Name: Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur mechanischen Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen zur Untersuchung von Hämostase und Wundheilung. Dieses Modell ermöglicht Echtzeit-Mikroskopie von Entzündung und Gefäßreparatur.

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Die Autoren danken Dr. Stephen Wilson und Dr. Lisa Wilsbacher für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wurde teilweise von NIH HL054737 unterstützt.

HINWEIS: Verfahren mit Zebrafisch wurden von UCSF Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Herstellung der Werkzeuge <ol><li> Legen Minutien Stift in ein Stifthalter und klemmen Sie den Stift. </li><li> Mit feiner Spitze Pinzette vorsichtig biegen Sie die Spitze des Stiftes, um einen leichten Haken erstellen. </li><li> Für Bearbeitung und Stabilisierung des Embryos während Verletzungen, biegen Sie das Ende einer 28 Gauge ½ Zoll-Nadel auf einer Insulinspritze mit Spitzzange montiert. </li></ol> 2. Herstellung von Zebrafischembryonen für Verletzungen <ol><li> Richten Sie Zebrafisch Brutpaare und sammeln Eier im Eier Wasser (60ug / ml Aquarium Salze), wie zuvor 22 gezeigt. </li><li> Fügen 0,003% N-Phenylthioharnstoff (PTU) mit dem Ei Wasser, wenn die Embryonen etwa 8 Stunden nach der Befruchtung (HPF) zu Melanisierung verhindern. </li><li> Dechorionate 2 Tage nach der Befruchtung (dpf) Embryonen vor dem Experiment mit feiner Spitze Pinzette. <br/&gt; Hinweis: Die Embryonen können jederzeit verletzt, nachdem Kreislauf beginnt werden. Die hier präsentierten Daten sind für 2 dpf Embryonen, aber die Technik ist erfolgreich in Embryonen bis 5 dpf aufgebracht. </li><li> Anesthetize die Embryonen mit 0,02% gepuffert 3-Aminobenzoesäure (Tricaine) ca. 10 min vor Manipulationen. </li></ol> 3. Mechanische Vessel Verletzung von Embryonen <ol><li> Übertragen narkotisierten Embryonen auf eine Depression gleiten auf einem Seziertisch Stereomikroskop mit einer Transferpipette. </li><li> Mit dem kurzen flachen Seite der Spritzennadel, um den Embryo mit der dominanten Hand zu manipulieren, positionieren Sie den Embryo auf die Seite mit der Bauchseite abgewandten Nadel. </li><li> Positionieren Sie die Minutien Stift mit der Spitze zeigte direkt auf der Bauchseite des Fisches hinter dem urogenitalen Öffnung. Positionieren Sie den Pin Minutien in einem leichten Winkel, so dass die gebogene Spitze ist in der Lage, durch die Periderm direkt in die Schwanzvene (Abbildung 1 &lt;bohren/ Strong&gt;). </li><li> Mit der Spritzennadel, um den Embryo zu manipulieren, durchbohren die Schwanzvene mit der Minutien Stift durch Antippen des Embryos in den Stift, um etwas haken Sie den Stift in die Vene. </li><li> Mit der Spritzennadel, ziehen Sie den Embryo von der Minutien Stift einen kleinen Riss im Behälter zu schaffen. ANMERKUNG: Eine erfolgreiche Verletzung führt zur sofortigen Blutungen aus der Vene führen. </li></ol> 4. Analyse der Blutstillung <ol><li> Wählen Sie nur Embryonen mit sichtbar zirkulierenden Blutzellen für dieses Verfahren. </li><li> Bereiten Sie den Timer, sobald die Minutien Stift aus dem Behälter gezogen beginnen. </li><li> Den Timer zu starten, sobald der Blutverlust aus der Wunde sichtbar gemacht werden. Wenn Blutverlust aus der Wunde nicht mehr, stoppen Sie die Zeit und notieren Gesamtzeit als Blutungszeit. Wenn die Koagulation inhibiert wird, nimmt die Zeit auf, um, wenn es nicht mehr sichtbar zirkulierenden Blutzellen. </li></ol> 5. Analyse der Wundheilung <ol><li> Über post-Verletzungen Tiere auf dem Glasboden Bildgebung Gerichte für die Mikroskopie. </li><li> Entfernen Sie die Mehrheit der Eier Wasser. </li><li> Decken Sie die Embryonen in 0,3 bis 1,2% niedrig schmelzender Agarose in Ei Wasser gelöst, um zwischen 42 und 45 ° C erwärmt und mit 0,02% Tricaine ergänzt. </li><li> Position Embryonen auf ihren Seiten mit einer Pinzette. </li><li> Nachdem die Agarose kühlt, füllen Sie die Schale mit 0,02% Tricaine in Ei Wasser. </li><li> Erwerben Sie Bilder mit Hellfeld, Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie. </li><li> Entfernen Embryo aus der Agarose mit einer Pinzette und Transfer zurück zum Ei Wasser. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Zebrafische wurden erfolgreich als ein Modell für die verschiedenen Arten von Wunden einschließlich Laserbeschädigung 13-15, Laser-induzierte Thrombose 16 und epithelialen Verwundung 10 verwendet. Wir berichten über ein Verfahren zur mechanischen Verwundung, die einfach auszuführen ist und erzeugt einen kontrollierten Verletzungen in einem in vivo-Modell, das sehr gut für Echtzeit-Mikroskopie ist. Schädigung führt zu einem schnellen und messbaren hämostatische Antwort u...

