Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Exosome effizient aus Körperflüssigkeiten zu isolieren, deren Fracht freizusetzen und diese schnell zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mithilfe magnetischer Mikropartikel, die mit Antikörpern gegen Exosomenmarker beschichtet sind, Exosome aus Körperflüssigkeiten angereichert werden. Anschließend werden die isolierten Exosome auf einer Elektrodenoberfläche immobilisiert. Danach werden die Exosome durch ein elektrisches Feld lysiert, und die enthaltene Fracht hybridisiert mit auf der Elektrodenoberfläche fixierten Sonden.

Einem Reporter-Molekül wird ebenfalls an das System hybridisiert. Der letzte Schritt besteht darin, eine Substratlösung auf die Elektrodenoberfläche aufzutragen und anschließend die Messung durch Erfassung des elektrischen Stroms durchzuführen. Letztendlich dient die elektrochemische Strommessung dazu, die Menge an Nukleinsäure oder Proteingehalt in der Exosomenprobe nachzuweisen.

Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber bestehenden Methoden wie der Ultrazentrifugation und dem Lysin-Puffer besteht darin, dass sie eine einfache und schnelle Methode zur Gewinnung und Analyse von Exosomeninhalten darstellt. Wir sind sehr begeistert von dieser Technologie, da sie uns erstmals ermöglicht, die von Organen bei Krankheit oder im Normalzustand über die Gefäße abgegebenen Informationen, die aus dem Ursprungsorgan stammen, in der Mundhöhle zu nutzen. Diese Technologie erlaubt es uns, diese Informationen einzufangen und die molekularen Inhalte freizusetzen, die wir gleichzeitig und flexibel detektieren können.

Diese diskriminierende Information bezüglich der Erkrankung kann für Nutzer, die neu in dieser Methode sind, schwierig sein, da die Handhabung magnetischer Mikropartikel problematisch werden kann, wenn nicht sorgfältig vorgegangen wird. Darüber hinaus stellt die Anwendung elektrochemischer Methoden in der Analyse biologischer Proben für manche möglicherweise ein neuartiges Konzept dar. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das Handling magnetischer Mikropartikel und das elektrochemische Beladen schwer zu erlernen sind. Besondere Vorsicht ist erforderlich, wenn mit magnetischen Mikropartikeln umgegangen und diese auf Elektroden aufgebracht werden.

Um die Resuspension zu beginnen, geben Sie eine Stammlösung, die 10 Mikrogramm pro Milliliter mit Streptavidin beschichtete magnetische Mikropartikel enthält, und fügen Sie fünf Mikroliter hinzu. Die Lösung wird einem Mikrozentrifugenröhrchen hinzugefügt, das 495 Mikroliter PBS enthält, um die Partikel zu waschen. Stellen Sie zunächst das Röhrchen für eine Minute auf einen Magnetrack und entfernen Sie vorsichtig den Puffer, ohne die Partikel zu stören.

Überführen Sie das Reagenzglas anschließend in ein nicht-magnetisches Gestell. Geben Sie 500 µL PBS zu und pipettieren Sie zur Waschung der Partikel. Wiederholen Sie diesen Schritt insgesamt dreimal; nach der letzten Waschung erneut verwenden.

Suspendieren Sie die Kügelchen in 490 µL PBS und geben Sie anschließend 5 µL biotinyliertes Maus-Anti-Human-CD63-Antikörper aus einer Stammlösung von 1 mg pro mL hinzu. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren, Programmieren eines Probendrehergeräts für eine reziproke Rotation von 90 Grad für fünf Sekunden und eine Vibration von fünf Grad für eine Sekunde. Stellen Sie die Röhrchen in den Probendreher und führen Sie das Programm 30 Minuten bei Raumtemperatur aus.

Überführen Sie die Röhrchen anschließend für fünf Minuten auf den Magnetrack. Waschen Sie die Partikel dreimal mit jeweils 500 µL PBS und resuspendieren Sie sie danach in 490 µL PBS, das Caine enthält. Beschriften Sie ein Röhrchen mit der Probenkennung und geben Sie 10 µL der Probe hinzu. Pipettieren Sie mehrmals, um die Probe mit den Antikörper-gebundenen Partikeln zu vermischen.

Als Nächstes überführen Sie die Röhrchen auf den Probendreher und führen das gleiche Programm zwei Stunden lang bei Raumtemperatur durch. Anschließend waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 500 Mikrolitern eines einmolarigen Tris-Hydrochlorid-Puffers. Mithilfe des magnetischen Gestells sind die Exosome nun an die magnetischen Kügelchen gebunden, um die Elektrode vorzubehandeln.

Verdünnen Sie zunächst die Stammlösungen der Sonde, Kaliumchlorid und des Ole-Monomers in destilliertem Wasser. Die 5'-biotinylierte DNA-Sonde ist spezifisch für GA-DH-mRNA. Mischen Sie die Monomer-Sondenlösung durch Vortexen.

Verwenden Sie ein 16-Sensor-Elektrodenarray, bei dem jede Einzelelektrode aus Arbeits-, Gegenelektrode und Referenzelektrode aus blankem Gold besteht. Platziere eine Kunststoffmulde auf dem Elektrodenarray, um eine Kreuzkontamination der Elektroden zu verhindern. Übertragen Sie 60 Mikroliter der Monomer-Probelösung auf die Oberfläche einer Goldelektrode, sodass die Arbeits-, Gegenelektrode und die Referenzelektrode von der Flüssigkeit bedeckt sind.

