßnahme des therapeutischen Ziels. Hier bieten wir Ihnen drei Protokolle für die therapeutische Intervention in etablierten Darmkrankheitsmodellen. Diese Modelle sind reproduzierbar und die Lieferung von Reagenzien für Krankheiten induzieren einfach zu verwalten. Wichtig ist, dass die Modelle von großer Bedeutungmehrere Facetten und Phasen der Colitis Beginn, und der Tumor Initiierung und Progression. Forscher sollen, ist das genetische Hintergrund der Mausstämme verwendet bei der Konstruktion Experimente wie die Anfälligkeit für Krankheiten von DSS und / oder AOM induzierte kann beträchtlich variieren 25 erfolgen. Zusätzlich können verschiedene Mikrobengemeinschaften haben unterschiedliche Stoffwechselleistungen im Zusammenhang mit der AOM, die durch Bakterien metabolisiert wird. Wir warnen davor, verschiedenen Kohorten von Mäusen, die in verschiedene Tierhaltung (einschließlich kommerzielle Anbieter) in einem einzigen Experiment geboren wurden. Ähnlich kann die verschiedenen Mikroflora in Mäuse von verschiedenen Einrichtungen verwendet hervorrufen anderen Host antwortet DSS-induzierte Epithelbarriere Schaden 11. Darüber hinaus sollte die geeignete Analyse der Gewebe (zum Beispiel RNA-Reinigung) ebenfalls berücksichtigt werden, da die Fähigkeit DSS reverse Transkriptase werden in den Folge molekulare Analyse 26,27 auswirken hemmen. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Maus Endoskopie ist eine Schneide-Technik zu Beginn der Erkrankung und Progression in einer individuellen Maus wiederholt zu überwachen. Die Möglichkeit, Videos aufzunehmen und zu extrahieren Standbilder ermöglicht eine einfache Überwachung mehrerer Krankheitsparameter und Tumoren. Neben der Verbesserung des Tierschutzes, reduziert endoskopische Überwachung auch die Notwendigkeit für mehrere Kohorten von Versuchsmäusen, die traditionell wurden zu verschiedenen Zeitpunkten getötet, um den Krankheitsverlauf zu verfolgen. Die MEICS Punktesystem ist kein Ersatz für eine histopathologische Analyse, sondern bietet ein alternatives Mittel für die Tiergesundheit und die Schädigung der Schleimhaut in lebenden Mäusen zu überwachen. Maus-Endoskopie ist eine spezialisierte Labortechnik, und alle Verfahren sollten von geschultem Personal durchgeführt, um geeignete Manipulation und Handhabung der Mäuse zu gewährleisten, sowie gleichbleibende Qualität in der für Krankheit Scoring verwendeten Bilder zur Verfügung zu stellen. In den Händen von qualifiziertem Personal, wir haben festgestellt, dass die Endoskopie induziert keine oder nur geringe Schäden an der tumors, die intratumorale Blutungen verursachen würde. Für die therapeutische Protokolle ausgeführt, betrachten wir Endoskopie sehr vorteilhaft, da sie einen Weg, um den anfänglichen Tumorlast zu bestimmen, und erlaubt uns, Gruppe Kohorten von Tieren mit ähnlichen Tumorbelastungen vor der Verabreichung eines therapeutischen Medikaments. Sequential Überwachung der Mäuse ermöglicht es Forschern, um die Wirksamkeit neuer Therapien frühzeitig festzustellen, mit der Möglichkeit der Beendigung erfolglosen Versuchen in einer angemessenen Zeitspanne. Als unser Verständnis von entzündlichen Darmerkrankungen und Darmkrebs Voraus, neue Ziele für die Therapie zu identifizieren. Geeigneten Tiermodellen wird ein integraler Bestandteil dafür, dass die vielversprechendsten neuen Therapien zur klinischen Studien bewegt werden.

