Name: Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose Cryptococcus neoformans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Cholesterin-Depletion in Makrophagen und deren Einfluss auf die Phagozytose von Cryptococcus neoformans. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Pilzinfektionen in vitro und liefert quantitative Ergebnisse zur Pathogenese.

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Diese Arbeit wurde vom NIH Zuschüsse AI56168, AI71142, AI87541 und AI100631 zu MDP unterstützt. Maurizio del Poeta ist Burroughs Wellcome Investigator in Infectious Diseases.

1. Cholesterin Depletion von J774A.1 Zellen mit MßCD <ol><li> In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 5 J774A.1-Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Well auf einer 96-well-Zellkulturplatte in 200 ul Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S). Bei 37 ° C und 5% CO &amp; sub2; O / N. </li><li> Medium entfernt von der Zellmonoschicht und die Zellen werden zweimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die gefiltert und autoklavierbar ist. </li><li> Fügen Sie 200 ul MßCD Lösung in der gewünschten Konzentration (10 mM oder 30 mM in PBS) oder 1x PBS als Kontrolle und Inkubation für 30 min bei 37 ° C unter Schütteln. Überstand entfernen und Reserve bei RT für die quantitative Analyse mit im Handel erhältlichen Kits unmittelbar nach dem Eingriff. </li><li> Mit 1x PBS oder serumfreiem DMEM Waschen Sie die Zellen zwei bis drei Mal und fahren Sie mit Infektion oder Lyse von Zellen pipetting zwei bis drei Mal mit deionisiertem H 2 O für die Analyse mittels Dünnschichtchromatographie oder mit einem Kit. HINWEIS: Nach Cholesterinabbau ein kommerziell erhält Cholesterin Quantifizierung Kit kann verwendet werden. Siehe Materialien Abschnitt. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers geschrieben. </li></ol> 2. Beobachtung von Cholesterin Inhalt von Dünnschicht-Chromatographie (TLC) <ol><li> Zweimal mit Aceton und einmal zu waschen eine TLC-Tank mit einer Lösung von Petrolether: Diethylether: Essigsäure (65: 30: 1 nach Volumen). Sättigen den Tank mit dem Petrolether: Diethylether: Essigsäure (65: 30: 1 nach Volumen) Lösung und lassen O / N. HINWEIS: Organische Lösemittel sollten immer unter einer Abzugshaube verwendet werden, um das Einatmen von Dämpfen zu verhindern. Handschuhe und Labormantel müssen immer getragen werden. Essigsäure ist eine starke Säure und sollte mit Vorsicht verwendet werden. </li><li> In einer sterilen Biosicherheitswerkbank, Samen 10 6 J774A.1 Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Vertiefung auf einer 6-Well-cell Kulturplatte in einem Volumen von 5 ml warmem DMEM mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt. Bei 37 ° C, 5% CO 2 O / N. </li><li> Abbau Makrophagen von Cholesterin durch folgende Schritte 1,2 bis 1,4, und ersetzen Sie 1 ml für 200 &amp; mgr; gegebenenfalls für die größeren und Größe zu berücksichtigen. </li><li> Fügen Sie 500 ul Trypsin-EDTA in jedes Loch, Inkubation für 3 min bei 37 ° C, und sanft kratzen Zellen mit einem Zellschaber. </li><li> Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen eingewogen und zusätzlich 500 ul warmem DMEM mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt. </li><li> Drehen Sie die Zellen für 5 min bei 300 g und Überstand. </li><li> Fügen Sie eine zusätzliche 500 ul warmes DMEM mit 10% FBS und 1% P / S zu dem Zellpellet ergänzt und sorgfältig resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Entfernen Sie 10 ul der Zellen und zählen Zellen auf einem Hämozytometer. Normalisieren die Zellkonzentrationen von jeder Probe, und fügen Sie die gleiche Anzahl von Zellen auf Glasröhren. HINWEIS: Bei diesem Schritt ist, kann manwählen, um Zellen, die aus den gleichen Behandlungsgruppen zu kombinieren, um eine stärker konzentrierte endgültige Lipidextrakt zu erhalten. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei RT inkubiert und das Medium entfernt. </li><li> 2 ml Methanol und Wirbel. Dann fügen Sie 1 ml Chloroform und Wirbel. Überprüfen Sie die Phasenlage um sicherzustellen, dass die Lösung in einphasigen machen. HINWEIS: Die Schläuche können bei 4 ° CO / N gespeichert werden. </li><li> Zentrifuge bei 1.700 xg für 10 min bei RT und den Überstand in ein neues Röhrchen </li><li> Fügen Sie eine zusätzliche 1 ml Chloroform, gefolgt von 1 ml dH 2 O Vortex zweimal für 30 Sekunden. Zentrifuge bei 1.700 xg für 5 Minuten bei RT. </li><li> Wiege eine Glasröhre auf einem empfindlichen Gleichgewicht und einen Glas-Pasteur-Pipette, um die Unterphase in das Glasrohr mit bekanntem Gewicht zu übertragen. </li><li> Trocknen Sie nach unten Lipiden in einer Zentrifugalverdampfer bis trocken (ca. 2 h). Wiegen Rohr mit getrockneten Lipide und berechnen Sie die trockene Lipidgewicht. HINWEIS: Dry Lipide können in -20 ° C bis zu seiner TLC führen gespeichert werden. </li><li> Verdünne getrockneten Lipide in Chloroform ausreichend, um die Konzentration von Lipid zu normalisieren (üblicherweise 20-50 ul) und der Last 20 ul der verdünnten Lipid auf eine Kieselgel-DC-Platte. Last 20 ug Cholesterin in 20 ul Chloroform als Standard verdünnt. </li><li> Fügen getrocknet DC-Platte auf den gesättigten TLC Tank und lassen Sie Lösungsmittel für die Migration von bis zu 1 cm vor der Plattenkante. Entfernen DC-Platte aus dem Tank und lassen Sie es ca. 5 Minuten trocknen lassen. </li><li> Visualisieren Lipide, indem in einem Joddampf Tank Migration überprüfen. Entfernen Sie und lassen Sie Flecken auf etwa 10 verblassen - 15 Minuten unter der Haube. HINWEIS: Jod ist ein Inhalationsrisiko. Verwenden Sie immer unter einer Abzugshaube. </li><li> Es wird eine Lösung für die Neutrallipid-Anfärbung durch Kombinieren von 60 ml Methanol mit 60 ml entionisiertem H 2 O, 4 ml Schwefelsäure und 630 mg Manganchlorid. </li><li> Die DC-Platte vorsichtig und langsam tauchen in das neutrale Lipid Farblösung in einer Schale und ohne Abgleitens der Kieselsäure l entfernenayer. ANMERKUNG: Das neutrale Lipid Färbelösung kann mehrere Male wiederverwendet werden, und so kann sie aus dem Fach abgerufen und in einer Flasche zur späteren Verwendung zurück gelegt. </li><li> Lassen Sie die Platte unter die Haube bei RT trocknen, bis alle Blasen verschwunden. Erhitzen Sie die DC-Platte auf einem Heizblock Satz bis 160 ° C und Saibling auf die gewünschte Farbe. HINWEIS: Eine Dichtemessung Programm wie Sehen funktioniert LS kann zur Quantifizierung der verkohlten Bands Lipidproben zu vergleichen. </li></ol> 3. Die Infektion von Makrophagen mit C. neoformans (H99) <ol><li> In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 5 Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Well auf einer 96-well-Zellkulturplatte in 200 &amp; mgr; l DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% P / S. Bei 37 ° C, 5% CO 2, 5% CO 2 O / N. HINWEIS: Die Infektion kann auch in Glas ausgeführt werden Talsohle konfokalen Gerichte für einfachere Bild; Alle Beträge bleiben gleich. </li><li> Wachsen einer Kultur der C. neoformans (H99)durch Inokulation von 10 ml YNB mit einer Kolonie von einem geschlagen Platte erhalten und Inkubation O / N bei 30 ° C unter Schütteln. </li><li> Waschen Sie und zählen C. neoformans (H99) Zellen. <ol><li> Centrifuge C. neoformans O / N-Kultur bei 1700 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie das Medium und entsorgen. Wash-Zellen mit 5 ml 1x PBS. Zentrifuge bei 1.700 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> PBS entfernen und wäscht mit 5 ml gefiltert 1x PBS. Zentrifuge bei 1.700 × g für 10 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male. </li><li> Entfernen PBS und Resuspendieren in 5 ml 1x PBS. </li><li> Stellen Sie eine serielle Verdünnung in PBS, um eine 1 zu erhalten: 500 Verdünnung der Kultur gewaschen. <ol><li> Füge 100 ul der ursprünglichen Probe zu 900 ul 1x PBS, um eine Verdünnung von 1:10 zu erhalten. </li><li> 100 l 1:10 verdünnten Probe zu 900 ul 1X PBS, um eine 1 zu erhalten: 100-Verdünnung. </li><li> Gib 200 ul der 1: 100 verdünnt Probe auf 800 &amp; mgr; l 1x PBS, um eine 1 zu erhalten: 500 dilutiauf </li></ol></li><li> Nehmen Sie 10 ul einer 1: 500-Verdünnung und zählen auf Hämozytometer, um die Anzahl der Zellen zu berechnen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie Arbeitslösung für die Aktivierung von Makrophagen und opsonisierenden C. neoformans. <ol><li> Verdünnen LPS und IFN 100x aus Stammlösungen durch Zugabe von 10 ul bis 990 ul. HINWEIS: LPS und IFN &amp; ggr; werden verwendet, um Phagozytose zu verbessern, sind jedoch nicht für die Phagozytose erforderlich. Wenn es ein Interesse an der fungiziden Aktivität von Makrophagen, führen Aktivierungs O / N bei 37 ° C mit Schütteln vor der Infektion. </li><li> Pro Probe kombinieren 