Name: Der Anbau von Heligmosomoides polygyrus: Eine immunmodulatorische Nematode Parasite und seine Secreted Produkte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von Heligmosomoides polygyrus für Immunologie und Parasitologie. Diese Methode ermöglicht die Isolierung immunmodulatorischer Moleküle zur Untersuchung ihrer Wirkung auf Immunzellen.

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Die Autoren werden vom Wellcome Trust durch den Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) und Programme Grant (Y.H. und R.M.M.) und Fellowship (J.R.G) finanziert, die BBSRC (G.C.), die American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. und R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) und die Rainin Foundation (D.J.S. und R.M.M.).

HINWEIS: Alle Verfahren in diesem Protokoll werden in Übereinstimmung mit den Richtlinien, die von Großbritannien Home Office und der Universität von Edinburgh Veterinary Services eingestellt geführt. 1. Infektion der Mäuse durch Gavage <ol><li> Shop Heligmosomoides polygyrus L3-Larven in destilliertem Wasser für bis zu sechs Monate bei 4 ° C. </li><li> Vor Gebrauch waschen L3-Larven dreimal in destilliertem Wasser: Zentrifuge bei 300 xg für 10 Minuten (mit Bremse), entfernen Sie alle, aber 500 ul Wasser (um störende pelletiert L3-Larven zu vermeiden) und das Pellet jedes Mal. </li><li> Bei dem dritten Waschen, Wasser hinzufügen, um eine genaue Volumen (in der Regel 40 ml) und saugen Sie 20 ul mit 200 ul Spitze geschnitten, um ihre Öffnung zu erweitern. Platzieren zwei 20-ul-Proben auf der Oberfläche einer 60 mm Kulturschale und zählen die L3-Larven (üblicherweise mobil und am besten unter 50-facher Vergrößerung mit einem Präpariermikroskop betrachtet). Resuspendieren endgültige Pellet in destilliertem Wasser auf ein concentration von 2.000 L3 Larven pro ml. </li><li> Für Lebenszyklus Produktion, infizieren 8 Wochen alte F1 (C57BL / 6xCBA) Mäuse mit 400 H. polygyrus L3-Larven in 200 ul destilliertem Wasser durch orale Gabe (zurückhalten Mäuse in aufrechter Position durch das Genick des Halses und sanft passieren die stumpfe Sondennadel durch den Mund und Speiseröhre in den Magen). Gut geschüttelt, vor jeder Infektion (Larven begleichen schnell in Wasser) und saugen Sie 200 ul in einer 1 ml Spritze; einen dedizierten Sondennadel mit einem abgerundeten Ende. Für experimentelle Infektion von jüngeren Mäuse (6-8 Wochen alt) oder anderen Inzuchtstämme (z C57BL / 6 oder BALBc) infizieren Mäuse mit 200 L3 Larven. </li></ol> 2. Vermehrung und Pflege von H. polygyrus <ol><li> Zeigen Kohle in der Mitte eines großen Kunststoffwanne und lassen kaltes Leitungswasser, um über sie für mindestens 30 Minuten laufen (ungewaschen Aktivkohle ist giftig für L3-Larven). Lassen Sie das Wasser aus der Wanne und legen Sie die Holzkohle auf two saugfähiges Papier legen, so dass es bis zur vollständigen Trocknung der Raumluft ausgesetzt. </li><li> Wenn Eier erforderlich sind, kratzen Kot zuerst aus dem Dickdarm mit einer Pinzette (und Schere falls erforderlich). Wenn eine große Anzahl von L3-Larven erforderlich ist, platzieren Mäuse auf einem Drahtgitter und sammeln Kotpillen über mehrere Tage. </li><li> Mischen Sie die Fäkalien mit granulierte Aktivkohle bei einem Verhältnis von mindestens 1: 1, um eine Konsistenz zu erreichen nur feucht genug, um sich an Filterpapier. Schmieren Sie eine dünne Schicht auf der Mitte von etwas angefeuchteten Filterpapier in einer Petrischale und legen Sie diese in einer feuchten Box (fügen Sie einige feuchten Papiertuch und eine Schüssel mit Wasser) im Dunkeln für 12-14 Tage. </li><li> Entfernen L3-Larven von Tag 7 ab, und sammeln sie auf mindestens zwei Gelegenheiten, bevor das Papier wird verworfen. Die Larven bilden einen Ring rund um den Rand des Filterpapiers; Heben Sie das Filterpapier aus der Petrischale und spülen Sie die Larven, die der Platte gelassen werden (mit einer Pipette und 5 ml sterilem Wasser pro Platte) in einen 50-ml-Tube. </li><li> AufzugAus dem Filterpapier und ernten die restlichen Larven links auf der Platte mit destilliertem Wasser in einen 50-ml-Tube. Zentrifugieren Sie die abfließende Lösung bei 300 g für 10 min. Dreimal Waschen Sie die Larven mit destilliertem Wasser und dann bei 4 ° C lagern in bis zu 50 ml destilliertem Wasser, bis sie benötigt. HINWEIS: Die Larven bleiben lebensfähig und infektiös für mindestens 6 Monate. </li></ol> 3. Sammlung von Adult H. polygyrus Worms <ol><li> Bereiten Sie die modifizierten Baermann Apparat im Voraus, wie in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Cull Mäusen 14 Tage nach der Infektion. </li><li> Den Unterleib mit 70% Ethanol waschen. Schneiden Sie die Haut über den Bauch und ziehen Sie, um die vordere Bauchwand zu offenbaren. Stellen Sie Mittellinienschnitt, um die Bauchhöhle gelangen. </li><li> Nehmen Sie den gesamten Dünndarm und Dickdarm (Duodenum von proximal nach distal Rektum). Zeigen in eine trockene Petrischale. </li><li> Richten Sie den Darm über ihre gesamte Länge; Verbrauchsteuern die Fäkalien haltige Dick; legen Sie diese in eine separate Schüssel für Eierzubereitungen später. </li><li> Zuschneiden die proximalen 20 cm des Dünndarms, die die adulten Würmer von der relativ dicken Wand des Duodenums und oft eine rote Erscheinungsbild -identified aufgrund der intraluminalen Würmer enthält. In eine (Durchmesser 100 mm) Petrischale mit 5 ml Hanks-Lösung, erwärmt auf 37 ° C (zwei Exemplare pro Schale). </li><li> Öffnen Sie den Wurm-gefüllte proximalen Darmteil in Längsrichtung mit einer Schere (rund digen Schere sind am besten für diese), und kratzen im Inneren der Darmschleimhaut mit zwei