Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die CPG-Methylierung in Zielregionen von Interesse aus genomischer DNA zu quantifizieren, die aus Gewebe oder Zellen von Interesse isoliert wurde. Dies wird erreicht, indem zunächst Sulfit-spezifische PCR-Primer entwickelt werden, um interessante Regionen aus bi-sulfit-konvertierter genomischer DNA zu amplifizieren. Im zweiten Schritt wird die Bi-Sulfit-konvertierte Region of Interest amplifiziert und Next Generation Sequencing oder NGS-Bibliotheken werden aus den Amplikonscons generiert.

Als nächstes werden die Bibliotheken sequenziert und FASTQ-Dateien für die Analyse generiert. Im letzten Schritt werden die Sequenzierungs-Reads mit der Bi-Sulfit-konvertierten Referenzzielsequenz abgeglichen, und die fünf mc-Prozent werden letztendlich durch Sulfit-Amplikon-Sequenzierung berechnet, oder BS a s kann durchgeführt werden, um die CPG-Methylierung in jeder interessierenden Region von jedem Modellorganismus präzise und genau zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Sanger-Sequenzierung besteht darin, dass BS A S eine genaue und präzise Quantifizierung der CPG-Methylierung in einem schnellen Hochdurchsatz ermöglicht und die Möglichkeit bietet, mehrere Regionen in einer hohen Anzahl von Proben zu untersuchen.

Nachdem Sie das Ziel identifiziert und den Primer entworfen haben, setzen Sie die Reaktion für die Optimierung der Zielamplifikation eines einzelnen Amplikons zusammen und versiegeln Sie dann eine PCR-Platte mit einer heißversiegelten Folie, um die Amplikons durch Seitenelektrophorese zu visualisieren. Beladen Sie anschließend die entsprechenden Vertiefungen mit 30 Mikrolitern PCR-Reaktionen oder Leiter und lassen Sie das Gel dann etwa 45 Minuten lang bei 200 Volt laufen. Wenn der erste Farbstoff das Ende des Gels erreicht, stoppen Sie die Reaktion und bedecken Sie dann das gesamte Gel mit fünf Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereitetem AUM-Bromid

Nach fünf Minuten bildet man das Gel über einen UV-Transluminator bei einer Anregungswellenlänge von 482 Nanometern ab. Verwenden Sie die Leiter, um die Größe der PCR-AMPLICONS zu bestimmen und die Spezifität der Reaktion zu bestimmen. Suchen Sie nach mehreren anderen Banden als der erwarteten Amplikongröße, um die durchschnittliche Größe der erkannten Bibliothekspeaks und eine Schätzung der Molarität zu bestimmen.

Führen Sie anschließend die Bibliotheken auf einem Kapillarelektrophorese-DNA-Größenchip mit einem hochempfindlichen DNA-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers aus. Um die Bibliotheken nach QPCR zu quantifizieren. Verwenden Sie Primer, die gegen die Adaptersequenzen in den generierten Bibliotheken und Standards mit einer bekannten Konzentration auf einem Echtzeitgerät entwickelt wurden, unter Verwendung der absoluten Quantifizierungseinstellungen gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Verwenden Sie dann die Größe der Bibliotheken und die molare Quantifizierung aus dem QPCR, um die molaren Konzentrationen der Bibliotheken zu berechnen. Importieren Sie nach der Sequenzierung die gezippten schnellen Q-Dateien in die entsprechende Sequenzierungsanalysepipeline, wählen Sie "Importieren" und dann die Sequenzierungsmethode aus, die zum Generieren der Lesevorgänge verwendet wird, um die Q-Werte für die Lesekürzungsanwendungen beizubehalten. Importieren Sie die entsprechenden gezippten schnellen Q-Lesedateien, und deaktivieren Sie dann unter Allgemeine Optionen die Option Qualitätsbewertungen verwerfen.