7,5 ul verdünnt LPS, 1,25 &amp; mgr; l verdünnt IFNy, 1,25 ul GXM Antikörper und das Volumen des C. neoformans Kultur, die 1,25 x 10 5 Zellen gibt. Bringen Volumen bis zu 250 &amp; mgr; l multipliziert mit der Anzahl von Proben mit DMEM mit 10% FBS und 1% P / S ergänzt. </li><li> Vortex und Inkubation Lösung für 20 min bei 37 ° C unter Schütteln. HINWEIS:Cholesterinabbau (Schritte von 1,2 bis 1,4) kann gleichzeitig mit der Opsonisierung Schritt erfolgen. Achten Sie darauf, Makrophagen vor dem Kombinieren der Arbeitslösung zu behandeln, da die opsonisierte Zellen sind optimal zu nicht mehr als 20 min nach dem Schritt 3.4.3 Inkubation verwendet werden. </li></ol></li><li> Infizieren Makrophagen <ol><li> Wash Makrophagen zweimal mit serumfreiem DMEM und fügen Sie 200 ul opsonisierten C. neoformans Arbeitslösung in jede Vertiefung. </li><li> Inkubieren für 2 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Fix und Stain Cells <ol><li> Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen 2 mal mit DMEM. </li><li> Luft trocknen die Zellmonoschicht für 10 Minuten und mit 200 ul eiskaltem Methanol, um die Zellen zu fixieren. </li><li> Inkubieren für 15 min bei RT und entfernen Sie alle verbleibenden Methanol. </li><li> Fügen Sie 200 ul von 10x Giemsa und Inkubation für 5 min bei RT. </li><li> Mit VE-Wasser und trocken O / N mit Kappe aus 3 mal - Waschen 2. HINWEIS: Imaging können am nächsten Tag bis zu einer Woche followi erfolgen oder bisng-Färbung. </li></ol></li><li> Visualisieren und Graf <ol><li> Mit einem Mikroskop, zählen 300 Zellen pro Datenpunkt (bei ​​2 von der gleichen Behandlung zählen 150 pro Vertiefung), und notieren Sie die Anzahl der infizierten Makrophagen und Anzahl der verschlungen Cryptococcus Zellen. HINWEIS: Wenn Sie auch sicher, Probenahme pro Datenpunkt Einsatz 2 Platten pro Bedingung, wählen Sie 3 nicht überlappende Bereiche pro Platte und zähle 50 Zellen pro Fläche. </li><li> Berechnen phagozytischen Index, indem der Prozentsatz der infizierten Makrophagen durch die mittlere Anzahl von C neoformans pro Makrophagen. Normalisieren phagozytischen Index ausdrückt Werte als ein Prozentsatz des 1x PBS behandelten Kontroll. Nach mehreren Versuchen berechnet den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts, um Trends in phagozytischen Index zu bestimmen. Verwenden Student t-Test auf Signifikanz zu bestimmen. </li><li> Nehmen Sie Aufnahmen von Zellen bei 1,000x oder 400-facher Vergrößerung. </li></ol></li></ol> 4. Trypanblau-Assay <ol><li> In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 6 Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Vertiefung auf einer 6-Well-Zellkultur-Platte in einem Volumen von 5 ml Dulbecco-Minimal-Essential-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt . Bei 37 ° C, 5% CO 2 O / N. </li><li> Abbau Makrophagen von Cholesterin durch folgende Schritte 1,2-1,4 daß 2 ml für 200 &amp; mgr; gegebenenfalls für die größeren und Größe zu berücksichtigen. HINWEIS: Achten Sie darauf, eine Steuerung mit 1x PBS sowie eine Steuerung, die vor jeder Behandlung gekratzt behandelt sind. </li><li> Gib 500 ul 1x PBS in jede Vertiefung und sanft kratzen Zellen mit einem Zellschaber. Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen und die Zellen zu suspendieren durch leichtes Auf- und Abpipettieren. </li><li> Entfernen Sie 10 ul der Zellen und Fleck mit 1 ul 4% Trypanblau. </li><li> Zählen von Zellen an einem Hämozytometer und berechnen die Lebensfähigkeit unter Verwendung der folgenden Gleichung:% Lebensfähigkeit = [1 - (blaue Zellen / Gesamtzellen)]x 100. Normalisieren Werte an die Steuerung, die unbehandelt war. Nach mehreren Versuchen berechnet den Mittelwert und die Standardabweichung zu Trends in der Lebensfähigkeit zu bestimmen. Verwenden Student t-Test auf Signifikanz zu bestimmen. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Bei der Arbeit mit diesem Protokoll ist es wichtig, genaue Zellzählungen beim Plattieren Säugetierzellen und opsonisierenden C erhalten neoformans Zellen. Dies minimiert die Unterschiede zwischen Studien und gewährleistet eine exakte 1: 1-Ziel-Effektor-Verhältnis während der gesamten Studie. Es ist auch wichtig, um das Timing des Cholesterinabbau und Infektion zu koordinieren, um die opsonisierten Hefezellen oder behandelten Makrophagen aus ruhenden bei RT zwischen den Verfahren zu verhindern. Lange Wa...