Glasobjektträger um die Würmer zu entfernen. Dann werfen Sie die saubere Darmwand. </li><li> Tipp Würmer in kleine Musselin Taschen, Klammer geschlossen und mit Büroklammern um den Rand des Glastrichters (Abbildung 1). </li><li> Füllen Trichter mit Hanks-Lösung, geben Sie ca. 4 Petrischalen von Würmern in jeden Trichter. </li><li> Platz Gerät in 37 ° C-Inkubator für 1-2 h, Rühren sanft auf halbem Weg durch, um zu verdrängenSchmutz aus dem Darm Vorbereitung, die den Musselin Filter verstopfen können. Achten Sie darauf, um das Auslaufen von Schutt außerhalb des Musselinbeutel zu vermeiden - das wird eine Verunreinigung des letzten HES Vorbereitung verursachen. Erwachsene Würmer sollten langsam durch das Baumwolltuch migriert und an der Unterseite des Glasteströhrchen angesiedelt haben. Entfernen Sie vorsichtig das Reagenzglas aus dem Verbindungsgummischlauch über dem Waschbecken (dabei darauf achten, nicht zu verlieren Würmer an dieser Stelle). </li><li> Mit einem Kunststoff Pipette die Würmer in einen 50-ml-Tube und waschen sechsmal mit Hanks-Lösung (erlauben Würmer mit der Schwerkraft mit einer Stripette niederzulassen, zu entfernen Medien, 40 ml Hanks-Lösung, und wiederholen Sie fünf Mal). HINWEIS: Wurm Kultur muss ab diesem Zeitpunkt steril gehalten werden. <ol><li> Gehen Sie zu einer Steril und waschen weitere sechs Mal in steriler Hanks-Lösung mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, bereit für die in-vitro-Kultur ergänzt. </li></ol></li><li> Zählen Sie dieerwachsenen Würmer, indem man zwei Proben von 20 ul mit einer gelben Spitze cut ergriffen, um ihre Öffnung zu erweitern erholt; erwarten, etwa 50% der Menge des inokulierten Larven. </li></ol> 4. Einrichten Kulturen für HES: Medium Vorbereitung, Waschen Erwachsene Worms <ol><li> Weichen die Würmer von 3,11 in etwa 10 ml RPMI, ergänzt mit 10% Gentamycin für 20 Minuten, so dass die Röhre ruht in einem Winkel, um sicherzustellen, Würmern vollständig abgedeckt werden. </li><li> Führen Sie diese in einer Steril: nachwaschen sechsmal mit Hanks-Lösung (ergänzt mit 5 U / ml Penicillin und 5 ug / ml Streptomycin). </li><li> Bereiten H. polygrus Medien. </li><li> Die Aufrechterhaltung der Sterilität in einem Abzug mit laminarer Strömung, um 500 ml des RPMI1640 Fügen 11,1 ml 45% Glukose (Endkonzentration 1,2% RPMI1640 enthält 0,2% Glucose), 5 ml 100x Peniclllin-Streptomycin (Endkonzentration 5 U / ml Penicillin, 5 &amp; ​​mgr; g / ml Streptomycin) versetzt, 5 ml L-Glutamin (Endkonzentration 2 mM), und5 ml Gentamycin (Endkonzentration 1%). Sie FCS hinzufügen nicht. </li><li> Aliquoten Würmer in entlüftet T25-Kolben, ca. 1.000 Würmer in 15 ml H. polygyrus Medien pro Kolben und Ort aufrecht in 37 ° C-Inkubator (5% CO 2) für 3 Wochen. </li></ol> 5. Herstellung von HES <ol><li> Sammeln HES haltigen Kulturmedien aus Kulturen in Abständen von nicht mehr als zweimal pro Woche, die Aufhebung der ersten Kollektion nach 24 Stunden der Kultur (durch den hohen Grad der LPS Verschmutzung und Wirtsproteinen - getrennt verarbeitet oder verworfen werden). Halten Sie jede Sammlung getrennt und deutlich mit dem Datum und Chargennummer versehen. Ersetzen Sie mit dem gleichen Volumen von H. polygyrus Medium auf jeder Gelegenheit. </li><li> Zentrifuge HES haltigen Medien bei 400 x g für 5 min. Dann filtern sterilisieren durch 0,2 um niedrige Proteinbindung Filter in 50 ml Tuben. Shop in der -20 ° C Gefrierschrank deutlich mit Datum der Wurm Ernte und das Datum der HES c gekennzeichnetollektion. </li><li> Nach 21 Tagen der HES Sammlung von Kultur, verwerfen Würmer. </li><li> Pool 500-1.000 ml HES Überstand (in der Regel aus der Tiefkühl, und nicht die, die die erste 24-Stunden-Sammlung) und einen 3.000 MWCO-Filter in der Ultrafiltrationsvorrichtung zu konzentrieren auf unter Stickstoffdruck. HINWEIS: Achten Sie sorgfältig darauf, den Filter trocken laufen lassen. <ol><li> So richten Sie das Filtergerät, zuerst die 3 kDa Membran glänzende Seite in einem 1-Liter-Becher sich gründlich mit destilliertem Wasser für 3 x 20 Minuten unter Rühren. Montieren Sie die Ultrafiltrationsvorrichtung nach Angaben des Herstellers mit Filtermembran glänzenden Seite nach oben. Platz im Schrank bei 4 ° C erwärmt und 50 ml destilliertem Wasser durch, bevor Sie sich auf die Sammel HES konzentrieren. </li><li> Fügen jedes Rohr von HES in die Filtrationsvorrichtung nach Bedarf (100-140 ml pro Tag), bis das Volumen 2-5 ml eingeengt wird. </li></ol></li><li> Um Verunreinigungen von der HES-enthaltende Kulturmedien zu entfernen, 50 ml pyr hinzufügenogen freien PBS zu der Filtervorrichtung und dann konzentrieren sich auf ca. 2 ml. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal (150 ml PBS insgesamt). Übertragen HES in einen 15-ml-Röhrchen, filtersterilisieren (mit einem 0,2-um-Filter) in einer Haube mit laminarer Strömung und Messen der Proteinkonzentration unter Verwendung eines Spektrophotometers (E 280 = 10) oder mit dem Bradford-Assay. </li><li> Aliquot, Label mit Chargennummer und das Datum und die Gefriert bei -80 ° C. </li><li> Führen eines chromogenen LAL Assay nach den Protokollen des Herstellers für jeden Ansatz durch HES vor der Verwendung. Wenn LPS Niveau von größer als 1 U LPS pro 1 ug Protein sind, sollten Sie nicht mit dieser Charge für in vivo-Experimenten oder in vitro-Kulturen. </li><li> Verarbeiten Sie die bei 24 Stunden getrennt in der gleichen Art und Weise gesammelt HES; es wird LPS und einige Wirtsproteine ​​enthalten und, obwohl sie nicht für verschiedene Experimente ist es eine nützliche Quelle von einzelnen Molekülen, die durch den monoklonalen Antikörper der Affinitätsreinigung isoliert werden kann. </li></ol&gt;

