Name: Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Erfahren Sie die effiziente Extraktion und Analyse von Exosomen aus Biofluiden mittels magnetischer Mikropartikel und elektrischer Felder. Diese Methode ermöglicht die schnelle elektrochemische Quantifizierung von RNA- und Proteingehalt für die Biomarkerentdeckung.

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Diese Arbeit wurde von der National Center for Research Resources und der National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health, durch Zuschuss UL1TR000124 (FW) unterstützt; die Felix &amp; Mildred Yip Stiftungsprofessur und die Barnes Familie Fonds (zu DTWW), dem National Institute of Dental und kraniofaziale Forschung der National Institutes of Health unter Preis Anzahl T90DE022734 (MT). Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

1. Magnetic Bead-basierten Exosom Extraction <ol><li> Pipettieren gut gemischte Lösung von 5 &amp; mgr; l Streptavidin-beschichteten magnetischen Mikropartikeln in 495 ul phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) -Puffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen, um die Perlen zu resuspendieren. Verwendung eines Magnetgestell Waschen und Resuspendieren der Kügelchen mit 500 ul PBS dreimal. Das Gestell ist eine Anordnung von Magneten auf der Seite einer Gehäuseeinheit, die die Probe-Mikrozentrifugenröhrchen halten kann. <ol><li> Für jede Waschanlage, lassen Sie uns zuerst die Rohre sitzen auf dem Rack für 1 min, und dann mit einem Pipettenspitze vorsichtig den Überstand Puffer ohne die Perlen zu stören. </li><li> Die Röhrchen auf einer regulären Zahnstange ohne Magnete an der Seite. Fügen Sie 500 ul PBS in die Rohre, und verwenden Sie die Pipette, um die Lösung und Perlen zusammen mischen. Dann legen Sie die Rohre wieder auf dem Magnetgestell wieder trennen Sie die Perlen aus der Lösung. </li><li> Führen Sie diese Entfernung der Puffer über Magnetisierung und Resuspension in PBS eininsgesamt dreimal. Dies führt eine erste Wasch der magnetischen Teilchen. </li></ol></li><li> Resuspendieren der Kügelchen in 490 &amp; mgr; l PBS-Puffer, mit dem Rohr auf dem nicht-magnetisierten Teil der Magnetgestell gestellt. Pipette 5 ul biotinylierten Maus-anti-Mensch-CD63-Antikörper mit 1,0 mg / ml Ausgangskonzentration in dem Gemisch von Perlen. Verwenden Sie die Pipette, um die Perlen und Antikörper in Lösung zu mischen. </li><li> Legen Sie die Reaktionsgefäße mit Perle und biotinyliertem Antikörper-Gemisch auf eine Probe-Rotator. Festlegen der Rotator Parametern für die Probe für reziproke Rotator Drehung bei 90 ° Neigung für 5 sec und Vibrieren bei 5ºC für 1 sec. Drehen der Probe-Perlen-Mischung Röhrchen bei diesen Parametern für 30 min bei RT. </li><li> Entfernen ungebundener Antikörper nach der Konjugation. <ol><li> Nach 30 Minuten Dreh bei RT, legen Sie die Rohre wieder in den Magnetträger für 5 min. </li><li> Führen Sie drei Wäschen von Perlen durch Entfernen der flüssigen Phase mit einer Mikropipette und wäscht mit 500 μ; L PBS. Nach dem dreifachen Waschen, resuspendieren die Perlen in 490 ul von Casein-PBS und auf den unmagnetisierten Teil des Racks. </li></ol></li><li> Exosom Extraktion mit Antikörper-beschichteten Perlen. <ol><li> Beschriften Sie jedes Rohr mit gezielten Proben-ID. Pipettieren Sie 10 ul-Probe von Serum oder Speichel in das Reaktionsgefäß. Verwenden Sie die Pipette, um die Probe und magnetischen Beads durch mehrmaliges Pipettieren mischen. </li><li> Die Röhrchen mit der Probe und anti-Mensch-CD63-Antikörper-Perlen auf Rotator und drehen für 2 h bei RT. Verwenden Sie die gleichen Rotator Parameter wie in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Nach 2 h der Probe drehen, führen eine dreifache Wasch durch Magnetisieren getrennte Kügelchen aus der Lösung, Entfernung flüssiger Phase mit Mikropipette und Resuspendieren Perlen in 500 ul Tris-HCl-Puffer. Die erhaltenen Perlen sind jetzt auf die Exosomen gebunden und sind bereit für das elektrische Feld Release und Messung. </li></ol></li></ol> 2. Elektrisches Feld induzierte Freigegeben einnd Messung exosomalen Inhalt <ol><li> Erste Beschichtung von Elektroden mit GADPH Primer <ol><li> Anwenden eines Kunststoff auch eine Elektrodenanordnung, um eine Kreuzkontamination der einzelnen Elektroden zu verhindern. Für dieses Experiment wurde mit einem 16-Sensor-Elektrodenanordnung mit jeder Einheit Elektrode in der Anordnung, die aus einem Arbeits-, Gegen- und Bezugselektrode des nackten Gold. </li><li> Bereiten Sie eine Mischung aus Lager 100 nM DNA-Sonde, 0,3 M KCl und 10 mM Pyrrol durch Pipettieren Lager Reagenzien in ein Rohr mit hochreinem destilliertem Wasser. Gründlich mischen durch Vortexen. HINWEIS: Für diese Studie entspricht die DNA-Sonde so ausgewählt, daß der GAPDH Referenzgens, die bekanntlich innerhalb von Exosomen vorliegen. Die Sondensequenz verwendet wird: 5&#39;-Biotin-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 &#39;. Verwenden Sie diese Mischung auf alle Elektroden. </li><li> Pipette 60 ul der Monomer-DNA Sondenmischung auf der Oberfläche jeder Goldelektrode. Untersuchen der Elektroden zu gewährleisten, dass eine ausreichende Abdeckung der Arbeits, counter und Referenzelektroden durch die flüssige Mischung. </li><li> Electropolymerize Monomer-Sondenmischung, um eine leitende Polymerschicht auf der Elektrodenoberfläche durch Anlegen einer zyklischen Rechteck (CSW) elektrische Feldprofil an die Elektrodenoberfläche zu schaffen. Dieses elektrische Feld besteht in der Anwendung 350 mV für 9 sec und sofort die Umstellung auf 950 mV für 1 s. Wenden Sie dieses zyklischen Rechteckprofil an die Elektrode 10 Zyklen, für insgesamt 100 sec der angelegten elektrischen Feldes. </li><li> Spülen Sensoroberfläche 3 mal mit destilliertem Wasser und mit Stickstoffgas trocken um Flüssigkeit von der Oberfläche der Elektrode zu entfernen. Sicherzustellen, daß die Flüssigkeit ordnungsgemäß von der Elektrode entfernt. </li></ol></li><li> Exosom Güter Entladen <ol><li> Last 5 ul 1 uM eines Detektors Sonde in 495 &amp; mgr; l der Kügelchen Exosom Gemisches und mit einer Pipette mischen. HINWEIS: Der Fühler ist ein DNA-Primer-Sequenz an eine Fluorescein-Molekül am 3&#39;-Ende konjugiert. Der Detektor probe Sequenz für diese Untersuchung verwendet wird, entspricht dem GAPDH mRNA in Exosomen gefunden. Die Sequenz des Fluorescein konjugierten Detektorsonde: 5&#39;-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-Fluorescein-3 &#39;. </li><li> Pipette 60 ul der Sonde und sicken Exosom Mischung auf eine Goldelektrode mit einer Magnetanordnung darunter. Diese Magnetanordnung besteht aus sechzehn 2,54 mm Durchmesser Neodymmagneten ausgerichtet, um den Arbeitselektroden des Sensors entsprechen. 2A veranschaulicht die Anordnung der Magnete und sicken exosome Lösung. </li><li> Sobald Probe auf der Elektrodenoberfläche geladen wird, gelten 20 Zyklen des CSW elektrisches Feld mit 9 sec bei -300 mV und 1 s bei +200 mV (200 s insgesamt). Die exosomalen Ladung, die freigesetzt wird, wird an die Primer auf der Oberfläche der Elektrode zu hybridisieren. Wenn Oberflächenmarker der Exosom sind Gegenstand der Untersuchung, überspringen Sie diesen Teil des Experiments. 2B veranschaulicht diesen Prozess. </li> &lt;li&gt; Wash-Off die ungebundenen Analyten auf der Elektrodenoberfläche durch dreifache Spülung der Elektrodenoberfläche mit destilliertem Wasser. Trocknen Sie die Elektrode mit Stickstoffgas. </li></ol></li><li> Reporter Antikörper und Readout <ol><li> Man gibt 60 &amp; mgr; l von 150 Einheiten / ml Anti-Fluorescein-Antikörper, konjugiert an Meerrettichperoxidase (HRP in 1: 1000 Verdünnung) in Casein / PBS verdünnt. </li><li> Verwenden eines ein elektrisches Feld angetrieben Konjugation an Komplex Anti-Fluorescein-HRP zu der Sonde Sandwich. Anwenden -200 mV für 1 Sekunde und +500 mV für 1 Sekunde für 5 Zyklen auf die Elektrodenoberfläche. 2A zeigt die Fänger- und Detektorsonde-Komplexe sowohl für ein Protein und Nukleinsäure-System. </li><li> Dreibettzimmer Waschsensoroberfläche mit destilliertem Wasser und mit Stickstoffgas trocken. </li><li> Nach dem Abwaschen von ungebundenem überschüssigem anti-Fluorescein-Antikörper, mit 60 &amp; mgr; l 3,3 &#39;, 5,5&#39;-Tetramethylbenzidin (TMB) -Substrat. Laden Sie dieses Substrat auf jede Sensorfläche mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Führen amperometrischen Auslesen des Stroms durch Messen des Elektrodenstroms bei -200 mV für 60 sec unter Verwendung einer elektro Potentiostat fähig gleichzeitige Messung von 16 Kanälen. 2C ist ein Beispiel der Stromverlauf während des Auslesens. </li></ol></li></ol><img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Komponenten Efirm Methode. (A) Verfahren zur Extraktion von Exosomen aus Biofluid mit anti-human CD63 beschichteten magnetischen Mikropartikeln und dann Entladen Exosom Fracht mit zyklischen Rechtecksignale an das Partikel-Exosom angewendet. (B) Schema der Elektrode Biosensor zum Nachweis von RNA / DNA / Protein-Targets von der frei Exosom verwendet. (C) repräsentatives Beispiel für amperometrische Auslesen aus dem Efirm Methodik, wo größere Stromstärke entspricht to höherer Gehalte eines Biomoleküls. Diese Zahl ist von Wei et al. 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52439/52439fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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</ol>