Phagozytose ist ein Prozess, durch den extrazellulären Instanzen durch Wirtszellen internalisiert. Es ist eine wichtige Waffe im Arsenal des Immunsystems, gegen Krankheitserreger zu verteidigen, aber der Prozess kann oft von Krankheitserregern unterlaufen werden, um für die Internalisierung und Verbreitung im ganzen Körper 1 zu ermöglichen. Die Phagozytose wird durch mehrere Signalwege, die im Anhang und Einwirkung über Umlagerungen von Zytoskelett der Wirtszelle führen vermittelt. Professional &quot;Phagocyten können sich auf der Oberfläche des eindringenden Pathogens erkennen und binden an Opsonine zur Anbringung und die Bildung der Lamellipodia, die den Krankheitserreger zu verschlingen und bilden eine phagosome 2 zu signalisieren. Unter den so genannten &quot;professionellen&quot; Fresszellen sind Makrophagen. Makrophagen sind hoch spezialisierte Zellen, die durchführen, Schutzfunktionen, die die Suche nach und Beseitigung von Krankheitserregern, die Reparatur beschädigter Gewebe und Vermittlung Entzündung, die meisten schließendiese durch den Vorgang der Phagozytose 1,2. Cryptococcus neoformans ist eine Art von pathogenen Hefe, die eine schwere Krankheit wie Kryptokokkose bekannt verursacht. Cryptococcus Sporen werden durch den Host Einatmen und führen zu einer Lungeninfektion, die in der Regel asymptomatisch ist. Es wird vermutet, dass die Exposition ist extrem weit verbreitet; eine Stichprobe von 61 Kindern aus den Pediatric Infectious Diseases Clinic am Bronx-Lebanon Hospital Center stellte fest, dass alle Befragten hatten Antikörper gegen das Cryptococcus Polysaccharid glucuronoxylomannan und andere Studien haben Prävalenz sowohl in humanen Immundefizienz-Virus (HIV) infizierten und infizierten Erwachsenen 3 gezeigt, 4. Alveolarmakrophagen sind in der ersten Zeile als Reaktion auf die Lungeninfektion und in den meisten Fällen erfolgreich klare Erregers. , Bei immungeschwächten Personen (zB HIV und AIDS-Patienten), die Hefe jedoch in der Lage, innerhalb der Makrophagen zu überleben. In diesenFällen können die Makrophagen als Nischen für die Replikation des Pathogens dienen und ihrer Weitergabe an das zentrale Nervensystem (ZNS), wobei die Krankheit tödlich 5 erleichtern - 8. Es wird vermutet, dass Makrophagen sogar die Hefe liefern direkt in die Hirnhäute und hilft, die Hefe, um die Blut-Hirnschranke über die &quot;Trojanisches Pferd&quot; Modell 3,9 überqueren - 11. Somit ist es wichtig, den Prozess der Phagozytose und die Faktoren, die es beeinflussen, insbesondere in Kryptokokkeninfektionen verstehen. Frühere Arbeiten in anderen Erreger-Systeme weisen auf Cholesterin und Lipid Rafts von Cholesterin eine wichtige Rolle bei der Phagozytose 12 spielen gebildet - 15. Cholesterin ist die am häufigsten vorkommende Lipidspezies in Säugetierzellen und umfasst 25 - 50% der Säugerzelle Membran 16. Es wurde festgestellt, um eine Rolle bei der Modulation der BioP spielenhysical Eigenschaften von Membranen durch Veränderung ihrer Steifigkeit 17. Cholesterin und Sphingolipiden bilden Lipidmikrodomänen innerhalb der Membran als Lipid Rafts bekannt. Lipidflößen gefunden worden, um die Bildung von Caveolae, sowie Bereitstellen einer isolierten Domäne für bestimmte Typen von Signalisierungs 16 beteiligt - 18. Aufgrund ihrer geringen Größe, ist es schwierig, Lipidflößen in vivo zu studieren. Ein nützlicher Weg, um die Rolle von Lipidflößen zu untersuchen ist, um ihre Bestandteile zu verändern. Methyl-β-Cyclodextrin (MßCD) ist eine Verbindung, die gefunden wurde, um Cholesterin aus Säugetiermembranen führen und wird häufig verwendet, um die Rolle von Lipidflößen 18 zu studieren. In diesem Protokoll wird eine Methode, um Cholesterin aus Wirtszellmembranen abzureichern und Quantifizierung der Wirkung der Abreicherung von der Fähigkeit der Wirtszellen, um C. phagozytieren neoformans in vitro. Dieses Verfahren macht Gebrauch von Zellkultur techniques auf einer immortalisierten Makrophagen-Zelllinie (J774A.1) als Modell für die Infektion. Cholesterinabbau durch Einwirkung MßCD, die einen hydrophoben Kern spezifisch an die Größe von Sterolen hat und in der Lage ist, um als Senke für Cholesterin, um es aus der Membran 19 zu ziehen handeln bewerkstelligt. Cholesterinabbau wurde quantitativ unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits und qualitativ mit einer modifizierten Bligh-Dyer Lipidextraktion, gefolgt von Dünnschichtchromatographie (TLC) 20 gemessen. . 23 - Phagozytose wurde durch Infizieren der Zelllinie mit einer Kultur der opsonisierten Hefe mit einem Cocktail von Interferon-γ und Lipopolysaccharid zur Aktivierung der Makrophagen gemischt gemessen Cryptococcus wurde mit einem glucuronoxylomannan (GXM) Antikörper 21 opsonisierten. Färbung und Mikroskopie Experimente zur Sichtbarmachung der Zellen und zur Berechnung der phagozytische Index erlaubt, den Grad der Phagozytose zu beurteilen. Zusammengenommen dieses Protokoll describes eine grundlegende Methode, die die Veränderung der Lipid-Zusammensetzung mit einem physiologischen Prozess integriert.

