Name: Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Generierung von EGFRvIII-spezifischen CAR T-Zellen für die Immuntherapie von Glioblastomen im Kontext der Standardtherapie. Diese Methode zeigt, wie Strahlentherapie und Temozolomid die Wirksamkeit adoptiver T-Zelltherapien verbessern.

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Die Autoren möchten Dr. Laura Johnson und Dr. Richard Morgan für die Bereitstellung des retroviralen CAR-Konstrukts danken. Die Autoren danken auch Giao Ngyuen für ihre Unterstützung bei der Dosimetrie für die Ganzhirnbestrahlung. Diese Arbeit wurde durch ein NIH NCI-Stipendium 1R01CA177476-01 unterstützt.

Dieses Protokoll basiert auf einem experimentellen Design, bei dem 10 Mäuse werden mit 10 7 CAR T-Zellen, die jeweils behandelt wurden. Das bedeutet, dass 10 8 CAR T-Zellen benötigt werden; die Ausbeute sollte von 5 x 10 -1 7 x 10 8 bis Konto für den Verlust der Lebensfähigkeit überschätzt werden. Das folgende Protokoll wird so skaliert, etwa 200 x 10 6 Zellen zu erzeugen. Die Zellen werden dann intravenös an weibliche C57BL / 6 Mäuse mit 9 Tage etabliert syngenen EGFRvIII-positiven intrakraniellen Tumoren verabreicht wird, von der bestehenden KR158B Astrozytom oder B16 Melanomzelllinien entwickelt. Gleichzeitig mit CAR T-Zell-Generation, sind tumortragenden Mäusen verabreicht klinisch relevanten Dosen von lymphodepletive TMZ (60 mg / kg) und WBI (16,5 Gy). Die Mäuse wurden gepflegt und unter pathogenfreien Bedingungen an der Duke University Medical Center (DUMC) gezüchtet. Alle Tierversuche wurden nach Protokollen von der Duke University Institution genehmigt durchgeführtal Animal Care und Verwenden Committee (IACUC). 1. Verabreichung von Temozolomid zur Tumor-tragenden Mäusen Den Tagen 0 bis 4: <ol><li> Berechnen der Gesamtanzahl von Mäusen injiziert werden und sich vermehren, indem 0,5, um das Volumen benötigt werden (zum Beispiel 30 x Mäusen 0,5 ml = 15 ml TMZ) TMZ Lösung zu bestimmen, und 1,5 ml dieses Bandes um Spillover (16,5 ml TMZ Konto ). </li><li> Multipliziert man diese Gesamtmenge von 3 mg / ml, um das Gewicht des lyophilisierten TMZ erforderlich zu bestimmen (beispielsweise 16,5 x 3 = 49,5 mg TMZ). Wiegen diese in ein konisches 50 ml. ACHTUNG: TMZ ist durch Einatmen, Verschlucken und Berührung mit den Augen, Haut und Schleimhäute giftig. Beraten Sie sich mit Arbeitssicherheit Institution und / oder Umwelt, Gesundheit und Wellness-Abteilung für Empfehlungen zur Verringerung des Risikos der Exposition. </li><li> Multiplizieren das Gesamtvolumen von 0,15, das Volumen an Dimethylsulfoxid zu bestimmen (DMSO) benötigt wird (beispielsweise 16,5 x0,15 = 2,475 ml DMSO). Filter sterilisieren Volumen DMSO (plus eine zusätzliche 2 ml für Greifen ausmachen) durch ein 0,2 um-Filter in ein steriles Röhrchen. Fügen 2,475 ml sterilem DMSO zu der TMZ-Pulver. </li><li> Legen Sie die TMZ / DMSO-Lösung in einen Becher Wasser über einer Heizplatte bei 65 ° C für 10-15 Minuten. Sobald TMZ vollständig aufgelöst ist, sollte die Lösung leicht gelb gefärbt werden; Wenn sich die Lösung rosa, dann wird die TMZ abgebaut und eine neue Lösung sollte mit einer frischen Menge TMZ hergestellt werden. </li><li> Berechnen des geeigneten Volumens von steriler Kochsalzlösung durch Multiplizieren 0,85 durch das Gesamtvolumen (0,85 x 16.5 ml = 14,025 ml Salzlösung) benötigt. 15 ml sterile Kochsalzlösung in einem 50 ml konischen. Während TMZ Auflösen in DMSO, Wärmekochsalzlösung auf 65 ° C. </li><li> Vortex die TMZ / DMSO-Lösung, um sicherzustellen, dass die TMZ Pulver vollständig gelöst und langsam erwärmt Salz zum TMZ / DMSO-Lösung. </li><li> Unmittelbar nach der Herstellung, 15 x 1 ml Tuberkulin syring voll ladenes mit TMZ-Lösung für die Verabreichung an 4 Tage etabliert tumortragenden Mäusen. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang an den Tagen 1 bis 4 für insgesamt fünf TMZ Verwaltungen. </li></ol> 2. Ganzhirnbestrahlung von tumortragenden Mäusen Den Tagen 2 bis 4: <ol><li> Schalten Sie das Röntgenbestrahlungsgerät und lassen Sie ihn warmlaufen, um die volle Spannung. Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Filter in Kraft ist und Eingabe der richtigen Spannung und die aktuellen Einstellungen (Abbildung 2A). HINWEIS: Die Dosimetrie des Bestrahlungs sollte im voraus erwiesen, um den entsprechenden Spannungseinstellungen und Grid-Layout (2A, B) zu bestimmen. </li><li> Berechnen der Zeitdauer, die notwendig ist, um in 5,5 Gy Röntgenstrahlung führen. Wenn beispielsweise Röntgenstrahlen werden mit einer Rate von 2 Gy / min geliefert, dann 2,75 min notwendig, um insgesamt 5,5 Gy liefern. Geben Sie die entsprechenden Zeitdauer. HINWEIS: In Tabelle 2 sind Maus WBI dosiert einnd ihre klinische Mittel beim Menschen. Im Zusammenhang mit der hochgradigen Gliomen, 60 Gy fraktioniert WBI (2 Gy Fraktionen, 5 Tage / Woche für 6 Wochen) ist die klinische Pflegestandard und die murine Äquivalent verwendet hier 16,5 Gy (5,5 Gy × 3). </li><li> Eine frische Lösung von Ketamin / Xylazin zur systemischen Anästhesie durch Zugabe von 2 ml Ketamin und 1 ml Xylazin und 17 ml Kochsalzlösung, so daß die endgültige Lösung 10 mg / ml Ketamin und 1 mg / ml Xylazin. </li><li> Wiegen Mäusen und verwalten 10 ul Ketamin / Xylazin intraperitoneal pro Gramm Körpergewicht, daß die Tiere eine Dosis von Ketamin bei 100 mg / kg und 10 mg / kg Xylazin empfangen. Mäuse sollten in vollem Umfang sediert werden und sichtbar innerhalb von 2 Minuten von Ketamin / Xylazin Verwaltung atmen. </li><li> Um Augen Feuchtigkeit in sedierten Tieren zu erhalten, reiben Sie eine kleine Menge von künstlichen Tränen Salbe auf jedes Auge. </li><li> Platzieren sediert Mäuse auf dem Gitter, so dass Köpfe werden in dem Gebiet, das die höchste Röntgen in empfängt positioniertIntensität (Abbildung 2B, C). Schild Körper vom Hals abwärts mit geeigneter Größe Bleirohr, um systemische Röntgen Lieferung (2D) zu blockieren. </li><li> Platzieren positioniert Mäusen unter dem Röntgenstrahl, so dass die Laser bezeichnet den Brennpunkt des Röntgenstrahls an der Koordinate (0,0) auf dem Gitter-Layout. Beginnen Röntgen Lieferung. </li><li> Wenn Röntgen Lieferung abgeschlossen