David Wong ist Mitbegründer RNAmeTRIX Inc., ein Molekulardiagnostik-Unternehmen. PeriRx LLC lizenziert geistigen Eigenschaften, die zur molekularen Diagnostik von RNAmeTRIX. David Wong ist Berater PeriRx.

Wie die Ergebnisse zeigen, sind anti-human CD63-beschichteten magnetischen Nanopartikel in der Lage, spezifisch einzufangen kleine Partikel, die eine Größe im Bereich von 70 bis 100 nm haben. Diese erfassten Teilchens entspricht der zuvor beobachteten Profil Exosomen. Weiterhin ist die Verwendung von Niederspannungs CSW nach der Abscheidung der Teilchen dargestellt, um sie von der Perlenoberfläche zu entfernen und verursachen DNA Abbauprofile ähnlich zu derjenigen eines herkömmlichen Lysepuffer basiertes Verfahren zur L...

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>. The disclosures were updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52439">Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)</a>.

Errata: Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosom Forschung ist ein aufstrebendes Gebiet der Untersuchung, die Lipid-Mikrobläschen, die RNA-1, 2-DNA und Protein 3 Fracht transportieren sucht. Frühere Untersuchungen von Exosom Biologie haben, um die Identifizierung von Exosomen in Körperflüssigkeiten wie Blut 4, 5 Urin, Muttermilch 6, und Speichel 7 geführt. Studien haben gezeigt, dass Exosomen spielen eine Rolle bei verschiedenen zellulären Wege, fernmedi Kommunikation zwischen verschiedenen Systemen des Körpers 8. Aufgrund der Rolle in Exosomen der interzellulären Kommunikation spielt, wird die Hypothese aufgestellt, dass sie Biomolekül Targets (Protein, RNA und DNA) mit Krankheitszuständen korreliert verpacken. In vitro 3 und Tiermodellstudien 9 angezeigt, um diese Hypothese zu bestätigen. Bei der Untersuchung exosomalen Inhalte für die Entdeckung neuer Biomarker, ist es notwendig, eine Methode für die selektive Exosom Isolation von Körperflüssigkeiten zu entwickeln, induzierte expulsiauf der Ladung von Exosomen und Quantifizierung von Exosom Biomolekülen. In dem Umfang der vorliegenden Arbeit wird Exosomen als eine Struktur mit einem Durchmesser von ca. 70-100 nm und besitzen Oberflächenmarker CD63 definiert werden. Forscher in der Regel zunächst zu reinigen Exosomen durch Ultrazentrifugation 10 und dann exosomalen Inhalte durch den Einsatz von Lysepuffer Sätze zu verarbeiten. Usage Lysepuffer Verfahren erfordert Inkubationszeiten reichen von Minuten bis Stunden. Dieser Vorgang kann möglicherweise Schaden zufügen Exosom Ladung und führen zu einer Verschlechterung zu probieren. B. Speichel exosome RNA über Lysepuffer in die umgebende extrazelluläre Umgebung freigesetzt besitzt eine Halbwertszeit von weniger als 1 min, wodurch Messung exosomalen RNA post Lysepuffer eine besonders schwierige Aufgabe, ohne den Zusatz von Stabilisierungsreagenzien 11. Das compoundierte Wirkung der Zugabe verschiedener Reagenzien zur Lyse und Stabilisierung können Mittel, die erschweren einzuführen und stören die analysis von exosomalen Inhalt. Eine alternative Vorgehensweise kann hilfreich für die schnelle Entladung exosomalen Inhalt und sicher die Erhaltung der Ladung zur Charakterisierung sein. In dieser Arbeit schlagen wir die Verwendung eines nicht-gleichmäßiges elektrisches Feld für die Freigabe exosomalen Inhalt. Elektrofelder bekannt, um die Fähigkeit zu polarisieren und