Experimentelle Glaukom von Ocular Injektion von magnetischen Mikrokügelchen Induzierte
2. Februar 2015
Wir stellen eine Methode zur Induktion eines erhöhten Augeninnendrucks (IOD) vor, indem magnetische Mikrosphären in das Rattenauge injiziert werden, um das Glaukom zu modellieren. Dies führt zu starken Druckanstiegen und einem ausgedehnten Absterben der Neuronen. Dieses Protokoll ist einfach durchzuführen, erfordert keine wiederholten Injektionen und erzeugt einen stabilen, lang anhaltenden IOD-Anstieg.
Ziel dieses Verfahrens ist es, bei der Ratte durch Injektion von paramagnetischen Mikrosphären in die vordere Augenkammer einen erhöhten Augeninnendruck zu induzieren. Legen Sie zuerst einen Magnetring um das Auge eines anästhesierten Tieres, waschen Sie die magnetischen Mikrosphären, resuspendieren Sie sie in Lösung und laden Sie sie dann in eine Spritze. Als nächstes injizieren Sie die magnetischen Mikrosphären in die vordere Augenkammer.
Entfernen Sie den Magnetring während der Bergung. Die Prozessdaten, die aus histologischen Analysen wie Tunnelfärbungen oder Sehnervenfärbungen gewonnen werden, können den Tod von retinalen Ganglienzellen messen, der aus einem erhöhten Augeninnendruck resultiert. Waschen Sie die sterilisierten magnetischen Mikrosphärenkügelchen mit acht Mikrometern dreimal in einem Milliliter der gepufferten Kochsalzlösung von Hank, suspendieren Sie sie und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 10.000 mal G.
Dann reus suspendieren Sie in 0,5 Millilitern HBSS für eine Lösung von 30 Milligramm pro Milliliter. Führen Sie nun mit einem Rückprall-Sonometer, das für die Verwendung im Rattenauge kalibriert ist, fünf Basis-IOD-Messungen bei den wachen Tieren durch. Nach der Betäubung tragen die Ratten Augensalbe auf das nicht bewertete kontralaterale Auge auf, um es feucht zu halten.
Während der Anästhesie 0,5% Propanhydrochlorid, Lokalanästhetikum, auf das operative Auge auftragen. Als nächstes waschen Sie dieses Auge mit 5%Povidon-Jod in Wasser. Nach fünf Minuten das Povidon-Jod absetzen und das Auge mit 0,9%iger steriler Kochsalzlösung waschen.
Halten Sie das Auge während der Anästhesie feucht mit regelmäßiger Anwendung von steriler Kochsalzlösung. Platzieren Sie nun einen steroidalen Magneten um das Auge, um das Risiko eines Iristraumas zu minimieren und den Verlust von Perlen zu minimieren. Richten Sie die Nadel tangential zur Hornhautoberfläche so parallel wie möglich zur Iris aus.
Fahren Sie fort, 25 Mikroliter mit 30 Milligramm pro Milliliter gammabestrahlte magnetische Mikrosphären in die Vorderkammer zu injizieren. Lassen Sie die Nadel eine Minute nach der Injektion an Ort und Stelle, um sicherzustellen, dass sich die Kügelchen im IOC-Hornhautwinkel absetzen und den wässrigen Abfluss aus dem Trabekelnetz behindern. Arbeiten Sie einige Sekunden nach dem anfänglichen Absetzen der Kügelchen mit der Nadel leicht schräg, um ein gewisses Austreten von wässrigem Wasser zu ermöglichen und vorübergehende Erhöhungen des Augeninnendrucks zu minimieren.
Um sicherzustellen, dass die Nadel weiterhin in separaten Verfahren verwendet wird, spülen Sie die Nadel mit PBS. Dann 70 % Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser in dieser Phase. Entfernen Sie bei Bedarf den Magneten und ziehen Sie damit Perlen in Bereiche mit unvollständiger Abdeckung.
Lassen Sie den Magneten nach der Injektion weitere 10 Minuten um das Auge herum. Um sicherzustellen, dass sich die Perlen gut im Hornhautwinkel absetzen. Umkehranästhesie mit 0,25 Milligramm pro Kilogramm ESOL-Hydrochlorid.
Verabreichen Sie 0,5 Propanhydrochlorid zur Analgesie und Chloramphenicol-Salbe topisch, um Infektionen zu verhindern. Lassen Sie die Tiere sich auf einer Heizmatte erholen, bis sie sich wieder bewegen. Dann in eine warme Box umfüllen.