Zebrafische wurden ausgiebig verwendet, um eine Vielzahl von Themen in der Gefäßbiologie zu studieren, einschließlich der Gefäßentwicklung, der Angiogenese und der hämatopoetischen Entwicklung und Pathologie1-3. Die Embryonen entwickeln 1 Tag nach der Befruchtung (dpf) einen funktionsfähigen Kreislauf sowie Leukozyten und andere Bestandteile des angeborenen Immunsystems (dpf) 1,4,5. Die Konservierung der Entzündungs- und Leukozytenreaktion auf Verletzungen hat den Zebrafischembryo zu einem informativen Modell für so unterschiedliche Entzündungsprozesse wie tuberkulöse Infektionen, Enterokolitis und Geweberegeneration gemacht6-9. Zebrafischembryonen wurden verwendet, um verletzungsbedingte Entzündungen zu untersuchen, insbesondere im Zusammenhang mit epithelialen Wunden und der neutrophilen Reaktion10,11. Eine Schädigung des Embryos führt zu einer hochkonservierten zellulären Reaktion der Zellen an der Verletzungsstelle und der angeborenen Immunzellen, die rekrutiert werden, um auf die Verletzung zu reagieren und deren Auflösung zu regulieren11,12. Andere Verletzungsmodelle haben fokussierte Laserpulse verwendet, um die Schädigung räumlich auf bestimmte Zelltypen wie Neuronen, Muskelzellen und Kardiomyozyten zu lokalisieren13-15. 
Zebrafischembryonen wurden als Modell verwendet, um Blutstillung und Thrombose unter Bedingungen pharmakologischer und genetischer Manipulation zu untersuchen, wobei sowohl mechanische als auch laserinduzierte Thrombusbildung verwendet wurden16-19. Komponenten der Gerinnungskaskade scheinen gut konserviert zu sein, und Transgene haben detaillierte Studien der Thrombozyten- und Fibringlagerung an der Gerinnungsstelle ermöglicht17,20,21. Das in dieser Arbeit vorgestellte Verfahren ergänzt diese Methoden, indem es ein System zur Untersuchung mechanischer Gefäßverletzungen bereitstellt, die zu einem Gefäßbruch, zur Thrombusbildung und -auflösung sowie zur Gefäßreparatur führen.

<table><tbody><tr><td>Minutia Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>Spitzendurchmesser 0,0125 mm, Stabdurchmesser 0,1 mm</td></tr><tr><td>Stifthalter</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Fine Tip Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Glass Depression Slide</td><td>Aquatic Eco-Systems</td><td>M30</td><td></td></tr><tr><td>Niedrigschmelzende Agarose</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>50081</td><td>Vorgeheizt auf 42 & ordm; C</td></tr><tr><td>N-Phenylthioharnstoff (PTU)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-Aminobenzoesäure (Tricain)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Hirudin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H7016</td><td></td></tr><tr><td>Glasboden-Bildgebungsschüsseln</td><td>Mattek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Präpariermikroskop</td><td>Olympus</td><td>SZH10</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>Aquarium Salze</td><td>Instant Ocean</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin Spritze mit 28,5 G Nadel</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td>329461</tr></tbody></table>

