Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, genetisch veränderte chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen von Mäusen zu erzeugen und ihre Wirksamkeit im Rahmen der Standardtherapie zu evaluieren. Bei hochgradigen Gliomen wird dies erreicht, indem zunächst mit der Standardbehandlung, der Bestrahlung des gesamten Gehirns und der Verabreichung von Temozolomid an Mäuse begonnen wird. Als nächstes wird ein Retrovirus produziert, das den Car-Vektor exprimiert, dann werden murine T-Zellen mit dem Car-Retrovirus transduziert.

Schließlich werden CAR-T-Zellen an Mäuse abgegeben, die mit der Standardbehandlung behandelt wurden, wobei schließlich CAR-T-Zellen in Verbindung mit Ganzhirnbestrahlung und Temozolomid verabreicht werden. Die Verabreichung wird verwendet, um zu testen, ob die Wirtskonditionierung durch Standardbehandlung die Wirksamkeit einer adoptiven T-Zell-Plattform erhöht. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Hirntumor-Immuntherapie zu beantworten, wie z.B. die Anti-Tumor-Wirksamkeit neuartiger Immuntherapien im Rahmen der Standardbehandlung von hochgradigen Gliomen.

Diese Methode kann jedoch Aufschluss über die Wirksamkeit von genmodifizierten Mi- und T-Zellen gegen hochgradige Gliome geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf die Bewertung der T-Zelltherapie gegen Melanom-, Lungen- und andere Hirnmetastasentumormodelle. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da dieses Verfahren mehrere Schritte erfordert, die parallel durchgeführt werden müssen.

Daher ist die Planung und Organisation von Aufgaben von entscheidender Bedeutung. Catherine Uni und Carter s Deva, beides talentierte Doktorandinnen aus meinem Labor, werden das Verfahren vorführen. Nachdem Sie drei Milligramm pro Milliliter Temozolomid oder TMZ in DMSO hergestellt haben, geben Sie die Lösung 10 bis 15 Minuten lang in ein Becherglas mit Wasser über einer heißen Platte bei 65 Grad Celsius.

Sobald sich das TMZ vollständig aufgelöst hat, sollte die Lösung eine blassgelbe Farbe annehmen. Füllen Sie 15 Ein-Milliliter-Spritzen vollständig mit TMZ-Lösung. TMZ sollte innerhalb von 90 Minuten nach der Zubereitung verabreicht werden, um sicherzustellen, dass kein TMZ aus der Lösung ausfällt, um die Bestrahlungsleistung des gesamten Gehirns am Röntgenstrahler durchzuführen und ihm zu ermöglichen, sich aufzuwärmen, sicherzustellen, dass der geeignete Filter eingesetzt ist, und die richtigen Spannungs- und Stromeinstellungen einzugeben.

Sobald die Mäuse sediert wurden, legen Sie die sedierten Mäuse gemäß dem Textprotokoll auf das Gitter, wobei ihre Köpfe in dem Bereich positioniert sind, der die höchste Röntgenintensität erhält. Verwenden Sie Bleischläuche, um die Körper vom Hals abwärts abzuschirmen, um die systemische Röntgenabgabe zu blockieren. Legen Sie die Mäuse in das Röntgengerät, wenn die Röntgenabgabe abgeschlossen ist.

Nehmen Sie die Tiere aus dem Bestrahlungsgerät. Wenn die Tiere wieder zu ausreichend Bewusstsein gekommen sind und das Brustbein liegend halten, setzen Sie sie wieder in die entsprechenden Käfige. Nach der Vorbereitung des D 10-Mediums und der Ernte von HEC 2 93 T-Zellen gemäß dem Textprotokoll wird ein Milliliter Zellsuspension in 7,5 mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter in jede der 1610 Zentimeter Poly-L-Lysin-beschichteten Platten mit 10 Millilitern D 10-Medium gegeben, die am folgenden Tag über Nacht inkubiert werden.