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Der Lebenszyklus von H. polygyrus Erlöse in einer konsistenten Art und Weise zuverlässig. Nach Natur Verschlucken oder orale Gabe von L3-Larven am Tag 0, beginnen Zysten unter der Zwölffingerdarm-Serosa von Tag 5 zu bilden, voran zu Larven Häutungen und Schwellenländern als erwachsenen Würmer in das Darmlumen von Tag 10, können Eier im Kot aus gesehen werden Tag 14 und Granulome auf der duodenalen Serosaoberfläche von Tag 21. Die oben beschriebenen (und in Figur 6 zusammengefaßt) -Protokoll sichtbar ermöglicht Produktion mit hohem Durchsatz von H. polygyrus Ausscheidungs-Sekretionsprodukte (HES), zusätzlich zum zuverlässigen Wiederherstellung lebensfähiger L3-Larven für zukünftige experimentelle und Lebenszyklus-Infektionen. H. polygyrus Infektion hat sich gezeigt Schutz in Modellen von Asthma abhängig von OVA oder Der p 1 (Hausstaubmilben-Allergen) 14 sein. Darüber hinaus könnte die Unterdrückung der Atemwegsentzündung mit CD4 + CD25 + übertragen werden </sup&gt; regulatorischen T-Zellen 14 oder CD19 + CD23 hallo regulatorischen B-Zellen 24 aus nicht-sensibilisierten, H. polygyrus infizierten Mäusen. Bei den Modellen der Autoimmunität, H. polygyrus Infektion wurde gezeigt suppressive in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell von Multipler Sklerose 9 zu sein, und die Unterdrückung kann entweder mit CD4 + T-Zellen oder CD19 + B-Zellen aus infizierten Mäusen 24 übertragen werden. Heligmosomoides polygyrus Ausführungs sekretorischen Produkten (HES) modulieren die Immunantwort des Wirts und Th2-vermittelte Entzündung unterdrücken, indem eine Reihe von Mechanismen (in Abbildung 7 beschrieben), einschließlich: a) Hemmung der dendritischen Zellen gegenüber Stimulation 25, b) Induktion von CD4 + Foxp3 + regulatorischen T-Zellen 18. und c) die Blockierung von IL-33 Produktion 20. HES hat sich gezeigt, schützend zu sein, wenn sie verabreicht eint Sensibilisierung oder Herausforderung in der OVA-Alaun-Modell von Asthma 19 und auch, wenn intranasal mit Alternaria Extrakt Allergen 20 verabreicht, durch Unterdrückung der frühen IL-33 Freisetzung. Vermeidung der LPS Kontamination von HES ist oft von entscheidender Bedeutung für den Erfolg der Zukunft immunologischen Experimenten. Im Protokoll hier skizzierten die kritischen Schritte bei der Erreichung dieses sind, dass innerhalb der Musselin Taschen der Baermann Gerät nicht in die endgültige HES Zubereitung enthaltenen Schmutz zu gewährleisten (siehe 2.10) und zur Seite zu ES-Lösung aus der ersten 24 Stunden der Kultur gesetzt (siehe 5.1). In den letzten Jahren HES wurde gründlich an der Proteom-Ebene mit mehr als 370 identifiziert 26,27 unterschiedliche Proteine ​​aus. Darüber hinaus hat ES aus dem 4. Larvenstadium zu Proteomanalyse 28 unterzogen. Laufende Arbeiten Charakterisierung der Hauptkomponenten von Glycan HES bekannte stark immunogen 3 zu sein, und sezernierten Mikro RNWie die in 50 bis 100 nm Bläschen oder Exosomen (Buck et al., Zur Publikation eingereicht) gekapselt. Mit der Gründung der reproduzierbaren Protokolle für die Sammlung von ES aus diesem hoch immunmodulatorische Parasiten und mit umfangreichen proteomische Daten zur Identifizierung der molekularen Komponenten von HES ist die Bühne nun für die Identifizierung und therapeutische Prüfung einzelner Moleküle aus H. eingestellt polygyrus die Schlüssel Auswirkungen auf das Immunsystem des Wirts zu vermitteln können.