<table><tbody><tr><td>Biosicherheitswerkbank der Klasse II Typ A2</td><td>Labconco</td><td>3460009</td><td></td></tr><tr><td>J774A.1 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>TIB-67</td><td>Kommt gefroren an. Siehe ATCC-Anleitung für die Kultivierung.</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Bei 4 > C und warm auf 37 &°; C vor der Anwendung</td></tr><tr><td>HI Fetal Rinderserum Performance Plus</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td>Bei -20 & Grad eingefroren halten; C und Tauen vor der Zugabe zu DMEM</td></tr><tr><td>auf Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Zur Ergänzung von DMEM</td></tr><tr><td>Isotemp Zellkultur-Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Modell # 3530</td></tr><tr><td>96-Well-Kulturschale</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fisher Scientific BioReagents</td><td>BP3994</td><td>Auf 1x verdünnen und vor Gebrauch filtrieren oder autoklavieren.</td></tr><tr><td>Methyl-&beta;-Cyclodextrin</td><td>Sigma Life Science</td><td>C4555-10G</td><td>In 1x PBS auflösen, um Lösungen mit Konzentrationen von 10 mM und 30 mM</td></tr><tr><td>herzustellen Orbitalschüttler</td><td>Labline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Life Technologies Molekulare Sonden</td><td>A12216</td><td>Alle Reagenzien für den Cholesterin-Assay sind im Kit enthalten. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.</td></tr><tr><td>96-Well-Schwarz-Assay-Platte</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>FilterMax Mikroplatten-Reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Modell F5</td></tr><tr><td>DC-Kammer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z126195-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498-4L</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-2L-R</td><td></td></tr><tr><td>TLC Papier</td><td>Whatman</td><td>3030917</td><td>Auf die für den DC-Tank erforderliche Größe zuschneiden</td></tr><tr><td>Abzug</td><td></td><td></td><td>Jeder Abzug, der den AIHA/ANSI-Standards entspricht</td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Corning Inc. Costar</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman Schar</td><td></td><td>Modell Alegra x-30R</td></tr><tr><td>Votex Mischer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>Modell # MS104S misst bis zu 0,1 mg</td></tr><tr><td>Glas Pasteur Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>Avanti Polar Lipide</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac Konzentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Modell # SPD2010</td></tr><tr><td></td><td>Petrolether Fisher Scientific</td><td>E139-1</td><td></td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>309966</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>TLC Silica Gel 60 mit Konzentrationszone</td><td>Analytische Chromatograhy Millipore</td><td>1.11845.0001</td><td></td></tr><tr><td>Jodchips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>376558-50G</td><td></td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>Manganchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244589</td><td></td></tr><tr><td>UVP EC3 Imaging</td><td>System Ultra-Violet Products Ltd.</td><td></td><td>Verwenden Sie die Vision Works LS-Software für die Densitometrie-Analyse</td></tr><tr><td>Konfokalschale mit Glasboden</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10C</td><td>www.glassbottomdishes.com</td></tr><tr><td>Cryptococcus neoformans (H99)</td><td></td><td></td><td>Bezogen vom Duke University Medical Center</td></tr><tr><td>YNB</td><td>BD</td><td>239210</td><td>Zubereitungshinweise finden Sie unter Hersteller. Verwenden Sie eine Glukosekonzentration von 20 g/L.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharid</td><td>Sigma</td><td>L4391-1MG</td> In <td>1x PBS auflösen, um 1 mg/ml Brühe herzustellen. Bei -20 °C lagern.</td></tr><tr><td>Interferon gamma</td><td>Sigma</td><td>I4777</td><td>In 1x PBS auflösen, um 0,1 mg/ml Stammlösung</td></tr><tr><td>herzustellen Glucuronoxylomannan-Antikörper (Anti-GXM)</td><td></td><td></td><td>Geschenk aus Arturo Casadevalls Laborkonzentration beträgt 1,98 mg/ml</td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194591</td><td>0,8 g Giemsa in 25 ml Glycerin auflösen und auf 60 μg erhitzen; C für 1 Std. 25 ml Methanol in die Lösung geben und mindestens 1 Monat bei Raumtemperatur reifen lassen.</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Observer.D1 Mikroskop mit AxioCam MRm zum Aufnehmen von Bildern</td></tr></tbody></table>