Und nach der Vorbereitung des Autoplasmids und des Transfektionsreagenzes, wie im Textprotokoll beschrieben, geben Sie den Lipid-DNA-Komplex tropfenweise für sechs bis acht Stunden in das HEC 2 93 T-Zell-Inkubat. Ersetzen Sie dann das Medium durch 12 Milliliter frisches T-Zell-Medium oder TCM. Gießen Sie dann eine Milz über ein 70-Mikrometer-Netzzellensieb und disaggregieren Sie, indem Sie das stumpfe Ende der Innenseite einer Fünf-Milliliter-Spritze verwenden, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen.

Nach der Vorbereitung eines frischen TCM-Pools, der disaggregierten Milz in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen in TCM und Pellet, eliminieren die Zellen rote Blutkörperchen, indem sie fünf Milliliter eines x Lysepuffers pro Milz verwenden, um die Zellen wieder zu resuspendieren und sich durch sanftes Auf- und Abpipettieren gut zu mischen. Legen Sie die Zellsuspension fünf Minuten lang in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Nehmen Sie die Lysereaktion aus dem Wasserbad und fügen Sie TCM im Verhältnis eins zu eins mit Lysepuffer hinzu, um die Reaktionswäsche zu neutralisieren, indem Sie 10 Minuten lang bei 300 g schleudern.

Nach dem Aspirieren des Überstands verwenden Sie zwei Milliliter TCM pro Milz, um das Pellet zu resuspendieren. Um die Zellen zu zählen, fügen Sie 10 Mikroliter Zellsuspension zu 190 Mikrolitern Trianblau hinzu. Sobald die Gesamtzahl der Zellen berechnet wurde, verwenden Sie TCM, ergänzt mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Conna A und 50 internationalen Einheiten pro Milliliter rekombinantem humanem Interleukin zwei, um die Zellen auf eine Konzentration von zwei mal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter zu verdünnen. Geben Sie zwei Milliliter oder viermal 10 zu den sechsten Zellen in jede Vertiefung einer 24 gut behandelten Gewebekulturplatte und inkubieren Sie am Tag nach der Splenektomie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Bereiten Sie PBS mit 25 Mikrogramm pro Milliliter vor. Rekombinantes humanes Fibronektinfragment oder RHFF und beschichten Sie nicht gewebekulturbehandelte 24-Well-Platten, indem Sie am nächsten Tag 0,5 Milliliter der Lösung in jede Vertiefung geben. Nehmen Sie die Lösung aus den Vertiefungen und fügen Sie pro Mulde einen Milliliter 2%iges BSA in PBS hinzu, das 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wird.

Entfernen Sie dann das BSA, indem Sie die Platte fest umdrehen, bevor Sie zwei Milliliter PBS zum Waschen hinzufügen. Nach dem Sammeln des Virusüberstands aus den HEC 2 93 T-Zellen wird frisches TCM zu einem Endvolumen in Millilitern hinzugefügt, das der Anzahl der RHFF-beschichteten Wells entspricht, zuzüglich weiterer drei Milliliter. Nehmen Sie die kultivierten Milzzyten aus dem Inkubator und suspendieren Sie die Reanimation, indem Sie jeweils zwei- bis dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren.

Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Als nächstes resuspendieren Sie die Zyten im Virusüberstand auf einmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter. Geben Sie dann einen Milliliter der Plete-Suspension pro Vertiefung in die Vertiefungen der RHFF-beschichteten Platten.

Nun drehst du die Platten 90 Minuten lang bei 32 Grad Celsius und 770 GS mit einer Beschleunigung von vier und einer Bremsstellung von Null während des Schleuderns. Bereiten Sie 50 internationale Einheiten pro Milliliter rekombinantes humanes IL zwei in TCM vor. Nach dem Schleudern einen Milliliter des Mediums in jede Vertiefung der Platten geben und über Nacht inkubieren.