Wenden Sie ein zyklisches Rechteckwellen-Elektrikfeldprofil, bekannt als A-C-S-W-E-Feld, an, um ein monomeres Probeelektropolymerisiert darzustellen. Dies erzeugt eine leitfähige Polymerschicht auf der Elektrodenoberfläche. Spülen Sie den Sensor dreimal mit destilliertem Wasser und trocknen Sie ihn anschließend mit Stickstoffgas, um Flüssigkeit von der Oberfläche der Elektrode zu entfernen.

Nachdem die Elektrode mit der Capture-Sonde präinkubiert wurde, fügen Sie fünf Mikroliter einer einmikromolaren Lösung der Detektor-Sonde zu 495 Mikrolitern der Bead-Exosomen-Komplexlösung hinzu und mischen Sie anschließend durch Pipettieren. Die Sonde ist ein dreifach fluoresceinmarkierter DNA-Primer, der spezifisch für GA dh ist. Platzieren Sie ein vorcodiertes Elektrodenarray über einem Magnetarray, das aus 16 Magneten besteht und entlang der Arbeitselektroden des Sensors ausgerichtet ist.

Überführen Sie anschließend 60 Mikroliter der Bead-Exosomen-Lösung auf die Elektrodenoberfläche. Leiten Sie ein A-C-S-W-E-Feld für 20 Zyklen an. Die freigesetzte exosomale Fracht bindet sich an die Sonde auf der Elektrodenoberfläche.

Spülen Sie die Elektrodenoberfläche dreimal mit destilliertem Wasser, um ungebundene Analyten zu entfernen, und trocknen Sie die Elektrode anschließend mit Stickstoffgas. Bereiten Sie danach eine 1:1000-Verdünnung des mit HRP konjugierten Anti-Fluorescein-Antikörpers in PBS, das Caine enthält, vor. Geben Sie anschließend 60 Mikroliter der Antikörperverdünnung auf die Elektrodenoberfläche.

Wenden Sie das A-C-S-W-E-Feld auf die Elektrodenoberfläche an, um den anti-Fluorescein-HRP-Antikörper an die Detektorsonde zu konjugieren. Spülen Sie die Sensoroberfläche dreimal mit destilliertem Wasser, um überschüssigen Antikörper zu entfernen, und trocknen Sie die Elektrode anschließend mit Stickstoffgas. Geben Sie danach mit einer Mehrkanalpipette jeweils 60 Mikroliter TMB-Substrat auf jede Sensoroberfläche und messen Sie mithilfe eines elektrochemischen Potentiostaten den Elektrodenstrom bei minus 200 Millivolt über einen Zeitraum von 60 Sekunden.

Um die Tric-Auslese zu erhalten, wurde die Transmissionselektronenmikroskopie eingesetzt, um festzustellen, ob Exosome an die magnetischen Perlen gebunden waren. Die an die Perlen gebundenen Granula mit einer Größe von 70 bis 100 Nanometern entsprechen der bekannten Größe von Exosomen nach Lyse durch das elektrische Feld oder durch Detergens. In der Nähe der Perlen sind keine Exosome sichtbar.

GA DH-mRNA in Exosomen wurde durch einen atrischen Output nachgewiesen. Die Menge an vorhandenem GA DH nimmt über die Zeit ab, wie erwartet, nach der Lyse der Exosomen entweder durch das elektrische Feld oder durch Detergens, was auf eine Exposition gegenüber der außervesikulären Umgebung des Speichels hinweist. Efim wurde verwendet, um den exosomalen Gehalt im Serum und im Speichel von Mäusen zu messen, denen humanen Lungenkrebszellen injiziert worden waren, die einen humanen CD 63 GFP Exosomen-Marker produzieren.

Nach 20 Tagen wurden bei den mit Krebszellen injizierten Mäusen höhere Konzentrationen von CD63-GFP sowohl im Serum als auch im Speichel festgestellt, nicht jedoch bei den mit Kochsalzlösung injizierten Mäusen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Kügelchen nicht zu berühren, um eine ausreichende Menge Flüssigkeit zu entnehmen, die Elektrodenoberfläche gleichmäßig zu waschen und die Bereiche auf der Elektrode korrekt zu beladen. Diese Technologie, die EFIM-Technologie, bietet die entscheidende, bisher nicht erfüllte Möglichkeit, wie eine systemische Erkrankung, ein entferntes Organ, ihre Informationen freisetzen und in dieser Entität namens Exosomen messbar machen kann.

Wie sie in den Speichel gelangen, in unsere Mundhöhle, und in der Lage sind, die Exosome zu erfassen, diese molekularen Zielstrukturen freizusetzen und deren gleichzeitige Detektion bei schwerwiegenden Erkrankungen wie Diabetes, Pankreaskrebs oder anderen lebensbedrohlichen Störungen zu ermöglichen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Exosome schnell aus einer Körperflüssigkeit gewinnt, wie man die Fracht der Exosome freisetzt und wie man den Inhalt der Exosome mithilfe eines integrierten Elektrodensystems schnell analysiert.