ist, entfernen Tiere aus dem Bestrahlungsgerät und auf ein warmes Heizkissen. Sedierten Tieren mit wachen Tieren beherbergen Sie nicht, bis Tiere ausreichend wieder zu sich kam, um Brustbein recumbence halten. Wenn Tiere Brustbein recumbence halten, legen Sie wachen Tieren zurück in ihre entsprechenden Käfigen. </li><li> Wiederholen Sie diese Prozedur an den Tagen 3 und 4 für insgesamt drei fraktionierten Dosen von Strahlung. </li></ol> 3. Transfektion Tag -1: <ol><li> Bereiten D10 Medium durch Zugabe von 50 ml fötales Rinderserum (FBS) und 500 ml von Dulbeccos Modified Eagle-Medium (DMEM). </li><li> Bereiten T Zellmedien (TCM) durch Zugabe 5,5 ml L-Glutamin, 5,5 ml Natriumpyruvat, 5,5 ml nicht-essentiellen Aminosäuren, und 5,5 ml Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) zu 500 ml RPMI-1640-Medium. Als Nächstes fügen 550 ul 2-Mercaptoethanol und 550 &amp; mgr; l Gentamycin. Schließlich, fügen Sie 50 ml FBS. </li><li> Ernte in vitro kultivierten HEK293T Zellen und bringen auf eine Konzentration von 7,5 x 10 6 Zellen / ml in D10 Medien. </li><li> Platte 10 ml D10 Medien und 1 ml HEK293T-Zellsuspension in jede der 16 x 10 cm mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichteten Platten. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> Tag 0: <ol start="6"><li> Tauschen Sie Medien mit 10 ml frischem D10 mindestens 30 Minuten vor Transfektion von Zellen. </li><li> Bestimmung der Menge an Vektor-Plasmid pCL-Eco Vektor und liposomalen Transfektionsreagenz zur Transfektion erforderlich durch Multiplizieren der Gesamtzahl der Platten + 1 (16 + 1 = 17) von 14,1 &amp; mgr;Vektorplasmid (14,1 x 17 = 239,7 &amp; mgr; g) 9,9 &amp; mgr; g pCL-Eco-Vektor (9,9 x 17 = 168,3 &amp; mgr; g), und 60 ul liposomalen Transfektionsreagenz (60 x 17 = 1.020 &amp; mgr; l). Alle Reagenzien werden bei Raumtemperatur vor der Herstellung von Lösungen sein. </li><li> Beschriften Sie zwei Röhren A und B Rohr A, fügen 239,7 ug Vektorplasmid und 168,3 &amp; mgr; g pCL-Eco Vektor (1,5 x 17) ml reduziert Serum modifiziertem Eagle-Medium (RS-MEM). In Rohr B, fügen Sie 1020 ul liposomalen Transfektionsreagenz auf (1,5 x 17) ml RS-MEM. </li><li> Inkubieren A und B getrennt für 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Mischen Sie A und B zusammen sanft (Vortex für 1-2 sec oder Invertzucker mehrmals) und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur, um Lipid / DNA-Komplex zu bilden. </li><li> Fügen Lipid / DNA-Komplex tropfenweise zu HEK293T-Zellen in 10-cm-Schale. </li><li> Bei 37 ° C für 6-8 h oder über Nacht (24 h nicht überschreiten). </li><li> Nach 6-8 h Inkubation ersetzen Medium mit 12 ml frischem TCM für die Virusproduktion. Diese vernickelt Medienwird an Tag 2 als viraler Überstand für T-Zell-Transduktion verwendet werden. </li></ol> 4. Splenektomie und T-Zell-Vorbereitung Tag 0: <ol><li> Gießen Sie 10 ml der TCM in einen 50-ml-Erlen und auf Eis für Milz Sammlung. </li><li> Opfern Sie die entsprechende Anzahl der Tiere mit CO 2 Ersticken und Sekundär Enthauptung: Platz Tiere in einem Käfig Erhalt CO 2 mit einer Flussrate von 10-30% Käfigvolumen / Minute, je American Veterinary Medical Association Richtlinien (nicht mehr als 5 Tiere können sein geopfert gleichzeitig), bis die Atmung beendet und danach für zwei Minuten. Tiere entfernen aus dem CO 2 Kammer und enthaupten. HINWEIS: Eine Milz einer 6-12 Wochen alte weibliche C57BL / 6-Maus wird etwa 4,5-5 x 10 7 Splenozyten ergeben. Dabei wird 4 Milzen etwa 200 x 10 6 Zellen geerntet werden. </li><li> Legen Sie die Maus, so dass die rechte Seite nach oben zeigt, undSpray mit 70% Ethanol. Mit der Zange, schnappen Sie sich einen dünnen Hautfalte unterhalb der linken Brustkorb und schnitt einen leichten Schnitt mit der Schere. Ziehen Sie die Haut vorsichtig packen eine dünne Falte des Bauchfells mit einer Pinzette und schneiden Sie einen kleinen Hohlraum. </li><li> Die Milz ist eine kleine, längliche, dunkelrote Organ, das einen abgeflachten Bohne ähnelt; zart greifen die Milz mit der Zange und Verbrauch durch Wegschneiden des umgebenden Bindegewebes. Platzieren Sie die Milzen herausgeschnitten, in den konischen, die 10 ml TCM auf Eis. </li><li> Gießen Milzen über einem 70 um Sieb Zellsieb und disaggregieren durch Maischen mit dem stumpfen Ende der in einen 5-ml-Spritze, um eine Einzelzellsuspension zu erzeugen. Es können maximal zwei Milzen sollte pro Mesh Sieb aufgeschlüsselt werden. </li><li> Mit einem kleinen Volumen von TCM sorgfältig waschen Sie das Sieb nach Disaggregation, um alle verbleibenden Splenozyten zu sammeln. Pool alle aufgeschlüsselte Milz in eine Einzelzellsuspension. Endvolumen auf 50 ml mit TCM für einen Wasch einerd bei 300 g für 10 Minuten zu drehen. </li><li> Es wird eine Lösung aus 1x Lysepuffer durch Zugabe von 5 ml 10x Lysepuffer 45 ml sterilem Wasser. Um den roten Blutkörperchen, Pellet in 5 ml 1x Lysepuffer pro Milz in einem 50 ml konischen gut mischen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren beseitigen. Wenn mehr als 5 Milz, mit einem 250 ml-Zentrifugenröhrchen. Platzieren konischen oder Zentrifugenröhrchen in einem 37 ° C Wasserbad für 5 min. </li><li> Entfernen Sie die Lyse-Reaktion aus dem Wasserbad und fügen TCM bei einem 1: 1-Verhältnis mit Lysepuffer, um die Reaktion zu neutralisieren. Durch Spinnen bei 300 g für 10 Minuten waschen. </li><li> Überstand entfernen und voll Pellet in TCM (2 ml / Milz, 8 ml insgesamt 4 Milz), die durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Zählen von Zellen durch Zugabe von 10 &amp; mgr; l der Zellsuspension in 190 ul Trypanblau (1:20 Verdünnung). Multiplizieren die in einer der vier Gitterquadrate von 20 x 10 4 x Gesamtvolumen (8 ml) erhaltenen Zahl, um die Gesamtzellzahl zu erhalten (beispielsweise 125 Zellen x 20 x 10 4 </sup&gt; x 8 ml = 200 x 10 6 Milzzellen). </li><li> Verdünnte Zellen auf eine Konzentration von 2 x 10 6 Zellen / ml in TCM mit 2 ug / ml Concanavalin A (ConA) und 50 IU / ml rekombinantem humanem Interleukin-2 (rhIL-2) ergänzt wird. So ist 200 x 10 6 Milzzellen, fügen Sie 92 ml Medium bis 8 ml Zellen, 200 ug ConA und 5.000 IE rhIL-2. </li><li> 2 ml Zellen zu jeder Vertiefung