mechanische gefäßverletzung in zebrafischembryonen

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafischembryonen (Danio rerio) haben sich als leistungsfähiges Modell für die Untersuchung einer Vielzahl von Entwicklungs- und Krankheitsprozessen erwiesen. Die äußere Entwicklung und die optische Transparenz machen diese Embryonen besonders zugänglich für die Mikroskopie, und es stehen zahlreiche transgene Linien zur Verfügung, die bestimmte Zelltypen mit fluoreszierenden Proteinen markieren, was den Zebrafischembryo zu einem idealen System macht, um die Interaktion von vaskulären, hämatopoetischen und anderen Zelltypen während der Verletzung und Reparatur in vivo sichtbar zu machen. Die Vorwärts- und Rückwärtsgenetik beim Zebrafisch ist gut entwickelt, und pharmakologische Manipulation ist möglich. Wir beschreiben ein mechanisches Gefäßverletzungsmodell unter Verwendung von Mikromanipulationstechniken, das mehrere dieser Merkmale ausnutzt, um Reaktionen auf Gefäßverletzungen, einschließlich Blutstillung und Blutgefäßreparatur, zu untersuchen. Mit einer Kombination aus Video- und Zeitraffermikroskopie zeigen wir, dass diese Methode der Gefäßverletzung zu messbaren und reproduzierbaren Reaktionen während der Blutstillung und Wundheilung führt. Diese Methode bietet ein System, um Gefäßverletzungen und -reparaturen im Detail in einem ganzen Tiermodell zu untersuchen.

Mechanische Gefäßverletzung wurde am 2. dpf Embryonen (- C 2A) durchgeführt. Schädigung führt zu einer schnellen und zuverlässigen Koagulation Reaktion wie durch die Zeit zur Beendigung der Blutung (2D) gemessen. Um zu bestimmen, ob oder ob nicht Unterschiede in der Gerinnungsreaktion gemessen werden konnte, das Antikoagulans Hirudin wurde den Embryonen durch Injektion in die Kanal Cuviers unmittelbar vor der Verletzung (5-10 nl von 1 Einheit pro ul Hirudin gelöst in Wasser) verabreicht...

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer mechanischen Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen. Dieses Verletzungsmodell bietet eine Plattform für die Untersuchung von Blutstillung, verletzungsbedingten Entzündungen und Wundheilung in einem Organismus, der sich ideal für die Echtzeitmikroskopie eignet.