Das kolorektale Karzinom (CRC) ist die 4. häufigste Ursache von malignen Erkrankungen weltweit 1. Trotz der erheblichen Fortschritte in unserem Verständnis der familiären Basis dieser Krankheiten dienen, trägt genetische Veranlagung nur ~ 20% der Fälle 2 CRC. Der Rest sind zahlreichen extrinsische und Umgebungsfaktoren, einschließlich chronische Entzündung zurückzuführen. Beim Menschen ist die Verbindung zwischen einer chronischen Entzündung und Darmkrebs evident bei Colitis ulcerosa (UC) der Patienten, die ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von Colitis assoziierte Darmkrebs (CAC) aufweisen, abhängig von der Dauer, des Ausmaßes und der Schwere der entzündlichen Erkrankung 3 -5. Dementsprechend sind neue Therapien in Entwicklung, um die Immunantwort und das zugehörige Herstellungs von Wachstumsfaktoren durch die entzündliche Tumor-Mikro 6-8 steuern. Es besteht ein zunehmender Bedarf an geeigneten präklinischen Tiermodellen, um die therapeutische Wirksamkeit zu charakterisierendiese Medikamente gegen die Entwicklung und das Fortschreiten der Krankheit. Mausmodelle haben eindeutig gezeigt, dass der Entzündungsmikro trägt zur CRC Progression, auch in Abwesenheit von offener Entzündung 9,10. Diese Modelle umfassen die Verwendung des Polysaccharid Dextransulfat-Natrium (DSS), in das Trinkwasser der Mäuse bereitgestellt, epitheliale Verletzungen und akuten und chronischen entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) 11,12 modellieren. Obwohl der Mechanismus, durch den DSS induziert Schleimhautschädigung und Colitis ist nicht vollständig verstanden, legen einige Studien nahe, dass DSS hemmt Zell reverse Transkriptase und Ribonuclease-Aktivitäten in den Zellen, oder die Bildung von Nano-Lipid-Komplexe, die mit der Kolon-Membran führt zu Schäden epithelialen verschmelzen 13,14. Änderungen an der Standard-DSS-Modell wurden auch wichtige Einblicke in die vorgesehenen Mechanismen, durch die Kolonepithelzellen halten Gewebshomöostase und OrdnungsmäßigkeitEnde Schleimhautimmunreaktion 15. Intraperitoneale Verabreichung von Azoxymethan (AOM) allein oder in Kombination mit DSS, ein Modell für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen somatische Mutationen in der epithelialen Schleimhaut und der inflammatorischen und stromale Mikroumgebung 16,17. AOM ist ein Metabolit des Karzinogen 1,2-Dimethylhydrazin (DMH), die nicht direkt in DNA-Mutationen führen. Stattdessen ist AOM hydrolysiert durch das Cytochrom-Isoform CYP2E1 in die Leber, wo MAM wird mit Glukuronsäure konjugiert und dann an den Darm durch Gallensekreten 18 transportiert methylazoxymethanol (MAM). Es wird vermutet, dass die bakterielle β-Glucuronidase trägt zum Abbau von MAM was zu DNA-Alkylierung und die Akkumulation von Mutationen in Epithelzellen 19. Meist AOM-induzierten Kolontumoren beherbergen Missense-Mutationen im Gen für β-Catenin, wodurch das Protein resistent gegen proteasomalen degradatiauf, die aberrante Aktivierung des Wnt-Signalwegs 20 zur Folge hat. Wenn die Aktivität des AOM ist mit der Schleimhautschädigung durch DSS ausgelöst kombiniert, die darauf folgende Wundheilungsreaktion erzeugt eine Mikroumgebung, die für das Wachstum und die Expansion der mutagenisierten Epithel ist. In einer Variation dieses Modells können wiederholte Gabe AOM allein über einen Zeitraum von mehreren Wochen modelliert werden sporadischen kolorektalen Krebs, in der Abwesenheit von DSS-induzierten Colitis 10,17. Diese beiden Modelle bieten kostenlose experimentellen Einstellungen CAC und sporadischen CRC bzw. studieren, die beide mit einem pro-inflammatorischen Tumor-Mikroumgebung 10 assoziiert. Die Verwendung von Serien Endoskopie bei Mäusen wurde von Becker und Kollegen 21 Pionierarbeit und ermöglicht Längs Überwachung von Colitis und Tumorprogression. Hier bieten wir Ihnen drei präklinischen Protokolle basierend auf DSS-induzierte Schädigung der Schleimhaut und / oder AOM-vermittelte tumor Induktion reproduzierbar induziert spezifische Darmerkrankungen. Das erste Protokoll beschreibt induziert akute Schädigung der Schleimhaut in Reaktion auf DSS Verwaltung, viele der histopathologischen Merkmalen mit CED assoziiert zu entlocken. Das zweite Protokoll wird an drei aufeinanderfolgenden Zyklen von DSS Verwaltung basierend auf die Fackeln Entzündungs ​​üblicherweise in IBD-Patienten beobachtet imitieren und kann in Verbindung mit AOM-induzierten Mutationen durchgeführt werden. Die endgültige Protokoll basiert auf AOM-induzierten epithelialen sporadische Mutationen basiert. Für jedes dieser Protokolle, die wir auf die entsprechenden Standardverfahren zu erweitern, um prophylaktische und therapeutische Interventionsmethoden, die wir entwickelt haben, um die Wirksamkeit von neuen Arzneimitteln zu überwachen sind.

