Name: Gallengang-Ligation in Mice: Induktion von Entzündungsleber-Verletzung und Fibrose von obstruktiver Cholestase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Lernen Sie die Gallengang-Ligation bei Mäusen zur Induktion experimenteller Leberfibrose durch obstruktive Cholestase. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung von Fibrogenese und Immunzellinfiltration.

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Die Autoren bedanken sich bei der finanziellen Unterstützung der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB / TRR57, Q3 und Q2) zu quittieren. Die Autoren danken Mareike Schulz, Pascal Paschenda und Klaudia Warzecha für ihre Hilfe bei der Erstellung der Aufnahmen.

HINWEIS: Alle Experimente wurden von der offiziellen Staatstierpflege und Verwendung Ausschuss (LANUV, Recklinghausen, Deutschland) zugelassen. Die Mäuse werden unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen nach den Richtlinien des Bundesverbandes für Versuchstierkunde Verbände (FELASA) untergebracht ist. Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Bundesgesetz über den Schutz der Tiere und der &quot;Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren&quot; (National Institutes of Health Publikation 8. Auflage, 2011) durchgeführt. 1. Die präoperative Vorbereitung HINWEIS: Führen Sie alle Verfahren im Rahmen sauber, aber nicht sterilen Bedingungen. Alle Instrumente und anderen wiederverwendbaren Geräten wie chirurgische Zangen, Scheren und Colibri Aufroller, die verwendet werden, um eine Operation durchzuführen muss vor nach Protokollen, die in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts zum Durchführen von Operationen an Tieren sind Gebrauch sterilisiert werden.; Eine detaillierte Liste der erforderlichen Reagenzien, Materialien und Geräte finden Sie in der Liste der spezifische Materialien / Ausrüstung beziehen. <ol><li> Während der gesamten Experimente, halten das Tier auf einer Wärmeplatte bei einer Temperatur von 37 ° C, fest mit einem Anästhesiesystem verbunden ist, und die Abdeckung der Betriebsbereich insgesamt mit fluidundurchlässigen, selbstklebenden Vorhängen. Richtig arrangieren alle Besetzungen und Lösungen, die für den Test vor der Operation eingesetzt werden (Abbildung 1). </li><li> Anesthetize die Maus mit Inhalation von 4 Vol% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Flussrate von 4 l / min für die Induktion der Anästhesie. Die Tiefe der Betäubung ist ausreichend, wenn die folgenden Kriterien von entscheidender Bedeutung erreicht werden: regelmäßige Spontanatmung, keine Reflex nach der Einstellung von Schmerzreizen zwischen den Zehen, und keine Reaktion auf Schmerzen. </li><li> Rasieren Sie die Bauchfell der Maus mit einem elektrischen Rasierer Fell und die Augen vor dem Austrocknen durch Verwendung von Auge und n schützenose Salbe. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf eine 37 ° C erhitzt, Kochplatte, legen Sie die Maus Schnauze im Fluovac Maske des Fluovac Anästhesiesystem, und befestigen Sie die Beine des Tieres mit Streifen von Seide Band. </li><li> Aufrechterhaltung einer Narkose der Maus durch Inhalation von 1,5-3 Vol% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Flussrate von 1 l / min und induct perioperative Analgesie durch intraperitoneale Injektion von Buprenorphin-Lösung (0,1 mg / kg Körpergewicht in 0,9% iger NaCl-Lösung gelöst) . </li><li> Sterilisieren Sie die rasierte Bauchhaut mit einem Gaze Tupfer, die mit einem Standard-Antiseptikum, bereit, alkoholische Lösung für die präoperative Behandlung der Haut benutzen befeuchtet wird. Hinweis: In unserem Protokolle verwenden wir einen Polyalkohol Haut antisepticum. Dies steht im Einklang mit dem Bundesgesetz über den Schutz der Tiere und der Richtlinien des Bundesverbandes für Versuchstierkunde Verbände. Das Antiseptikum enthält 70% (v / v) 2-Propanol, Butanol-1,3.diol und Spuren Chinolingelb und perfume. </li></ol> 2. Chirurgische Verfahren <ol><li> Öffnen des Bauches mit einer Mittellinie Laparotomie mit einer Länge von etwa 2 cm durch Schneiden der Cutis und Faszie gleichzeitig mit einem 11,5 cm chirurgische Scheren. </li><li> Sezieren das Bindegewebe an der Oberseite des Bauchfells mit der Schere als Treuer. </li><li> Schneiden Sie das Bauchfell entlang der Linea alba, um die Bauchhöhle zu öffnen. </li><li> Vergrößern des Hohlraums durch Einsetzen eines Haltenaht im Brustbein, die Erhöhung der Wendel der Naht, und Befestigen auf der Oberseite des Fluovac Maske. </li><li> Verbreiten Sie den Arbeitsbereich, indem Sie einen Colibri Retraktor in der Bauchhöhle (Abbildung 2). </li><li> Heben Sie die Leber mit Feuchtigkeit versorgt (0,9% NaCl-Lösung) Wattestäbchen, so dass die Bauchseite, es klebt an der Membran und der Hilus ist deutlich sichtbar. </li><li> Expose der Gallengang durch Schwanzbewegung des Darms (Abbildung 3). </li><li> Trennen Sie sorgfältig den Gallengang aus derflankierenden Pfortader und Leberarterie mit Hilfe eines Mikroverzahnung Pinzette (4A). </li><li> Setzen Sie den 5-0 Naht um den Gallengang und sichern Sie es mit zwei chirurgischen Knoten. Wenn das Binden der Knoten erhöht die Zugkraft kontinuierlich wirksam Behinderung ohne Durchtrennen des Gallengangs (4B) zu gewährleisten. </li><li> Hinzufügen eines zweiten Schädel Ligierung in der gleichen Weise, aber nicht den Gallengang dazwischen (4C) zu sezieren. Andernfalls besteht die große Gefahr, dass die Galle Lecks, wenn ein Knoten nicht sicher ist, und die Tiere keine Cholestase, sondern entwickeln eine schwere Bauchfellentzündung. </li><li> Schneiden Sie die Enden der Fäden (4D), senken Sie das Brustbein, und entfernen Sie die Rückziehvorrichtung. </li><li> Spülen Sie die Bauchhöhle mit 0,9% NaCl-Lösung und ersetzen Sie die Bauchorgane an die physiologischen Positionen. </li><li> Schließen Sie die beiden Bauch Schichten (Peritoneum und Cutis und Armaturenbrett) mit separaten Lauf Nähte mit 6-0 Mersilk. </li><li> Schneiden Sie die Ends der Nähte und sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit einem Gaze Tupfer mit Desinfektionslösung angefeuchtet haben. HINWEIS: Bei der Durchführung der Operation zum ersten Mal, führen Sie alle Verfahren unter einem Operationsmikroskop mit einer Vergrößerung von 16X-20X. Dies ermöglicht eine bessere Anerkennung des Gallengangs und unterscheidet sie von der Pfortader und Leberarterie (5 und 6) deutlich. Einige Labors empfehlen die Dissektion der Gallengang zwischen den zwei Ligaturen. Verlassen den Gallengang intakt da potenzielle Undichtigkeiten in einem der Knoten wird in schweren akuten Peritonitis, Aszites und systemischen Endotoxämie führen, wenn der Gallengang präpariert. </li></ol> 3. Postoperative Behandlung und Follow-up <ol><li> Lassen Sie die Maus, um in einem Käfig von einer Infrarotlampe erwärmt erholen, bis die Maus ganz wach und aktiv. </li><li> Danach bewegen Sie die Maus auf eine normale Käfig und bieten freien Zugang zu Wasser und Nahrung. </li><li> AN ach der Operation zu überwachen, die Tiere in regelmäßigen Abständen durchzuführen, Follow-up postoperative Behandlung mit geeigneten Analgesie (zB Buprenorphin-Lösung) im Anschluss an die lokale Empfehlung des internen Tierpflege und verwenden Ausschüsse. HINWEIS: Führen Sie die Schmerztherapie für 3 Tage. Jede abnorme Verhalten kann seltene Komplikationen wie Peritonitis, Sepsis oder inneren Blutungen hinweisen und sollten als menschliche Endpunkt behandelt, um das Experiment zu beenden. </li><li> Die Tiere werden mit freiem Zugang zu Futter und Wasser ad libitum bis zum Ende des Experiments gehalten. Es besteht keine Notwendigkeit für die Blutabnahme, da laufende Fibrogenese von Gelbsucht angegeben. </li><li> Werden die Tiere getötet, das Blut zur Messung von klinisch-chemischen Parametern (AST, ALT, Bilirubin usw.) und die Leber für die histochemische und biochemische Analyse abgerufen gesammelt. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Cholestatischen Leberverletzung ist eine der wichtigsten ursächlichen Faktoren für die Entstehung von Leberfibrose und Leberzirrhose bei Patienten mit chronischer Lebererkrankung. Basierend auf der Tatsache, dass diese Krankheiten zu produzieren unwägbaren Gesundheitskosten, ist es verständlich, dass viele Forscher versuchen, die pathogenen Mechanismen der laufenden Leberfibrose zu verstehen. Daher experimentellen Modellen generiert wurden, die verschiedene Aspekte der komplexen Mechanismen, die zu Leber Entzündung, Fibrose und Zirrhose 1 führen zu imitieren. Chirurgische BDL ist eine der am weitesten verbreiteten experimentellen Modellen, die verwendet wird, um obstruktive cholestatischen Verletzungen bei Mäusen und Ratten 4,23,24 induzieren. In den meisten Protokollen werden die Tiere anästhesiert und eine Mittelteil-Laparotomie durchgeführt. Anschließend wird der Gallengang aus der Bauchhöhle freigelegt und unter Verwendung von chirurgischen Zwirn doppelt ligiert. Als eine Folge werden die Mäuse und Ratten, die diese Operation d empfangenenevelop stark fibrotischen Reaktion, die auf den ersten stammen aus den Bereichen periportalen 25. Im Laufe der Jahre verschiedene chirurgische Techniken und Modifikationen beschrieben worden. Besondere Verfahren ermöglichen sogar Wieder oder reanastomosis nach BDL 23. Andere Techniken basieren auf Teil BDL was zu deutlich weniger Nekrosenbildung und damit Hepatozytenproliferation 24 basiert. Teil BDL in Kombination mit anschließender Entfernung der Gallenblase (Cholezystektomie) die Bildung verhindert von Cholezystitis auch eine ausgezeichnete experimentellen Modell für Akut Cholestase. Es wurde vorgeschlagen, ein Modell, das näher an die Situation beim Menschen ist 24 sein. Und in der Tat, während der Einrichtung von diesem Modell, wurde bereits gezeigt, dass es reproduzierbar verursacht Cholestase mit nur minimalen histologischen Gewebeverletzung und nicht zu chronischer Cholestase 25 fortfahren. Daher wurde vorgeschlagen, dass dieses Modell eignet sich für die Untersuchung late Auswirkungen rückgängig Cholestase 24. Noch ausgefeiltere Methoden basieren auf der Mikrochirurgie und erlauben eine schnelle und reproduzierbare Weise, cholestatische Leberschäden nur in ausgewählten Teilen der Leber 26 zuzufügen. Obwohl diese anspruchsvolle Änderungen von der ursprünglichen BDL-Protokoll haben sich als sehr hilfreich bei der Untersuchung spezifischer Fragestellungen, vielen Laboren weltweit im Grunde zielen auf die Verwendung des BDL-Modell als gut reproduzierbare und zuverlässige Modell für cholestatische Leberfibrose. Allerdings können viele Komplikationen, die auftreten könnten, die Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der von diesem Modell erhalten, wenn technische Ungenauigkeiten nicht vermeiden Ergebnisse wesentlich verändern. Zum Beispiel, Blutungskomplikationen zu Verletzungen der Beilagen des Gallengangs Blutgefäße stehen (siehe Figuren 3-4) kann während oder rasch nach der Operation auftreten. Eine Überdosierung von Anästhesie mit anschließender Kardiodepression oder respiratory Ausfall auch vermeidbare Komplikationen des Verfahrens. Schwere Infektionen, die von Peritonitis einer Sepsis kann während der gesamten Zeit des Experiments auftreten, wenn die Fäden nicht genau durchgeführt und Gallen Lecks in die Bauchhöhle. Unfallverletzungen in den Darm während der Operation könnte auch zu Bauchfellentzündung führen. Daher ist es offensichtlich, dass standardisierte Protokolle, die in Übereinstimmung mit der strengen Handhabung Richtlinien sind dringend erforderlich. Diese Bestimmung wurde kürzlich auch in den Ländern der Europäischen Union, die neuen Tierschutzvorschriften im Jahr 2013 1 umgesetzt gefordert. Die jeweiligen Anforderungen, die mit dieser Regelung verbunden sind, sind nicht neu und wurden bereits im Jahr 1959 vorgeschlagen, als Russell und Burch schlug eine ethische Rahmen für die Durchführung wissenschaftlicher Experimente mit Tieren, die vor allem auf eine Ersetzung, Verfeinerung und Verringerung (3R) Prinzip 27 basiert. Wenn nach dem outlined-Protokoll gibt es nur wenige Komplikationen, die durch technische Ungenauigkeiten auftreten können. Drei spezifische Fragen könnten in eher niedrigen Frequenz auftreten. Wie bei allen chirurgischen Eingriffen, die Überdosis des Narkosemittels ist eine potentielle Gefahrenquelle für die Tiere vor allem in Kombination mit Hypothermie. Wenn während der Operation kardiovaskuläre Komplikationen auftreten, sollte die Zufuhr von Narkosemittel sofort gestoppt werden und sollte der Bediener versuchen, soviel wie möglich Sauerstoff an der Maus bereitzustellen. Dies kann mit Hilfe eines kleinen Kunststoffspritze, die mit Luft gefüllt ist und in den Mund des Tieres beeinträchtigt gepumpten erfolgen. Alternativ ist die Verwendung eines kleinen Peleusball zur Belüftung des betroffenen Tier oft hilfreich für die Revitalisierung. Probleme bei der Wundheilung Nach der BDL Operation kann Mäuse eigene Halsnähte oder die anderer Tiere zu beißen. Wenn dies auftritt, sollte die jeweilige Mäusen getrennt werdenKäfig. Tiere, die mit offenen Wunden sollten narkotisiert, das Gebiet um die Wunde leicht mit einer Standard antiseptische sterilisiert und die Wunde wieder zusammengenäht werden. Während der nächsten 3 Tage, sollte die Wunde dieser Tiere regelmäßig überprüft werden (zwei bis drei Mal am Tag). Dehnungen des Bauches oder Bildung von Aszites sind indikativ für bakterielle Infektionen. Diese könnten durch nicht steriles Arbeiten während der Operation auftreten können. Alle Arten von Infektionen sollte ausnahmslos als humane Endpunkt behandelt und die betroffenen Tiere geopfert werden sollte. Wir stellten ein einfach zu Protokoll, das die Leistung des BDL in Mäusen, die einfach zu implementieren ist und erinnert nur geringe Tiersterblichkeit in Verbindung mit einer hohen Reproduzierbarkeit ermöglicht folgen. Alle chirurgischen Protokolle können schnell von erfahrenen Wissenschaftlern aufgegriffen werden. Während der gesamten Experimente wurden die Tiere auf eine Wärmeplatte bei 37 ° C gehalten und permanent verbundenenauf ein Anästhesiesystem minimiert Schmerzen und Leiden. Bei der Operation wird der Bauch mit einem Mittellinie Laparotomie und den Gallengang doppelt ligiert, ohne sich damit auseinandersetzen eröffnet. Die repräsentativen Ergebnisse, die hier diskutiert wurden, zeigen, daß die phänotypischen Veränderungen in Bezug auf Leber Morphologie (Entzündung, Fibrose, Zirrhose) sind sehr gut reproduzierbar und erlauben, verschiedene Aspekte der Fibrogenese untersuchen (z. B. die Einleitung, Entzündung, Progression, Endstadium der Erkrankung) in festgelegten Zeitpunkten. Wir hoffen, dass die Zusammenfassung unserer Protokoll wird dazu beitragen, die Lernkurve, die notwendig ist, um erfolgreich zu etablieren diese Fibrose-Modell in anderen Labors und auf zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse an verschiedenen Standorten garantieren zu verkürzen. Dabei denken wir, dass die vorgestellte Protokoll unterstützt das 3R-Prinzip, die von Russell und Burch 1959 angeblich und stellt die Grundlage der neuen Tierschutzvorschriften, die derzeit in vielen Ländern wi umgesetzt werdendünne europäischen Rahmen.