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Das allgemeine Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, eine mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen herbeizuführen. Dies wird erreicht, indem man die Coddle-Vene des Zebrafischembryos mit einer Minutiennadel durchsticht. Anschließend wird die Blutstillung bewertet, indem die Zeitspanne gemessen wird, während der Blut aktiv aus der Wunde austritt.Anschließend wird die Zeitraffer-Mikroskopie durchgeführt, um Aspekte der Wundheilung wie die Reparatur von Gefäßen sichtbar zu machen. Die Ergebnisse zeigen, dass eine mechanische Gefäßverletzung an Zebrafischembryonen verwendet werden kann, um Aspekte der Hämostase und der Wundreparatur, wie Blutungszeiten und die Zeit bis zur Wiederherstellung des Blutflusses, reproduzierbar zu messen. Der Hauptvorteil dieser Methode im Vergleich zu Mausmodellen und anderen Standardverletzungsmodellen liegt darin, dass an Zebrafischembryonen Entzündung, Hämostase und Reparatur mithilfe der Echtzeit-Mikroskopie leicht sichtbar gemacht werden können.Beginnen Sie damit, einen Minutiennadel in einen Nadelschaft einzuführen und die Nadel mit feinen Pinzetten zu fixieren. Biegen Sie vorsichtig die Spitze der Nadel, um einen leichten Haken zu erzeugen, mit dem das Embryo während der Verletzung manipuliert und stabilisiert werden kann. Verwenden Sie eine Spitzzange, um das Ende einer 28-Gauge-Nadel mit einer halben Zoll Länge, die an einer Insulinspritze befestigt ist, zu biegen.Bereiten Sie als Nächstes Zebrafischembryonen vor, indem Sie Zuchtpaare zusammenstellen und Eier in Ei-Wasser sammeln, wie zuvor gezeigt. Wenn die Embryonen acht bis 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) erreicht haben, geben Sie PTU zum Ei-Wasser hinzu, um die Melaninbildung ab dem zweiten Tag nach der Befruchtung (DPF) zu verhindern. Entfernen Sie mithilfe feiner Pinzette die Chorionhülle der Embryonen und betäuben Sie diese mit einer Endkonzentration von 0,02 % gepuffertem Tricain, um embryonale Blutgefäße mechanisch zu verletzen.Verwenden Sie eine Transferpipette, um anästhesierte Embryonen auf einen Vertiefungsträger zu geben. Legen Sie unter dem Stereomikroskop die kurze, flache Seite einer Spritzenkanüle in die dominante Hand und positionieren Sie den Embryo seitlich, wobei die ventrale Seite von der Kanüle abgewandt ist. Positionieren Sie nun die Feinnadelnadel so, dass ihre Spitze direkt hinter der urogenitalen Öffnung an der ventralen Oberfläche des Fisches anliegt.Halten Sie es in einem leichten Winkel, sodass die gebogene Spitze direkt durch die Periderm in die Coddle-Vene eindringen kann. Verwenden Sie dann die Spritzennadel, um den Embryo zu manipulieren. Stechen Sie mit der Feinnadel in die Coddle-Vene, indem Sie den Embryo leicht gegen die Nadel tippen, um die Nadel mit Hilfe der Spritzennadel leicht in die Vene einzuhaken.Ziehen Sie den Embryo von der Minutiennadel weg, um eine kleine Einrischung im Gefäß zu erzeugen. Eine erfolgreiche Verletzung führt zu sofortigem Bluten aus der Vene. Wählen Sie für dieses Verfahren nur Embryonen mit sichtbar zirkulierenden Blutzellen aus.Wenn der Feinmechanikpin an Ort und Stelle ist, ziehen Sie ihn aus dem Gefäß heraus, und sobald Blutverlust aus der Wunde sichtbar ist, starten Sie eine Stoppuhr. Wenn der Blutverlust aus der Wunde aufhört, stoppen Sie die Stoppuhr und notieren Sie die Gesamtzeit als Blutungszeit; falls die Gerinnung gehemmt ist, notieren Sie die Zeit, zu der keine zirkulierenden Zellen mehr sichtbar sind. Überführen Sie die Tiere nach der Verletzung in Imaging-Schalen mit Glasboden für die Mikroskopie, entfernen Sie den Großteil des Ei-Wassers und ersetzen Sie es durch 0,3 bis 1,2 % Low-Melting-Agarose, ergänzt mit 0,02 % Trica und erhitzt auf 42 bis 45 Grad Celsius. Bedecken Sie die Embryonen.Verwenden Sie eine Pinzette, um die Embryonen seitlich zu positionieren. Nachdem das Aro abgekühlt ist, füllen Sie die Petrischale mit 0,02 % Trica in Ei-Wasser. Verwenden Sie Hellfeld-Epi-Fluoreszenz- oder konfokale Mikroskopie, um die Bilder nach der Aufnahme zu erfassen.Verwenden Sie eine Pinzette, um die Embryonen zurück in das Ei-Wasser zu überführen. Dieses Video zeigt eine mechanische Gefäßverletzung, die an einem 2D-PF-Embryo durchgeführt wurde. Aktiver Blutverlust ist zu erkennen, gefolgt von einer Beendigung der Blutung; die Verletzung führt zu einer schnellen und zuverlässigen Gerinnungsreaktion, gemessen an der Zeit bis zum Stillstand der Blutung, um festzustellen, ob Unterschiede in der Gerinnungsreaktion nachweisbar sind.Das Antikoagulans Odin wurde den Embryonen unmittelbar vor der Verletzung durch Injektion in den Gang von QVA verabreicht. Wie hier gezeigt, erhöhte der Wirkstoff die Blutungszeiten im Vergleich zur Kontrolle mit Trägerstoff signifikant. In diesem Video sind unmittelbar nach der Verletzung Hinweise auf Gefäßschäden und Koagulation mithilfe transgener Linien für endotheliale Marker und rote Blutkörperchen sichtbar.Alle fünf Minuten wurden über einen Zeitraum von 12 Stunden Bilder aufgenommen, die die verschiedenen Stadien der Wundheilung zeigen. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine mechanische Verletzung in Zebrafischembryonen verursacht.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Die hier vorgestellte Methode umfasst die genaue Verletzung des Lebens Zebrafischembryonen mit hochenergetischer Laserpulse und der anschließenden Analyse dieser Verletzungen und deren Wiederherstellung mit der Zeit. Wir zeigen auch, wie genetisch markierten einzelne oder Gruppen von Skelettmuskelzellen kann während und nach der Laser-Licht induzierten Schäden verfolgt werden.

