Der Anbau von Heligmosomoides polygyrus: Eine immunmodulatorische Nematode Parasite und seine Secreted Produkte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die von langlebigen Helmuth-Parasiten abgesonderten Moleküle zu sammeln und zu analysieren, die die Immunreaktionen des Wirts herunterregulieren und so das Überleben der Parasiten ermöglichen. Dazu werden die Parasiten zunächst in ihrem natürlichen Lebensraum, dem Darmtrakt von Mäusen, gezüchtet. Der zweite Schritt besteht darin, die reifen Parasiten nach der Euthanasie von den Mäusen zu isolieren.

Als nächstes werden die Helmuth-Parasiten in Gewebekulturen kultiviert, wobei das Medium bis zu drei Wochen lang ausbricht und in dieser Zeit große Mengen an Ausscheidungs-, Sekretions- oder ES-Molekülen freisetzt. Der letzte Schritt besteht darin, die freigesetzten Moleküle aus den Kulturüberständen zurückzugewinnen und in ES-Chargen für biologische und biochemische Tests zu konzentrieren. Letztendlich können die konzentrierten Überstände direkt an bestimmten Zelltypen in vitro getestet werden, um Veränderungen in der Immunzellfunktion zu untersuchen, oder Mäusen verabreicht werden, um ihre Fähigkeit zu testen, Allergien und andere Erkrankungen zu unterdrücken.

Wir hatten die Idee zu dieser Methode, als wir feststellten, dass die Immunsuppression mit einer Infektion lebender Parasiten verbunden ist, was auf eine aktive und anhaltende Freisetzung von immunsuppressiven Molekülen aus lebenden Parasiten hinweist. Obwohl diese Methode Einblicke in Parasiteninfektionen geben kann, entdecken wir, dass die Moleküle, die die Immunität unterdrücken, wahrscheinlich sehr wirksam bei der Behandlung von Schlüsselkrankheiten der westlichen Welt sind, wie z. B. Allergien, Autoimmunität und entzündliche Darmerkrankungen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Rückgewinnung und Verarbeitung von Helmuth-Parasiten sehr spezialisiert sind und der aseptischen Kulturtechnik besondere Aufmerksamkeit erfordern.

Acht Wochen alte F1-Mäuse werden mit H-Polyus-Larven durch orale Sonde für die Lebenszyklusproduktion von H-Polyus infiziert. H polyus L drei Larven zu 2000 pro Milliliter destilliertem Wasser zubereiten, wie im beigefügten Protokoll beschrieben. Text, um vor jeder Infektion 400 L drei pro Maus in 200 Mikrolitern zu verabreichen.

Trainieren Sie die Larvensuspension, indem Sie sie fünfmal mit einer Ein-Milliliter-Spritze mit einer speziellen Sondennadel mit abgerundetem Ende umdrehen und aspirieren Sie 200 Mikroliter der Larvensuspension. Um eine orale Sonde durchzuführen, halten Sie die Maus in einer aufrechten Position am Nacken fest und führen Sie die stumpfe Sondennadel vorsichtig durch den Mund und die Speiseröhre in den Magen ein. Adulte Würmer und Parasiteneier werden aus der Maus gewonnen.

14 Tage nach der Infektion, 14 Tage nach der Infektion. Adulte H-Polyus-Würmer werden von den Mäusen unter Verwendung einer modifizierten Bajamon-Vorrichtung gesammelt, die wie hier gezeigt hergestellt wurde. Um diesen Vorgang zu starten, waschen Sie den Bauch des eingeschläferten Tieres mit 70% Ethanol.

Schneiden Sie die Haut über dem Bauch ab und ziehen Sie sie zurück, um die vordere Bauchdecke freizulegen. Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie, um in die Bauchhöhle zu gelangen. Entfernen Sie den gesamten Dünn- und Dickdarm vom proximalen Zwölffingerdarm bis zum distalen Rektum.

Lege es in eine trockene Petrischale. Begradigen Sie den Darm über seine gesamte Länge, um den Stuhl mit Dickdarm herauszuschneiden, und legen Sie ihn in eine separate Schale, um später Eier zu gewinnen. Identifizieren Sie als Nächstes die proximalen 20 Zentimeter des Dünndarms, in dem sich die erwachsenen Würmer befinden.

Er zeichnet sich durch die relativ dicke Wand des Zwölffingerdarms aus und hat aufgrund der intraluminalen Würmer oft ein rotes Aussehen. Schneiden Sie diesen Teil des Dünndarms heraus und geben Sie ihn mit fünf Millilitern Hank-Lösung in eine Petroschale. Mit einer Schere mit rundem Ende auf 37 Grad Celsius erwärmen.

