Validierung der Nanobody und Antikörper-basierte In-vivo- Tumorxenotransplantat NIRF-Bildgebung Experimente bei Mäusen verwenden Ex vivo Durchflusszytometrie und Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die ex vivo-Validierung von in vivo Nahinfrarot-Fluoreszenz-Xenotransplantat-Bildgebungsexperimenten an Mäusen unter Verwendung von Fluor-4-markierten Nanokörpern oder herkömmlichen Antikörpern. Dies wird erreicht, indem zunächst Nahinfrarotfluor, vier markierte antigenspezifische Antikörper und konventionelle Antikörper an Mäuse verabreicht werden, die sowohl antigenpositive als auch negative Xenotransplantate tragen. Der zweite Schritt ist die Durchführung von In-vivo-Bildgebung.

Nach der Bildgebung werden die Mäuse geopfert, um die Xenotransplantate zu entfernen, die für ex vivo-Analysen aufbereitet werden. Letztendlich werden ex vivo Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um in vivo Bildgebungsergebnisse zu validieren. Der Vorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Methoden wie der nuklearen Bildgebung besteht darin, dass die Verwendung eines Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoffs einen umfassenden in vitro-, in vivo- und ex vivo-Vergleich der multimodalen Bildgebung mit einer einzigen Sonde für die Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie und Nahinfrarot-Fluoreszenzbildgebung ermöglicht.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Tumorbildgebung zu beantworten, wie z.B. die Lokalisierung von Metastasen während der Operation und die Überwachung der Wirksamkeit von Anti-Tumor-Therapien. Die Markierung von Antikörpern mit Fluorkraft ermöglicht die exakte ex vivo Quantifizierung von zellgebundenen Antikörpern. Dies ermöglicht es uns zu unterscheiden, ob spezifische Singles, die wir in vivo sehen, auf Antikörper zurückzuführen sind, an Zelloberflächenantigene gebunden sind, oder unspezifisch aufgrund des sogenannten erhöhten Permeabilitäts- und Retentionseffekts.

Sieben bis neun Tage nach der Injektion der Tumorzellen, wenn die Tumore einen Durchmesser von etwa acht Millimetern haben sollten. Bereiten Sie sich darauf vor, die Mäuse zuerst abzubilden, tragen Sie eine Augensalbe auf und initialisieren Sie das Bildgebungssystem. Positionieren Sie dann die narkotisierten Mäuse auf dem beheizten Tisch, wobei ihre Tumore auf die Kamera gerichtet sind.

Halten Sie für die Dauer des Bildgebungsverfahrens ein bis 2 %-ISO-Fluor mit dem isof-Fluorverteiler, der in der Bildgebungskammer untergebracht ist. Überwachen Sie die Atemfrequenzen. Wenn sie zu schnell sind, dann ist die Anästhesie zu leicht, und wenn sie langsam oder unregelmäßig ist, dann ist die Anästhesie zu tief

Bilden Sie dann die Mäuse ab, nachdem Sie das Basisbild erhalten haben. Injizieren Sie den Mäusen 50 Mikrogramm LOR sechs 80 markierte Antikörperkonstrukte. Tun Sie dies in einem Volumen von 200 Mikrolitern Kochsalzlösung in die Schwanzvene.

Nach der Bildgebung die Maus einschläfern und auf einen Styroporblock montieren und mit 70% Ethanol reinigen. Schneiden Sie dann die Haut auf, um die Tumore freizulegen. Entfernen Sie die Tumore mit einem Skalpell und lassen Sie die Tumore intakt.

Nach der Entfernung halbieren Sie die Tumoren und geben Sie eine Hälfte zur Faxanalyse in eine Schale mit P-B-S-A-E-B-S-F-Lösung auf ICE und die andere Hälfte auf zweimal kaltes, 4%iges PFA für die Immunhistochemie. Nach 24 Stunden im Fixiermittel bei vier Grad Celsius übertragen Sie die Tumore mit 30 % Saccharose auf PBS und halten sie bei vier Grad Celsius, bis sie vollständig in der Lösung versunken sind. Würfeln Sie dann die Tumore in Stücke, die in Kryoformen passen.