stören die Lipid-Doppelschicht, die Zellmembranen bildet durchzuführen. Unsere experimentelle Arbeit untersucht Nutzung ungleichmäßige zyklischen Rechtecksignale (CSW) zur Unterbrechung der microvesicle Struktur der Exosomen und Freigabe geführt Fracht. Bei dieser Methode werden Spannungen in der mehrere hundert Millivolt-Bereich, was bedeutet, dass die meisten Biomoleküle nicht gestört werden. Wir zeigen, dass die Verwendung einer zyklischen Rechteckwellen in der Lage ist, um die Freisetzung von Speichel exosome mRNA-Gehalt in das umgebende Fluidumgebung zu betätigen. Diese Version von exosomalen Inhalt ist nahtlos mit einem Elektrodensystem, die verwendet werden können, um die Biomarker-Expressionsniveaus zu quantifizieren integriert 12,13. Dieses vorgeschlagene Verfahren ermöglicht eine schnelle, empfindliche und Lysepuffer kostenlose Analyse Exosom Inhalt. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52439/52439fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Übersicht über Efirm-Workflow.. Die Efirm Verfahren wird im Großen und Ganzen in die drei Hauptphasen, die zur Reinigung und Analyse von Exosomen notwendig sind geteilt. Das CSW auf Basis exosomalen Content-Release und Analyseverfahren wird in Verbindung mit CD63-spezifischen magnetischen Mikrokügelchen für Exosom Isolierung verwendet. Diese CD63-Affinität Perlen ermöglichen die selektive Isolierung von Exosomen aus Speichelproben (und andere Körperflüssigkeiten). Nach der Inkubation und Gewinnung von Exosomen mit den magnetisierten Kügelchen werden die Perlen mit dem elektrochemischen Sensor-System für die CSW basierte Content-Release und Analyse Teil des Experiments migriert. Abbildung 1 gibt einen Überblick über die Arbeitfließt der Efirm Verfahren.

<table><tbody><tr><td>Helios 16-Kanal-Lesesystem mit Chip-Schnittstelle&nbsp;</td><td>Genfluidik, USA</td><td>&nbsp; RS-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>16x Sensor Chip, Bare Gold, Packung mit 5 Chips</td><td>Genefluidics, USA</td><td>SC1000-16X-B</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylierter anti-humaner CD63 Antikörper</td><td>Ancell, USA</td><td>215-030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Invitrogen, USA</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Neodynium Magnetics (1/10" Durchmesser x 1/32" dick)</td><td>K& J Magnetics, USA</td><td>DH101</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Distilled</td><td>Water Life Technologies, USA</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Mettler Toldeo 3 M KCl Solution</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1911512</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>W338605-100g</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments</td><td>Roche, Deutschland</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;,5,5&prime;-Tetramethylbenzidinsubstrat (TMB/H2O2, geringe Aktivität)</td><td>Neogen, USA</td><td>330175</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Kochsalzlösung</td><td>Life Technologies, USA</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Casein/PBS</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>37532</td><td></td></tr></tbody></table>

der nachweis von exosomalen biomarker von electric field-induzierte freisetzung und messung (efirm)

Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM)