Leberfibrose ist als die übermäßige Produktion und Akkumulation von extrazellulärer Matrix (ECM), die aus einem komplexen Netzwerk von Wechselwirkungen von Matrix-produzierenden Lebersternzellen und einer Vielzahl von Leber-residenten und infiltrierenden Zellen Blutzellen 1,2 Ursprung definiert. Obwohl Leberfibrose kann durch eine Vielzahl von unterschiedlichen Stimuli verursacht werden die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen Fibrose sind in der Regel sehr ähnlich. Nach Leberschäden wird ein hoch orchestriert Programm der molekularen und zellulären Veränderungen eingeleitet. In diesem Programm wird eine enge Verzahnung von Entzündungssignalen, Monozyten / Makrophagen und hepatischen Sternzellen stattfindet, die am Ende Ergebnisse in Sternzellaktivierung und Transdifferenzierung zu Myofibroblasten, ECM Ablagerung und in Folge anatomische und funktionelle Veränderungen der Lebergewebeintegrität 3. Die Aktivierung von hepatischen Sternzellen sich besonders durch inflammatorische Signale und Interaktionen mit Leber angetriebenWohn Makrophagen (dh den Kupffer-Zellen). Pathogen associated molecular patterns werden von spezialisierten pattern recognition receptors wie die Toll-like Rezeptoren erkannt, die, wenn sie aktiviert Signal durch ein komplexes Netzwerk von unterschiedlichen Signalwege, die die Expression und Sekretion einer Vielzahl von entzündlichen Zytokinen und Chemokinen, die den Entzündungsprozess 3 fahren auslösen. Die entzündliche Reaktion, und das gebildete Leber Insult ist nur vorübergehend, wenn der krankheits Faktor beseitigt. Im Gegensatz dazu, wenn die Verletzung auftritt, entwickelt sich eine chronische Entzündung in der Leber und die Expression und Akkumulation von ECM Massen in den Vordergrund, was zu fortschreitenden Ersatz von Lebergewebe von Narbengewebebildung. Da Leberfibrose bei Menschen ist ein weltweites klinisches Problem haben mehrere experimentelle Nagetiermodellen von akuten und chronischen Leberversagen in den letzten Jahrzehnten etabliert. In den muRine System sind beispielsweise gemeinsame Modelle die Verabreichung einer Vielzahl von verschiedenen Lebergifte, die Ligation des Choledochus, Induktion von Autoimmunleberverletzungen und die gezielte Einführung von Gendefekten oder umgekehrt die Überexpression von Transgenen, die kritisch auswirken Signalwege in der Pathogenese von Leberfibrose 4 beteiligt. Ligatur des Gallengangs in Nagetieren wurde als ein experimentelles Verfahren in der Forschung seit vielen Jahren 5-8 durchgeführt. Eine erste hoch reproduzierbare Protokoll für längere Gallengangsligatur (BDL) in Nagetieren wurde jetzt schon vor mehr als drei Jahrzehnten 9 dargestellt. In diesem Protokoll sowohl Kanülen / Behinderung und Ligation induziert eine hohe Ausbeute an Zirrhose bei Ratten mit morphologischen Veränderungen, die denen in der menschlichen biliäre Zirrhose 9 beobachtet wurden. Die jeweilige Protokoll ist einfach, das chirurgische Verfahren ist relativ schnell anwendbareUnd die Überlebensraten der Tiere sind hoch: mehr als 95%. Im klassischen Ratte Kanülierung / Obstruktion Protokoll wird ein kurzer Einschnitt von 2 cm direkt unterhalb des Schwertfortsatzes gefertigt. Danach wird eine Kanüle in den proximalen Abschnitt des Gallenganges eingeführt und in seiner Position mit Seidennähten fixiert. In einem nächsten Schritt wird der distale Teil der Kanüle mit 3 Knoten behindert, in der rechten unteren Quadranten 9 durch das untere Ende des Mittelschnitt gelegt und begraben subkutan. Am Ende wird der Abdomen geschlossen, und die Tiere konnten sich erholen. In der Ligation werden die Ratten, um eine zweifache Bindung des Choledochus entweder mit oder ohne Präparation des Gallengangs zwischen den Ligaturen 9 unterworfen. Dieses experimentelle Modell wird gut angenommen und weltweit in Hunderten von Labors verwendet, um Leber Cholestase und Fibrose induzieren. Es induziert intrahepatischen Gallen Proliferation, myofibroblastischer differentiation von Portal Fibroblasten Umgebung proliferierenden biliäre Epithelzellen, was zu einer in hohem Maße reproduzierbar, massiven Expression und Abscheidung von ECM 10,11. Daher wird die Anwendung dieses Modells bei Ratten und Mäusen als unter Wissenschaftlern, die die Pathogenese der Leberentzündung und Fibrose verstehen wollen beliebt. In unserem Labor haben wir ausgiebig dieses Protokoll in der Vergangenheit an der Ratte eine Reihe von Experimenten mit dem Ziel, spezielle molekulare und zelluläre Aspekte der Leberfibrose zu untersuchen und neuartige Konzepte und antifibrotische Wirkstoffe 12-15 testen. Kürzlich, passten wir diese Methode auf die murinen System und gefunden, daß die Gallengangsligatur Operation ist auch ein attraktives Mittel, um zeitabhängige Fibrose mit geringer Variation und Mortalität bei Mäusen 16-18 herzustellen. Aufgrund der geringeren Größe der Tiere jedoch einige wichtige Änderungen im Hinblick auf die Anästhesie, OP-intervention und Nachbehandlung Beobachtung sind notwendig, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse in diesem Modell zu erhalten. Die vollständige Anpassung ist in dem folgenden Protokoll und im zugehörigen Videodokumentation zusammengefasst.