<table><tbody><tr><td>Dextransulfat-Natrium (MW 36.000-50.000)</td><td>MP Biochemikalien</td><td>160110</td><td>Erfordert eine Chargenprüfung.</td></tr><tr><td>Azoxymethan</td><td>Sigma</td><td>A5486-100MG</td><td>Erfordert eine Chargenprüfung.</td></tr><tr><td>Vanille Protein Shake</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Erhältlich in Krankenhausapotheken.</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>PPC</td><td>M60303</td><td>Hierbei handelt es sich um ein eingeschränktes Reagenz, das unter Verschluss gehalten werden sollte.</td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Standard Laborreagenz.</td></tr><tr><td>Coloview miniendoskopisches System</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Endovision Tricam</td><td>Karl Storz</td><td>20212001-020</td><td></td></tr><tr><td>Xenon 175 Lichtquelle mit Anti-Beschlag-Pumpe</td><td>Karl Storz</td><td>20134001</td><td></td></tr><tr><td>HOPKINS straight Forward Teleskop</td><td>Karl Storz</td><td>64301AA</td><td></td></tr><tr><td>Endoskopische Hülle (Gesamtdurchmesser 3 mm)</td><td>Kalr Stroz</td><td>61029C</td><td></td></tr><tr><td>Glasfaser-Lichtkabel</td><td>Kalr Stroz</td><td>69495ND</td><td></td></tr><tr><td>Computer- und Mediaplayer-Software</td><td>Apple</td><td></td><td>iMovie-Waage</td></tr><tr><td></td><td>Alle</td><td></td><td>Jede Waage, die zum Wiegen von Mäusen geeignet ist.</td></tr></tbody></table>

nicht-invasive beurteilung der wirksamkeit neuer therapeutika für darmpathologien verwenden der seriellen endoskopische bildgebung von lebenden mäusen

Non-invasive Assessment of the Efficacy of New Therapeutics for Intestinal Pathologies Using Serial Endoscopic Imaging of Live Mice

Tiermodelle für entzündliche Darmerkrankungen (CED) und Darmkrebs (CRC) haben signifikante Einblicke in die zellinternen und extrinsischen Mechanismen gegeben, die zum Auftreten und Fortschreiten von Darmerkrankungen beitragen. Die Identifizierung neuer Moleküle, die diese Pathologien begünstigen, hat zu einer Flut von Aktivitäten geführt, die sich auf die Entwicklung potenzieller neuer Therapien konzentrieren, um ihre Funktion zu hemmen. Infolgedessen werden heute verschiedene präklinische Mausmodelle mit einem intakten Immunsystem und einer stromalen Mikroumgebung stark genutzt. Im Folgenden beschreiben wir drei experimentelle Protokolle, um die Wirksamkeit neuer Therapeutika in präklinischen Modellen für (1) akute Schleimhautschäden, (2) chronische Kolitis und/oder Colitis-assoziierten Dickdarmkrebs und (3) sporadischen Darmkrebs zu testen. Wir skizzieren auch Verfahren für die serielle endoskopische Untersuchung, mit denen das therapeutische Ansprechen eines einzelnen Tumors dokumentiert und die Gesundheit einzelner Mäuse überwacht werden kann. Diese Protokolle bieten komplementäre experimentelle Plattformen, um die Wirksamkeit von therapeutischen Wirkstoffen zu testen, die sich bei Mäusen als gut verträglich erwiesen haben.