makrophagen-cholesterin depletion und auswirkungen auf die phagozytose<em&gt; cryptococcus neoformans</em

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis ist eine lebensbedrohende Infektion, die von pathogenen Pilzen der Gattung Cryptococcus verursacht. Die Infektion erfolgt beim Einatmen von Sporen, die in der Lage, in die tiefe Lunge replizieren. Phagozytose von Cryptococcus durch Makrophagen ist eine der Möglichkeiten, dass die Krankheit in der Lage, in das zentrale Nervensystem verteilt, um letale Meningoenzephalitis führen. Daher ist die Lehre der Assoziation zwischen Cryptococcus und Makrophagen wichtig für das Verständnis des Fortschreitens der Infektion. Die vorliegende Studie beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll, um Makrophagen-Infektiosität von C. studieren neoformans in vitro. Mit diesem Protokoll wird die Rolle des Gastgebers Sterole auf Wirt-Pathogen-Interaktionen untersucht. Verschiedene Konzentrationen von Methyl - Cyclodextrin (MCD) wurden verwendet, um Cholesterin aus murinen Retikulum Sarkom Makrophagen-ähnlichen Zellinie J774A.1 abzureichern. Cholesterinabbau bestätigt und quantifiziert unter Verwendung sowohl einer handels verfügbe Cholesterinquantifizierung Kit und Dünnschicht-Chromatographie. Cholesterin verarmte Zellen wurden unter Verwendung Lipopolysacharide (LPS) und Interferon gamma (IFN &amp; gamma;) aktiviert und mit Antikörper-opsonisiertes Cryptococcus neoformans Wildtyp H99 Zellen bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 1 infiziert: 1. Infizierte Zellen wurden nach 2 h Inkubation mit C. wachten neoformans und ihre phagozytische Index wurde berechnet. Cholesterinabbau führte zu einer signifikanten Reduktion der phagozytische Index. Die vorgestellten Protokolle bieten eine bequeme Methode, um die Einleitung des Infektionsprozesses in einer Laborumgebung nachzuahmen und Studium der Rolle von Wirtslipidzusammensetzung auf die Infektiosität.

Cholesterin Depletion Analyse des Überstands in Stufe 1.3 des Protokolls durch folgende Anweisungen des Herstellers im Amplex Red Cholesterol Assay Kit vorbehalten ergibt eine erhöhte Konzentration von Cholesterin in MßCD behandelten Probe im Vergleich zu der 1x PBS-Kontrolle. Je nach Zelltyp und MßCD Konzentration verwendet Cholesterinabbau kann variieren. Für J774 mit 10 mM MßCD behandelt wurde eine Abreicherung von ca. 50% beobachtet. Depletion kann mit aus dem Überstand und Zelllysat in Sch...

In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Infektion von Makrophagen mit Cryptococcus neoformans beschrieben. Außerdem wird eine Methode zur Sterolabbaution aus den Makrophagen erläutert. Diese Protokolle bieten einen Leitfaden für die Untersuchung von Pilzinfektionen in vitro und die Untersuchung der Rolle von Sterolen bei solchen Infektionen.

