Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen
17. Februar 2015
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer mechanischen Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen. Dieses Verletzungsmodell bietet eine Plattform für die Untersuchung von Blutstillung, verletzungsbedingten Entzündungen und Wundheilung in einem Organismus, der sich ideal für die Echtzeitmikroskopie eignet.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, eine mechanische Gefäßverletzung bei Zebrafischembryonen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem die Kotschalader des Zebrafischembryos mit einer Minutia-Nadel punktiert wird. Als nächstes wird die Blutstillung beurteilt, indem die Zeit gemessen wird, in der das Blut aktiv aus der Wunde fließt.
Anschließend wird eine Zeitraffermikroskopie durchgeführt, um Aspekte der Wundheilung wie z.B. die Gefäßreparatur sichtbar zu machen. Die Ergebnisse zeigen, dass mechanische Gefäßverletzungen in Zebrafischembryonen verwendet werden können, um Aspekte der Blutstillung und Wundheilung reproduzierbar zu messen, wie z.B. die Blutungszeiten und die Zeit, die benötigt wird, um den Blutfluss wiederherzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber Maus- und anderen Standard-Verletzungsmodellen besteht darin, dass im Zebrafischembryo Entzündungen, Blutstillung und Reparatur mithilfe von Echtzeitmikroskopie leicht sichtbar gemacht werden können.
Führen Sie zunächst einen winutia-Stift in einen Stifthalter ein und klemmen Sie den Stift mit einer feinen Pinzette fest. Biegen Sie die Spitze des Stifts vorsichtig, um einen leichten Haken zu erzeugen, um den Embryo während der Verletzung zu manipulieren und zu stabilisieren. Biege mit einer Spitzzange das Ende einer 28-Gauge-Nadel mit einem halben Zoll, die auf einer Insulinspritze montiert ist.
Bereiten Sie als Nächstes Zebrafischembryonen vor, indem Sie Brutpaare aufstellen und Eier in Eiwasser sammeln, wie zuvor gezeigt. Wenn die Embryonen acht bis 24 Stunden nach der Befruchtung oder HPF erreicht sind, fügen Sie PTU zum Eiwasser hinzu, um die Melone nach zwei Tagen zu verhindern. Nach der Befruchtung oder DPF verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Embryonen zu entkleiden, betäuben Sie die Embryonen mit einer Endkonzentration von 0,02 %Gepuffertes Trica, um die embryonalen Blutgefäße mechanisch zu verletzen.
Verwenden Sie eine Transferpipette, um anästhesierte Embryonen auf einen Objektträger zu legen. Legen Sie sich auf ein Präpariermikroskop und halten Sie die kurze, flache Seite einer Spritzennadel in der dominanten Hand und positionieren Sie den Embryo auf der Seite, wobei die Bauchfläche von der Nadel abgewandt ist. Positionieren Sie nun den Minutia-Stift mit der Spitze direkt gegen die ventrale Oberfläche des Fisches hinter der Urogenitalöffnung
.Halten Sie es in einem leichten Winkel, so dass die gebogene Spitze durch die Perhaut direkt in die Koppelvene stechen kann. Dann verwenden Sie die Spritzennadel, um den Embryo zu manipulieren. Verwenden Sie die Minutia-Nadel, um die Coddle-Vene zu durchstechen, indem Sie den Embryo in die Nadel klopfen, um die Nadel mit der Spritzennadel leicht in die Vene einzuhaken.
Ziehe den Embryo vom winzigen Stift weg, um einen kleinen Riss im Gefäß zu erzeugen. Eine erfolgreiche Verletzung führt zu sofortigen Blutungen aus der Vene. Wählen Sie für dieses Verfahren nur Embryonen mit sichtbar zirkulierenden Blutzellen.
Ziehen Sie den winzigen Stift aus dem Gefäß und sobald der Blutverlust aus der Wunde sichtbar ist, starten Sie einen Timer Wenn der Blutverlust aus der Wunde aufhört, stoppen Sie den Timer und notieren Sie die Gesamtzeit als Blutungszeit, wenn die Gerinnung gehemmt ist, notieren Sie die Zeit, in der keine sichtbar zirkulierenden Zellen mehr vorhanden sind. Übertragen Sie die Tiere nach der Verletzung zur Mikroskopie in Bildgebungsschalen mit Glasboden und entfernen Sie den Großteil des Eiwassers, dann mit 0,3 bis 1,2 % niedrigschmelzenden Aeros, ergänzt mit 0,02 % trica und erhitzt auf 42 bis 45 Grad Celsius. Decken Sie die Embryonen ab.