Gewichtsverlust wird als Standard-Parameter verwendet werden, um für die Krankheit mit Colitis, die routinemäßig verwendet wird, um die allgemeine Gesundheit der Mäuse Monitor verbunden überwachen. Tiere in der Regel ihr Gewicht zu halten, während DSS haltiges Wasser verabreicht wird und nur Gewicht verlieren beginnen, wenn sie in den normalen Trinkwasser zurück. Akzeptabel Gewichtsverlust Parameter sollten gemäß dem Tierethikkommission der Institution etabliert werden. Um die Dehydrierung bei längerem Durchfall zu vermeiden, sollte die routinemäßige Bestimmung der Maische (Futterpellets püriert und mit Trinkwasser) mit einem Protein-Shake zusätzlich zu den normalen Trinkwasser ergänzt. Als Alternative Anästhesie Ketamin / Xylazin oder ähnliche Mittel verwendet werden können, ist, wenn Isofluran Ausrüstung nicht verfügbar ist. Durch die starre Beschaffenheit des Endoskops nur diese Vorgehensweise ermöglicht eine Visualisierung der distalste 3 cm des Mausdickdarm. Neuere Endoskope mit<html> zusätzliche Funktionen (einschließlich Flexibilität und Fluoreszenz) sind je nach den Bedürfnissen des Experiments. Da jedoch die nachteiligen Wirkungen von DSS sind überwiegend dem distalen Colon von Mäusen, mit in der Mitte Kolon beobachtet milder Pathologie beschränkt, das starre Endoskop nicht Überwachung der Schleimhaut Gesundheit der einzelnen Mäusen hemmen. Obwohl wir ein Protokoll für die prophylaktische Behandlung von akuten DSS-induzierter Kolitis zu beschreiben, kann dieses Protokoll einfach geändert werden, um Interventionen Behandlungsstrategien zu testen. Die Wirksamkeit eines Medikaments zur Epithelschädigung und Colitis lindern kann in Längsrichtung in einzelne Mäuse beobachtet und auf Basis der beschriebenen Scoring Parameter (Abbildung 5) quantifiziert werden. Dies ist gegenüber herkömmlichen experimentellen Designs, das Culling von Mäusen zu bestimmten Zeitpunkten während des Versuchsprotokoll erfordern, vorteilhaft und ermöglicht nicht die Charakterisierung der Erkrankung als Antwort auf eine Behandlung mit der Zeit. <html> t &quot;&gt; Klinische Studien am Menschen haben eine beträchtliche Variabilität in verschiedenen Tumoren wie bei einem individuellen Patienten auf Behandlungen ansprechen hervorgehoben. Die Verfahren, die hier beschrieben werden, sind ein Mittel, um die Gesamttumorlast sowie das Ansprechen auf die Behandlung einzelner Tumorverlauf zu überwachen eines Experiments. Es ist wichtig zu beachten, dass die Interventions Protokolle, die für die Krebsmodellen umrissen sind, nicht berücksichtigt die Effekte einer Therapie auf Tumorinitiation zu nehmen. Die prophylaktische Protokolle, mit der Behandlung vorgesehen vor, wenn die Tumore endoskopisch sichtbar werden, sind erforderlich, um diese Informationen zu erhalten. Die hier beschriebenen Protokolle liefern Informationen über die therapeutische Wirkung auf die auf das Fortschreiten (gemessen durch die Tumorgröße) der einzelnen Tumoren. Tumorregression kann auch durch eine Reduzierung der Anzahl der sichtbaren Tumore anzugeben. g &quot;/&gt; Abb. 1: Die Überwachung der Wirksamkeit einer prophylaktischen Behandlung Therapie in einem Modell der akuten Darmschäden Das experimentelle Protokoll (a) erfordert 8 Tage von Anfang bis Ende. Therapeutics werden von Tag 1 für prophylaktische Behandlungen verabreicht (b). DSS im Trinkwasser (c) von Tag 3 des Versuchsprotokoll bereitgestellt. Endoskopie durchgeführt wird (d), um das Fortschreiten der Krankheit bei den Tieren zu überwachen. Empfohlener Zeitpunkten umfassen Tag 0 (unbehandelt) und Tag 2 (Health Monitoring), Tag 5 und 8 (zu Krankheitslast bestimmen). Das Experiment wird beendet (e) am Morgen des 8. Tag: In einer Wildtyp-Maus (f) das Fortschreiten der Krankheit mit der Zeit zunimmt. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: Überwachung der Wirksamkeit der Intervention Therapie in einem Modell of ulcerosa-assoziierten Krebs. Das experimentelle Protokoll (a) ist 72 Tage vom Beginn bis zum Abschluss. Therapeutics (b) an Mäuse mit etablierten Tumoren von Tag 46 für eine Intervention Behandlungen verabreicht. AOM (c) wird am Tag 1 injiziert, und DSS im Trinkwasser über einen Zeitraum von drei Zyklen des experimentellen Protokolls bereitgestellt, beginnend am 8. Tag Endoskopie (d) durchgeführt wird, um das Fortschreiten der Krankheit bei den Tieren zu überwachen. Empfohlener Zeitpunkten umfassen Tag 0 (unbehandelt), Tag 20 (Gesundheitsüberwachung) und Tag 40 (nach Gruppen Tiere nach Tumorlast). Endoskopie wird wöchentlich im Laufe der therapeutischen Behandlung durchgeführt, um Krankheitsverläufe zu überwachen. Das Experiment (e) am Morgen des 72. Tag beendet In einer Wildtyp-Maus (f) Tumorbelastung steigt von Tag 40 ab. <img alt="Figur 3"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.383 / 52383fig3highres.jpg&quot; /&gt; Abb. 3: Die Überwachung der Wirksamkeit der Intervention Therapie in einem Modell der spontanen Darmkrebs Das experimentelle Protokoll (a) benötigt&gt; 50 Wochen von Anfang bis Ende. Therapeutics (b) an Mäuse mit etablierten Tumoren Interventions Behandlungen verabreicht. AOM (c) wird am Tag 1 über den Verlauf der experimentellen Protokoll injiziert und danach wöchentlich für 6 aufeinanderfolgenden Einspritzungen. Endoskopie (d) durchgeführt wird, um das Fortschreiten der Krankheit bei den Tieren zu überwachen. Empfohlener Zeitpunkten umfassen Tag 0 (unbehandelt) und Woche 8 (Tumorüberwachung) und alle zwei Wochen gibt es nach (auf Tumorlast zu schaffen). Endoskopie wird wöchentlich im Laufe der Behandlung, um therapeutische Ergebnisse zu überwachen geführt. Das Experiment (e) in Woche 50 beendet in einer Wildtyp-Maus (f) Tumorbelastung steigt von Woche 40 ab. </<html> p&gt; <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig4highres.jpg" width="650" /> Abb. 4: Geräteaufbau Der Versuchsaufbau (a) für das endoskopische Gerät, mit einzelnen Geräte angezeigt. Das starre Endoskop (b), wobei die einzelnen Bestandteile angegeben. Balken = 2,5 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52383/52383fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig5highres.jpg" width="650" /> Abb. 5: Scoring Krankheitsparameter durch Endoskopie ist eine Grundriss (a) des Murine Endoskopische Index von Colitis Severity (MEICS). Ein Überblick (b) der einzelnen Tumor Scoring-Parameter.es / ftp_upload / 52.383 / 52383fig5highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52383/52383fig6highres.jpg" width="650" /> Abbildung 6: Vertreter therapeutischen Behandlungen Vertreter Gewichtsverlust, endoskopische Bilder und Spielstände für:. (A) Akute DSS-induzierten Schäden der Schleimhaut (b) Tumoren, die im Anschluss an die AOM / DSS-Protokoll entwickelt, (c) Tumoren, die im Anschluss an die sequentielle entwickelt.. AOM-Protokoll. N = 3 Mäuse pro Gruppe. * P &lt;0,05, *** p &lt;0,001 (Student-T-Test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52383/52383fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