Öffnen Sie den mit Wurm gefüllten proximalen Darmabschnitt in Längsrichtung und kratzen Sie die Innenseite der Darmschleimhaut mit zwei Objektträgern ab. Um die Würmer zu entfernen, entsorgen Sie die saubere Darmwand. Erstellen Sie den Trichter mit Hanks Lösung.

Tackern Sie einen kleinen Musselinbeutel zu und kippen Sie die Würmer aus zwei Petrischalen hinein. Ordnen Sie zwei Musselinbeutel an jedem Glastrichter an und befestigen Sie die Beutel mit Büroklammern am Rand des Trichters. Stellen Sie das Gerät für ein bis zwei Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Bewegen Sie das Gerät nach der Hälfte der Inkubation vorsichtig, um Ablagerungen aus dem Darmpräparat zu entfernen, die den Musselinfilter verschließen könnten. Achten Sie darauf, dass kein Schmutz außerhalb des Musselinbeutels verschüttet wird, da dies bei der endgültigen HES-Vorbereitung zu einer Kontamination führen kann. Am Ende der Inkubation lösen Sie das Sammelreagenzglas vorsichtig mit einer Kunststoffpipette vom Gummischlauch über einem Waschbecken, geben die Würmer in ein 50-Milliliter-Röhrchen und lassen die Würmer sich mit der Schwerkraft absetzen.

Entfernen Sie das Medium mit einem Streifen. Fügen Sie 40 Milliliter Hank-Lösung hinzu und lassen Sie die Würmer sich absetzen. Wiederholen Sie dies fünfmal für insgesamt sechs Wäschen. Die Vermeidung einer Kontamination der Dunstkultur ist entscheidend für den Erfolg dieses Protokolls.

Ab diesem Zeitpunkt muss die Wurmkultur steril gehalten werden. Setzen Sie sie in eine Laina-Durchflusshaube und waschen Sie die Wurmkultur weitere sechs Mal in steriler Hank-Lösung, die mit einer Pipette mit Antibiotika ergänzt wird, und entnehmen Sie zwei Proben von 20 Mikrolitern, um die gewonnenen adulten Würmer zu zählen. Es wird erwartet, dass etwa 50 % der Menge der geimpften Larven am 14. Tag der Infektion Eier sammeln, um den Kot mit einer Pinzette aus dem zuvor herausgeschnittenen Dickdarm zu entfernen.

Mischen Sie anschließend den Kot mit granulierter Holzkohle in einem Verhältnis von mindestens eins zu eins. Um eine Konsistenz zu erreichen, dämmen Sie einfach so weit, dass ein Papier haftet. Schmieren Sie eine dünne Schicht auf die Mitte eines Stücks feuchten Filterpapiers in einer Petrischale und legen Sie dieses in eine feuchte, lichtdichte Box, um es 12 bis 14 Tage lang dunkel zu halten.

Beginnen Sie ab dem siebten Tag mit dem Sammeln von L, drei Larven und Larven. Forme einen Ring um den Rand des Filterpapiers. Heben Sie das Filterpapier aus der Petrischale und spülen Sie mit einer Pipette fünf Milliliter steriles Wasser pro Platte die Larven ab, die auf der Platte verbleiben.

Füllen Sie die Larven in ein 50-Milliliter-Röhrchen um. Setzen Sie das Filterpapier wieder in die Schale ein und stellen Sie es in die Dunkelheit und wiederholen Sie die Larvensammlung wöchentlich für einen Monat für einen Monat. Anschließend werden die gesammelten Larven wie im Protokolltext beschrieben gewaschen und bei vier Grad Celsius in destilliertem Wasser gelagert.

Um dieses Verfahren zu beginnen, weichen Sie die Würmer 20 Minuten lang in etwa 10 Millilitern Hängelösungen ein, die mit 10 % Gentamicin ergänzt werden, und lassen Sie das Röhrchen schräg ruhen, um sicherzustellen, dass die Würmer nach 20 Minuten vollständig bedeckt sind. Waschen Sie die Würmer sechsmal mit Hank-Lösungen, ergänzt mit Antibiotika, Eloqua-Würmern in entlüftete T 25-Kolben. Stellen Sie die Kolben für drei Wochen aufrecht in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator, eine Zubereitung aus Ausscheidungssekretionsprodukten oder HES aus den Würmern.