<table><tbody><tr><td>Isofluran</td><td>Forene Abbott</td><td>B 506</td><td></td></tr><tr><td>Rasierer Favorita II</td><td>Aeskulap</td><td>GT104</td><td></td></tr><tr><td>Scherkopf</td><td>Aeskulap</td><td>GT730</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen Augen- und Nasensalbe</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>6029009.00.00</td><td></td></tr><tr><td>Warmhalteplatte und Controller</td><td>Labotect</td><td>HP 062</td><td></td></tr><tr><td>Fluovac Anästhesiesystem</td><td>Harvard Apparatur</td><td>34-1030</td><td></td></tr><tr><td>ISOFLO (Isoflurane Vapor) Verdampfer</td><td>Eickemeyer</td><td>4802885</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Tape</td><td>handelsüblich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seidenpapier</td><td>handelsüblich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Durapore Silk Tape</td><td>3M</td><td>1538-1</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Fuhrmann GmbH</td><td>32014</td><td></td></tr><tr><td>Polyalkohol Haut&hellip; farblos Antisepticum</td><td>Antiseptica GmbH</td><td>72PAH200</td><td></td></tr><tr><td>Raucodrape OP Klebetücher</td><td>Lohmann & Rauscher GmbH</td><td>33013</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>14074-11</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Zange gerade</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Mersilk Nahtmaterial</td><td>Ethicon</td><td>K889H</td><td>Seide, nicht resorbierbar / Bauchverschluss</td></tr><tr><td>Nadelhalter Mathieu</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>12010-14</td><td></td></tr><tr><td>Colibri Retraktor</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Noba Verbandmittel</td><td>974202</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1032238</td><td></td></tr><tr><td>25mL Becherglas</td><td>Schott Duran</td><td>50-1150</td><td></td></tr><tr><td>Isotonische (0,9%) NaCl-Lösung</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>PZN 00765145</td><td></td></tr><tr><td>Mikroverzahnungszange Moria MC31</td><td>Fine Science Tools Inc.</td><td>11370-31</td><td>Trennung des Gallengangs</td></tr><tr><td>5-0 Mersilene Naht</td><td>Ethicon</td><td>EH6731H</td><td>Polyester, nicht resorbierbar/Gallengangsligatur</td></tr><tr><td>5 ml Spritze</td><td>BD Discardit II</td><td>300296</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Nadel 26 G x 1</td><td>B. Braun</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphin</td><td>Essex Pharma</td><td>997.00.00</td><td>Analgeticum, 0,1 mg/kg</td></tr><tr><td>Infrarotlampe</td><td>Petra Electric</td><td>IR 11</td><td></td></tr></tbody></table>

gallengang-ligation in mice: induktion von entzündungsleber-verletzung und fibrose von obstruktiver cholestase

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Bei den meisten Wirbeltieren produziert die Leber Galle, die notwendig ist, um absorbiert Fette zu emulgieren und erlauben die Verdauung der Lipide im Dünndarm sowie Bilirubin und andere Stoffwechselprodukte ausscheiden. In der Leber der Versuchs Obstruktion der extrahepatischen Gallenwege eine komplexe Kaskade von Ereignissen, die zu pathologischen Cholestase und Entzündung, was zu einer starken fibrotischen Reaktion der periportalen Felder Ursprung führt. Daher chirurgische Ligation der Gallengang hat sich die am häufigsten verwendete Modell zur obstruktiven Cholestase Verletzungen bei Nagetieren zu induzieren und die molekularen und zellulären Ereignisse, die diese pathophysiologischen Mechanismen, die durch unsachgemäße Gallenfluss induziert zugrunde liegen, zu studieren. In den letzten Jahren wurden verschiedene Operationstechniken beschrieben worden, dass entweder die Möglichkeit, Wiederverbindung oder reanastomosis nach Gallengang-Ligation (BDL), zB Teil BDL oder andere mikrochirurgische Verfahren für bestimmte Forschungsfragen. Ist das am häufigsten verwendete Modell jedoch die komplette Obstruktion der Gallengang, die einen starken fibrotischen Reaktion nach 21 bis 28 Tage induziert. Die Sterblichkeitsrate ist hoch wegen infektiöser Komplikationen oder technische Ungenauigkeiten enthalten. Hier stellen wir eine detaillierte Operationsverfahren zur BDL Modell bei Mäusen, die eine hoch reproduzierbare fibrotische Reaktion in Übereinstimmung mit dem 3R-Regel für den Tierschutz von Russel und Burch 1959 postuliert induzieren.