Heligmosomoides polygyrus ist ein natürlicher Maus-Magen-Darm-Helminthen, die eng mit hoch vorherrschende menschliche Nematodparasiten 1 verbunden ist. Im Gegensatz zu anderen Nematoden Modelle wie Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus konsequent stellt eine chronische Infektion in Mäusen als eine direkte Folge von mehreren leistungsstarken immunmodulatorische Mechanismen beschäftigt, um die Immunantwort des Wirts 2 zu unterdrücken. H. polygyrus hat einen direkten Lebenszyklus: infektiösen L3-Larven werden von feco-orale Übertragung aufgenommen (oder durch orale Gabe in der Laborumgebung verabreicht), worauf sie wandern zum subseröse Schicht des Zwölffingerdarms und encyst vor der Rückkehr in das Darmlumen als erwachsenen Würmer etwa acht Tage nach der ersten Infektion. Paarung und Eierproduktion tritt am Tag 10 und es ist möglich, adulte Würmer für Kultur und Sammlung von Ausscheidungs-sekretorischen Produkte da ernteny 14 ab 3. H. polygyrus interagiert auch mit der kommensalen Mikroflora, mit erhöhter Milchsäurebakterien vorhanden in infizierten Mäusen anfällig 4-6, und ein höheres Maß an H. polygyrus Infektion nach Exposition von Mäusen auf Laktobazillen 6. Aktive Infektion mit H. polygyrus wurde gezeigt, dass gegen Immunpathologie in vielen Tiermodellen für Autoimmunität 7-10 schützen, Colitis 11,12 und Allergien 13-16. Daher gab es großes Interesse an dem Potenzial der Ausscheidungs-Sekretorische Moleküle aus diesem Parasiten (&quot;HES&quot;), um nach unten zu modulieren Pathologie in vivo 17,18. Tatsächlich werden schützende Wirkung nach der Behandlung der Mäuse mit HES-Produkte 19 über Pfade, die jetzt identifiziert 18,20 ersichtlich. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die zuverlässige Herstellung von Heligmosomoides polygyrus und Wiederherstellung ihrer abgesondert Produktedaß weiter eine Reihe von funktionellen biochemische und immunologische Untersuchungen verwendet werden.

<table><tbody><tr><td>Amicon Konzentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Modell 8050 50 ml http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks' gepufferte Salzlösung</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Aktivkohle</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glukoselösung</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45%ige Lösung http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Falcon Röhrchen</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Kolben</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&nbsp;</td><td>25 cm belüftete Flasche http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB</td></tr><tr><td>Chromogener LAL-Assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 Assay http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; ohne L-Glutamin http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

der anbau von<em&gt; heligmosomoides polygyrus:</em&gt; eine immunmodulatorische nematode parasite und seine secreted produkte

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoides polygyrus (früher Nematospiroides dubius bekannt und auch von einigen als H. bakeri bezeichnet) ist ein gastrointestinaler Helminthen, die mehrere immunmodulatorische Mechanismen einsetzt, um eine chronische Infektion in Mäusen herzustellen und ähnelt vorherrschenden menschlichen Wurminfektionen. H. polygyrus wurde ausgiebig auf dem Gebiet der Wurm abgeleitete Immunregulation studiert und hat sich als potent drücken experimentellen Modellen von Allergie und Autoimmunität (beide mit einer aktiven Infektion und isoliert abgesondert Produkte). Die in diesem Papier beschriebene Protokoll beschreibt Verwaltung des H. polygyrus Lebenszyklus für eine konsistente Produktion von L3-Larven, die Verwertung von erwachsenen Parasiten und Sammlung ihrer Ausscheidungs-Sekretionsprodukte (HES).