der 24-Well-Gewebekultur-behandelten Platten, derart, daß 4 x 10 6 Zellen werden in jede Vertiefung (beispielsweise 100 ml der Zellen werden etwa 4 Platten erfordern). </li><li> Inkubieren über Nacht bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li></ol> 5. Transduction 1. Tag: <ol><li> Berechnen Sie die Anzahl der Nicht-Gewebekultur-behandelten 24-Well-Platten für die Weiterleitung benötigt, indem die Anzahl der Milz von 2 geerntet (8 Platten werden 4 Milz erforderlich) zur Verfügung. </li><li> Als nächstes berechnen die benötigte Menge von rekombinantem Human-Fibronektin-Fragment (RHFF) Lösungzu beschichten Platten durch Multiplikation notwendig (Gesamtzahl der Vertiefungen + 3) x 0,5 ml (8 Platten x 24 Wells = 192 + 3 = 195) x 0,5 ml = 97,5 ml. </li><li> Bereiten 97,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend RHFF bei einer Konzentration von 25 ug / ml durch Multiplizieren der Gesamtmenge mit 25 &amp; mgr; g (97,5 x 25 = 2437,5 &amp; mgr; g). Fügen Sie diese Menge an RHFF auf 97,5 ml PBS. </li><li> Coat Nichtgewebekultur behandelten 24-Well-Platten durch Zugabe von 0,5 ml PBS / RHFF Lösung pro Well. </li><li> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C. </li></ol> Tag 2: <ol start="6"><li> Dump PBS / RHFF Lösung aus nicht-Gewebekultur-behandelte Platten mit 24 Vertiefungen. </li><li> 1 ml / Vertiefung 2% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS und Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min. </li><li> Entfernen BSA durch festes umstülpend Platte. Durch Zugabe von 2 ml PBS waschen. </li><li> Sammeln viralen Überstand durch Übertragen von Medien voneinander HEK293T PDL Platte in ein 250 ml-Zentrifugenröhrchen und Spin 10 min bei 500 x g. </li><li> Sorgfältig übertragen Virus supernatant in eine frische 250 ml Zentrifugenröhrchen, wobei Sie nicht auf das Zellpellet sich gebildet haben können stören. </li><li> Frisches TCM dem viralen Überstand, so dass das Endvolumen von 3 ml über dem für RHFF beschichteten Vertiefungen benötigten Menge. Beispielsweise wird für 192 RHFF beschichteten Vertiefungen, bringe das Volumen der Virusüberstand zu 192 + 3 ml = 195 ml. </li><li> Entfernen kultivierten Splenozyten aus dem Inkubator und Resuspension durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren 2-3 mal in jede Vertiefung. In einen 250-ml-Erlen. Bei Verwendung einer Mehrkanalpipette, mit einem sterilen Behälter vor der Übertragung wird Ihnen helfen, diesen Schritt zu beschleunigen. Zählen Sie, wie oben beschrieben und Spin bei 300 g für 10 min. </li><li> Hinzufügen rhIL-2 auf virale Überstand in einer Konzentration von 50 IU / ml. Fügen Sie beispielsweise 50 x 195 = 9750 IU rhIL-2-195 ml Virusüberstand. </li><li> Resuspendieren Splenozyten in viralen Überstand bei 1 x 10 6 Zellen / ml </li><li> 1 ml / Vertiefung von Splenozyten Suspension RHFF beschichteten Platten mit 24 Vertiefungen. </li><li>Spin für 90 min nach der folgenden Einstellungen: 770 xg, Beschleunigung = 4, Brems- / Verzögerung = 0, 32 ° C. </li><li> Bereiten Sie eine TCM-Lösung mit 50 IU / ml rhIL-2. So bereiten Sie eine 200 TCM-Lösung durch Zugabe von 10.000 IE rhIL-2. 1 ml rhIL-2 / TCM jeder Vertiefung nach dem Zentrifugieren. </li><li> Kultur über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2. </li></ol> 6. CAR T-Zell-Kultur und Ernte Tag 3 und 4: <ol><li> Wenn T-Zellen zu erreichen&gt; 80% Zusammenfluss können Zellen aufgeteilt werden (in diesem Fall in der Regel am Tag 3 oder Tag 4). So teilen Zellen vorsichtig pipettieren oben und unten in jeder Vertiefung 2-3 mal, und bewegen Sie 1 ml aus jeder Vertiefung in neue Vertiefungen einer frischen 24-Well-Gewebekulturplatte behandelt. Dann fügen Sie 1 ml frischem TCM mit 50 IU / ml IL-2 in jede Vertiefung, so dass endgültige Volumen ist 2 ml in alle Vertiefungen. </li><li> Wenn Zellen nicht&gt; 80% Konfluenz erreichen, führen Sie eine halbe Medienwechsel durch langsames Abpipettieren 1 ml Medium von der Spitze der jede Vertiefung. D vermeidenisturbing Zellen ließ sich auf den Boden, während der Beseitigung von Papier. 1 ml frischem TCM, enthaltend 50 IU / ml rhIL-2. </li></ol> Tag 5: <ol start="3"><li> Resuspendieren CAR T-Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren 3 mal in jede Vertiefung und in ein 250-ml-Zentrifugenröhrchen. Spin-Zellen bei 300 g für 10 min. </li><li> Komplett absaugen Überstand ohne störende Pellet. Einmal mit PBS zu waschen, zu zählen Zellen, wie zuvor beschrieben, und waschen mit PBS ein zweites Mal. Ein typisches CAR T-Zell-Ausbeute beträgt ca. 1 x 10 6 Zellen pro Vertiefung (8 x 24 Wells Platten = 192 x 10 6 CAR T-Zellen). </li><li> Zellen in PBS bei einer Konzentration von 5 x 10 7 / ml für eine Injektion von 1 × 10 7 in einem Volumen von 200 &amp; mgr; g (zB für 192 x 10 6 CAR T Zellen gewaschen Pellet in 3,84 ml PBS). </li></ol> 7. CAR T-Zell-Administration, um tumortragenden Mäusen Tag 5: <ol><li> Transport Zellen auf Eis zu Tierhaltung zur intravenösen Injektion. Last 500-1000 ul in Insulinspritze mit 27 bis 31 G-Nadel, um sicherzustellen, dass alle Blasen ausgestoßen werden. </li><li> Schnappen Sie sich eine Maus an der Basis des Schwanzes und setzen in Rohrrainer. </li><li> Ziehen Sie den Schwanz mit der Vene nach oben gespannt, und gleiten Sie die Nadel etwa 1-2 mm unter die Haut in die Vene, indem Sie ihn in die Schwanzvene parallel. Langsam vertreiben 200 ul in die Vene. Wenn die Nadel richtig in die Vene eingeführt, wird die Lautstärke leicht fließen in; sonst wird es Widerstand und die Nadel benötigt, um von dem Schwanz entnommen und vollständig wieder eingesetzt. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Die hier beschriebene Behandlung Timeline wurde konzipiert, um die klinische Behandlungsstandard modellieren und zu nutzen, ihre Auswirkungen für CAR Adoptiv Therapie. CAR T Zelldosen, TMZ Schemata und Strahlentherapie Verabreichung kann verändert werden, um in vivo T-Zell-Aktivität, lymphodepletion und Tumortötung zu erhöhen. TMZ Regimen erhöht werden, um Host Myeloablation und verstärkten Ausbau adoptiv transferierten Zellen 30 zu ergeben. Außerdem können die Auswirkungen der lymphodepletive TMZ du...