In einem typischen Experiment wurde BDL in 40 männliche C57BL / 6-Wildtyp-Mäusen Gewichtung etwa 18-20 Gramm durchgeführt. Dieses Experiment wurde durchgeführt, um Leberfibrose in der Initiierungsphase (3 und 7 Tage), während der Progression (10, 14 und 20 Tage) untersucht, und bei Langzeit (30 und 60 Tage) 16. In diesem Modell hat persinusoidal Fibrose schon am Tag 10 nach der Operation entwickelt, während periportal Fibrose, die dauerhaft bis zum Versuchsende erhöht wurde vollständig nach 20 Tagen entwickelt. In dem genannten Experiment alle Tiere, die eine einfache Scheinarbeit erhielten, überlebten, und nur zwei der 40 Mäuse (5%), die BDL erhielten, entwickelten ein schlechter Allgemeinzustand und wurden daher vorzeitig vor dem geplanten Endpunkt des Experiments getötet. Die Aktivität der scheinoperierten Tieren war ausnahmslos bereits Normal einen Tag nach Bauchschnitt, während die meisten Tiere nach BDL ausgesetzt zeigte verminderte Aktivität während der ersten drei Tage. Jaundiced Haut war nach der Einstellung des BDL 16 bereits sichtbar gewesen, in allen BDL Tiere ein oder zwei Tage. Die Werte der beiden Alanin-Aminotransferase (ALT) und Aspartat-Transaminase (AST), die etablierten Serum-Marker einer Leberschädigung darstellen rapide zugenommen und erreichte während Tag 7 und Tag 20 nach BDL (Tabelle 1). Danach ALT und AST nahm stetig ab, bis Tag 30 und blieb bis 60 Tage nach der Operation stabil. Im Einklang mit der cholestatischen Verletzungen waren die Serumkonzentrationen von Gesamt-Bilirubin stetig erhöht und erreichte ein Plateau nach 7 Tagen 16. Ähnliche zeitliche Verlauf der Serum-ALT und AST-Aktivitäten wurden auch für Ratten, BDL unterwiesen. In einer neueren Studie wurde demonstriert, dass die Serumspiegel von AST und ALT bis zu 5 oder 10-fache der normalen nach dem BDL Operation erhöht bei der ersten Woche und nach zwei Wochen verringert 19. Typischerweise werden die Lebern der scheinoperierten Tieren sehen immer noch smooth am Ende des Experiments, während die Lebern von Tieren, die BDL übermittelt zeigen baulichen Veränderungen, die vor allem durch die Bildung von Ödemen und fibrotische Knötchen auf der Oberfläche des entsprechenden Leber und Hydrops der Gallenblase, die mit großen Mengen von gefüllten auszeichnen Galle (Abbildung 7). Die charakteristischen morphologischen Veränderungen der Leber, die durch das BDL Operation induziert werden, sind ebenfalls nachweisbar histologischen Standardanalyse (Abbildung 8). In der gleichen Reihe von Experimenten, die Entwicklung von Leberfibrose wurde halbquantitativ beurteilt basierend auf Leberhistologie von einem Blind Pathologen unter Verwendung eines Punktesystems, in dem periportal Fibrose von 0-4 und perisinusoidale Fibrose von 0-2 aufgeführt bewertet, was eine maximale Wert, der der Zirrhose 6. war erwartungsgemäß der Mittelwert-Fibrose-Score in der Gruppe der scheinoperierten Tieren war 0,00 ± 0,00. Im Gegensatz dazu wird bei der Gruppe von Tieren tHut erhalten BDL stieg die Punktzahl stetig bis Tag 60 auf einen Wert von 4,83 ± 0,17. Die maximal 3 für periportal Fibrose wurde am Tag 20 erreicht Bei allen Tieren untersucht, war perisinusoidale Fibrose während den ersten 10 Tagen des Versuchs fehlt und war zunächst bemerkbar nach zwei Wochen. Danach stetig es bis zum Ende des Experiments auf Werte von 1,8 ± 0,17 (Tabelle 1). Auch in mehreren anderen unabhängigen Tierversuchen, die durchgeführt wurden, wurde beobachtet, dass die Bildung von Fibrose war in hohem Maße reproduzierbar zeigt zeitabhängige Zunahme der intrahepatischen Kollagenexpression und Deposition als Folge der laufenden Fibrogenese (Abbildung 9). In ähnlicher Weise ist das Verfahren der kontinuierlichen Fibrogenese in erhöhte Expression von α-Aktin der glatten Muskulatur (α-SMA), das eine Markierung von Fibroblasten dar bemerkbar, dh aktivierten hepatischen Sternzellen und Portal Myofibroblastenund Leber Hydroxyprolin, eine Aminosäure, reichlich in Kollagen gefunden Matrizen 18 (Abbildung 9). Darüber hinaus wird die Expression von Vimentin, das zunehmende Mengen von Myofibroblasten oder Fibroblasten gibt an, nach dem Abbinden des BDL Operation 20 erhöht. Die Gleichzeitigkeit der Entzündung in Leber verletzt werden durch erhöhte Expression von Lipocalin 2 (LCN2), die stark bei akuten und chronischen Leberschädigung induziert wird und entwickelt sich leberschützende Effekte bei akuter Leberschäden 21,22 wider. Entzündungszellen, die die Leber von Tieren, die BDL übermittelt infiltrieren kann durch spezifische Färbung mit einem Antikörper, der spezifisch für CD45 (Figur 10) festgestellt werden. Diese Zelloberflächenmarker, der auch als Protein-Tyrosinphosphatase (Proteintyrosinphosphatase, Rezeptortyp) bekannt ist speziell in allen differenzierten hämatopoetischen Zellen außer Erythrozyten und Plasmazellen exprimiert. <table fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot; border = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> Zeit nach Gallengang-Ligation (in Tagen) </td><td> Gesamtbilirubin </td><td rowspan="2"> AST (U / L) </td><td rowspan="2"> ALT (U / L) </td><td rowspan="2"> Portal Fibrose </td><td rowspan="2"> Perisinusoidale Fibrose </td><td rowspan="2"> Gesamtpunktzahl </td></tr><tr><td> (Mg / dl) </td></tr><tr><td> 0 (n = 3) </td><td> 0,17 ± 0,06 </td><td> 192,67 ± 30,50 </td><td> 50,33 ± 6,03 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td></tr><tr><td> 3 (n = 5) </td><td> 6,85 ± 2,21 </td><td> 1159,25 ± 319,27 </td><td> 566,50 ± 335,25 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td></tr><tr><td> 7 (n = 5) </td> &lt;td&gt; 14,38 ± 2,14 ± </td><td> 976,60 ± 477,16 </td><td> 448,20 ± 259,47 </td><td> 0,60 ± 0,25 </td><td> 0,0 ± 0,0 </td><td> 0,60 ± 0,25 </td></tr><tr><td> 10 (n = 5) </td><td> 15,92 ± 2,60 </td><td> 1916,60 ± 868,25 </td><td> 560,40 ± 80,88 </td><td> 1,40 ± 0,25 </td><td> 0,25 ± 0,25 </td><td> 1,67 ± 0,25 </td></tr><tr><td> 14 (n = 5) </td><td> 17,90 ± 3,84 </td><td> 1088,60 ± 276,32 </td><td> 505,00 ± 96,15 ± </td><td> 2,4 ± 0,25 </td><td> 1,0 ± 0,0 </td><td> 3,40 ± 0,24 </td></tr><tr><td> 20 (n = 4) </td><td> 18,00 ± 2,12 </td><td> 1072,67 ± 364,27 </td><td> 404,00 ± 195,48 </td><td> 3,0 ± 0,0 </td><td> 1,0 ± 0,0 </td><td> 4,0 ± 0,0 </td></tr><tr><td> 30 (n = 5) </td><td> 16,04 ± 4,79 </td><td> 446,40 ± 169,75 </td><td> 260,20 ± 126,97 </td><td> 2,8 ±; 0.2 </td><td> 1,4 ± 0,25 </td><td> 4,20 ± 0,20 </td></tr><tr><td> 60 (n = 6) </td><td> 16,02 ± 1,19 </td><td> 484,67 ± 117,79 </td><td> 257,17 ± 50,97 </td><td> 3,0 ± 0,0 </td><td> 1,8 ± 0,17 </td><td> 4,83 ± 0,17 </td></tr></tbody></table> Abkürzungen verwendet: ALT Alanin-Aminotransferase; AST, Aspartat-Aminotransferase. Tabelle 1: Fibrosis Bonitur in einem repräsentativen Experiment Die Daten dieser Tabelle wurde aus einer Studie, in der Leberfibrose wurde durch Gallengang-Ligation in C57BL / 6-Mäusen 16 induzierte reproduziert.. In dieser Studie wurde die Sterblichkeit nach der Operation war BDL 5% (2 von 40 Tieren wurde vorzeitig geopfert, weil arme Tier Bedingungen entwickelt). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Versuchsaufbau zur Durchführung eines GallenKanalligation. Das Tier wird auf einer Wärmeplatte bei einer Temperatur von 37 ° C gehalten und der Betriebsbereich ist insgesamt mit fluidundurchlässigen, selbstklebende Vorhänge abgedeckt. Während der gesamten Operation wird das Tier ständig mit einem Narkosesystem angeschlossen sind. Alle Besetzungen und Lösungen (Analgetika, Anästhetika, antiseptischen Lösung, 0,9% NaCl) sind übersichtlich angeordnet. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig2highres.jpg" /> Fig. 2: Herstellung des OP-Bereich Vor Eröffnung der Bauchhöhle sollte die Bauchhaut mit einem elektrischen Rasierer rasiert und Pelz mit einer antiseptischen Gazetupfer desinfizieren. Der OP-Bereich wird dann mit fluidundurchlässigen, selbstklebende Vorhänge abgedeckt. Der Bauch ist mit einer Mittellinie Laparotomie (~ 2 cm in der Länge) geöffnet. Der Hohlraum wird durch Einfügen eines Halte Naht im Brustbein und in den Arbeitsbereich von verbreiten vergrößertEinfügen eines Colibri Aufroller so ungehindert experimentieren während der Operation. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: Die Exposition des Gallengangs. (A) Für die Durchführung der Gallengang-Ligation, die ventrale Seite der Leber wird angehoben, so dass er an der Membran haften und die hepatische Hilus deutlich sichtbar wird. (B) Um eine bessere setzen den Gallengang, wird der Darm mit kaudal verschoben eine befeuchtete Wattestäbchen. Der Gallengang ist mit einem Pfeil markiert. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig4highres.jpg" /> Abbildung 4: Ligieren des Gallengangs. (A) In einem ersten Schritt wird der Gallengang wird vorsichtig von der flankierenden Pfortader und Leberarterie mit Hilfe eines Mikroverzahnung Pinzette abgetrennt. (B) Anschließend wird eine Naht um platziertder Gallengang und mit einem chirurgischen Knoten befestigt ist. (C) Danach wird eine zweite Naht in der Nähe des ersten Nahtfadens angeordnet und um den Gallengang verknotet. (D) Die Naht verkürzt wird, der Hohlraum mit 0,9% iger NaCl-Lösung gespült und alle Organe, ihre physiologische Position ersetzt. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig5highres.jpg" /> Fig. 5:. Präzise Darstellung Verknoten, um die Platzierung der Nähte und die Einstellung der beiden Knoten, die den Gallenfluss zu vermeiden zu dokumentieren, wurde das gleiche Verfahren in Figur 4 skizziert unter einem binokularen dokumentiert (A) Confinement des Gallengangs mit dem ersten Naht. (B) Knotting der ersten Naht. (C) Confinement des Gallengangs mit der zweiten Naht. (D) Knotting der zweiten Naht. (E) Doppelklicken ligiert Galle ddukt nach dem Kürzen von Über Nähte. (E &#39;) Dieses Panel zeigt eine Skizze der (E). Die Positionen der rechten (RL), linken (LL) und Mittellinie (ml) Lappen der Leber sowie des Gallenganges, des Magens und Zwölffingerdarm werden mit den Buchstaben. In der Skizze der Gallengang wird doppelt durch zwei Nähte ligiert. <img alt="Figur 6" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig6highres.jpg" width="400" /> Abb. 6: Anatomie der Gallengang, Pfortader und Leberarterie bei Mäusen Für eine bessere anatomische Lage der Gallengang werden die Pfortader und Leberarterie als Schema dargestellt. Markiert sind auch die Positionen der rechten (RL), links (ll) Medianwert (ml) und der Nucleus caudatus (cl) Leberlappen. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig7highres.jpg" /> Abbildung 7: Vertreter appearance von Lebern von 2 Wochen nach Scheinoperation und BDL. C57BL / 6-Mäuse wurden einer Operation oder BDL Operation sham. Nach zwei Wochen wurde die Bauchhöhle geöffnet. Während die Lebern der scheinoperierten Tiere zeigten keine Anzeichen von Fibrose, die Lebern von Tieren, die Ligation der Gallengang hatte eine unregelmäßige Oberflächenstruktur mit der Bildung von Ödemen und fibrotische Knötchen auf der Oberfläche des entsprechenden Lebern. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig8highres.jpg" /> Abb. 8: Hämatoxylin und Eosin-Färbung Leberschnitte wurden aus C57BL / 6-Wildtyp-Tiere, die scheinoperierten waren (A) oder empfangen BDL drei Wochen (B) vorbereitet. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin nach Standardverfahren gefärbt. Bitte beachten Sie die typischen Veränderungen im BDL Leber, die Entzündungszeichen (infiltrierenden Zellen), Parenchym (hepato enthaltencyte) Nekrose, und die Vermehrung von Gallengänge. Der Balken in jeder Figur Panel repräsentiert 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52438/52438fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="9" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig9highres.jpg" /> Abbildung 9: Die histologischen und biochemischen Anzeigen für Leberfibrose. (A) Leberschnitte wurden von Tieren, die Schein-Operation oder BDL für 2 Wochen erhalten vorbereitet und mit Sirius Red (oben, Kollagenfasern in rot) gefärbt oder für die Expression von α-smooth muscle actin (α-SMA) (unten analysiert , α-SMA-positiven Zellen in braun) durch Immunhistochemie. Der Balken in jeder Figur Panel stellt 100 um. (B) Proteinextrakte aus Lebern wurden einer Western-Blot unterzogen und für expre analysiertssion von Kollagen Typ I, α-SMA und Vimentin, die gut etablierten Markern der Leberfibrose sind. Die Expression der Lipocalin-2 (LCN2) die entzündliche Reaktion, die mit den laufenden Fibrogenese zugeordnet ist. In dieser Analyse wurde gleich Eiweißbelastung durch Sondieren der Blots mit einem für β-Actin-Antikörper nachgewiesen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52438/52438fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="10" src="/files/ftp_upload/52438/52438fig10highres.jpg" /> Fig. 10: Immunologische Färbung von infiltrierenden Entzündungszellen serielle Leberschnitte wurden aus einer Leber eines Tieres, das Gallengangsligatur für 3 Wochen erhielt, hergestellt. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (A) oder mit einem Antikörper, der spezifisch für CD45 (B) angefärbt. Bitte beachte,die hohe Zahl der CD45-positiven Zellen rund um die Gallengänge. Diese massiven Infiltration, die Entzündungen zeigen sich nicht in Leberschnitten von scheinoperierten Tieren sichtbar (nicht dargestellt). Der Balken in jeder Figur Panel stellt 500 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52438/52438fig10large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