Die Anfälligkeit für eine Infektion mit H. polygyrus wird zu einem großen Teil durch den genetischen Hintergrund der Mausstamm (Tabelle 1) gesteuert wird; C57BL / 6 und CBA-Mäusen sind sehr anfällig 21,22. Für die Versorgung der Lebenszyklus des Parasiten hat die F1-Hybride zwischen diesen beiden Stämmen für seine Fähigkeit, sehr viel höher Wurmlast ohne Morbidität (übermäßige Darmepithelzellen Schäden) zu widerstehen, verglichen mit entweder Elternstamm ausgewählt. Oralsonde 400 L3 Larven wird der Lebenszyklus in F1-Mäuse zu erhalten (was zu Erwachsenen in 2 gezeigt Wurmlast), während eine Dosis von 200 L3 Larven wird allgemein für Experimente bei homozygoten Inzuchtstämmen (beispielsweise C57BL / 6 verwendet oder BALBc). Allerdings müssen diese Dosierung kann je nach Umgebungs Cofaktoren, die zwischen Tierhaltung, wie Schwankungen der Darmflora unterscheiden können reduziert werden. Chargen von HES haben reproduzierbare effi bewährtsamkeit in funktionellen Assays und Protein-Zusammensetzung; Außerdem, wenn Überstände von jedem aufeinanderfolgenden Woche Kultur wurden analysiert, bis zu insgesamt 4 Wochen wurden die Proteinprofile gefunden, sehr ähnlich (Figur 3). Wenn HES Konzentration wird mittels Bradford-Test gemessen (siehe 5.5) werden die Gesamt Protein ist in der Regel etwa 1 mg / ml (Figur 4). Ein alternatives Verfahren zum Konzentrieren von HES mit einem Zentrifugenkonzentrator (zB Vivaspin 3 kDa cut-off Membran), in denen die Proben werden auf bis zu 4.000 g in einem Ausschwingrotor Zentrifuge, Entfernen Puffersalze und niedrigmolekulare Bestandteile. Kreisel Konzentration ist am besten für kleine Verarbeitungsmengen (1-10 ml) geeignet und sind auf eine maximale Konzentration etwa den Faktor 30x begrenzt. Beim Sammeln von HES, ist die Vermeidung der Kontamination von entscheidender Bedeutung. Um eine Kontamination mit Gastmolekülen zu vermeiden, entsorgen wir HES-containing Kulturmedien von der ersten 24 Stunden nach der erwachsene Wurm Ernte aus dem Mausdarm. Wir die Höhe der LPS Verschmutzung quantifizieren auch in jeder Charge von HES mit einem chromogenen LAL-Test (siehe 5.7). 1 U LPS entspricht ~ 100 pg LPS und Ebenen darunter werden als vernachlässigbar angesehen 23. In unseren Händen, die meisten Partien von HES deutlich unter dieser Grenze, die mittlere Konzentration von LPS in HES als 0,23 U / ug (Abbildung 5). Die Wirkungen von LPS in in vivo-Modellen der Pathologie (zum Beispiel die Unterdrückung von asthmatischen Reaktionen) benötigt mindestens 10 ng LPS 23. Daher in vivo-Verabreichung von 5 ug HES aus einer Charge mit 100 pg LPS / ug HES umfasst 500 pg LPS deutlich unter die effektive Konzentration in dem LPS zu einem Problem. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Baermann Apparat BaerMann Versuchsaufbau für die Sammlung von Erwachsenen H. polygyrus (wie in Kapitel 2 beschrieben). <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: Mittlere Worm Burden 14 Tage nach der Infektion mit 400 L3 Larven Mittlere Wurm belastet 14 Tage nach der Infektion mit 400 L3-Larven. Gezeigten Datenpunkte sind aus 19 separaten Runden der Infektion von C57BL / 6xCBA Mäusen. Mittelwert ± SEM dargestellt. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: Proteinprofile von HES aus aufeinanderfolgenden Wochen in Kultur SDS-PAGE-Profil von HES-Proteine ​​in aufeinander folgenden Wochen der Kultur gesammelt. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: </strong&gt; Endmenge von HES 500 ml ES-haltigen Medien Die Ausbeute an HES-Protein aus 11 verschiedenen Chargen von ca. 500 ml Kulturüberstand stammt. Mittelwert ± SEM dargestellt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> Abbildung 5: LPS Kontamination von HES Ebenen LPS Kontamination in 41 Chargen von HES durch die Limulus ameobocyte Assay gemessen. Median LPS-Konzentration = 86 U pro mg HES. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> Abbildung 6: Schematische Darstellung der Animated H. polygyrus Lebenszyklus Zusammenfassung der wichtigsten Phasen des Lebenszyklus von orale Gabe von L3-Larven, durch Rückgewinnung von Larven und erwachsenen Würmer zu Isolierung von HES. Abbildung 7: Schematische Darstellung der Animated HES und ihre Funktionen Taste immunmodulatorische Effekte von in HES enthaltenen löslichen Mediatoren und Exosomen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Genotype (und Hintergrund Stamm) </td><td> Primäre Infektion Phänotyp </td><td> Hinweis </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Inzuchtstämmen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A / J, CBA, C3H </td><td> Sehr anfällig </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 und C57BL / 10 </td><td> Anfällig </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / c, DBA / 2, 129 / J </td><td> Zwischen- </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> Geringe Empfindlichkeit </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für Cytokine oder Cytokinrezeptoren </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> Anfälliger </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> Weniger anfällig (a); keine Änderung in der Empfindlichkeit, sondern erhöht Granulome (b) </td><td> (A) 33 </td></tr><tr><td> (B) 34 </td></tr><tr><td> IL-2R &amp; beta; Transgenic (C57BL / 6) </td><td> Beständig </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> Höhere Fruchtbarkeit </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R-- / - (C57BL / 6 und BALB / c) </td><td> Sehr anfällig </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c oder C57BL / 6) </td><td> Highly Resistant </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 Transgenic(FVB) </td><td> Beständig </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Mangel Th2, verringert Granulom gormation </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / c) </td><td> Anfälliger </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) </td><td> Keine Veränderung der Empfindlichkeit </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Hohe Th1, Erhöhte Anfälligkeit </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für die T-Zell-Marker </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / c) </td><td> Geringfügig höheren Fruchtbarkeit </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / c) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit &amp;# 160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Transgene für angeborene Immun loci </td><td></td></tr><tr><td> Typ-1-Interferon-Rezeptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> Höhere Fruchtbarkeit, mehr Granulome </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> Widerstandsfähiger, mehr Granulome </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / Wv (WBB6) </td><td> Anfälliger </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Primäre Infektion mit H. polygyrus in genetisch unterschiedliche und gezielte Gen-Mausstämme.

Heligmosomoides polygyrus ein Maus Nematoden mit starken immunmodulatorischen Fähigkeiten, ähneln denen von hoch vorherrschende menschliche Wurminfektion. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die langfristige Wartung der H. polygyrus Lebenszyklus.