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Rolle von Cholesterin bei der Aufnahme von Cryptococcus neoformans durch Makrophagen aufzuklären. Dies wird erreicht, indem zunächst Cholesterin aus einer murinen Makrophagenzelllinie mittels Methyl-β-Cyclodextrin entfernt wird. Anschließend wird die Cholesterinabreicherung mittels Dünnschichtchromatographie und eines kommerziell erhältlichen Tests bestätigt und quantifiziert.Dann werden die Cryptococcus neoformans-Zellen mit Antik&ouml;rpern ionisiert, die spezifisch f&uuml;r Gluc, Xlo-Manin oder die GXMA-Komponente der Cryptococcus-Kapsel sind. Schlie&szlig;lich werden cholesterolarme Makrophagen mit opsonisiertem Cryptococcus neoformans infiziert. Letztendlich werden lebendzelltaugliche und Lichtmikroskopie verwendet, um die infizierten Zellen sichtbar zu machen und den Grad der Phagozytose zu bestimmen.Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie mit grundlegendem Laborgerät in relativ kurzer Zeit durchgeführt werden kann und dennoch quantitative Ergebnisse liefert. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Pilzpathogenese zu beantworten. Zum Beispiel: Welche Rolle spielen Wirtslipidtransplantate im Hinblick auf pilzliche Pathogene?Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie oder die Bekämpfung von Okulärinfektionen, da die Internalisierung in Makrophagen ein entscheidender Schritt für das Auslösen schwerwiegender Erkrankungen ist. Obwohl diese Methoden Einblicke in die Infektiosität von Pilzpathogenen ermöglichen, kann sie auch auf andere Organismen angewandt werden, beispielsweise auf obligate intrazelluläre Pathogene. In einem sterilen Biosicherheitswerkbank pipettieren Sie 10 hoch 5 J774.A1 makrophagenähnliche Zellen pro Vertiefung einer 96-Loch-Kulturplatte. Fügen Sie 200 Mikroliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin (PS), hinzu und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Am folgenden TagEntfernen Sie das Medium von der Zellmonoschicht und waschen Sie die Zellen zweimal mit gefiltertem oder autoklaviertem PBS. Geben Sie 200 Mikroliter Methyl-beta-Cyclodextrin oder Embeta-CD-Lösung in der gewünschten Konzentration oder ein XPBS als Kontrolle hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Entfernen Sie den Überstand und bewahren Sie ihn bei Raumtemperatur zur quantitativen Analyse mit einem kommerziell erhältlichen Kit auf.Unmittelbar nach diesem Verfahren die Zellen mit PBS oder serumfreiem DMEM zwei bis drei Mal waschen, bevor die Cholesterinquantifizierung durchgeführt oder die Infektion fortgesetzt wird. Schritt zur Infektion der cholesterinarmen Makrophagen in einem sterilen Biosicherheitswerkbank. 10 hoch 5 makrophagenähnliche Zellen pro Vertiefung ansäen.In einer 96-Loch-Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 gleichzeitig inkubieren. Kultivieren Sie eine C neoformans H 99-Kultur, indem Sie eine Kolonie von einer ausgestrichenen Platte isolieren und 10 Milliliter YNB inoculieren und über Nacht bei 30 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren. Zentrifugieren Sie die C neoformans-Kultur bei 1.700 × g und 4 Grad Celsius für 10 Minuten.Entfernen Sie den Überstand und geben Sie fünf Milliliter 1× PBS hinzu, bevor erneut zentrifugiert wird. Anschließend waschen Sie die Zellen dreimal mit filtriertem 1× PBS, bevor Sie die Zellen in fünf Milliliter 1× PBS resuspendieren. Als Nächstes bereiten Sie eine serielle Verdünnung der gewaschenen Kultur vor, indem Sie 100 Mikroliter der ursprünglichen Probe zu 900 Mikroliter 1× PBS hinzufügen.Um eine 1:10-Verdünnung zu erhalten, geben Sie 100 µL der 1:10-verdünnten Probe zu 900 µL 1× PBS, um eine 1:100-Verdünnung zu erhalten. Geben Sie abschließend 200 µL der 1:100-verdünnten Probe zu 800 µL 1× PBS. Um eine 1:500-Verdünnung zu erhalten, geben Sie 10 µL der Endverdünnung in ein Hämozytometer und zählen Sie, um die Anzahl der Zellen zur Herstellung einer Arbeitslösung zur Aktivierung von Makrophagen und Opsonierung von C. neoformans zu berechnen. Verdünnen Sie LPS und Interferon-gamma 100-fach aus den Stammlösungen, indem Sie jeweils 10 µL der Verbindung in 990 µL PBS verdünnen. Kombinieren Sie für jede Probe 7,5 µL LPS, 1,25 µL Interferon-gamma, 1,25 µL GXM-Antikörper und 1,25 × 10⁵.Sehen Sie nach neoformen Zellen, dann DMEM ergänzt mit FBS und Ps verwenden und das Volumen auf 250 Mikroliter pro Probe auffüllen. Die Lösung vortexen und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren, bevor die Makrophagen infiziert werden. Die Cholesterin-Depletion kann nach der Cholesterin-Depletion durchgeführt werden. Verwenden Sie serumfreies DMEM, um sie zweimal zu waschen, bevor Sie 200 Mikroliter der opsonisierten C. neoformans-Arbeitslösung zu jeder Probe hinzufügen.Gut zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Danach die Zellen fixieren und färben. Nachdem die Zellen zweimal mit DMEM gewaschen und die Zellmonoschicht 10 Minuten luftgetrocknet wurde, 200 Mikroliter eiskalte Methanol-Fixierungslösung 15 Minuten bei Raumtemperatur hinzufügen und anschließend verbleibendes Methanol entfernen.Fügen Sie als Nächstes 200 µL 10 x Giza hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie anschließend zwei bis drei Mal mit entionisiertem Wasser, lassen Sie den Deckel abgenommen und trocknen Sie über Nacht am nächsten Tag oder bis zu einer Woche lang unter einem Mikroskop. Zählen Sie 300 Zellen pro Datenpunkt und notieren Sie die Anzahl der infizierten Makrophagen sowie die Anzahl der aufgenommenen Cryptococcus-Zellen. Berechnen Sie den PHA-sauren Index, indem Sie den Prozentsatz infizierter Makrophagen mit der mittleren Anzahl von C neoformans pro Makrophage multiplizieren. Normalisieren Sie den F-sauren Index, indem Sie die Werte als Prozentsatz eines XPBS-behandelten Kontrollansatzes angeben. Berechnen Sie nach mehreren Versuchen den Mittelwert und die Standardabweichung des Mittelwerts, um Trends im F-sauren Index zu bestimmen.Verwenden Sie den t-Test für unabhängige Stichproben (Student's T-test), um die Signifikanz wie hier gezeigt zu bestimmen. Die Analyse des Überstands von embeta-CD-behandelten Zellen zeigte einen erhöhten Cholesterinspiegel im Vergleich zum Überstand der PBS-Kontrollzellen, was auf eine stärkere Cholesterindepletion in den M-beta-CD-behandelten Zellen hinweist. Die Depletion kann anhand der aus dem Überstand und dem Zelllysat erhaltenen Cholesterinwerte berechnet werden, wie hier veranschaulicht, um die Ergebnisse zur Cholesterindepletion zu unterstützen.Zelllysate, die mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) analysiert wurden, zeigen eine deutliche Abnahme der Färbung von Cholesterin in Zellen, die mit steigenden Konzentrationen von M beta CD behandelt wurden. Die Analyse der TLC zeigt eine ähnliche Tendenz wie der quantitative Assay; nach der Infektion bleiben die Zellen angeheftet und intakt, und die Zellmorphologie bleibt unverändert im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Mikroaufnahmen optimal infizierter Zellen zeigen deutlich, dass C. neoformans von den Säugetierzellen aufgenommen wurde.Dieses Diagramm zeigt, dass bei Berechnung anhand von 300 Makrophagen pro Behandlungsgruppe ein Rückgang des sauren F-Index in cholesterolarmen Zellen festgestellt wurde. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie in etwa fünf Stunden durchgeführt werden, nicht einschließlich der Inkubationszeiten, die über Nacht erfolgen müssen, nachdem dieses Protokoll angewandt wurde. Andere Methoden, wie beispielsweise die Isolierung detergentresistenter Membranen aus Makrophagen, können durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen zu beantworten, etwa ob die Cholesterinverarmung die Optik von Cryptococcus beeinflusst, indem sie die Lipidrafts des Wirts verändert, nachdem sie etabliert wurde.Diese Techniken weisen den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Membranbiologie und Immunologie, um die Mechanismen der Phagozytose durch Makrophagen- und Pathogen-Interaktionen bei pathogenen Pilzen zu verstehen. Es sollte nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit Krankheitserregern äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzausrüstung sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.