Das Glioblastom (GBM) ist die häufigste primären bösartigen Gehirntumor und ist immer tödlich. Die chirurgische Resektion in Verbindung mit nicht-spezifischen Standardtherapie Chemotherapie und Strahlentherapie nicht vollständig zu beseitigen Krebszellen, was zu einer düstere Prognose von weniger als 15 Monaten bei Patienten mit dieser Krankheit ein. Im Gegensatz dazu bietet die Immuntherapie eine genaue Vorgehensweise für die gezielt Tumorzellen angreift und somit das Potenzial hat, als eine sehr effektive Behandlungsplattform mit reduzierten Risiko von Sicherheiten Toxizität 2-4 dienen. T-Zellen entwickelt, ex vivo, um auszudrücken, chimären Antigenrezeptoren (CAR) bieten eine vielseitige Strategie zur Tumor-Immuntherapie. Die Autos werden durch Fusionieren der extrazellulären variable Region eines Antikörpers mit einem oder mehreren intrazellulären T-Zelle-Signalmolekül (en), die anstelle einer Volllängen-Haupthistokompatibilitätskomplex erzeugt (MHC) restringierten T-Zell-Rezeptor 5. Diese Art der antikörperähnlichen Antigens Sie AnAuf ermöglicht reaktiven Antigen-spezifische T-Zellen zu erkennen und zu reagieren, um Tumorantigene in Abwesenheit von MHC und kann für eine praktisch unendliche Antigenrepertoire angepasst werden. CAR-T-Zellen gegenüber einer Vielzahl von Tumorantigenen konstruiert wurden vorklinische Wirksamkeit und hervorragende Versprechen in der Klinik 6-9 gezeigt. Insbesondere im Zusammenhang mit der GBM eine CAR-T-Zell-Targeting-Plattform den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptorvariante III (EGFRvIII), ausgedrückt ein Tumor-spezifische Mutation an der Zelloberfläche 10, wurde gezeigt, dass das Überleben in Gliom-tragenden Mäusen 11 verlängern. Trotz ihrer Vielseitigkeit jedoch der klinische Nutzen von CAR adoptive Therapie nicht vollständig realisiert worden ist, was zum Teil an Tumor-assoziierte Immunsuppression und Immunumgehung 12-16 sowie Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung Antigen-spezifischen T-Zellen in vivo. Aufbauend Standardtherapie (SOC) mit Immuntherapie kann potenziell zu überwinden mehrere dieser lImitationen, was zu einer erhöhten Wirksamkeit sowohl in der präklinischen und klinischen Einstellung. SOC für post-Resektion GBM besteht aus hochdosiertem Temozolomid (TMZ), einem DNA-Alkylierungsmittel 17 und gesamte Gehirn Bestrahlung (WBI) 1. Diese Behandlungen gelten als mit Tumorvakzinen über Hochregulierung von Tumor-MHC-Expression von 18 bis 20 und das Vergießen von Antigenen durch toten Tumorzellen 17,19,21,22 Synergie. Tatsächlich ist die Zugabe von TMZ 20,23 oder 18,24 WBI führt zu verbesserten Antitumorwirksamkeit von immunbasierten Behandlungen in der präklinischen Einstellung. Ferner, wie viele nicht-spezifischen zytotoxischen Chemotherapeutika, TMZ ist bekannt, dass eine systemische Lymphopenie 25,26, die als Mittel zur Hostanlage für adoptive Therapie Plattformen 27-29 genutzt werden können verursachen. TMZ vermittelte lymphodepletion wurde gezeigt, dass die Häufigkeit und die Funktion von Antigen-spezifischen T-Zellen zu verstärken, was zu einer erhöhten Wirksamkeit eines ADOPtive Therapie Plattform gegen intrakranielle Tumore 30. Im Rahmen der CAR-Therapie dient lymphodepletion als Mittel zur Wirtsanlage sowohl durch die Reduzierung der Anzahl der endogenen Suppressor-T-Zellen 31 und 32 homöostatischen Proliferation induzierende über Einschränkungen des Wettbewerbs für Zytokine 33 und somit eine Verbesserung Antitumoraktivität 11,34. Angesichts der synergistische Beziehung zwischen GBM SOC und Immuntherapie-Plattformen, die Bewertung neuer Therapien und Adoptivimpfstoffplattformen im Rahmen der SOC ist von entscheidender Bedeutung für die Erstellung aussagekräftige Rückschlüsse auf die Wirksamkeit. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren für die Erzeugung und die intravenöse Verabreichung von murinen EGFRvIII spezifische CAR T-Zellen zusammen mit TMZ und WBI in Mäusen EGFRvIII-positive intrakraniellen Tumoren (siehe Abbildung 1 für die Behandlung Timeline). Kurz gesagt, werden CAR T-Zellen ex vivo durch retrovirale Transduktion gemacht. Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK) 293T-Zellen werden mit einem DNA / Lipid-Komplex (enthaltend die CAR-Vektor und pCL-Eco-Plasmiden), um Viren, die dann verwendet wird, um aktivierten murinen Splenocyten, die geerntet werden und parallel kultivierten transduzieren erzeugen transfiziert. Im Verlauf der CAR Generierung werden murine Hosts Lager EGFRvIII-positiven intrakraniellen Tumoren in Dosierungen entsprechend der klinischen SOC verabreicht fraktionierte ganzen Gehirn Röntgenbestrahlung und systemischen TMZ Behandlung. CAR T-Zellen werden dann intravenös lymphodepleted Gastgeber geliefert. Folgende Vorgehensweise wird in sieben getrennten Phasen beschrieben: (1) Die Verabreichung von Temozolomid an tumortragenden Mäusen, (2) Ganzhirnbestrahlung von tumortragenden Mäusen, (3) Die Transfektion, (4) Splenektomie und T-Zell-Vorbereitung, (5 ) Transduction, (6) CAR T-Zell-Kultur und Ernte, und (7) CAR T-Zell-Verwaltung auf tumortragenden Mäusen. Diese Phasen bestehen aus mehreren Schritten, die 6-7 Tage dauern und gleichzeitig durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>pCL-Eco Retrovirus Verpackung Vektor</td><td>Imgenex</td><td>10045P</td><td>Helfervektor zur Erzeugung von CAR-Retrovirus</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2010</td><td>Unspezifisches Mitogen zur Induktion der T-Zellproliferation und Virustransduktion</td></tr><tr><td>Retronektin</td><td>ClonTech/Takara</td><td>T100B</td><td>Erleichtert die retrovirale Transduktion von T-Zellen</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668-019</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>HEK293 Nährmedien</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>T-Zellkulturmedien</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life</td><td>Technologies</td><td>11058-021</td><td>Transfektionsmedien</td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine Life</td><td>Technologien</td><td>25030-081</td><td>T-Zell-Nährmedien-Ergänzung</td></tr><tr><td>100 mM Natriumpyruvat</td><td>Lebenstechnologien</td><td>11360-070</td><td>T-Zellkultur-Medienergänzung</td></tr><tr><td>100X MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung</td><td>Lebenstechnologien</td><td>11140-050</td><td>T-Zellkultur-Medienergänzung</td></tr><tr><td>55 mM 2-Mercaptoethanol</td><td>Lebenstechnologien</td><td>21985-023</td><td>Reduktionsmittel zur Entfernung freier Radikale</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td>T Zellkulturmedienergänzung</td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>Life technologies</td><td>15750-060</td><td>T Zellkulturmedienergänzung</td></tr><tr><td>GemCell U.S. Herkunft Fötales Rinderserum</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>Bietet Wachstumsfaktoren und Nährstoffe für in vitro Zellwachstum</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA), Fraktion V&ndash; </td><td>Gemini Bio Products</td><td>700-100P</td> in Standardqualität <td>Blockiert die unspezifische Bindung von Retroviren an Retronektin-beschichtete Platten</td></tr><tr><td>Pharm Lyse (10x Konzentrat)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>Lysiert rote Blutkörperchen während der Splenozytenverarbeitung</td></tr><tr><td>70 μm; m Sterile Zellsiebe</td><td>Corning</td><td>352350</td><td>Filtert große Gewebepartikel während der Splenozytenverarbeitung</td></tr><tr><td>ab 100 mm BioCoat Kulturschalen mit Poly-D-Lysin</td><td>Corning</td><td>356469</td><td>Fördert die HEK293-Zelladhäsion, um die Proliferation nach der Transfektion</td></tr><tr> zu maximieren<td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Temozolomid</td><td>Best Pharmatech</td><td>N/A</td><td>Lyophilisiertes Pulver, das am Tag der Verabreichung zubereitet</td> wird</tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D2650</td><td>Notwendig für die vollständige Auflösung von Temozolomid</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung</td><td>Hospira</td><td>IM 0132 (5/04)</td><td>Lösungsmittel für Temozolomid und Ketamin/Xylazin</td></tr><tr><td>Ketathesia HCl</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>11695-0701-1</td><td>Ketaminlösung</td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>Lloyd Inc</td><td>N/A</td><td>Xylazin sterile Lösung 100 mg/ml</td></tr></tbody></table>

