Quantitative massenspektrometrische Analyse von Krebs-Zellen-Proteome Abgeleitet von Liquid und soliden Tumoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Proteinexpressionsprofile von flüssigen und soliden Tumoren aufzuklären. Dies wird erreicht, indem zunächst Krebszellen aus Blut- oder Gewebeproben von Patienten angereichert werden. Im zweiten Schritt werden Proteine aus den Krebszellen isoliert und anschließend mit einem tumorspezifischen Susac-Quantifizierungsstandard gemischt.

Im letzten Schritt wird das Proteingemisch verdaut. Letztendlich wird die Massenspektrometrie eingesetzt, um die Proteinexpressionsprofile von flüssigen und festen Tumoren darzustellen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Onkologie und Pathologie zu beantworten, wie z.B. wie Wirkstoffziele und Mechanismen der Therapieresistenz identifiziert werden können.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Entdeckung von Biomarkern geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie die Untersuchung verschiedener, fester und flüssiger Krebsarten angewendet werden. Das Verfahren wird von Dr. Hannibal Berger Institut für Pathologie und Dr. Christophe Lanz aus meinem Labor demonstriert. Um flüssige Tumorzellen für die Fluoreszenzsortierung mittels Durchflusszytometrie vorzubereiten, beginnt Ali damit, dass er einen Milliliter der menschlichen mononukleären Zellprobe, die in PBS suspendiert ist, plus 2% FBS für die Negativkontrolle und einen Milliliter für jeden Fluoreszenzfarbstoff, der in der endgültigen Färbung verwendet wird, angibt. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen mit den entsprechenden Antikörpern für die Isolierung der leukämischen Zellpopulation und für die Kompensationskontrollen auf Eis.

Waschen Sie die Zellen nach 30 Minuten zweimal mit PBS plus 2%FCS. Geben Sie dann einen Zellviabilitätsfleck auf die entsprechenden Röhrchen und sortieren Sie die Zellen gemäß dem Schema. Entnahme der Proben in IMDM plus 10%FCS zur Entnahme solider Tumore durch Laser-Capture-Mikrodissektion.

Verwenden Sie zunächst ein Mikrotom, um fünf bis 10 Mikrometer dicke Abschnitte aus forminfixierten, in Paraffin eingebetteten Proben zu schneiden. Anschließend montieren Sie die Schnitte auf folienbeschichtete Objektträger und trocknen die Proben nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius. Die Schnitte werden durch aufeinanderfolgende einminütige Inkubationen in absolutem Xylol, 70 % Ethanol und Wasser depariert und rehydriert.

Anschließend färben Sie die Abschnitte 20 Sekunden lang mit Hämatin. Spülen Sie sie mit Leitungswasser ab und sammeln Sie die interessierenden Zellen mit dem Laser-Capture-Mikrodissektionssystem, um Protein aus den sortierten flüssigen Tumorzellen zu extrahieren. Schleudern Sie die Probe dreimal herunter und waschen Sie die Zellen während der zweiten beiden Zentrifugationen in 500 Mikrolitern kaltem PBS.

Als nächstes inkubieren Sie die Zellen in 40 Mikrolitern Lysepuffer pro einmal 10 auf die sechs Zellen. Nach 15 Minuten zentrifugieren Sie das Lysat und überführen den klaren Lysat-haltigen Überstand in ein neues Reaktionsröhrchen, um Protein aus den mikropräparierten soliden Tumorzellen zu extrahieren. Inkubieren Sie die Gewebeprobe mit 60 Mikrolitern Gewebelysepuffer bei 72 Grad Celsius.

Nach 15 Minuten wird die Flüssigkeit durch eine kurze Zentrifugation aufgefangen und der Überstand in ein neues Reaktionsröhrchen überführt. Dann beschallen Sie das Lysat drei Minuten lang auf Eis, gefolgt von einer Inkubation mit 15 Mikrolitern, die 20 % Natrium-ESAL-Sulfat bei 99 Grad Celsius in einem Heizblock mit 600 U/min Rührwerk enthalten. Nach einer Stunde schleudern Sie das Lysat herunter und übertragen Sie das S Natin in ein neues Röhrchen.