Exosomen sind mikrovesikulären Strukturen, die eine Vermittlerrolle in der interzellulären Kommunikation spielen. Es ist von Interesse, um die innere Ladung von Exosomen studieren, um festzustellen, ob sie Krankheit diskriminierenden Biomarker tragen. Zur Durchführung exosomalen Analyse ist es notwendig, ein Verfahren zur Extraktion und Analyse von Exosomen Ziel biofluids ohne Beschädigung der internen Inhalte zu entwickeln. Elektrisches Feld-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm) ist ein Verfahren zur spezifischen extra Exosomen aus biologischen Flüssigkeiten, Entladen ihre Ladung, und testen ihre internen RNA / Proteingehalt. Verwendung eines anti-human CD63 spezifische Antikörper magnetische Mikroteilchen werden Exosomen zuerst aus Biofluiden fällt. Nach der Extraktion, Niederspannungs-Elektro zyklischen Rechtecksignale (CSW) angewendet, um die Vesikelmembran stören und Fracht entladen. Der Inhalt der Exosom, mit DNA-Primer oder Antikörper auf einer Elektrodenoberfläche für qua immobilisierten hybridisiertenntification molekularer Inhalte. Die Efirm Methode ist für die Extraktion von Exosomen und Entladen von Fracht zur Analyse ohne Lysepuffer vorteilhaft. Dieses Verfahren ist in der Lage, die spezifische Detektion von beiden RNA und Protein Biomarker Ziele in der Exosomen. Efirm extrahiert Exosomen speziell auf ihre Oberflächenmarker basiert im Gegensatz zur Größe basierte Techniken. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Assay zeigen die Funktionalität des Verfahrens für die Exosom Erfassung und Analyse. Die Efirm Methode wurde die Analyse von 9 Mäusen mit menschlichen Lungenkrebs H640-Zellen injiziert (eine Zelllinie transfiziert, um die Exosom Marker menschlichen CD63-GFP exprimieren) um ihre exosome Profil gegen 11 Mäusen, die Kochsalzlösungskontrollen getestet exosomalen. Erhöhte exosomalen Biomarker (Referenz-Gen GAPDH und Proteinoberflächenmarker CD63 Menschen-GFP) gefunden für das H640 injizierten Mäusen in beiden Serum und Speichelproben. Außerdem saliva und Serumproben wurde gezeigt, dass die Linearität (R = 0,79) haben. Diese Ergebnisse lassen auf die Lebensfähigkeit der Speichel exosome Biomarker zum Nachweis von distalen Krankheiten.

Validierung Exosom Erfassung von Perlen Mit TEM Isolierung der Exosomen aus Speichel unter Verwendung von Anti-Mensch-CD63 magnetischen Kügelchen wurde folgender Extraktionsvorschrift unter Verwendung der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt. TEM zeigt magnetische Beads mit 70-100 nm Granulat unmittelbar benachbarten (siehe 3A und 3B), was mit der bekannten Profil der Exosomen. Keine 70-100 nm Granulat wurde für die magnetische...

Exosomen sind mikrovesikuläre Strukturen, die in Bioflüssigkeiten vorkommen und möglicherweise wichtige krankheitsdiskriminierende Biomarker tragen. Hier wird eine neuartige Methode verwendet, um Exosomen spezifisch zu extrahieren und die exosomale Fracht für beide RNA/Protein-Ziele nach dem Aufschluss von Exosomen mit ungleichmäßigen elektrischen zyklischen Rechteckwellen schnell zu testen.