Positionieren Sie die Embryonen mit einer Pinzette auf der Seite. Nachdem der Aro abgekühlt ist, füllen Sie die Schüssel mit 0,02 % Trica in Eiwasser. Verwenden Sie Hellfeld-Epi-Fluoreszenz oder konfokale Mikroskopie, um Bilder nach der Bildgebung aufzunehmen.
Verwenden Sie eine Pinzette, um die Embryonen zurück in das Eiwasser zu übertragen. Dieses Video zeigt eine mechanische Gefäßverletzung, die an einem 2D-PF-Embryo durchgeführt wurde. Es ist ein aktiver Blutverlust zu beobachten, gefolgt von einem Stopp der Blutung, die zu einer schnellen und zuverlässigen Gerinnungsreaktion führt, gemessen an der Zeit bis zum Ende der Blutung, um festzustellen, ob Unterschiede in der Gerinnungsreaktion gemessen werden konnten oder nicht.
Das Antikoagulans Odin wurde den Embryonen unmittelbar vor der Verwundung durch Injektion in den Gang von QVA verabreicht. Wie hier gezeigt, verlängerte das Medikament die Blutungszeiten im Vergleich zur Vehikelkontrolle signifikant. In diesem Video sind Hinweise auf Gefäßschäden und Gerinnung unmittelbar nach der Verletzung anhand transgener Linien für Endothel- und Erythrozytenmarker zu sehen.
Über einen Zeitraum von 12 Stunden wurden alle fünf Minuten Bilder aufgenommen, die die verschiedenen Stadien der Wundheilung zeigten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine mechanische Verletzung bei Zebrafischembryonen verursacht.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Erzeugung einer mechanischen Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen beschrieben. Dieses Verletzungsmodell bietet eine Plattform, um die Hämostase, verletzungsbedingte Entzündungen und die Wundheilung in einem Organismus zu untersuchen, der sich ideal für die Echtzeitmikroskopie eignet.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Biologie
- Hämostase
Hintergrund
- Zebrafischembryonen sind ein wertvolles Modell zur Untersuchung von vaskulären Verletzungen.
- Die Echtzeitmikroskopie ermöglicht eine detaillierte Beobachtung biologischer Prozesse.
- Das Verständnis von Hämostase und Wundheilung ist entscheidend für die medizinische Forschung.
- Eine mechanische Gefäßverletzung kann kontrolliert induziert werden.
Zweck der Studie
- Erstellung eines reproduzierbaren Modells für mechanische Gefäßverletzungen.
- Beurteilung der Hämostase und Entzündungsreaktionen in Zebrafischembryonen.
- Visualisierung der Wundheilungsprozesse mittels Zeitraffermikroskopie.
Verwendete Methoden
- Das Durchstechen der Caudalvene von Zebrafischembryonen mit einer Minutiennadel.
- Die Messung der Dauer des aktiven Blutflusses aus der Wunde.
- Die Durchführung der Zeitraffermikroskopie zur Beobachtung der Gefäßreparatur.
- Die Analyse der Blutungszeiten und der Wiederherstellung des Blutflusses.
Hauptergebnisse
- Das Modell ermöglicht eine reproduzierbare Messung der Hämostase.
- Mittels Zeitraffermikroskopie lässt sich die Wundheilung effektiv visualisieren.
- Entzündungs- und Reparaturprozesse können in Echtzeit beobachtet werden.
- Diese Technik bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen Tiermodellen.
Schlussfolgerungen
- Das Zebrafischembryomodell eignet sich effektiv zur Untersuchung von vaskulären Verletzungen.
- Die Echtzeit-Bildgebung liefert Einblicke in die Hämostase und Regeneration.
- Diese Methode kann das Verständnis von verletzungsbedingten Prozessen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die mechanische Gefäßverletzung bei Zebrafischembryonen bietet eine reproduzierbare Plattform zur Echtzeit-Bildgebung für die Untersuchung von Hämostase und vaskulärer Reparatur im Kontext des Gesamtorganismus. Dieses Modell unterstützt die Zielvalidierung und die mechanistische Absicherung in der Forschung zu Thrombose und Wundheilung, indem es die quantitative Messung von Blutungsdynamik und Gefäßneubildung ermöglicht. Die optische Transparenz und die genetische Modifizierbarkeit erlauben eine direkte Visualisierung zellulärer Reaktionen und verbessern so die Vorhersagekraft in frühen Entdeckungsprogrammen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen in Hämostasewegen durch kontrollierte vaskuläre Verletzung und Echtzeitüberwachung der Gerinnselbildung.