Wir beschreiben Methoden zur longitudinalen Überwachung der Wirksamkeit von Therapeutika zur Behandlung von Dickdarmpathologien bei Mäusen mit einem starren Endoskop. Dieses Protokoll kann leicht für die Charakterisierung des therapeutischen Ansprechens eines einzelnen Tumors bei lebenden Mäusen und auch für die Überwachung eines möglichen Krankheitsrückfalls verwendet werden.

Nicht-invasive Beurteilung der Wirksamkeit neuer Therapeutika für Darmpathologien Verwenden der seriellen endoskopische Bildgebung von lebenden Mäusen

Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wirksamkeit neuer Therapeutika in Kolitis- und Krebsmodellen zu prüfen, indem bei Mäusen eine Erkrankung induziert wird, um Therapien zu untersuchen, die die induzierte Pathologie hemmen. Das Therapeutikum wird prophylaktisch verabreicht. In diesem Video wird rekombinantes menschliches Interleukin-11-Protein verwendet; anschließend wird Dextran-Sulfat-Natrium oder DSS im Trinkwasser verabreicht, um akute Schleimhautschäden sowie viele der histopathologischen Merkmale hervorzurufen, die mit entzündlichen Darmerkrankungen assoziiert sind. Anschließend werden Veränderungen der Erkrankung mittels Endoskopie überwacht, um die therapeutische Wirksamkeit zu bestimmen. Letztendlich zeigen die Ergebnisse eine verminderte Krankheitslast, basierend auf endoskopischer Überwachung und Bewertung nach therapeutischer Behandlung von Mäusen mit induzierter Krankheitspathologie. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Möglichkeit, eine einzelne Maus im Verlauf des Experiments im Vergleich zu Standardverfahren der histologischen Analyse zu überwachen.Die Untersuchung mehrerer Kohorten von Tieren ist erforderlich. Diese Methodik kann uns dabei helfen, zentrale Fragen bezüglich Entzündungen und Darmkrebs zu stellen und zu beantworten, insbesondere um zu untersuchen, ob eine gezieltere Beeinflussung der Zytokinsignalübertragung den Krankheitsverlauf beeinflusst. Es ist wichtig, diese präklinischen Modelle zur Beurteilung der Wirksamkeit von Arzneimitteln und Verbindungen zu nutzen, was es uns ermöglicht, dieselbe Maus zu mehreren Zeitpunkten zu untersuchen und festzustellen, ob diese Substanzen eine biologische Aktivität aufweisen.Ich werde dieses Verfahren gemeinsam mit Giovanni CI Ciano, einem Tierpfleger aus unserem Institut, demonstrieren. Am ersten Tag verabreichen Sie das gewünschte Therapeutikum sowie geeignete Fahrzeugkontrollen. In dieser Demonstration wurden fünf Mikrogramm rekombinantes menschliches Interleukin-11-Protein in 200 Mikroliter gepuffertem Phosphat-Salzlösung gelöst und intraperitoneal verabreicht. Bestimmen Sie den Zeitpunkt und die Häufigkeit der Applikationen, die vom pharmakokinetischen Profil des getesteten Therapeutikums abhängen. Hier ist ein Ablaufplan für eine prophylaktische Behandlung mit zweimal täglich intraperitonealen Injektionen über den gesamten Versuchszeitraum dargestellt.Überwachen Sie die Stuhlkonsistenz und das Vorhandensein von Blut und wiegen Sie jede Maus täglich. Am Behandlungstag sollte das Wiegen mit der Gabe des therapeutischen Wirkstoffs zusammenfallen, um den durch wiederholtes Anfassen verursachten Stress für die Mäuse zu minimieren. Am dritten Tag bereiten Sie eine 2,5%ige Dextran-Natriumsulfat- oder DSS-Lösung in dem Trinkwasser zu, das den Mäusen routinemäßig von der Tierhaltung bereitgestellt wird.Pro Maus und Tag werden etwa fünf Milliliter DSS-Lösung für das Experiment benötigt. Der Verbrauch des DSS-Wassers kann sich ändern, wenn die Umgebungstemperatur der Tierhaltungseinrichtung schwankt. Stellen Sie den Mäusen frische DSS-Lösung zur Verfügung.Geben Sie Liam an fünf aufeinanderfolgenden Tagen am Abend des fünften Tages in saubere Wasserflaschen. Stellen Sie zusätzlich normales Trinkwasser sowie zerdrückte Futtermittelkugeln und eine Proteinzusatzfütterung in kleinen Petrischalen bereit. Am Morgen des achten Tages.Führen Sie die Maus-Euthanasie wie im Textprotokoll beschrieben durch, um Gewebe für anschließende histologische Analysen zu sammeln. Führen Sie routinemäßige Chargentests durch, um die geeignete DSS-Dosierung festzulegen und zyklische Schwankungen zwischen den Chargen zu vermeiden. Die geeignete Dosierung sollte auf dem Gewichtsverlust basieren und durch histopathologische Bestätigung der Kolitis verifiziert werden.Passe die DSS-Dosis zwischen ein und 4 % Gewicht pro Volumen an, abhängig von der Mikroflora der Tieranlage und der DSS-Charge. Die Endoskopieausrüstung sollte gemäß Standardverfahren zusammengestellt werden.Desinfizieren und reinigen Sie die Endoskoppersonde mit 70 % Ethanol oder einem antibakteriellen Gleitmittel. Die Aufnahmen können mit einem Laptop oder Desktop-Computer sowie gängiger Mediensoftware wie iMovie aufgezeichnet werden. Zur Visualisierung des Kolons während des endoskopischen Eingriffs ist ein Standard-Computermonitor ausreichend, ein medizinischer Monitor ist nicht erforderlich.