Bestimmen Sie als Nächstes die Proteinkonzentrationen des geklärten zellulären und Super-SLAC-Standards und mischen Sie dann gleiche Mengen der Tumorzellstücke mit dem Super-SLAC-Standard, gefolgt von Lithium. Entsalzen Sie Sulfatpuffer bei 25 % des Probenvolumens und Reduktionsmittel bei 10 % des Probenvolumens. Erhitzen Sie dann die resultierende Lösung in einem Heizblock 10 Minuten lang bei 72 Grad Celsius.

Zur Messung der Proteinkonzentration des soliden Tumorlysats auf einem Plattenreader mischen Sie eine Standardreihe von Rinderserumalbumin-Verdünnungslösungen, das Lysat und den entsprechenden Super-SLAC-Standard mit einem kommerziell erhältlichen Proteinassay und einer 96-Well-Platte. Nach einer Minute Schütteln inkubieren Sie die Probe für den entsprechenden Zeitraum und messen Sie die Extinktion gemäß den Angaben des Herstellers. Mischen Sie dann gleiche Mengen geklärtes Lysat und den Super-SLAC-Standard mit 200 Mikrolitern Harnstoff in einer Filtereinheit und zentrifugieren Sie die Proben 30 Minuten lang.

Zur Analyse der Tumorzelllysate mittels Flüssigchromatographie und massenspektrometrischer Analyse. Beginnen Sie damit, die interessierenden Peptide fünf Minuten lang in einem Ultraschallbad in 30 Mikrolitern Ladepuffer aufzulösen. Schleudern Sie dann das Protein herunter und überführen Sie den klaren Überstand in ein massenspektrometrisches Autosampler-Fläschchen.

Als nächstes injizieren Sie fünf Mikroliter Probe pro Analyse in das nano lc, ms MS System autos, den Probenehmer und konzentrieren und entsalzen Sie die Peptide online in einem umgekehrten Phase-C-18-Preco-montierten und belüfteten Säulenaufbau. Trennen Sie schließlich die Peptide auf einer umgekehrten Phase-C-18-Mikrosäule in einer Nanos-Sprühsäule zum Selbsttakten. Unter Verwendung eines 90-minütigen Gradienten von fünf bis 35 % Acetylnitril gegenüber 0,1 % wässriger Ameisensäure bei 300 Nanolitern pro Minute wird dann eine Nano-Sprühionenquelle verwendet, um das Peptid zu übertragen und zu analysieren.

Unter Verwendung einer der 15 datenabhängigen Erfassungsmethoden können verschiedene Arten von Massenspektrometern zur Analyse der Peptide verwendet werden. Das proteomische Profiling von flüssigen und soliden Tumoren von Patienten ist ein vielversprechender Ansatz für die Entdeckung neuer diagnostischer und prädiktiver Biomarker. Diese erste Abbildung zeigt beispielsweise eine beispielhafte Gating-Strategie für die Isolierung von CD 17-Färbungen, leukämischen Zellen aus einer flüssigen Tumorprobe.

Während hier ein fünf bis 10 Mikrometer dicker Abschnitt, der auf Folie montiert ist, Membrandias bedeckt, wie gerade gezeigt. Wie gezeigt, wurde dann eine Region of Interest manuell ausgewählt und durch Laser-Capture-Mikrodissektion exzidiert, eine unüberwachte Cluster-Analyse der Proteinexpressionsprofile von flüssigen und festen Tumorproben kann dann mittels Massenspektrometrie durchgeführt werden, was eine klare Trennung der verschiedenen Tumorentitäten entsprechend ihren unterschiedlichen Proteinexpressionsprofilen ermöglicht. Diese Daten können dann letztlich zur Etablierung klinisch relevanter Biomarker beitragen.

Die Implementierung von Anreicherungsstrategien für posttranslationale Modifikationen wie Phosphorylierung oder UIC-Beatmung kann ebenfalls durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B.: Wie können dysregulierte Kinasemuster nach ihrer Entwicklung identifiziert werden? Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der Pathologie und Onkologie den Weg, die spezifischen Biomarker und Signalwege in einer Vielzahl von Krebsentitäten zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Proteine aus Krebs als Subpopulationen isoliert werden können, um ihre Proteinexpressionsmuster und Signalzustände durch Massenspektrometrie zu analysieren.