Eine Störung des Gallenflusses führt zu einer schweren entzündlichen cholestatischen Leberschädigung mit einer charakteristischen zeitabhängigen Abfolge morphologischer Veränderungen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die chirurgische Ligatur des Gallengangs communis bei Mäusen vor, das es ermöglicht, nach 21 bis 28 Tagen eine starke fibrotische Reaktion zu induzieren.

Gallengang-Ligation in Mice: Induktion von Entzündungsleber-Verletzung und Fibrose von obstruktiver Cholestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine experimentelle Leberfibrose bei Mäusen zu induzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Mittellinien-Laparotomie durchgeführt wird, um den Bauch des Tieres zu öffnen. Als nächstes wird die Leber angehoben, um den Gallengang freizulegen.Dann wird der Gallengang mit zwei chirurgischen Knoten verschlossen. Letztendlich werden Leberschäden, Leberfibrose und Zirrhose gemessen, indem die Ablagerung von Kollagen durch histologische Analyse überwacht wird. Der Hauptvorteil dieses experimentellen Modells im Vergleich zu anderen Modellen, wie z.B. der chronischen Anwendung von Tetrachlorkohlenstoff, besteht darin, dass dieses Modell sehr gut reproduzierbar ist und eine insgesamt niedrige Sterblichkeitsrate aufweist.Diese Methode hilft, zentrale Fragen auf dem Gebiet des Fortschreitens der Leberfibrose zu beantworten. Zum Beispiel der Beitrag verschiedener Immunzellinfiltrationen oder die Regulation von Signalwegen in der Leber. Das Modell der Gallengangsligatur hat viele Gemeinsamkeiten mit der humanen Pathogenese.Wir glauben also, dass dieses Modell sehr wertvoll ist, um Wissen von der Maus auf die menschliche Krankheit zu übertragen. Obwohl diese Methode einen Einblick in den allgemeinen Aspekt der Leberfibrogenese bietet, kann sie auch auf andere Tiermodelle wie Hamster oder Ratten angewendet werden. Der kritische Teil des chirurgischen Eingriffs für den Anfänger besteht darin, den B-Kanal von der Frankieröffnung zu trennen. Wind.Die Demonstration dieser Raketen wird von K und Zivilisten, unseren beiden Technikern unserer Laborkörper, durchgeführt. Alle Versuche wurden vom offiziellen staatlichen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung genehmigt. Alle Versuche wurden in Übereinstimmung mit dem Bundesgesetz über den Schutz von Tieren und Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren zur Vorbereitung von Operationen durchgeführt.Montieren Sie die folgenden sterilen Instrumente und Lösungen, wie in der Liste der spezifischen Materialien und Geräte im Textprotokoll beschrieben. Stellen Sie nach der Betäubung einer Maus gemäß dem Textprotokoll sicher, dass das Tier keine Reaktion auf Schmerzen zeigt. Rasieren Sie mit einem Elektrorasierer das Bauchfell und tragen Sie eine Augen- und Nasensalbe auf, um die Augen vor dem Austrocknen zu schützen. Stellen Sie die Maus auf eine 37 Grad Celsius heiße Kochplatte.Führen Sie die Mausschnauze in die Fluvac-Maske eines Fluvac-Anästhesiesystems ein und fixieren Sie die Beine des Tieres mit einem Seidenband. Halten Sie die Anästhesie durch Inhalation von 1,5 bis 3 % ISO-Fluor in 100 % Sauerstoff bei einer Flussrate von einem Liter pro Minute aufrecht. Desinfizieren Sie abschließend den Operationsbereich.Decken Sie den Einsatzbereich insgesamt mit flüssigkeitsundurchlässigen Selbstklebetüchern ab. Um mit der Operation zu beginnen, führen Sie mit einer chirurgischen Schere eine etwa zwei Zentimeter lange Mittellinien-Laparotomie durch, indem Sie gleichzeitig die Schnitte und die Faszie schneiden. Verwenden Sie die Schere als Spreizer, um das Bindegewebe auf dem Bauchfell zu präparieren.Schneiden Sie das Bauchfell entlang der linearen Alba, um die Bauchhöhle zu öffnen. Vergrößern Sie dann die Kavität, indem Sie eine Haltenaht in das Brustbein einführen, das Filament der Naht anheben und auf der Fluvac-Maske fixieren. Die perioperative Analgesie mit 0,1 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin wird in die Bauchhöhle gegeben.Führen Sie anschließend einen Cree-Retraktor in die Bauchhöhle ein, um den Operationsbereich zu spreizen. Verwenden Sie dann ein Wattestäbchen mit Kochsalzlösung, um die Leber anzuheben, so dass die ventrale Seite am Zwerchfell haftet und das Hilum deutlich sichtbar ist. Um nun den Gallengang freizulegen, bewegen Sie den Darm in verhätschelter Richtung und trennen Sie dann den Gallengang vorsichtig mit einer Mikrozange von der flankierenden Pfortader und der Leberarterie.Legen Sie eine Naht von fünf bis null um den Gallengang und befestigen Sie sie mit zwei chirurgischen Knoten. Kontinuierliche Erhöhung der Anziehungskraft, um eine effektive Obstruktion zu gewährleisten, ohne den Gallengang zu durchtrennen. Um zu verhindern, dass der Knoten undicht wird und das Tier eine schwere Bauchfellentzündung entwickelt, fügen Sie auf die gleiche Weise ein zweites Schädelband hinzu, ohne den Gallengang dazwischen zu präparieren, schneiden Sie die Enden der Nähte ab, senken Sie das Brustbein ab und entfernen Sie den Retraktor.Verwenden Sie 0,9% Kochsalzlösung, um die Bauchhöhle zu spülen und die Bauchorgane in ihre physiologische Position zu bringen. Verwenden Sie sechs Zero Merc Silk Laufnähte, um sowohl das Peritoneum als auch die süßeste Plus-Faszie zu schließen. Verwenden Sie eine antiseptische Lösung, um den Operationsbereich zu desinfizieren.Lassen Sie die Maus nach der Operation in einem Käfig erholen, der von einer Infrarotlampe erwärmt wird. Wenn die Maus vollständig wach und aktiv ist, bringen Sie sie in einen normalen Käfig und verschaffen Sie ihr ad liptum Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Gallengangsligatur wurde durchgeführt, um die hepatische Fibrogenese in der Initiationsphase während der Progression und langfristig zu untersuchen. Wie in dieser Tabelle gezeigt, hat sich die sinusoidale Fibrose der Pers bereits am 10. Tag nach der Operation entwickelt, während die periportale Fibrose, die bis zum Ende des Experiments dauerhaft anstieg, nach 20 Tagen vollständig entwickelt war, stiegen sowohl ein LT- als auch ein ST-Serummarker für Leberschäden schnell an und erreichten am siebten und 20. Tag ihren Höhepunkt.Nach der BDL danach nahmen A LT und A ST bis zum 30. Tag stetig ab und blieben bis 60 Tage nach der Operation stabil. In Übereinstimmung mit der scholastischen Schädigung waren die Serumkonzentrationen des Gesamtbilirubins stetig erhöht und erreichten nach sieben Tagen ein Plateau. Typischerweise sehen die Lebern von scheinoperierten Tieren am Ende des Versuchs noch glatt aus, während die Tiere, die BDL erhielten, Ödeme und fibrotische Knötchen auf der Oberfläche der Leber und Hydrops der Gallenblase entwickelten, die mit Galle gefüllt waren.Morphologische Veränderungen werden auch durch histologische Analysen sichtbar. Die Entwicklung der Fibrose ist hochgradig reproduzierbar und zeigt eine zeitabhängige Zunahme der intrahepatischen Kollagenexpression und -ablagerung als Folge der laufenden Fibrogenese, weitere Indikatoren der Fibrogenese sind die erhöhte Expression von Alpha-Aktin-Vimentin der glatten Muskulatur und der entzündungsassoziierte Marker Lipin zwei. Sobald Sie den Meister haben, kann dieser Vorgang in 10 bis 50 Minuten durchgeführt werden, wenn er beim Versuch des Verfahrens ordnungsgemäß durchgeführt wird.Es ist wichtig, daran zu denken, Ölprozeduren unter sauberen, aber nicht sterilen Bedingungen durchzuführen. Andere Methoden, wie die Verabreichung von Tetrachlorkohlenstoff, können durchgeführt werden, um festzustellen, ob die Mechanismen spezifisch für das Gallengangsligaturmodell oder allgemein relevant für die Leberfibrogenese nach ihrer Entwicklung sind. Diese Methodik ebnete vielen Forschern auf dem Gebiet der Hepatologie den Weg, um die verschiedenen Signalwege zu analysieren und zu erforschen, die sich in der hepatischen Fibrogenese entwickelt haben.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Produktligation bei Mäusen mit hoher Reproduzierbarkeit durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Tieren einen verantwortungsvollen Umgang erfordert und dass die VA von inhalativen Betäubungsmitteln während der Durchführung des Eingriffs äußerst gefährlich sein kann.