generierung von car t-zellen für die adoptive therapie im kontext von glioblastoma standardtherapie

Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

Die adoptive T-Zell-Immuntherapie bietet eine vielversprechende Strategie, um maligne Gliome gezielt zu bekämpfen und zu eliminieren. T-Zellen können ex vivo so verändert werden, dass sie chimäre Antigenrezeptoren exprimieren, die spezifisch für Gliomantigene (CAR-T-Zellen) sind. Die Expansion und Funktion adoptiv übertragener CAR-T-Zellen kann durch die lymphodepletive und tumorizide Wirkung der Standard-Chemotherapie und Strahlentherapie potenziert werden. Wir beschreiben eine Methode zur Generierung von CAR-T-Zellen, die auf EGFRvIII, ein Gliom-spezifisches Antigen, abzielen, und bewerten ihre Wirksamkeit in Kombination mit einem Mausmodell der Glioblastom-Standardbehandlung. T-Zellen werden durch Transduktion mit einem retroviralen Vektor verändert, der das Anti-EGFRvIII-CAR-Gen enthält. Tumortragende Tiere werden einer Wirtskonditionierung durch eine Kur mit Temozolomid und Ganzhirnbestrahlung in Dosierungsschemata unterzogen, die dem klinischen Behandlungsstandard entsprechen. CAR-T-Zellen werden dann intravenös an geprimte Wirte abgegeben. Diese Methode kann verwendet werden, um die Antitumorwirksamkeit von CAR-T-Zellen im Rahmen der Standardtherapie zu bewerten.

CAR T-Zellen durch Transduktion mit dem EGFRvIII CAR retroviralen Vektor 11 erzeugt. Dieser Vektor, MSGV1 wurde vom SFGtcLuc_ITE4 Vektor 35, der die murine Stammzellen Virus (MSCV) langen terminalen Wiederholungen, die verlängerte gag-Region und Umschlag-Spleißstelle enthält entwickelt (Spleißdonorstelle, sd, und Spleißakzeptor, sa), und virale Verpackungssignal (ψ). Die EGFRvIII CAR enthaltend die humane anti-EGFRvIII scFv-Fragment (scFv) 139, zusammen mit murinem CD8TM, CD28, 4-1BB und CD3 &amp; ...