- Operationaler Wert: Unterstützt die funktionelle Zielstrukturvalidierung durch Messung der Blutungszeit und der Reparaturkinetik der Gefäße in genetisch zugänglichen Embryonen.
- Prädiktiver Wert: Erleichtert die präklinische Risikominderung von Antikoagulanzien oder prohämostatischen Substanzen mittels reproduzierbarer, quantifizierbarer phänotypischer Endpunkte.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare Verletzungsmodelle, die für High-Content-Screenings von Substanzen geeignet sind, die die Blutgerinnung oder vaskuläre Integrität beeinflussen.
- Quantitative Ausgangsgrößen: Liefert messbare Endpunkte wie Blutungszeitdauer und Zeit bis zur Wiederherstellung des Blutflusses und ermöglicht dadurch Dosis-Wirkungs-Analysen.
- Skalierbarkeit und Wiederverwendbarkeit: Kompatibel mit Zeitraffermikroskopie und transgenen Reportersystemen, wodurch eine mehrfache Verwendung in verschiedenen Substanz-Screening-Kampagnen ermöglicht wird.
Translationale und präklinische Forschung
- Klinische Relevanz: Modelliert menschliche vaskuläre Verletzungsprozesse und unterstützt die translationale Biomarker-Entdeckung in Hämostase und Thrombose.
- Präklinische Kontinuität: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem sie die Echtzeitbeobachtung von Entzündung, Gerinnungsstabilisierung und endothelialer Reparatur ermöglicht.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Liefert mechanistische Erkenntnisse, die Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in der frühen therapeutischen Entwicklung unterstützen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung über die Lead-Identifizierung bis hin zur präklinischen Wirksamkeitsprüfung ein, insbesondere für hämatologische und vaskuläre Therapiebereiche.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Gerinnungsfaktoren und Mechanismen der Gefäßreparatur durch kontrollierte Verletzung und Echtzeit-Bildgebung.
- Screening: Ermöglicht die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Hämostase und die Wundheilung.
- Analytik: Erzeugt quantitative, zeitliche Messgrößen (Blutungszeit, Durchflusswiederherstellung), die den vergleichenden Analysen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen dienen.
- Translationale Forschung: Knüpft an präklinische Arbeiten an, indem sie evolutionär konservierte Gefäßbiologie und die Echtzeit-Visualisierung von Reparaturprozessen nutzt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbares Plattformmodell für mehrere Projekte in den Bereichen Thrombose, Entzündung und Gefäßbiologie aufgrund ihrer Anpassungsfähigkeit und Kompatibilität mit Bildgebungstechnologien.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert eine vorhersagbare Zuverlässigkeit bei der Zielvalidierung, indem die Unschärfe bezüglich des hämostatischen Mechanismus durch direkte Beobachtung verringert wird.
- Operativer Wert: Stellt Standardisierung und Reproduzierbarkeit sicher, indem definierte Verletzungsprotokolle und quantifizierbare Endpunkte verwendet werden.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem eine frühzeitige Risikominimierung bei Wirkstoffen mit vaskulären oder hämatologischen Nebenwirkungen ermöglicht wird.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung, indem mechanistische Daten zur Zielinteraktion und Pfadmodulation bereitgestellt werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit Zebrafischen, in Mikrochirurgie und in Verfahren zur Live-Bildgebung.
- Setzt mikrofluidische oder Immobilisierungswerkzeuge sowie hochauflösende Mikroskopiesysteme (Hellfeld, Fluoreszenz, konfokal) voraus.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen den Teams hinsichtlich der Embryonalstadien, der Konsistenz der Verletzungen und der Messung der Endpunkte.
- Zu berücksichtigende Anpassungen umfassen die Auswahl transgener Linien zur Markierung endothelialer oder hämatopoetischer Zellen sowie Protokolle zur Dosierung von Antikoagulanzien.
- Praktische Einschränkungen bestehen in der Größe der Embryonen, die die Durchsatzkapazität begrenzt, sowie in der Notwendigkeit einer sorgfältigen Temperaturkontrolle während der Bildgebung.