macrophage-cholesterol-depletion-its-effect-on-phagocytosis

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Homöostase und Pathologie in vielen Geweben. Das Protokoll beschreibt hier vorgestellte Verfahren zur Abreicherung von...

Depletion und Rekonstitution von Makrophagen in Mäuse

In diesem Video demonstrieren wir einen Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von Cryptococcus neoformans, einem pathogenen Pilz, Infektionen in Makrophagen. Die Zytotoxizität wird durch die Freisetzung des zytoplasmatischen Laktatdehydrogenase-Enzyms aufgrund der Makrophagenlyse bestimmt, die durch eine Cryptococcus neoformans-Infektion verursacht wird.

Ein Laktat-Dehydrogenase-Freisetzungsassay zum Nachweis einer Cryptococcus neoformans-Infektion in Makrophagen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bewertung der Wirkung von Aspirin und Ibuprofen in ihren minimalen inhibitorischen Konzentrationen auf die Makrophagen-Phagozytose unter Verwendung von pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff-gefärbten Pilzzellen. Die Medikamente hemmen die Cyclooxygenase-2, verringern die Prostaglandinbildung und verstärken die Makrophagen-Phagozytose, wie durch Fluoreszenzmessungen von pH-empfindlichem Farbstoff beobachtet wurde.

Die Wirkung von Aspirin und Ibuprofen auf die phagozytäre Fähigkeit von Makrophagen

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

Wir beschreiben, wie Makrophagen C. visualisieren neoformans (Cn) Interaktionen in Echtzeit, wobei ein besonderer Schwerpunkt auf den Prozess der nicht-lytischen Exozytose mit digitalen Lichtmikroskopie. Unter Verwendung dieser Technik einzeln infizierten Makrophagen untersucht, um verschiedene Aspekte dieses Phänomens festzustellen ist.

Visualisierung nichtlytischen Exozytose Cryptococcus neoformans Von Makrophagen mit digitalen Lichtmikroskopie

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Phagozytose von fluoreszierenden Partikeln durch adhärente Makrophagenzelllinien mit einer fluorometrischen Methode. Diese Methode ermöglicht eine Hochdurchsatz-Quantifizierung der Partikelinternalisierung sowie der daraus resultierenden Aktinpolymerisation.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

Es wird ein Protokoll für die Zellkultur von Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) differenzierten menschlichen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen vorgestellt. Das Protokoll nutzt die Kryokonservierung von Monozyten in Verbindung mit ihrer Massendifferenzierung in Makrophagen. Dann können geerntete Makrophagen in Kulturvertiefungen mit den erforderlichen Zelldichten für die Durchführung von Experimenten ausgesät werden.

Kultur von M-CSF Differentiated Menschliche Monozyten abgeleiteten Makrophagen

Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Geschwindigkeit von Phagosomen, die sich in lebenden Zellen in Richtung des Zellzentrums bewegen, die mit oder ohne das humane Immundefizienzvirus (HIV) Typ 1 infiziert sind, wobei die konfokale Fluoreszenzmikroskopie der Spinning-Disk zur Identifizierung fluoreszierender infizierter Zellen und die Hellfeldmikroskopie zum Nachweis von Phagosomen  verwendet wird.

Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten

Lipids sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle bei der zellulären Funktionen spielen. Hier beschreiben wir eine Methode, um die Lipidzusammensetzung von Neutrophilen, um zu bestimmen, wobei der Schwerpunkt auf dem Cholesterinspiegel, sowohl durch HPTLC und HPLC mit einem besseren Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen der neutrophilen extrazellulären Falle Bildung zu gewinnen.

Methoden Lipidveränderungen in Neutrophilen und die anschließende Bildung von Neutrophilen Extracellular Traps zu studieren

Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung und Erzeugung dynamischer Bilder der mesenchymalen Stammzell (MSC) vermittelten Regulation der Makrophagen (MΦ) Phagozytose von nicht opsonisierten Hefepartikeln (Zymosan) vorgestellt, die zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind.

Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung

Erfahren Sie die Cholesterin-Depletion in Makrophagen und deren Einfluss auf die Phagozytose von Cryptococcus neoformans. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Pilzinfektionen in vitro und liefert quantitative Ergebnisse zur Pathogenese.

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose

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