Die lymphodepletiven und immunmodulatorischen Effekte von Chemotherapie und Bestrahlungsstandard können genutzt werden, um die Antitumorwirksamkeit der T-Zell-Immuntherapie zu verbessern. Wir skizzieren eine Methode zur Erzeugung von EGFRvIII-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen und deren Verabreichung im Rahmen der Glioblastom-Standardtherapie.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, genetisch veränderte chimäre Antigenrezeptor-Maus-T-Zellen herzustellen und deren Wirksamkeit im Kontext der Standardtherapie zu bewerten. Bei hochgradigem Gliom wird dies erreicht, indem zunächst die Standardtherapie, bestehend aus Ganzhirnbestrahlung und Gabe von Temozolomid, an Mäusen durchgeführt wird. Anschließend wird ein Retrovirus, das den CAR-Vektor exprimiert, hergestellt und dann murine T-Zellen mit dem CAR-Retrovirus transduziert.Schließlich werden CAR-T-Zellen Mäusen verabreicht, die gemäß der Standardtherapie behandelt wurden, wobei die endgültige Verabreichung der CAR-T-Zellen in Kombination mit Ganzhirnbestrahlung und Temozolomid erfolgt. Diese Applikation dient dazu zu testen, ob die Wirtsvorbereitung durch die Standardtherapie die Wirksamkeit einer adoptiven T-Zell-Plattform verbessert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immuntherapie von Hirntumoren zu beantworten, beispielsweise die antitumorale Wirksamkeit neuartiger Immuntherapien im Kontext der Standardtherapie für Gliome hohen Grades.Obwohl diese Methode Einblicke in die Wirksamkeit von genveränderten mi- und T-Zellen gegen hochgradige Gliome ermöglichen kann, ist sie ebenfalls auf andere Systeme anwendbar, beispielsweise auf die Bewertung der T-Zell-Therapie bei Melanom, Lungenkrebs und anderen Modellen von Hirnmetastasen. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode neu beginnen, Schwierigkeiten haben, da das Verfahren mehrere parallel durchzuführende Schritte erfordert.Daher sind Planung und Organisation von Aufgaben entscheidend. Die Durchführung der Prozedur zeigen Catherine Uni und Carter s Deva, zwei talentierte Doktoranden aus meinem Labor. Nachdem Sie drei Milligramm pro Milliliter Temozolomid oder TMZ in DMSO vorbereitet haben, stellen Sie die Lösung für 10 bis 15 Minuten in ein Becherglas mit Wasser auf eine Heizplatte bei 65 Grad Celsius.Nachdem das TMZ vollständig gelöst ist, sollte die Lösung eine blassgelbe Farbe annehmen. Füllen Sie 15 Ein-Milliliter-Spritzen vollständig mit der TMZ-Lösung. Das TMZ sollte innerhalb von 90 Minuten nach der Zubereitung verabreicht werden, um sicherzustellen, dass kein TMZ aus der Lösung ausfällt. Schalten Sie die Bestrahlungsleistung für die Ganzhirnbestrahlung am Röntgenbestrahlungsgerät ein und lassen Sie es aufwärmen, stellen Sie sicher, dass der geeignete Filter eingesetzt ist, und geben Sie die korrekten Spannungs- und Stromwerte ein.Nachdem die Mäuse gemäß dem Textprotokoll sediert wurden, positionieren Sie die sedierten Tiere auf dem Gitter, wobei die Köpfe im Bereich liegen sollen, der die höchste Röntgenstrahlenintensität erhält. Schützen Sie die Körper ab dem Hals mithilfe von Bleirohren, um eine systemische Bestrahlung mit Röntgenstrahlen zu verhindern. Stellen Sie die Mäuse nach Abschluss der Röntgenbestrahlung in die Röntgenanlage.Entfernen Sie die Tiere aus dem Bestrahlungsgerät. Sobald die Tiere ausreichend bei Bewusstsein sind und die Brustlage beibehalten können, stellen Sie sie in die entsprechenden Käfige zurück. Nachdem das D10-Medium vorbereitet und die HEC293T-Zellen gemäß dem Textprotokoll gewonnen wurden, geben Sie je ein Milliliter Zellsuspension mit einer Konzentration von 7,5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in jede der 10 cm großen, mit Poly-L-Lysin beschichteten Platten, die jeweils 10 Milliliter D10-Medium enthalten, und inkubieren Sie über Nacht. Am folgenden Tag führen Sie die weiteren Schritte durch.Und nachdem das Car-Plasmid und das Transfektionsreagenz gemäß dem schriftlichen Protokoll vorbereitet wurden, die Lipid-DNA-Komplexe tropfenweise dem HEC-2-93-T-Zellinkubat zugeben und sechs bis acht Stunden inkubieren. Danach das Medium durch 12 Milliliter frisches T-Zellmedium oder TCM ersetzen. Als Nächstes eine Milz über einen 70-Mikrometer-Zellsieb gießen und durch Verwenden des stumpfen Endes des Inneren einer 5-Milliliter-Spritze disaggregieren, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen.Nach der Zubereitung eines frischen TCM-Pools wird die disaggregierte Milz in einem 50-Milliliter-Konischgefäß in TCM pelletiert. Die roten Blutkörperchen werden durch Zugabe von fünf Milliliter 1× Lysepuffer pro Milz eliminiert, wobei die Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren gut resuspendiert werden. Die Zellsuspension wird für fünf Minuten in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius gestellt. Die Lysereaktion wird aus dem Wasserbad entnommen, und TCM wird im Verhältnis 1:1 zum Lysepuffer zugegeben, um die Reaktion zu neutralisieren. Anschließend wird durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 Minuten gewaschen.Nach dem Absaugen des Überstandes den Pellet mit zwei Millilitern TCM pro Milz resuspendieren. Um die Zellen zu zählen, 10 Mikroliter Zellsuspension zu 190 Mikroliter Trypanblau hinzufügen. Sobald die Gesamtzahl der Zellen berechnet wurde, die Zellen in TCM verdünnen, das mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Concanavalin A und 50 internationalen Einheiten pro Milliliter rekombinantem humanen Interleukin-2 ergänzt ist, sodass eine Konzentration von zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter erreicht wird. Jeweils zwei Milliliter oder vier mal 10 hoch sechs Zellen in jede Vertiefung einer 24-Loch-Gewebekulturplatte geben und am Tag