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Exosomes are microvesicular structures that play a mediating role in intercellular communication. It is of interest to study the internal cargo of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Exosome effizient aus Körperflüssigkeiten zu isolieren, deren Fracht freizusetzen und diese schnell zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mithilfe magnetischer Mikropartikel, die mit Antikörpern gegen Exosomenmarker beschichtet sind, Exosome aus Körperflüssigkeiten angereichert werden. Anschließend werden die isolierten Exosome auf einer Elektrodenoberfläche immobilisiert. Danach werden die Exosome durch ein elektrisches Feld lysiert, und die enthaltene Fracht hybridisiert mit auf der Elektrodenoberfläche fixierten Sonden. Einem Reporter-Molekül wird ebenfalls an das System hybridisiert. Der letzte Schritt besteht darin, eine Substratlösung auf die Elektrodenoberfläche aufzutragen und anschließend die Messung durch Erfassung des elektrischen Stroms durchzuführen. Letztendlich dient die elektrochemische Strommessung dazu, die Menge an Nukleinsäure oder Proteingehalt in der Exosomenprobe nachzuweisen.Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber bestehenden Methoden wie der Ultrazentrifugation und dem Lysin-Puffer besteht darin, dass sie eine einfache und schnelle Methode zur Gewinnung und Analyse von Exosomeninhalten darstellt. Wir sind sehr begeistert von dieser Technologie, da sie uns erstmals ermöglicht, die von Organen bei Krankheit oder im Normalzustand über die Gefäße abgegebenen Informationen, die aus dem Ursprungsorgan stammen, in der Mundhöhle zu nutzen. Diese Technologie erlaubt es uns, diese Informationen einzufangen und die molekularen Inhalte freizusetzen, die wir gleichzeitig und flexibel detektieren können.Diese diskriminierende Information bezüglich der Erkrankung kann für Nutzer, die neu in dieser Methode sind, schwierig sein, da die Handhabung magnetischer Mikropartikel problematisch werden kann, wenn nicht sorgfältig vorgegangen wird. Darüber hinaus stellt die Anwendung elektrochemischer Methoden in der Analyse biologischer Proben für manche möglicherweise ein neuartiges Konzept dar. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das Handling magnetischer Mikropartikel und das elektrochemische Beladen schwer zu erlernen sind. Besondere Vorsicht ist erforderlich, wenn mit magnetischen Mikropartikeln umgegangen und diese auf Elektroden aufgebracht werden.Um die Resuspension zu beginnen, geben Sie eine Stammlösung, die 10 Mikrogramm pro Milliliter mit Streptavidin beschichtete magnetische Mikropartikel enthält, und fügen Sie fünf Mikroliter hinzu. Die Lösung wird einem Mikrozentrifugenröhrchen hinzugefügt, das 495 Mikroliter PBS enthält, um die Partikel zu waschen. Stellen Sie zunächst das Röhrchen für eine Minute auf einen Magnetrack und entfernen Sie vorsichtig den Puffer, ohne die Partikel zu stören. Überführen Sie das Reagenzglas anschließend in ein nicht-magnetisches Gestell. Geben Sie 500 µL PBS zu und pipettieren Sie zur Waschung der Partikel. Wiederholen Sie diesen Schritt insgesamt dreimal; nach der letzten Waschung erneut verwenden.Suspendieren Sie die Kügelchen in 490 µL PBS und geben Sie anschließend 5 µL biotinyliertes Maus-Anti-Human-CD63-Antikörper aus einer Stammlösung von 1 mg pro mL hinzu. Mischen Sie die Lösung durch Pipettieren, Programmieren eines Probendrehergeräts für eine reziproke Rotation von 90 Grad für fünf Sekunden und eine Vibration von fünf Grad für eine Sekunde. Stellen Sie die Röhrchen in den Probendreher und führen Sie das Programm 30 Minuten bei Raumtemperatur aus.Überführen Sie die Röhrchen anschließend für fünf Minuten auf den Magnetrack. Waschen Sie die Partikel dreimal mit jeweils 500 µL PBS und resuspendieren Sie sie danach in 490 µL PBS, das Caine enthält. Beschriften Sie ein Röhrchen mit der Probenkennung und geben Sie 10 µL der Probe hinzu. Pipettieren Sie mehrmals, um die Probe mit den Antikörper-gebundenen Partikeln zu vermischen.Als Nächstes überführen Sie die Röhrchen auf den Probendreher und führen das gleiche Programm zwei Stunden lang bei Raumtemperatur durch. Anschließend waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 500 Mikrolitern eines einmolarigen Tris-Hydrochlorid-Puffers. Mithilfe des magnetischen Gestells sind die Exosome nun an die magnetischen Kügelchen gebunden, um die Elektrode vorzubehandeln.Verdünnen Sie zunächst die Stammlösungen der Sonde, Kaliumchlorid und des Ole-Monomers in destilliertem Wasser. Die 5'-biotinylierte DNA-Sonde ist spezifisch für GA-DH-mRNA. Mischen Sie die Monomer-Sondenlösung durch Vortexen.Verwenden