Äthetisieren Sie Gruppen von fünf bis sechs Mäusen gleichzeitig in einer Kammer mit 3% Fluoreszenz in 100% Sauerstoff mit einer Rate von 0,2 bis 0,4 Litern pro Minute. Sobald die Mäuse äthetisiert sind, was durch Zehenquetschung bestätigt wird, sollten die Isofluoreszenz-Werte für die Erhaltungsdosierung auf 0,5 bis 2 % eingestellt werden. Entfernen Sie eine einzelne Maus aus der Kammer und platzieren Sie sie in Rückenlagerung mit dem Kopf in einer Nasenkappe; die Vollnarkose sollte überwacht werden, und die Hinterbeine sollten so justiert werden, dass sie hinter der Maus ausgestreckt sind. Tragen Sie Veto-Salbe auf die Augen der Mäuse auf, um Austrocknung zu verhindern.Halten Sie den Schwanz der Maus dort, wo er auf die untere Wirbelsäule trifft, um den Anus deutlich sichtbar zu machen. Bei zu starker Luftzufuhr wird die Luftströmung dazu führen, dass sich der Colon aufbläht. Luft wird in den Magen der Maus gepumpt.Führen Sie die starre Endoskopmanschette vorsichtig in das Rektum ein. In der Regel kann das Endoskop bis zu drei Zentimeter eingeführt werden, ab diesem Punkt krümmt sich der Colon bei Mäusen und ist für das starre Endoskop nicht mehr zugänglich. Eine häufige Schwierigkeit während endoskopischer Eingriffe ist die Verblockung des Zugangs zum Kolonlumen durch Fäkalmaterie.Vermeiden Sie dies, indem Sie vor dem Eingriff vorsichtig den Bauch der Mäuse massieren, um die Defäkation zu fördern. Starten Sie die Videoaufzeichnung zu jedem Zeitpunkt des endoskopischen Verfahrens. Die Krankheitsbewertung kann während des Eingriffs durch einen erfahrenen Assistenten oder zu einem späteren Zeitpunkt anhand der Videodateien durchgeführt werden; stellen Sie sicher, dass diese Schritte von einem erfahrenen Wissenschaftler durchgeführt werden.Jedes Endoskopieverfahren dauert ungefähr zwei Minuten pro Maus nach der endoskopischen Untersuchung. Bringen Sie die Mäuse in ihren Käfig zurück und überwachen Sie sie während der Erholung von der Anästhesie. Die Tiere sind im Allgemeinen innerhalb von zwei Minuten nach Beendigung der Anästhesie wieder beweglich. Die hier gezeigten Ergebnisse stammen von Mäusen, die DSS ausgesetzt waren, um eine akute entzündliche Darmerkrankung zu modellieren.Am achten Tag des Protokolls unbehandelt. Wildtyp-Mäuse weisen wie erwartet Kolitis mit Gewichtsverlust auf; Endoskopiebilder und Endoskopie-Kolitis-Scores von Kontrollmäusen sowie von Mäusen, die mit rekombinantem humanem Interleukin-11-Protein behandelt wurden, sind dargestellt. Gewichtsverlust wird als Standardparameter zur Überwachung der kolitisassoziierten Erkrankung verwendet, was routinemäßig zur Beurteilung des allgemeinen Gesundheitszustands der Mäuse herangezogen wird, wie durch den verringerten endoskopischen Kolitis-Score veranschaulicht.Die verminderte Erkrankung ist nach therapeutischer Behandlung von Mäusen mit induzierter Krankheitspathologie erkennbar. Sobald Sie diese Technik beherrschen, sollten Sie in der Lage sein, die Maus innerhalb von etwa zwei Minuten zu beurteilen. Im Allgemeinen ermöglicht es Ihnen diese Methode, sehr effektiv zu testen, ob diese Behandlungen eine Wirkung auf Entzündungen und Krebs in einem relevanten präklinischen Modell haben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Postoperativen Ileus (POI) ist eine Komplikation der Bauchchirurgie führt zu einer erhöhten Morbidität und einen längeren Krankenhausaufenthalt. Da prophylaktische oder therapeutische Strategien fehlen verstärkte Forschung notwendig ist. Deshalb haben wir eine standardisierte und machbar Mausmodell, um die Pathophysiologie von POI zu untersuchen und mögliche therapeutische Optionen zu studieren.