nach der Splenektomie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren.Herstellen von PBS, das 25 Mikrogramm pro Milliliter enthält. Rekombinantes humanes Fibronectin-Fragment oder RHFF, und Beschichten von nicht für Gewebekultur behandelten 24-Loch-Platten, indem am folgenden Tag 0,5 Milliliter der Lösung in jedes Loch gegeben werden. Entfernen der Lösung aus den Löchern und Hinzufügen von je einem Milliliter 2 % BSA in PBS; 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Entfernen Sie dann das BSA, indem Sie die Platte kräftig umdrehen, bevor Sie zwei Milliliter PBS zum Waschen hinzufügen. Nachdem Sie das virale Überstand aus den HEC 2 93 T-Zellen gesammelt haben, geben Sie frisches TCM hinzu, wobei das Endvolumen in Millilitern der Anzahl der mit RHFF beschichteten Vertiefungen entspricht, zuzüglich drei weiterer Milliliter. Nehmen Sie die kultivierten Milzzellen aus dem Inkubator und resuspendieren Sie sie, indem Sie sie sanft zwei bis drei Mal in jeder Vertiefung auf- und abpipettieren.Überführen Sie die Zellsuspensionen in ein kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen. Resuspendieren Sie die Zellen anschließend im viralen Überstand auf eine Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Geben Sie dann je ein Milliliter der Suspension pro Vertiefung in die Vertiefungen der mit RHFF beschichteten Platten.Zentrifugieren Sie nun die Platten 90 Minuten lang bei 32 Grad Celsius und 770 GS mit einer Beschleunigung von vier und einer Bremsstellung von null während der Zentrifugation. Bereiten Sie 50 internationale Einheiten pro Milliliter rekombinantes humanes IL-2 in TCM vor. Geben Sie nach der Zentrifugation je ein Milliliter des Mediums in jede Vertiefung der Platten und inkubieren Sie über Nacht.Wenn die T-Zellen eine Konfluenz von mehr als 80 % erreichen, die Zellen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren in jedem Brunnen zwei bis drei Mal aufspalten. Anschließend ein Milliliter aus jedem Brunnen in neue Brünnchen einer frischen 24-Loch-Gewebekulturplatte übertragen. Ein Milliliter frisches TCM mit 50 internationalen Einheiten pro Milliliter IL-2 zu jedem Brunnen hinzufügen. Falls die Zellen keine Konfluenz von mehr als 80 % erreichen, die Hälfte des Mediums wechseln, indem langsam ein Milliliter Medium von der Oberseite jedes Brunnens abpipettiert und durch ein Milliliter frisches TCM ersetzt wird, das 50 internationale Einheiten pro Milliliter rekombinantes humanes IL-2 enthält. Die CAR-T-Zellen durch dreimaliges vorsichtiges Auf- und Abpipettieren in jedem Brunnen resuspendieren und in ein 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführen.Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 ×g für 10 Minuten. Danach pipettieren Sie das Überstand vollständig ab, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Zellen mit PBS und zählen Sie sie, bevor Sie sie ein zweites Mal waschen.Eine typische CAR-T-Zell-Ausbeute beträgt ungefähr eine mal zehn hoch sechs Zellen pro Vertiefung mit PBS Resus. Suspendieren Sie die Zellen in einer Konzentration von fünf mal zehn hoch sieben pro Milliliter für eine Injektion von einer mal zehn hoch sieben in einem Volumen von 200 Mikrolitern, um tumortragende Mäuse zu behandeln. Verwenden Sie eine Nadel mit einer Größe von 27 bis 31 Gauge, um 500 bis 1000 Mikroliter in eine Insulinspritze zu füllen, wobei sichergestellt werden muss, dass alle Luftblasen entfernt wurden. CAR-T-Zellen wurden durch Transduktion mit dem EGFRvIII-CAR-Retrovirusvektor generiert, der die Langen Terminalwiederholungen des Murinen Stammzellvirus (MSCV) enthält.Der erweiterte gag-Bereich und das Spleißstelle des Hüllproteins sowie ein virales Verpackungssignal. Der EG FFR V drei car, der das humane anti-EEG FRV drei einzelkettige variablen Fragment 1 39 enthält, wurde in den retroviralen Vektor kloniert, wobei murines CD acht, tm CD 28 4 1 BBB und die intrazellulären Regionen von CD drei Zeta in Tandem angeordnet sind. Nach der Transduktion können EG FFR V drei CAR-T-Zellen mittels Durchflusszytometrie mit einem zweifarbigen Panel quantifiziert und phänotypisiert werden, das aus einem STRT-Bicorin-konjugierten, biotinylierten EG FFR V drei-abgeleiteten Multimer und anti-CD-drei-fit C besteht. Mithilfe des in diesem Video beschriebenen Protokolls wird die CAR-Expression routinemäßig in 55 bis 70 % der CD-drei-positiven murinen T-Zellen beobachtet.CAR-T-Zellen können durch die Zugabe weiterer fluoreszenzmarkierter Antikörper zum zweifarbigen CAR-Panel, wie in diesem Beispiel gezeigt, weiter phenotypisiert werden. Die Färbung für CD8 und CD4 zeigt, dass 70 % der transduzierten CARs CD8-positive T-Zellen sind, während 20 % CD4-positive T-Zellen darstellen. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von 12 Stunden über einen Zeitraum von einer Woche durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß gemäß diesem Verfahren durchgeführt wird. Andere Methoden wie ELISA, ELISpot und/oder intrazelluläre Zytokinfärbung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten.Beispielsweise: Reagieren Ihre mit chimärem Antigenrezeptor transduzierten T-Zellen funktionell auf die Erkennung des Antigens, und ist ihre Funktionalität antigenspezifisch? Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Retroviren, Temozolomid und Röntgenstrahlung äußerst gefährlich sein kann, und dass Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit unter BSL-2-Bedingungen, das Tragen persönlicher Schutzausrüstung, die Durchführung von Experimenten in dafür vorgesehenen Bereichen sowie die entsprechende Schulung im Umgang mit Versuchstieren erforderlich sind.Die Verwendung von Röntgengeräten sollte bei der Durchführung dieser Verfahren stets berücksichtigt werden.