Sie ein 16-Sensor-Elektrodenarray, bei dem jede Einzelelektrode aus Arbeits-, Gegenelektrode und Referenzelektrode aus blankem Gold besteht. Platziere eine Kunststoffmulde auf dem Elektrodenarray, um eine Kreuzkontamination der Elektroden zu verhindern. Übertragen Sie 60 Mikroliter der Monomer-Probelösung auf die Oberfläche einer Goldelektrode, sodass die Arbeits-, Gegenelektrode und die Referenzelektrode von der Flüssigkeit bedeckt sind.Wenden Sie ein zyklisches Rechteckwellen-Elektrikfeldprofil, bekannt als A-C-S-W-E-Feld, an, um ein monomeres Probeelektropolymerisiert darzustellen. Dies erzeugt eine leitfähige Polymerschicht auf der Elektrodenoberfläche. Spülen Sie den Sensor dreimal mit destilliertem Wasser und trocknen Sie ihn anschließend mit Stickstoffgas, um Flüssigkeit von der Oberfläche der Elektrode zu entfernen.Nachdem die Elektrode mit der Capture-Sonde präinkubiert wurde, fügen Sie fünf Mikroliter einer einmikromolaren Lösung der Detektor-Sonde zu 495 Mikrolitern der Bead-Exosomen-Komplexlösung hinzu und mischen Sie anschließend durch Pipettieren. Die Sonde ist ein dreifach fluoresceinmarkierter DNA-Primer, der spezifisch für GA dh ist. Platzieren Sie ein vorcodiertes Elektrodenarray über einem Magnetarray, das aus 16 Magneten besteht und entlang der Arbeitselektroden des Sensors ausgerichtet ist.Überführen Sie anschließend 60 Mikroliter der Bead-Exosomen-Lösung auf die Elektrodenoberfläche. Leiten Sie ein A-C-S-W-E-Feld für 20 Zyklen an. Die freigesetzte exosomale Fracht bindet sich an die Sonde auf der Elektrodenoberfläche.Spülen Sie die Elektrodenoberfläche dreimal mit destilliertem Wasser, um ungebundene Analyten zu entfernen, und trocknen Sie die Elektrode anschließend mit Stickstoffgas. Bereiten Sie danach eine 1:1000-Verdünnung des mit HRP konjugierten Anti-Fluorescein-Antikörpers in PBS, das Caine enthält, vor. Geben Sie anschließend 60 Mikroliter der Antikörperverdünnung auf die Elektrodenoberfläche. Wenden Sie das A-C-S-W-E-Feld auf die Elektrodenoberfläche an, um den anti-Fluorescein-HRP-Antikörper an die Detektorsonde zu konjugieren. Spülen Sie die Sensoroberfläche dreimal mit destilliertem Wasser, um überschüssigen Antikörper zu entfernen, und trocknen Sie die Elektrode anschließend mit Stickstoffgas. Geben Sie danach mit einer Mehrkanalpipette jeweils 60 Mikroliter TMB-Substrat auf jede Sensoroberfläche und messen Sie mithilfe eines elektrochemischen Potentiostaten den Elektrodenstrom bei minus 200 Millivolt über einen Zeitraum von 60 Sekunden.Um die Tric-Auslese zu erhalten, wurde die Transmissionselektronenmikroskopie eingesetzt, um festzustellen, ob Exosome an die magnetischen Perlen gebunden waren. Die an die Perlen gebundenen Granula mit einer Größe von 70 bis 100 Nanometern entsprechen der bekannten Größe von Exosomen nach Lyse durch das elektrische Feld oder durch Detergens. In der Nähe der Perlen sind keine Exosome sichtbar.GA DH-mRNA in Exosomen wurde durch einen atrischen Output nachgewiesen. Die Menge an vorhandenem GA DH nimmt über die Zeit ab, wie erwartet, nach der Lyse der Exosomen entweder durch das elektrische Feld oder durch Detergens, was auf eine Exposition gegenüber der außervesikulären Umgebung des Speichels hinweist. Efim wurde verwendet, um den exosomalen Gehalt im Serum und im Speichel von Mäusen zu messen, denen humanen Lungenkrebszellen injiziert worden waren, die einen humanen CD 63 GFP Exosomen-Marker produzieren.Nach 20 Tagen wurden bei den mit Krebszellen injizierten Mäusen höhere Konzentrationen von CD63-GFP sowohl im Serum als auch im Speichel festgestellt, nicht jedoch bei den mit Kochsalzlösung injizierten Mäusen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Kügelchen nicht zu berühren, um eine ausreichende Menge Flüssigkeit zu entnehmen, die Elektrodenoberfläche gleichmäßig zu waschen und die Bereiche auf der Elektrode korrekt zu beladen. Diese Technologie, die EFIM-Technologie, bietet die entscheidende, bisher nicht erfüllte Möglichkeit, wie eine systemische Erkrankung, ein entferntes Organ, ihre Informationen freisetzen und in dieser Entität namens Exosomen messbar machen kann.Wie sie in den Speichel gelangen, in unsere Mundhöhle, und in der Lage sind, die Exosome zu erfassen, diese molekularen Zielstrukturen freizusetzen und deren gleichzeitige Detektion bei schwerwiegenden Erkrankungen wie Diabetes, Pankreaskrebs oder anderen lebensbedrohlichen Störungen zu ermöglichen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Exosome schnell aus einer Körperflüssigkeit gewinnt, wie man die Fracht der Exosome freisetzt und wie man den Inhalt der Exosome mithilfe eines integrierten Elektrodensystems schnell analysiert.