Verwenden Sie das kontralaterale Auge als unbewertete Kontrolle. Wiederholen Sie die IOD-Messungen alle zwei bis drei Tage nach der Verabreichung der Kügelchen und danach alle zwei bis drei Tage, definieren Sie die Kriterien für die Einbeziehung der Augen in Studien, einschließlich des Augeninnendrucks, der um fünf Millimeter Quecksilbersäule über den kontralateralen Kontrolldruck angehoben wird, und der Augeninnendruck 60 Millimeter nicht überschreitet. Augen, bei denen der Druck eine Woche nach der Injektion wieder auf den Ausgangswert zurückkehrt, sollten nicht in die Studien einbezogen werden. Es ist jedoch möglich, bei Bedarf Kügelchen in Augen, die keinen hohen IOD entwickeln, erneut zu injizieren.
Fixieren Sie die präparierten Augen und den Sehnerv in 4%-Paraldehyd, indem Sie die Schädigung der Netzhautneuronen durch Tunnelfärbung und die Schädigung des Sehnervs durch Toine Blue beurteilen. Färbung. In diesem Experiment induzierte die Injektion von magnetischen Kügelchen in den Hornhautwinkel konsistent einen anhaltenden und robusten Druckanstieg. Darüber hinaus wurde der Druckanstieg während der gesamten Dauer des Experiments aufrechterhalten.
Der mittlere Augeninnendruck, gemittelt über die gesamte Dauer des Experiments, betrug 19,7 plus minus 0,3 Millimeter Quecksilbersäule und 40,5 plus minus 2,8 Millimeter Quecksilber für Augen, die mit Perlen injiziert wurden. Darüber hinaus stieg der maximale Augeninnendruck von 22,8 plus minus 0,3 Millimeter Quecksilbersäule auf 49,9 plus minus 2,3 Millimeter Quecksilbersäule, um festzustellen, ob eine Erhöhung des Augeninnendrucks zum Absterben von retinalen Ganglienzellen führt. Die Tunnelfärbung wurde an der Netzhaut und die Histologie an Querschnitten des transversalen Sehnervs in der Netzhaut durchgeführt.
Wir beobachteten eine Zunahme der Tunnelfärbung bei Kügelchen-injizierten Augen mit erhöhtem Augeninnendruck. Die Anzahl der apoptotischen Kerne stieg bei hypertensiven Netzhäuten zur kontralateralen Kontrolle etwa um das 15-fache an, wie bei Augen, bei denen magnetische Kügelchen ohne Druck injiziert wurden, erwartet wurde, unterschied sich die Anzahl der tunnelpositiven Zellen nicht signifikant von der der nicht injizierten Kontrollen. Weitere Untersuchungen der Pathologie des Sehnervs im Glaukommodell zeigten die Akkumulation von Oldblau in vielen Axonen, was auf eine Degeneration dieser zellulären Prozesse hinweist.
Übersicht
Diese Studie stellt eine Methode zur Induktion eines erhöhten intraokularen Drucks (IOP) bei Ratten durch Injektion magnetischer Mikrosphären in die vordere Augenkammer vor, wodurch eine Glaukom-Modellierung erfolgt. Das Verfahren führt zu signifikanten Druckerhöhungen und zum Absterben von Neuronen und ermöglicht einen stabilen und lang anhaltenden Anstieg des IOP, ohne dass wiederholte Injektionen erforderlich sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Augenheilkunde
- Forschung zum Glaukom
Hintergrund
- Erhöhter Augeninnendruck ist ein wesentlicher Risikofaktor für das Glaukom.
- Aktuelle Modelle erfordern oft mehrere Eingriffe.
- Magnetische Mikrosphären bieten einen neuartigen Ansatz zur Induktion des Augeninnendrucks.
- Das Verständnis des neuronalen Zelltods beim Glaukom ist entscheidend für die Entwicklung von Therapien.
Zweck der Studie
- Etablierung eines zuverlässigen Modells zur Untersuchung des Glaukoms bei Ratten.
- Beurteilung der Auswirkungen eines erhöhten IOD auf den Tod retinaler Ganglienzellen.
- Beurteilung der Langzeiteffekte von Injektionen magnetischer Mikrosphären auf den IOD.
Verwendete Methoden
- Injektion paramagnetischer Mikrosphären in das Rattenauge.
- Messung des IOD mittels Rebound-Tonometrie.
- Histologische Analyse von Netzhaut- und Sehnervschäden.
- Beurteilung apoptotischen Zelltods mittels TUNEL-Färbung.
Hauptergebnisse
- Signifikante und anhaltende Erhöhung des IOP in den mit Perlen injizierten Augen.