generation-car-t-cells-for-adoptive-therapy-context-glioblastoma

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video demonstriert eine Technik zur ex vivo Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen chimären Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen. Retrovirale Vektoren, die transgene RNA tragen, werden mit Milzzellen in einem mit Interleukin-2 supplementierten Medium gemischt, um das Überleben und die Proliferation von T-Zellen zu fördern. Das Gemisch wird dann auf eine mit rekombinanten menschlichen Fibronektinfragmenten beschichtete Platte überführt und zentrifugiert, um die Fusion des Virus mit der Zelle...

Eine ex vivo-Technik zur Erzeugung tumorspezifischer chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen

Ein neues Verfahren, das für die Behandlung von rezidivierenden Glioblastomen verwendet wird, beschrieben. Dieser Behandlungsansatz verwendet die Anwendung des elektrischen Wechseltumortherapiefelder (TTFields), als TTF Therapie in Kombination mit Bevacizumab, ein gezieltes Mittel, das derzeit der FDA zugelassen als Monotherapie bekannt.

Tumor Behandlung Feldtherapie in Kombination mit Bevacizumab für die Behandlung von rezidivierendem Glioblastom

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vorbereitung und der stereotaktischen Verwaltung der allogenen menschlichen Lymphozyten in immungeschwächte Mäuse tragen orthotopen menschlichen primären Hirntumoren. Diese Studie liefert eine Machbarkeitsstudie für die Machbarkeit und die Antitumor-Wirksamkeit von zellulären Immuntherapien Intrabrain geliefert.

Stereotaktische Adoptiv Übertragung von zytotoxischen Immunzellen in murinen Modellen der Orthotopen Human Glioblastoma Multiforme Xenotransplantate

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Produktion und präklinische Tests der murinen CD19 Auto T-Zellen durch retrovirale Transduktion und Nutzung als Therapie gegen etablierte Phänomen A20 B-Zell-Lymphom bei Mäusen BALB/c mit oder ohne lymphodepleting Vorklimatisierung.

Ein Phänomen B-Zell-Lymphom Mausmodell für präklinische Bewertung von CD19-Auto-T-Zellen

Hier beschreiben wir eine in-vitro-Kokultur Methode rekursiv Herausforderung Tumor gezielt T-Zellen, die phänotypische und funktionelle Analyse der Antitumor-T-Zell-Aktivität ermöglicht.

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

Wir beschreiben einen Ansatz zur zuverlässigen Generierung von chimeric antigen receptor (CAR) T-Zellen und testen deren Differenzierung und Funktion in vitro und in vivo.

Herstellung von Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Zellen für die Adoptivimmuntherapie

Tumore des Zentralnervensystems (ZNS) sind die häufigste krebsbedingte Todesursache bei Kindern, und lokoregionäre immunbasierte Therapien werden zunehmend in klinischen Studien an Patienten getestet. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur lokoregionären Kanülenimplantation bei Mäusen zur präklinischen Evaluierung von immuntherapeutischen Infusionen, die auf ZNS-Tumoren abzielen.

Intrakranielle Kanülenimplantation für serielle lokoregionäre chimäre Antigenrezeptor (CAR) T-Zell-Infusionen in Mäusen

Dieses Protokoll rationalisiert die retrovirale Vektorproduktion und die murine T-Zelltransduktion und erleichtert die effiziente Generierung von CAR-T-Zellen der Maus.

Effiziente Generierung von murinen chimären Antigenrezeptor (CAR)-T-Zellen

Dieses Protokoll bietet einen optimierten Arbeitsablauf zur Generierung und zum Testen von humanen chimären Antigenrezeptor-regulatorischen T-Zellen (CAR-Tregs).

Erzeugung humaner chimärer Antigenrezeptor-regulatorischer T-Zellen

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren zur Erzeugung transienter chimärer Antigenrezeptor (CAR) T-Zellen unter Verwendung von nicht-integrierender mRNA für die Krebsimmuntherapie und bietet zuverlässige Methoden zur Bewertung von CAR-T-Zellen und ihrer zytotoxischen Funktion.

Ein nicht-viraler Ansatz zur Erzeugung transienter chimärer Antigenrezeptor-T-Zellen unter Verwendung von mRNA für die Krebsimmuntherapie

Erfahren Sie die Generierung von EGFRvIII-spezifischen CAR T-Zellen für die Immuntherapie von Glioblastomen im Kontext der Standardtherapie. Diese Methode zeigt, wie Strahlentherapie und Temozolomid die Wirksamkeit adoptiver T-Zelltherapien verbessern.

Generierung von CAR T-Zellen für die adoptive Therapie im Kontext von Glioblastoma Standardtherapie

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