Der Nachweis von exosomalen Biomarker von Electric Field-induzierte Freisetzung und Messung (Efirm)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Exosomen effizient aus Bioflüssigkeiten zu extrahieren, die Exosomenfracht auszustoßen und die Fracht schnell zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Exosomen aus Bioflüssigkeiten unter Verwendung magnetischer Mikropartikel mit Exosomenmarkern extrahiert werden, die auf Antikörper abzielen, und dann die extrahierten Exosomen auf eine Elektrodenoberfläche geladen werden. Als nächstes wird das Exosom mit Hilfe eines elektrischen Feldes geschleust und die Exosomenfracht mit Sonden auf der Oberfläche der Elektrode hybridisiert.

Ein Reportermolekül wird ebenfalls mit dem System hybridisiert. Der letzte Schritt besteht darin, eine Substratlösung auf die Elektrodenoberfläche aufzubringen und dann die Ablesung durch Messung des elektrischen Stroms zu erhalten. Letztendlich wird die elektrochemische Messung des Stroms verwendet, um die Menge eines Nukleinsäure- oder Proteingehalts in der Exosom-Probe anzuzeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber der bestehenden Methode, wie z. B. der Ultrazentrierung und dem Lysinpuffer, besteht darin, dass es sich um eine einfache, schnelle Methode zur Extraktion und Prüfung des Exosomengehalts handelt. Wir sind sehr begeistert von dieser Technologie, weil sie es uns zum ersten Mal ermöglicht, die Informationen zu nutzen, die von Organen in Krankheit oder Normalität abgegeben werden, die vom Ursprungsorgan durch das Gefäßsystem abgegeben werden und wenn sie in unsere Mundhöhle gelangen. Diese Technologie ermöglicht es uns, diese Informationen zu erfassen und den molekularen Inhalt, den wir gleichzeitig nachweisen können, flexibel freizusetzen.

Im Allgemeinen können Benutzer, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Verwendung von magnetischen Mikropartikeln schwierig sein kann, wenn man nicht vorsichtig ist. Darüber hinaus kann die Verwendung elektrochemischer Methoden in der biologischen Probenanalyse ein neues Paradigma für einige Proben sein. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die magnetische Mikropartikel- und Elektrobelastung schwer zu erlernen ist. Besondere Vorsicht ist geboten beim Umgang mit magnetischen Mikropartikeln und deren Verladung auf Elektroloden.

Um mit der Resuspendierung zu beginnen, wird eine Stammlösung, die 10 Mikrogramm pro Milliliter mit streptem Adin beschichtete magnetische Mikropartikel enthält, mit fünf Mikrolitern versetzt. Die Lösung für ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 495 Mikrolitern PBS zum Waschen der Kügelchen. Stellen Sie das Röhrchen zunächst für eine Minute auf ein Magnetgestell und entfernen Sie vorsichtig den Puffer, ohne die Kügelchen zu stören.

Übertragen Sie dann das Rohr auf ein nichtmagnetisches Rack. Fügen Sie 500 Mikroliter PBS und PET hinzu, um die Kügelchen zu waschen. Tun Sie dies insgesamt drei Mal nach dem letzten Waschvorgang.

Suspendieren Sie die Kügelchen in 490 Mikrolitern PBS und fügen Sie dann fünf Mikroliter biotinylierten Maus-Anti-Human-CD-63-Antikörper aus einer Stammlösung von einem Milligramm pro Milliliter hinzu. Mischen Sie die Lösung, indem Sie einen Probenrotator pipettieren, der fünf Sekunden lang um 90 Grad reziprok gedreht und eine Sekunde lang um fünf Grad vibriert wird. Legen Sie die Röhren in den Rotator und lassen Sie das Programm 30 Minuten lang bei Raumtemperatur laufen.

Übertragen Sie anschließend die Röhrchen für fünf Minuten in das Magnetgestell. Waschen Sie die Kügelchen dreimal mit 500 Mikrolitern PBS und resuspendieren Sie sie dann in 490 Mikrolitern PBS, das Cain enthält. Beschriften Sie ein Röhrchen mit der Probenidentifikation und fügen Sie dann mehrmals 10 Mikroliter der Probenpipette hinzu, um die Probe mit den Antikörper-konjugierten Kügelchen zu mischen.

Übertragen Sie anschließend die Röhrchen in den Probenrotator und führen Sie das gleiche Programm zwei Stunden lang bei Raumtemperatur durch. Waschen Sie die Perle dann dreimal mit 500 Mikrolitern eines einmolaren Trishydrochlorid-Puffers. Mit dem magnetisierten Gestell werden nun die Exosomen an die magnetisierten Kügelchen gebunden, um die Elektrode vorzupolieren.

Zuerst werden die Stammreagenzien der Sonde, des Kaliumchlorids und des Olmonomers in destilliertem Wasser verdünnt. Die fünf wichtigsten biotinylierten DNA-Sonden sind spezifisch für GA DH mRNA. Mischen Sie die Monomersondenlösung durch Vortexen.

Verwenden Sie ein Elektrodenarray mit 16 Sensoren, bei dem jede Elektrode aus funktionierenden Gegen- und Referenzelektroden besteht, die aus blankem Gold bestehen. Platzieren Sie eine Kunststoffvertiefung auf dem Elektrodenarray, um eine Kreuzkontamination der Elektroden zu verhindern. Übertragen Sie 60 Mikroliter der Monomersondenlösung auf die Oberfläche einer Goldelektrode, so dass der Arbeitszähler und die Referenzelektroden von der Flüssigkeit bedeckt sind.