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Cholestase ist ein klinischer Zustand häufig von Chirurgen und Gastroenterologen gestoßen. Erstellung eines reversible cholestatische Rattenmodell kann in Anbetracht der geringeren Größe und einzigartige hepatopancreatobiliary Anatomie in Ratten eine Herausforderung sein. Dieses Video Artikel veranschaulicht die Schaffung eines reversible cholestatische Modell.

Erstellung von Reversible Cholestatische Rattenmodell

Eine hohe Inzidenz von Tumorrezidiven nach Resektion von Lebermetastasen bleibt ein ungelöstes Problem. Das dargestellte Mausmodell kann nützlich sein, um die Gründe für solche Rezidive zu untersuchen. Es kombiniert erstmals ein Leberresektionsmodell mit der intrahepatischen Injektion von Tumorzellen.

Der Einfluss von Leberresektion auf Intrahepatische Tumorwachstum

Dünndarm-abhängige Gallensäure Resorption und Feedback-Hemmung der hepatischen Gallensäure Synthese ist wichtig für systemische Homöostase und Gesundheit. In dieser Studie beschreiben wir ein Mausmodell für ileale Resektion, Ileectomy-induzierten Galle Malabsorption, Overaccumulation und Toxizität im Darm der Maus zu bewerten.

Overaccumulation Ileectomy-induzierten Galle im Darm der Maus

Hier beschreiben wir eine gängige Methode um chronische Schädigung der Leber bei Mäusen zu induzieren, durch die Fütterung einer Cholin-Mangel und Ethionine ergänzt (CDE) Ernährung. Wir zeigen Systemüberwachung, Leber Perfusion, Isolation und Erhaltung. Schädigung der Leber, Pathohistology, Fibrose, entzündliche, und Leber Stammvater-Zell-Reaktionen kann ein zeitlichen Verlauf von sechs Wochen mitteilen.

Der murinen Cholin-Mangel, Ethionine ergänzt (CDE) Diät-Modell einer chronischen Leberschädigung

Hier präsentieren wir Ihnen teilweise Gallengang Ligatur als chirurgische Modell der Leberschädigung und Regeneration bei Nagetieren.

Partielle Gallengang Ligation in der Maus: eine kontrollierte Modell der lokalisierten obstruktive Cholestase

Wir präsentieren eine recht einfache und empfindliche Methode zur genauen Quantifizierung der Gallengangsdichte in der Mausleber. Diese Methode kann bei der Bestimmung der Auswirkungen von genetischen und ökologischen Modifikatoren und der Wirksamkeit potenzieller Therapien in Mausmodellen von Gallenerkrankungen helfen.

Bestimmung der Gallengangsdichte in der Mausleber

Hier wird ein Protokoll zur Isolierung von Maushepatozyten aus erwachsenen Mauslebern mit einer modifizierten Kollagenase-Perfusionstechnik vorgestellt. Ebenfalls beschrieben ist die Langzeitkultur von Hepatozyten in einer 3D-Kollagen-Sandwich-Einstellung sowie die Immunkennzeichnung der zytoskelettalen Komponenten zur Untersuchung der Gallenkanalbildung und deren Reaktion auf die Behandlung.

Isolation und 3D Kollagen Sandwich Kultur der primären Maus Hepatozyten, um die Rolle des Zytoskeletts in Bile Canalicular Formation In Vitro zu studieren

Dieses Protokoll bietet eine einfache und zuverlässige Methode für die Herstellung von lebensfähigen präzisionsgeschnittenen Leberscheiben von Mäusen. Die Ex-vivo-Gewebeproben können mehrere Tage lang unter Labor-Gewebekulturbedingungen aufbewahrt werden, was ein flexibles Modell zur Untersuchung der Leberpathobiologie bietet.

Murine Präzisionsgeschnittene Leberscheiben als Ex-Vivo-Modell der Leberbiologie

Chronische Pankreatitis (CP) ist eine Krankheit, die durch Entzündungen und Fibrose der Bauchspeicheldrüse gekennzeichnet ist, die oft mit hartnäckigen Bauchschmerzen verbunden sind. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verfeinerung der Technik, um ein Mausmodell von CP durch Gallengangsinfusion mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) zu erzeugen.

Ein Mausmodell für chronische Pankreatitis mittels Gallengangs-TNBS-Infusion

Wir haben ein Mausmodell für chronische Leberfibrose etabliert, das ein geeignetes Tiermodell für die virusinduzierte Leberfibrose-mechanistische Untersuchung der Gallengangsatresie (BA) und eine Plattform für zukünftige BA-Behandlungen darstellt.

Ein Mausmodell der chronischen Leberfibrose zur Untersuchung der Gallengangsatresie

Es hat sich gezeigt, dass die Assoziierung der Leberpartition und der Pfortaderligatur bei der gestiebenen Hepatektomie (ALPPS) mehrere Wochen nach der Operation im ersten Stadium zu einer bemerkenswerten Leberregeneration führt. Tiermodelle, die einer ALPPS unterzogen wurden, wurden entwickelt, um die potenzielle Regenerationsfähigkeit der Leber zu untersuchen und günstige klinische Ergebnisse zu erzielen.

Ein Mausmodell der zugehörigen Leberpartition und der Pfortaderligatur für ein gestuftes Hepatektomieverfahren mit Hilfe der Mikroskopie

Lernen Sie die Gallengang-Ligation bei Mäusen zur Induktion experimenteller Leberfibrose durch obstruktive Cholestase. Diese reproduzierbare Methode ermöglicht die Untersuchung von Fibrogenese und Immunzellinfiltration.

Gallengang-Ligation in Mice: Induktion von Entzündungsleber-Verletzung und Fibrose von obstruktiver Cholestase

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