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Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Video demonstrieren wir ein Verfahren zur Isolierung von Exosomen aus Ziel-Bioflüssigkeiten mit magnetischen Mikrokügelchen. Das Verfahren ermöglicht die schnelle Erfassung von Exosomen, die für die nachgelagerte Analyse verwendet werden können.

Magnetbead-basierte Exosomenextraktion: Eine Technik zur Isolierung spezifischer Exosomen aus Bioflüssigkeiten

In diesem Artikel wird eine Methode zur Isolierung von Exosomen aus Vollblut und zur weiteren Analyse durch Nanopartikel-Tracking mit einem halbautomatischen Instrument vorgestellt. Die vorgestellte Technologie bietet eine äußerst empfindliche Methode zur Visualisierung und Analyse von Partikeln in flüssiger Suspension.

Eine innovative Methode zur Quantifizierung und Exosom Size Measurement

Extrazellulären Vesikeln spielen eine wichtige Rolle in physiologischen und pathologischen Prozessen, einschließlich Gerinnung, Immunreaktionen und Krebs oder als potentielle therapeutische Mittel bei der Arzneimittelabgabe oder der regenerativen Medizin. Dieses Protokoll stellt Methoden zur Quantifizierung und Charakterisierung von Größe isoliert und nicht-isoliert extrazellulären Vesikeln in verschiedenen Flüssigkeiten mit abstimmbaren Widerstandspulsmessung.

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Rasche Fluoreszenz basierende Charakterisierung der einzelnen extrazelluläre Vesikel im menschlichen Blut mit Nanopartikel-Tracking Analyse

Die klinische Übersetzung von exosominierten Biomarkern für kranke und bösartige Zellen wird durch das Fehlen schneller und präziser Quantifizierungsmethoden behindert. Dieser Bericht beschreibt den Einsatz von Mikroskop-Bildern mit geringer Vergrößerung im Dunkelfeld, um bestimmte exotische Subtypen in kleinen Volume-Serum-oder Plasmaproben zu quantifizieren.

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Wir zeigen, wie man ein neuartiges Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument verwendet, um die Größenverteilung und Gesamtpartikelkonzentration von extrazellulären Vesikeln abzuschätzen, die aus dem periigonadalen Fettgewebe der Maus und dem menschlichen Plasma isoliert wurden.

Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

In diesem Artikel wird eine neue Generation multiparametrischer Analyseplattformen mit erhöhtem Durchsatz für die Charakterisierung von extrazellulären Vesikel-Untergruppen vorgeschlagen. Die Methode basiert auf einer Kombination von gemultiplexten Biosensormethoden mit metrologischen und morphomechanischen Analysen durch Rasterkraftmikroskopie, gekoppelt mit Raman-Spektroskopie, um vesikuläre Ziele zu qualifizieren, die auf einem Microarray-Biochip gefangen sind.

Multimodale Analyseplattform auf einem Multiplex-Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie-Chip zur Analyse extrazellulärer Vesikel-Untergruppen

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll, das eine In-vitro-Bewertung der Häufigkeit von fluoreszenzmarkierten microRNAs ermöglicht, um die Dynamik der microRNA-Verpackung und des Exports in extrazelluläre Vesikel (EVs) zu untersuchen.

Verfolgung der miRNA-Freisetzung in extrazelluläre Vesikel mittels Durchflusszytometrie

Hier demonstrieren wir die Charakterisierungsmethode für extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus biologischen Flüssigkeiten wie Tränen und Speichel von menschlichen Probanden gewonnen wurden. Der bei dieser Methode verwendete Scanner ist in der Lage, den Phänotyp, die Größe und die Gesamtpartikelzahl von EVs aus 1 μl der Probe zu erkennen.

Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus biologischen Flüssigkeiten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Analyse einzelner kleiner extrazellulärer Vesikel (sEVs) mittels label-freier, oberflächenverstärkter Raman-Spektroskopie (SERS), was minimalinvasive Krankheitsdiagnostik und Bewertung von sEVs als therapeutische Verabreichungsmittel ermöglicht.

Erforschung der Anwendung oberflächenverstärkter Raman-Streuung-basierter Biosensierung einzelner sEVs in der Krankheitsdiagnose und -therapie

Erfahren Sie die effiziente Extraktion und Analyse von Exosomen aus Biofluiden mittels magnetischer Mikropartikel und elektrischer Felder. Diese Methode ermöglicht die schnelle elektrochemische Quantifizierung von RNA- und Proteingehalt für die Biomarkerentdeckung.

Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

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