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Imaging von zerebrovaskulären Entwicklung in Zebrafisch-Larven beschrieben. Techniken zur 3D-Bildgebung zu erleichtern und zu ändern zerebrovaskuläre Entwicklung mit chemischen Behandlungen sind ebenfalls vorhanden.

Imaging und 3D-Rekonstruktion der zerebrovaskuläre Strukturen in embryonalen Zebrafisch

Nach Durchtrennung des Rücken, erwachsenen Zebrafisch haben die funktionelle Erholung von 6 Wochen nach der Verletzung. Um die Vorteile der Larven Transparenz und schnellere Erholung zu nehmen, stellen wir ein Verfahren zur Durchtrennung des Rückenmarks Larven. Nach Durchtrennung beobachten wir sensorischen Erholung ab 2 Tage nach der Verletzung, und C-Bogen-Bewegung um 3 Tage nach der Verletzung.

Rückenmarksdurchtrennung in der Zebrafisch-Larven

Um die zellulären und molekularen Mechanismen der Neurogenese und Regeneration adulter Zebrafische zu beleuchten, haben wir ein Protokoll für invasive Operationen entwickelt, die mechanische Verletzungen im adulten Telencephalon des Zebrafisches verursachen, und die anschließende Überwachung von Veränderungen in der gestochenen Hemisphäre durch Immunhistochemie oder in situ Hybridisierung.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Der Zebrafisch ist ein hervorragendes Modellsystem für genetische und Entwicklungsstudien. Die Bead-Implantation ist eine wertvolle Gewebemanipulationstechnik, die verwendet werden kann, um Entwicklungsmechanismen zu untersuchen, indem Veränderungen in der lokalen zellulären Umgebung eingeführt werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Implantation von Mikrokügelchen im Zebrafischembryo durchgeführt wird.

Microbead Implantation im Zebrafischembryo

Ziel dieses Protokolls ist es, eine neuartige Methode zur Beurteilung der segmentalen Herzfunktion bei embryonalen Zebrafischen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu beschreiben.

Displacement Analysis of Myocardial Mechanical Deformation (DIAMOND) Reveals Segmental Heterogeneity of Cardiac Function in Embryonic Zebrafish

Wir modifizierten das Marmarou-Gewichtsabfallmodell für erwachsene Zebrafische, um eine Breite von Pathologien nach stumpfer traumatischer Hirnverletzung (TBI) und die Mechanismen, die der nachfolgenden neuronalen Regeneration zugrunde liegen, zu untersuchen. Dieses stumpfe TBI-Modell ist skalierbar, induziert ein leichtes, mittelschweres oder schweres SHT und rekapituliert die bei menschlichen TBI beobachtete Verletzungsheterogenität.

Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen

Eine neue intraperitoneale (IP) Injektionsmethode bei adulten Zebrafischen wird beschrieben. Beim Umgang mit toxischen Verbindungen wie Doxorubicin ist dieses Verfahren wirksamer als die beiden bisher berichteten IP-Methoden. Die Technik ist so konzipiert, dass sie von Forschern mit begrenzter Erfahrung im Zebrafischmodell leicht übernommen werden kann.

Eine intraperitoneale Injektionstechnik bei erwachsenen Zebrafischen, die Körperschäden und die damit verbundene Mortalität minimiert

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur mikrochirurgischen Transplantation einer magnetischen Perle in das sich entwickelnde Zebrafischherz, das die Manipulation mechanischer Kräfte in vivo ermöglicht und einen mechanisch stimulusabhängigen Kalziumeinstrom in Endokardzellen auslöst.

Mechanische Kräfte im sich entwickelnden Zebrafischherz mit Hilfe von Magnetkügelchen manipulieren

Dieses Protokoll beschreibt eine kostengünstige Lichtmikroskopiemethode zur Beurteilung der Herzmorphologie und -funktion in Zebrafischembryonen, die eine reproduzierbare Bewertung der Entwicklungskardiotoxizität ermöglicht, ohne dass fortschrittliche Bildgebungssysteme erforderlich sind.

Funktionelle kardiale Bildgebung in Zebrafischembryonen mittels Standardmikroskopie und Videoanalyse: Anwendungen in der Umwelt- und biomedizinischen Forschung

Erfahren Sie die Methode zur mechanischen Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen zur Untersuchung von Hämostase und Wundheilung. Dieses Modell ermöglicht Echtzeit-Mikroskopie von Entzündung und Gefäßreparatur.

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

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