HES mit Kultur. Die Medien werden in Abständen von nicht mehr als zweimal pro Woche aus den Kulturen entnommen und jeweils durch die gleiche Menge h polyus Medien ersetzt. Bewahren Sie jede Entnahme getrennt und deutlich mit dem Datum und der Chargennummer gekennzeichnet auf, da das Potenzial für eine Kontamination mit LPS und Wirtsproteinen höher ist.

Die erste Entnahme nach 24 Stunden Kultur sollte beiseite gestellt und entweder separat verarbeitet oder die HES-Zentrifuge mit Medien mit einem Gehalt von 400 mal G für fünf Minuten verworfen werden. Aspirieren Sie dann das Medium mit einer 50-Milliliter-Spritze und passieren Sie einen 0,2-Mikron-Filter mit geringer Proteinbindung in 50-Milliliter-Röhrchen. Anschließend wird die gepoolte HES Supena über einen 3000 Molekulargewichts-Cutoff-Filter in einer Ultrafiltrationsvorrichtung unter Stickstoffdruck konzentriert, um die Filtervorrichtung zunächst einzurichten, die drei Kilo Dalton-Membran mit der glänzenden Seite nach unten in einem Ein-Liter-Becherglas mit destilliertem Wasser unter Rühren zu waschen.

Montieren Sie das Ultrafiltrationsgerät gemäß den Anweisungen des Herstellers, stellen Sie die Filtermembran mit der glänzenden Seite nach oben in einen Schrank mit vier Grad Celsius und lassen Sie 50 Milliliter destilliertes Wasser durch, bevor Sie mit dem Konzentrieren des gegossenen HES beginnen. Achten Sie sehr darauf, dass der Filter nicht trocken läuft. Geben Sie jedes Röhrchen HES nach Bedarf in das Filtrationsgerät, bis das Volumen auf zwei bis fünf Milliliter konzentriert ist, um Aminosäuren und andere Bestandteile des Gewebekulturmediums zu entfernen.

Aus der HES-Zubereitung 50 Milliliter pyrofreies PBS in das Filtrationsgerät geben und dann auf etwa zwei Milliliter konzentrieren. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Mit insgesamt 150 Millilitern PBS wird ein ES in eine Spritze überführt und mit einem 0,2-Mikron-Filter sterilisiert.

Nach Messung der Proteinkonzentration aliquot mit der Chargennummer und dem Datum markieren und bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Eine orale Sonde von 400 L drei Larven wird verwendet, um den Lebenszyklus von H poly gyus bei F1-Mäusen aufrechtzuerhalten. Die daraus resultierenden adulten Wurmbelastungen sind hier dargestellt.

Chargen von HES haben ihre reproduzierbare Wirksamkeit in funktionellen Assays und in der Proteinzusammensetzung bewiesen. Darüber hinaus stellte sich bei der Analyse von Überständen aus jeder aufeinanderfolgenden Kulturwoche heraus, dass die Proteinprofile bis zu insgesamt vier Wochen lang sehr ähnlich waren. Wenn eine TS-Konzentration mit dem Bradford-Assay gemessen wird, beträgt das Gesamtprotein normalerweise etwa ein Milligramm pro Milliliter.

Die Ausbeute an HES-Protein aus 11 verschiedenen Chargen, die aus etwa 500 Millilitern Überstand der Kultur gewonnen wurden, ist dargestellt. Die Vermeidung von Kontaminationen ist bei der Entnahme von HES von entscheidender Bedeutung, wenn der LPS-Kontaminationsgrad in 41 HES-Chargen mit dem limbus AAMI CYTE-Assay gemessen wurde. Es wurde festgestellt, dass die meisten Chargen von HES deutlich unter dem empfohlenen Kontaminationsschwellenwert lagen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, beim Einrichten der Kulturen eine sorgfältige sterile Technik beizubehalten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei bis vier Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Andere Methoden wie Proteomik, Proteinfraktionierung und Analyse von Glykanen, Lipiden und microRNAs können durchgeführt werden, um das Spektrum der molekularen Produkte, die von diesen Parasiten freigesetzt werden, vollständig zu verstehen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Polylimus vermehrt. Moid ist polyus und sammelt DS-Produkte aus den gezüchteten adulten Würmern, um ihre Auswirkungen auf das Immunsystem zu testen. Obwohl dieser Parasit für den Menschen nicht wirksam ist, ist es wichtig, Sicherheitsvorkehrungen zu befolgen und sich an das angegebene Protokoll zu halten, um die Reproduzierbarkeit zwischen den Chargen von Hess zu gewährleisten.