Functional Assessment of Darmmotilität und Darmwand Entzündung in Nagetiere: Analysen in einem standardisierten Modell der intestinalen Manipulation

In den vergangenen Jahren wurden neue Generation Endoskope wichtige diagnostische Forschung Hilfsmittel zum Auswerten murinen Colitis und kolorektalen Tumoren entwickelt. Wir stellen hier ein detailliertes Protokoll für endoskopische Beurteilung von Entzündungen und kolorektalen Tumoren in Mäusen, sowie eine neuartige Bewertungssystem, das Dezimal-Identifikatoren verwendet, um die Schwere der endoskopischen ulcerosa und kolorektalen Tumoren dokumentiert.

Flexible Koloskopie in der Maus, um die Schwere der Colitis und kolorektalen Tumoren auswerten mit einem validierten Endoskopische Scoring System

Kleintierbildgebung Techniken ermöglichen Serien diagnostische Untersuchungen und therapeutische Interventionen in vivo. Vor kurzem hat der Umfang der Anwendungen erheblich erweitert und umfasst gegenwärtig Beurteilung Colontumorentwicklung, Wundheilung und Kontrolle von Entzündungen. Dieses Protokoll zeigt diese verschiedenen Anwendungsmöglichkeiten der murinen Endoskopie.

Murine Endoskopie für In Vivo Multimodale Bildgebung der Krebsentstehung und Bewertung der Darm Wundheilung und Entzündung

Durch die Verwendung von transgenen Reportermäusen und injizierbaren Fluoreszenzmarkierungen ermöglicht die konfokale Langzeitmikroskopie mit intravitaler Spinning-Disk die direkte Visualisierung des Verhaltens myeloischer Zellen in intestinalen Adenomen im ApcMin/+ Darmkrebsmodell.

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics Apc Min / + Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Dieser Artikel beschreibt eine Videobildgebungstechnik und hochauflösende raumzeitliche Kartierung, um Veränderungen in der neuronalen Regulation der Dickdarmmotilität bei erwachsenen Mäusen zu identifizieren. Subtile Auswirkungen auf die gastrointestinale Funktion (GI) können mit diesem Ansatz in isolierten Gewebepräparaten nachgewiesen werden, um unser Verständnis von GI-Erkrankungen zu verbessern.

Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

Hier präsentieren wir Ihnen eine Protokoll, die beschreibt allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation und ermöglicht sich wiederholenden Mini-endoskopische Auswertungen des distalen Colon an Ort und Stelle für die Präsenz, die Merkmale und die Schwere der Kolon Entzündung im live Mäuse Darm Graft - Versus - Host-Seuche leiden.

Induktion der intestinalen Graft - Versus - Host-Seuche und seiner Mini-endoskopische Beurteilung in Live Mäuse

Hier stellen wir ein Protokoll zur Festlegung wichtiger Endpunkte und proliferativer Marker für kleine Darmverletzungen und kompensatorische Hyperproliferation unter Verwendung eines Modells der chemotherapieinduzierten Schleimhautitis vor. Wir demonstrieren die Detektion von sich vermehrenden Zellen mit einem zellzyklusspezifischen Marker und mit kleinem Darmgewicht, Kryptatiefe und Villushöhe als Endpunkte.

Wichtige Endpunkte und proliferative Marker zur Beurteilung von kleinen Darmverletzungen und Anpassung mit einem Mausmodell der Chemotherapie-induzierten Mukositis

Wir beschreiben eine Methode zur Visualisierung von GFP-markierten IELs mit intravitaler Bildgebung des murinen Dünndarms durch invertierte Konfokalmikroskopie der Spinnscheibe. Diese Technik ermöglicht die Verfolgung von lebenden Zellen innerhalb der Schleimhaut für bis zu 4 h und kann verwendet werden, um eine Vielzahl von darmen immun-epitheliale Wechselwirkungen zu untersuchen.

Intravitale Bildgebung von intraepitheliale Lymphozyten im murinen Dünndarm

Unter Ausnutzung der intravitalen Mikroskopie ermöglicht die hier vorgestellte Methode die Echtzeit-Visualisierung des Darmepithelzellvergießens bei lebenden Tieren. Daher wird topisch gefärbte Darmschleimhaut (Acriflavine und RhodamineB-Dextran) von anästhesierten Mäusen bis zur einzelzelligen Auflösung mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet.

Ein intravitaler, auf Mikroskopie basierender Ansatz zur Bewertung der Darmdurchlässigkeit und der Epithelzellvergießen-Performance

Hier bieten wir eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens zur Induzieren von kolonoskopisch geführten Pinch-Biopsien bei Mäusen und verfolgen Denkwunden in Echtzeit. Zusätzlich werden Methoden zur Herstellung von Geweben für histologische, immunhistochemische und molekulare Analysen des Wundbettes bereitgestellt.

Durchführen von colonoscopic-Guided Pinch Biopsien bei Mäusen und Bewertung nachfolgender Gewebeveränderungen

Dysregulierte intestinale epitheliale Barrierefunktion und Immunantworten sind Kennzeichen entzündlicher Darmerkrankungen, die aufgrund fehlender physiologischer Modelle noch schlecht untersucht sind. Hier beschreiben wir ein Maus-Darmschleifenmodell, das ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment verwendet, um die Schleimhautpermeabilität und die Leukozytenrekrutierung in vivo zu untersuchen.

Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

Erfahren Sie die nicht-invasive endoskopische Überwachung therapeutischer Wirksamkeit bei Kolitis und Darmkrebs in lebenden Mäusen. Diese Methode ermöglicht die präzise Bewertung von Behandlungseffekten im Zeitverlauf.

Nicht-invasive Beurteilung der Wirksamkeit neuer Therapeutika für Darmpathologien Verwenden der seriellen endoskopische Bildgebung von lebenden Mäusen (Video) | JoVE Journal

Nicht-invasive Beurteilung der Wirksamkeit neuer Therapeutika für Darmpathologien Verwenden der seriellen endoskopische Bildgebung von lebenden Mäusen

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