Wenn T-Zellen eine Konfluenz von mehr als 80 % erreichen, teilen Sie die Zellen, indem Sie zwei- bis dreimal vorsichtig in jeder Vertiefung auf und ab pipettieren. Übertragen Sie dann einen Milliliter aus jeder Vertiefung in neue Vertiefungen einer frischen 24-Well-Platte mit Gewebekultur. Geben Sie einen Milliliter frisches TCM mit 50 internationalen Einheiten pro Milliliter IL zwei in jede Vertiefung, wenn die Zellen nicht mehr als 80 % Konfluenz erreichen, ändern Sie die Hälfte des Mediums, indem Sie langsam einen Milliliter Medium von der Oberseite jeder Vertiefung abpipettieren und durch einen Milliliter frisches TCM ersetzen, das 50 internationale Einheiten pro Milliliter rekombinantes humanes IL enthält. In jeder Vertiefung dreimal nach unten geben und in ein 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umfüllen.

Die Zellen 10 Minuten lang bei 300 GS drehen. Saugen Sie anschließend den Überstand vollständig an, ohne das Pellet zu stören. Verwenden Sie PBS, um die Zellen zu waschen, und zählen Sie sie dann, bevor Sie sie ein zweites Mal waschen.

Eine typische CAR-T-Zell-Ausbeute beträgt etwa einmal 10 bis sechs Zellen pro Vertiefung mit PBS Resus. Suspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von fünfmal 10 bis sieben pro Milliliter für eine Injektion von eins mal 10 bis sieben in einem Volumen von 200 Mikrolitern, um sie in tumortragende Mäuse zu injizieren. Verwenden Sie eine 27- bis 31-Gauge-Nadel, um 500 bis 1000 Mikroliter in eine Insulinspritze zu laden, und stellen Sie sicher, dass alle Blasen ausgestoßen werden. CAR-T-Zellen wurden durch Transduktion mit dem retroviralen Vektor E GFR V mit drei CARs erzeugt, der das Rine-Stammzellvirus oder MSCV-Long-Terminal-Repeats enthält.

Die erweiterte Knebelregion und die Spleißstelle der Hülle sowie ein virales Verpackungssignal. Das EG FFR V drei Auto mit dem menschlichen Anti-EEG FRV drei einkettiges variables Fragment. 1 39 wurde in den retroviralen Vektor zusammen mit murinen CD 8, tm CD 28 4 1 BBB und CD drei zeta intrazellulären Regionen kloniert. Nach der Transduktion können EG FFR V drei CAR-T-Zellen quantifiziert und durch Durchflusszytometrie mit einem zweifarbigen Panel quantifiziert und phänotypisiert werden, das aus einem STRT-Bicorin-konjugierten biotinylierten EG FFR V drei, abgeleiteter Multier und Anti-CD drei fit C.Unter Verwendung des in diesem Video beschriebenen Protokolls wird die car-Expression routinemäßig in 55 bis 70% der CD 3-positiven murinen T-Zellen beobachtet.

CAR-T-Zellen können durch Zugabe anderer fluoreszenzmarkierter Antikörper zu dem zweifarbigen Car-Panel weiter phänotypisiert werden, wie in diesem Beispiel zu sehen ist. Die Färbung für CD 8 und CD vier zeigt, dass 70 % der transduzierten Autos CD 8-positive T-Zellen sind, während 20 % CD 4-positive T-Zellen sind. Diese Technik kann in 12 Stunden über einen Zeitraum von einer Woche durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Andere Methoden wie Elisa-, Ellie-Spot- und/oder intrazelluläre Zytokinfärbung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten.

Reagieren Ihre chimären Antigenrezeptor-transduzierten T-Zellen beispielsweise funktionell auf die Antigenerkennung und ist ihre Funktionalität antigenspezifisch? Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Retroviren, Temozolomid und Röntgenstrahlung extrem gefährlich sein kann und Auswirkungen wie der Betrieb unter BSL haben kann. Zwei Bedingungen: das Tragen persönlicher Schutzausrüstung, die Durchführung von Experimenten in den dafür vorgesehenen Bereichen und die Erlangung einer angemessenen Schulung für den Umgang mit Tieren.

Und bei der Durchführung dieser Eingriffe sollte immer ein Röntgengerät verwendet werden.