Der Anbau von<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Eine immunmodulatorische Nematode Parasite und seine Secreted Produkte

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die von langlebigen Helmuth-Parasiten sezernierten Moleküle zu sammeln und zu analysieren, die die Immunantwort des Wirts herabregulieren und dadurch das Überleben der Parasiten ermöglichen. Dies wird erreicht, indem man zunächst die Parasiten in ihrem natürlichen Lebensraum, dem Darmtrakt von Mäusen, kultiviert. Der zweite Schritt besteht darin, die ausgewachsenen Parasiten nach der Tötung der Mäuse zu isolieren. Anschließend werden die Helmuth-Parasiten über einen Zeitraum von bis zu drei Wochen in Gewebekultur kultiviert, wobei sie große Mengen an exkretorischen, sekretorischen oder ES-Molekülen freisetzen. Im letzten Schritt werden die freigesetzten Moleküle aus den Kulturüberständen gewonnen und in Chargen von ES für biologische und biochemische Untersuchungen angereichert. Letztendlich können die angereicherten Überstände direkt an spezifischen Zelltypen in vitro getestet werden, um Veränderungen in der Immunzellfunktion zu untersuchen, oder an Mäusen verabreicht werden, um ihre Fähigkeit zur Unterdrückung von Allergien und anderen Erkrankungen zu prüfen.Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir bemerkten, dass die Immunsuppression mit einer Infektion durch lebende Parasiten verknüpft war, was auf eine aktive und andauernde Freisetzung immunsuppressiver Moleküle durch lebende Parasiten hindeutet. Obwohl diese Methode Einblicke in Parasiteninfektionen ermöglichen kann, sind die von uns entdeckten Moleküle, die die Immunität unterdrücken, vermutlich sehr wirksam bei der Behandlung zentraler Erkrankungen der westlichen Welt, wie Allergien, Autoimmunerkrankungen und entzündliche Darmerkrankungen. Eine visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Gewinnung und Verarbeitung von Helminten-Parasiten recht spezialisiert sind und besondere Sorgfalt im aseptischen Kulturverfahren erfordern.8 Wochen alte F1-Mäuse werden mittels oraler Gavage mit H. polygyrus-Larven infiziert, um den Lebenszyklus von H. polygyrus zu ermöglichen. Bereiten Sie H. polygyrus-L3-Larven in einer Konzentration von 2.000 pro Milliliter destilliertem Wasser gemäß des begleitenden Protokolls vor. Verabreichen Sie 400 L3-Larven pro Maus in 200 Mikroliter vor jeder Infektion.Suspension der Larven durch fünfmaliges Umstülpen aufziehen und 200 Mikroliter der Larvensuspension mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer speziellen Gavagesonde mit abgerundeter Spitze aspirieren. Zur oralen Gavage das Maus in aufrechter Position am Nackenfell fixieren und die stumpfe Gavagesonde vorsichtig durch Mund und Speiseröhre in den Magen einführen. Erwachsene Würmer und Parasiteneier werden aus der Maus gewonnen.14 Tage nach der Infektion, 14 Tage nach der Infektion. Erwachsene Helicobacter-polygyrus-Würmer werden mithilfe einer modifizierten Bayamon-Vorrichtung, die wie hier gezeigt präpariert wurde, aus den Mäusen gewonnen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie den Bauch des euthanasierten Tieres mit 70 %igem Ethanol abwaschen.Schneiden Sie die Haut über dem Abdomen und ziehen Sie sie zurück, um die vordere Bauchwand freizulegen. Führen Sie einen medianen Schnitt durch, um in die Bauchhöhle einzudringen. Entfernen Sie den gesamten Dünndarm und Dickdarm vom proximalen Duodenum bis zum distalen Rektum.Legen Sie es in eine trockene Petrischale. Richten Sie den Darm über seine gesamte Länge gerade, entfernen Sie den fäkalienhaltigen Dickdarm und legen Sie diesen in eine separate Schale, um später die Eier zu gewinnen. Identifizieren Sie anschließend die proximalen 20 Zentimeter des Dünndarms, die die erwachsenen Würmer enthalten.Es zeichnet sich durch die relativ dicke Wand des Duodenums aus und weist oft aufgrund der intraluminalen Würmer ein rötliches Aussehen auf. Resektieren Sie diesen Abschnitt des Dünndarms und geben Sie ihn in eine Petrischale mit fünf Millilitern Hank's-Lösung. Erwärmen Sie auf 37 Grad Celsius mit abgerundeten Scheren.Öffnen Sie den mit Würmern gefüllten proximalen Darmabschnitt longitudinal und schaben Sie mit zwei Objektträgern die Innenseite der Darmschleimhaut ab. Um die Würmer zu entfernen, entsorgen Sie die saubere Darmwand. Bauen Sie den Trichter mit Hank's Lösung auf.Befestigen Sie einen kleinen Mullbeutel mit einer Heftklammer und gießen Sie die Würmer aus zwei Petrischalen hinein. Bringen Sie je zwei Mullbeutel an jedem Glastrichter an und sichern Sie die Beutel mit Büroklammern am Rand des Trichters. Stellen Sie die Apparatur für eine bis zwei Stunden in einen 37 °C Inkubator. Halbzeit der Inkubation vorsichtig das Gerät schütteln, um Ablagerungen von der Darmpräparation zu lösen, die den Mullfilter verstopfen könnten. Achten Sie darauf, dass keine Ablagerungen außerhalb des Mullbeutels verschüttet werden, da dies zu einer Kontamination bei der endgültigen HES-Präparation führen würde. Am Ende der Inkubation das Sammelreagenzglas vorsichtig über einem Ausguss mithilfe einer Plastikpipette vom verbindenden Gummischlauch abtrennen, die Würmer in ein 50-Milliliter-Gefäß überführen und die Würmer durch Schwerkraft absetzen lassen.Entfernen Sie das Medium mit einer Pipette. Geben Sie 40 Milliliter Hank's-Lösung hinzu und lassen Sie die Würmer absinken. Wiederholen Sie dies fünfmal, sodass insgesamt sechs Waschschritte durchgeführt werden. Die Vermeidung von Kontaminationen der Trübungskultur ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls.Die Wurmkultur muss ab diesem Zeitpunkt steril gehalten werden. Überführen Sie die Kultur in eine laminare Flusswerkbank und waschen Sie die Wurmkultur erneut sechsmal mit steriler Hank’s-Lösung, die mit Antibiotika angereichert ist, unter Verwendung einer Pipette. Sammeln Sie zwei Proben à 20 Mikroliter, um die gewonnenen erwachsenen Würmer zu zählen. Etwa 50 % der eingeimpften Larven sollten am 14. Tag nach der Infektion Eier ablegen, um mit einer Pinzette Fäkalien aus dem zuvor exzidierten Colon abzukratzen.Mischen Sie anschließend den Kot mit granulierter Holzkohle im Verhältnis von mindestens eins zu eins. Um eine Konsistenz zu erzielen, die gerade ausreicht, um ein Papier zu füllen und daran haften zu bleiben. Tragen Sie eine dünne Schicht in die Mitte eines feuchten Filterpapiers in einer Petrischale auf und stellen Sie diese in eine lichtundurchlässige, feuchte Box, um sie 12 bis 14 Tage lang im Dunkeln zu halten.Ab dem siebten Tag beginnen Sie, L3-Larven zu sammeln. Befördern Sie eine Ringanordnung entlang des Randes des Filterpapiers. Heben Sie das Filterpapier aus der Petrischale und spülen Sie die auf der Platte verbliebenen Larven mit einer Pipette mit fünf Milliliter sterilem Wasser pro Platte ab.