- Zunahme des Absterbens retinaler Ganglienzellen, korreliert mit erhöhtem IOP.
- Histologische Nachweise einer Degeneration des Sehnervs.
- Die Kontrollaugen wiesen während der gesamten Studie normale IOP-Werte auf.
Schlussfolgerungen
- Die Methode modelliert Glaukom effektiv bei Ratten.
- Erhöhter IOP führt zu erheblichen neuronalen Schäden.
- Dieses Modell kann für zukünftige Glaukomforschung und therapeutische Tests verwendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode bietet ein robustes und reproduzierbares Modell zur Induktion einer anhaltenden Erhöhung des intraokularen Drucks bei Ratten, das mechanistische Untersuchungen der Glaukompathophysiologie ermöglicht. Sie unterstützt die Zielvalidierung, indem sie den Druckanstieg mit dem Tod retinaler Ganglienzellen und der Degeneration des Sehnervs verknüpft, und bietet damit einen prädiktiven Wert für die Screening-Tests neuroprotektiver Therapien. Die Einfachheit des Modells und seine lang anhaltende Wirkung reduzieren die experimentelle Variabilität und erleichtern die Zusammenarbeit über Fachbereiche hinweg in Entdeckungsprozessen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung des kausalen Zusammenhangs zwischen IOD und Glaukom durch induzierte, anhaltende Druckerhöhung.
- Operativer Wert: Bietet ein konsistentes Phänotyp zur Beurteilung der Zielstrukturen in pathogenetischen Wegen.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen, die an der Regulation des Trabekelwerks und der Dynamik des Kammerwassers beteiligt sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare IOP- und histopathologische Messgrößen zur Assay-Standardisierung.
- Operativer Wert: Liefert reproduzierbare Messungen des Basis- und erhöhten IOP für Screening-Kampagnen von Wirkstoffen.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Dosis-Wirkungs-Beurteilung von IOP-senkenden Substanzen mittels longitudinaler Drucküberwachung.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Rekapituliert zentrale Glaukom-Pathologien, einschließlich der Apoptose retinaler Ganglienzellen und der Degeneration der Axone im Sehnerv.
- Operativer Wert: Ermöglicht die präklinische Bewertung neuroprotektiver und IOD-modulierender Substanzen in einem krankheitsrelevanten System.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Abstimmung von Biomarkern durch korrelative Analyse der IOD-Werte und neuronaler Todesraten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Modell fügt sich in die Entdeckungskontinuum des Glaukoms von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein und wird durch seine Fähigkeit gestützt, messbare Erhöhungen des IOD sowie darauffolgende Neurodegeneration zu erzeugen.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die hypothesenbasierte Untersuchung von auf IOP beruhenden Mechanismen bei Netzhaut- und Sehnervpathologien.
- Screening: Stellt den IOP als pharmakodynamischen Biomarker zur Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf den Kammerwasserabfluss bereit.
- Analytik: Liefert quantitative IOP-Messungen sowie histopathologische Endpunkte zur vergleichenden Analyse von Krankheitszuständen.
- Translationale Forschung: Verbindet die IOP-Erhöhung mit für den Menschen relevanten neurodegenerativen Prozessen und unterstützt so die translationale Kontinuität.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur IOP-Induktion, die auf verschiedene Nagetiermodelle für Längsschnittstudien anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert eine vorhersagbare Sicherheit hinsichtlich der Kausalität zwischen IOD und Glaukom durch anhaltende Druckerhöhung und Neurodegeneration.
- Operativer Wert: Stellt durch standardisierte Mikrosphäreninjektion und magnetische Positionierungstechniken die Reproduzierbarkeit sicher.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch von Studien, indem die biologische Variabilität in Wirksamkeitsstudien basierend auf IOD reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Glaukomtherapeutika anhand ihrer IOD-senkenden und neuroprotektiven Eigenschaften.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der okularen Chirurgie an Nagetieren und der IOP-Messung mittels Rebound-Tonometrie.
- Setzt den Zugang zu sterilen magnetischen Mikrosphären, Sterilisationsgeräten und Reagenzien für histologische Färbungen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen den Forschungsteams hinsichtlich der Kriterien für den IOP-Anstieg und der Protokolle zur histologischen Beurteilung.
- Beinhaltet Anpassungen aufgrund der Anatomie des Mausauges und des geringeren Volumens der vorderen Augenkammer.
- Eingeschränkt durch die Notwendigkeit einer postoperativen Überwachung, um transiente Druckresponder auszuschließen und die Konsistenz des Modells sicherzustellen.