Wenden Sie ein zyklisches Rechteckwellen-Elektrofeldprofil an, das als A-C-S-W-E-Feld bekannt ist, auf eine elektropolymerisierte Monomersonde. Dadurch entsteht eine leitende Polymerschicht auf der Elektrodenoberfläche. Spülen Sie den Sensor dreimal mit dem destillierten Wasser ab und trocknen Sie ihn dann mit Stickstoffgas, um Flüssigkeit von der Oberfläche der Elektrode zu entfernen.

Nachdem Sie die Elektrode mit der Einfangsonde vorcodiert haben, fügen Sie fünf Mikroliter einer einmikromolaren Lösung der Detektorsonde zu 495 Mikrolitern der Bead-Exosom-Komplexlösung hinzu und mischen Sie dann durch Pipettieren. Hier. Bei der Sonde handelt es sich um einen Fluorescein-konjugierten DNA-Primer mit drei Primzahlen, der spezifisch für GA dh ist. Platziert wird ein vorcodiertes Elektrodenarray über einem Magnetarray, das aus 16 Magneten besteht, die auf die Arbeitselektroden des Sensors ausgerichtet sind.

Übertragen Sie dann 60 Mikroliter der Bead-Exosom-Lösung auf die Elektrodenoberfläche. Wenden Sie das Feld A-C-S-W-E für 20 Zyklen an. Die freigesetzte exosomale Fracht hybridisiert mit der Sonde auf der Elektrodenoberfläche.

Spülen Sie die Elektrodenoberfläche dreimal mit destilliertem Wasser ab, um ungebundene Analyten zu entfernen, und ziehen Sie dann die Elektrode mit Stickstoffgas heraus. Als nächstes führen Sie eine Verdünnung von 1 bis 1000 des antifluorescein HRP-konjugierten Antikörpers in PBS durch, das Cain enthält. Geben Sie dann 60 Mikroliter der Antikörperverdünnung auf die Elektrodenoberfläche.

Wenden Sie das A-C-S-W-E-Feld an die Elektrodenoberfläche an, um den Anti-Fluorescein-HRP-Antikörper an die Detektorsonde zu konjugieren. Spülen Sie die Sensoroberfläche dreimal mit destilliertem Wasser ab, um überschüssige Antikörper zu entfernen, und ziehen Sie dann die Elektrode mit Stickstoffgas heraus. Laden Sie anschließend 60 Mikroliter TMB-Substrat mit einer Mehrkanalpipette auf jede Sensoroberfläche, indem Sie eine elektrochemische Potentialstat verwenden und den Elektrodenstrom 60 Sekunden lang bei minus 200 Millivolt messen.

Um die tric-Auslesung zu erhalten, wurde die Transmissionselektronenmikroskopie verwendet, um festzustellen, ob Exosomen an die magnetischen Kügelchen gebunden sind. Die 70 bis 100 Nanometer großen Granulate, die an die Kügelchen gebunden sind, stimmen mit der bekannten Größe der Exosomen bei der Lyse durch das elektrische Feld oder Detergens überein. In der Nähe der Kügelchen sind keine Exosomen zu erkennen.

GA DH mRNA in Exosomen wurde durch atric readout nachgewiesen. Die Menge an GA DH nimmt im Laufe der Zeit wie erwartet nach der Exosomenlyse entweder durch das elektrische Feld oder durch Detergens ab, was auf eine Exposition gegenüber der extravesikulären Umgebung des Speichels hinweist. Efim wurde verwendet, um den exosomalen Gehalt des Serums und des Speichels von Mäusen zu messen, denen menschliche Lungenkrebszellen injiziert wurden, wobei ein humaner CD 63 GFP Exo Somal-Marker produziert wurde.

Nach 20 Tagen wurden sowohl im Serum als auch in den Sali der Mäuse, denen die Krebszellen injiziert wurden, höhere Konzentrationen von CD 63 GFP gefunden, nicht jedoch bei den Mäusen, die mit Kochsalzlösung injiziert wurden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Kügelchen nicht zu berühren, um beim Waschen der Kügelchen eine ausreichende Menge Flüssigkeit herauszuholen, die Elektrodenoberfläche gleichmäßig zu waschen und die Bereiche auf der Elektrode richtig zu belasten. Diese Technologie, diese ehem-Technologie, lieferte die entscheidende unerfüllte Fähigkeit, wie eine systemische Krankheit, ein distales Organ, ihre Informationen abgeben und sie in dieser Entität namens Exosomen berechnen kann.

Wie sie in den Speichel und in unsere Mundhöhle gelangen und in der Lage sind, die Exosomen einzufangen, diese molekularen Ziele freizusetzen und gleichzeitig die Erkennung von bedrohlichen Krankheiten wie Diabetes, Bauchspeicheldrüsenkrebs oder anderen lebensbedrohlichen Erkrankungen zu ermöglichen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man schnell Exosomen aus einer Bioflüssigkeit extrahiert, wie man die Fracht der Exosomen entlädt und wie man den Inhalt der Exosomen mit einem integrierten Elektrodensystem schnell analysiert.