Überführen Sie die Larven in ein 50-Milliliter-Röhrchen. Legen Sie das Filterpapier zurück in die Petrischale und stellen Sie diese erneut für eine wöchentlich wiederholte Sammlung der Larven bis zu einem Monat lang in den Dunkeln. Die gesammelten Larven werden anschließend gemäß dem beschriebenen Protokolltext gewaschen und bei vier Grad Celsius in destilliertem Wasser aufbewahrt.Um dieses Verfahren zu beginnen, werden die Würmer etwa 10 Milliliter hang-Lösung zugesetzt, die mit 10 % Gentamicin ergänzt wurde, und 20 Minuten lang inkubiert, wobei das Gefäß schräg gestellt wird, um sicherzustellen, dass die Würmer nach 20 Minuten vollständig bedeckt sind. Die Würmer werden sechsmal mit Hank’scher Lösung, ergänzt mit Antibiotika, gewaschen und anschließend in belüftete T-25-Flaschen überführt. Die Flaschen werden für drei Wochen aufrecht in einem 37 °C warmen Inkubator platziert, um Ausscheidungssekretionsprodukte oder HES aus den Würmern vorzubereiten.Kultur mit HES. Das Kulturmedium wird in Abständen von höchstens zweimal pro Woche gesammelt und jedes Mal durch ein gleiches Volumen h polyus Medium ersetzt. Jede Sammlung muss getrennt aufbewahrt und deutlich mit Datum und Chargennummer gekennzeichnet werden, da die Gefahr einer Kontamination mit LPS und Wirtsproteinen höher ist.Die erste Sammlung nach 24 Stunden Kultivierung sollte beiseitegestellt und entweder separat aufgearbeitet oder verworfen werden. Zentrifugieren Sie das HES-haltige Medium bei 400 ×g für fünf Minuten. Danach das Medium mit einer 50-Milliliter-Spritze abpipettieren und durch einen 0,2-Mikron-Filter mit geringer Proteinbindung in 50-Milliliter-Röhrchen leiten. Anschließend wird das gepoolte HES-Supernatant über eine Ultrafiltrationsvorrichtung mit einer Molekulargewichtsabscheidung von 3000 unter Stickstoffdruck konzentriert. Um die Filtervorrichtung vorzubereiten, spülen Sie die dreikilodalton-Membran mit der glänzenden Seite nach unten in einem einen Liter fassenden Becher unter Rühren mit destilliertem Wasser. Bauen Sie die Ultrafiltrationsvorrichtung gemäß den Herstelleranweisungen zusammen, wobei die Filtermembran mit der glänzenden Seite nach oben eingesetzt wird. Stellen Sie die Vorrichtung in einen Schrank mit vier Grad Celsius und lassen Sie 50 Milliliter destilliertes Wasser hindurchlaufen, bevor Sie mit der Konzentrierung des gegossenen HES beginnen. Achten Sie darauf, dass die Filtermembran niemals austrocknet. Fügen Sie nach Bedarf jeweils ein Röhrchen HES in die Filtrationsvorrichtung hinzu, bis das Volumen auf zwei bis fünf Milliliter konzentriert ist, um Aminosäuren und andere Bestandteile des Gewebekulturmediums zu entfernen.Aus der HES-Präparation 50 Milliliter pyrogenfreies PBS zum Filtrationsgerät geben und anschließend auf etwa zwei Milliliter einkonzentrieren. Diesen Schritt zweimal wiederholen. Unter Verwendung eines Gesamtvolumens von 150 Milliliter PBS eine ES in eine Spritze überführen und mit einem 0,2-Mikron-Filter sterilfiltrieren.Nach der Bestimmung der Protein­konzentration Aliquotenbeschriftung mit der Chargennummer und dem Datum vornehmen und bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Eine orale Gavage von 400 µL je drei Larven dient zur Aufrechterhaltung des H. polygyrus-Lebenszyklus in F1-Mäusen. Die resultierende Zahl erwachsener Würmer ist hier dargestellt.Es hat sich gezeigt, dass Chargen von HES reproduzierbare Wirksamkeit in Funktionsassays und hinsichtlich der Proteinzusammensetzung aufweisen. Darüber hinaus erwiesen sich die Proteinprofile bei der Analyse der Überstände aus jeder aufeinanderfolgenden Woche der Kultur als sehr ähnlich, und zwar insgesamt bis zu vier Wochen lang. Wenn eine TS-Konzentration mittels des Bradford-Assays gemessen wird, beträgt das Gesamtprotein üblicherweise etwa ein Milligramm pro Milliliter.Die Ausbeute an HES-Protein aus 11 verschiedenen Chargen, gewonnen aus etwa 500 Milliliter Kulturüberstand, ist dargestellt. Die Vermeidung von Kontaminationen ist entscheidend beim Sammeln von HES, da die Gehalte an LPS-Kontaminationen in 41 Chargen von HES mittels des Limulus Amebocyte Lysate (LAL)-Tests gemessen wurden. Die meisten HES-Chargen wiesen deutlich niedrigere Kontaminationswerte als der empfohlene Schwellenwert auf.Während der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, stets sorgfältig sterile Techniken bei der Einrichtung der Kulturen anzuwenden. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn das Verfahren ordnungsgemäß befolgt wird. Andere Methoden wie die Proteomik, die Proteinfraktionierung sowie die Analyse von Glykanen, Lipiden und microRNAs können durchgeführt werden, um das Spektrum der von diesen Parasiten freigesetzten molekularen Produkte vollständig zu verstehen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Poly limus vermehrt. Moid ist Polyus und sammelt DS-Produkte aus den kultivierten erwachsenen Würmern, um deren Wirkung auf das Immunsystem zu testen. Obwohl dieser Parasit für den Menschen nicht wirksam ist, ist es wichtig, Sicherheitsvorkehrungen einzuhalten und dem vorgegebenen Protokoll genau zu folgen, um die Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Chargen von Hess zu gewährleisten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Trichuris muris Infektion ist ein Darm-Modell von Th2 Immunität, wo resistente Mäuse generieren eine schützende Th2-Antwort und anfälligen Mäusen erzeugen eine pathologische Th1-Antwort.