Füllen Sie die Formen mit OCT-Masse und übertragen Sie die Tumorbrocken in die Formen. Das Gewebe muss vollständig in OCT eingetaucht werden. Dann überführen Sie die Kryoformen auf Trockeneis und lagern sie, wenn sie vollständig gefroren sind, bei minus 80 Grad Celsius, bis sie verarbeitet werden können.

Um die Zellen vorzubereiten, übertragen Sie die Tumorhälfte in eine Zelle, Sieb in das Sieb. Schneiden Sie es in drei bis vier Stücke, nehmen Sie dann den Kolben aus einer Zwei-Milliliter-Spritze und drücken Sie das Gewebe mit dem Kolben gegen das Sieb. Sammeln Sie die Lösung, die durch das Sieb fließt Nachdem das Gewebe zerdrückt wurde, spülen Sie das Sieb mit PBS.

Füllen Sie dann die gesammelte Suspension in ein neues Röhrchen um und schleudern Sie es fünf Minuten lang bei 500 g herunter. Wir suspendieren das Zellpellet in 10 Millilitern PBS mit 0,2 % BSA. Zählen Sie dann die Zellen, aliquotieren Sie ein bis 5 Millionen Lymphomzellen in eine Fünf-Milliliter-Faxröhre, drehen Sie die Röhre bei 500 G herunter und verwerfen Sie den Überstand.

Suspendieren Sie dann die Zellen in 100 Mikrolitern PBS mit 0,2% BSA. Zu diesem Zeitpunkt ist es möglich, FCR mit einem Antikörper zu blockieren, um FC gamma R zu binden.Warten Sie 10 Minuten und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS mit 0,2% BSA. Fügen Sie nun einen monoklonalen Anti-CD 45-Antikörper hinzu, um die Leukozyten zu identifizieren.

Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang im Dunkeln mit diesem Antikörper und entfernen Sie ihn dann kurz vor der Faxanalyse mit zwei Wäschen. Färben Sie die Zellen 15 Minuten lang mit Propidiumiodid auf Eis, um abgestorbene Zellen zu identifizieren. Waschen Sie sie dann sauber mit einfachem PBS.

Anschließend suspendiert Resus die Zellen in 150 Mikrolitern PBS und fährt mit den Fakten fort. Mäusen wurden 50 Mikrogramm Nanokörper und monoklonale Antikörper injiziert, um die Spezifität der fluoreszenzmarkierten Konstrukte zu bewerten. Für die In-vivo-Bildgebung.

Alle Bildgebungen wurden sechs Stunden nach dem Injektionsfluss durchgeführt. Die zytometrische Analyse von Tumorzellsuspensionen zeigte eine spezifische Markierung von antigenpositiven Tumorzellen mit beiden AF six 80-Konjugaten. Es gab keine unspezifische Markierung von antigennegativen Zellen mit beiden Konstrukten.

Der Tumor. Kryoschnitte zeigten eine starke und nahezu homogene Markierung von antigenpositiven Zellen mit dem Nanokörper. Der monoklonale Antikörper ergab jedoch eine deutlich schwächere homogene Färbung als erwartetes Antigen.

Negative Tumoren zeigten keine Färbung des Antikörperantigens, negative Tumoren zeigten eine unspezifische Streufärbung im interstitiellen Raum nach Injektion des konventionellen Antikörpers. Dies war der Färbeszene im Antigen sehr ähnlich. Positive Tumoren nach Injektion des konventionellen Antikörpers Einmal gemeistert.

Der bildgebende Teil dieser Technologie kann an einem einzigen Tag durchgeführt werden. Nach diesem Verfahren kann dies geschehen. Andere Methoden, wie z.B. die Radiomarkierung von Nanokörpern, können durchgeführt werden, um die Bioverteilung der injizierten Konjugate in verschiedene Gewebe zu untersuchen oder andere Fragestellungen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine multimodale Ex-vivo-Validierung Ihrer In-vivo-Fluoreszenzbildgebung im nahen Infrarot mit einer Fluoro-Vier-markierten Sonde durchführen können.

Damit erhalten Sie eine Technik zur Evaluierung neuer Antikörperkonstrukte für die präklinische molekulare Bildgebung.