Trichuris muris Infektion: Ein Modell des Typ-2-Immunität und Entzündung im Darm

Das Ziel dieser Präsentation ist es, in vivo und in-vitro-Techniken für die Aufzucht von insektenpathogenen Nematoden zu demonstrieren. In-vivo-Verfahren betrachten die Aufzucht dieser Nematoden mit einer Insektenwirts, während die in-vitro-Methoden zu nutzen reichen Agar-Medien.

In-vivo-und In-vitro-Aufzucht von Nematoden (Steinernematidae und Heterorhabditidae)

Wilde Caenorhabditis-Nematoden sind mit vielen Mikroben assoziiert, oft im Darmlumen oder im Darm. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Anreicherung von nicht kultivierbaren Mikroben, die den Darm besiedeln, unter Ausnutzung der Widerstandsfähigkeit der Dauerkutikula.

Selektive Reinigung von wilden Caenorhabditis-Nematoden zur Anreicherung von Darmmikrobiombakterien

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Untersuchung der vererbten Immunität in einem Caenorhabditis elegans Modell der Mikrosporidieninfektion

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Kultivierung und genetische Manipulation entomopathogener Nematoden

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Eine Strategie für die Untersuchung von IL-9-produzierenden lymphatischen Zellen im Nippostrongylus brasiliensis-Infektionsmodell

Caenorhabditis elegans ist eine der wichtigsten Modellarten in der Biologie, aber fast alle Forschungen werden in Abwesenheit ihrer natürlich assoziierten Mikroben durchgeführt. Die hier beschriebenen Methoden werden dazu beitragen, die Vielfalt assoziierter Mikroben als Grundlage für zukünftige funktionelle C. elegans-Forschung besser zu verstehen.

Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

Strongyloides ratti ist ein parasitärer Fadenwurm, der bei Labormäusen vorübergehende Infektionen verursacht und gewebemigrierende und intestinale Lebensstadien aufweist. Hier stellen wir ein Protokoll für die Aufrechterhaltung des Parasitenzyklus bei Ratten und die experimentelle Infektion von Mäusen vor, einschließlich der Parasitenquantifizierung im Kopf, in der Lunge und im Darm.

Experimentelle Infektion von Mäusen mit dem parasitären Fadenwurm Strongyloides ratti

Hier beschreiben wir die in vitro Kulturbedingungen, die Isolierung und die verstärkte Bildung von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Echinococcus granulosus. Die kleinen EVs wurden durch dynamische Lichtstreuung und Transmissionselektronenmikroskopie charakterisiert. Die Aufnahme durch dendritische Zellen aus dem Knochenmark und ihre phänotypische Modulation wurden mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie untersucht.

Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

Wir stellen zwei Methoden vor, mit denen Landwirte entomopathogene Nematoden massenhaft als Bioinsektizide vermehren können. Die erste Methode verwendet Polyacrylamidgel als Nematoden-Kultivierungssubstrat, während die zweite polymerbeschichtete Baumwolle als Kultivierungssubstrat verwendet. Beide Methoden basieren auf der in vivo Vermehrung von Nematoden in Insektenkadaver.

Pflanzenbasierte in vivo Vermehrung entomopathogener Nematoden

Erfahren Sie die Kultivierung von Heligmosomoides polygyrus für Immunologie und Parasitologie. Diese Methode ermöglicht die Isolierung immunmodulatorischer Moleküle zur Untersuchung ihrer Wirkung auf Immunzellen.

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