Wählen Sie einen Speicherort für die importierten Lesevorgänge aus und klicken Sie auf Fertig stellen. Wählen Sie dann unter NGS-Kernwerkzeuge die Option Trimmsequenzen aus. Markieren Sie die Lesevorgänge, die gekürzt werden sollen, und behalten Sie nur die Lesevorgänge bei, die größer oder gleich Q 30-Werten sind.

Wählen Sie dann den Zuschnitt mithilfe von Qualitätsfaktoren aus und setzen Sie das Limit auf 0,001. Zum weiteren Auswählen nur der Rohre, die kleiner oder gleich einem mehrdeutigen Nukleotid enthalten. Wählen Sie Mehrdeutige Nukleotide kürzen aus, und legen Sie die maximale Anzahl von Mehrdeutigkeiten auf eins fest.

Wählen Sie dann einen Speicherort aus, an dem die getrimmten Reads gespeichert werden sollen, und klicken Sie auf Fertig stellen, um die getrimmte Res der in silico by Sulfite konvertierten Genreferenz zuzuordnen. Wählen Sie unter NGS-Kernwerkzeuge die Option Kartenlesevorgänge aus. Um als Referenz zu referenzieren, wählen Sie die getrimmten Lesevorgänge aus, die zugeordnet werden sollen, und klicken Sie auf Weiter.

Wählen Sie dann unter Referenzmaskierung die konvertierte Referenzsequenz aus, und wählen Sie keine Maskierung aus. Klicken Sie auf Weiter, und weisen Sie dann eine Punktzahl von drei für Nichtübereinstimmungen, Einfügungen und Löschungen zu. Weisen Sie der Referenz eine Punktzahl von eins für den minimalen Anteil der Leselängenkarte zu, und weisen Sie eine Punktzahl von 0,9 für den minimalen Anteil der Identität zwischen der Zuordnung, dem Lesen und der Referenz unter Unspezifische Übereinstimmungsbehandlung zu, wählen Sie aus, ignorieren Sie und klicken Sie unter Ausgabeoptionen auf Weiter.

Wählen Sie als Nächstes Eigenständige Lesezuordnungen erstellen aus. Klicken Sie dann unter Ergebnisbehandlung auf Speichern. Wählen Sie einen Speicherort aus, an dem die Lesezuordnung gespeichert werden soll, und klicken Sie auf Fertig stellen, um den Variantenaufruf für die zugeordneten Lesevorgänge auszuführen.

Wählen Sie unter Re-Sequencing-Analyse die Erkennung von Niederfrequenzvarianten aus und wählen Sie das zu analysierende Read-Mapping aus. Klicken Sie auf Weiter und dann unter Parameter Niederfrequenzvariante den Wert 0,01 % und klicken Sie auf Weiter. Legen Sie unter allgemeinen Filtern die minimale Abdeckung auf 1000 fest, um sicherzustellen, dass sich die Sequenz in einer Tiefe von mindestens 1000 x befindet.

Klicken Sie abschließend auf Weiter, und wählen Sie dann unter Ausgabeoptionen die Option Kommentierte Tabelle erstellen und wählen Sie einen Speicherort für die Variantentabellendatei aus, klicken Sie auf Fertig stellen und verwenden Sie die Variantenhäufigkeiten an den annotierten CPG-Stellen in der interessierenden Region aus der Variantentabellendatei, um die Häufigkeit der Cytosin-Methylierung an einem Referenz-Cytosin im CG-Kontext durch Sulfit-Amplikon-Sequenzierungs-Reads zu berechnen, die korrekt an der konvertierten Referenzsequenz ausgerichtet sind. in der Abbildung. Die CPG-Dinukleotide können eindeutig identifiziert und die Methylierungszustände durch Beobachtung der Basenaufrufe an den CPG-Stellen abgeschätzt werden. In den kartierten Reads führt eine Methylierung von 0 % zu kartierten Reads, die Thymin enthalten, die den CPG-Stellen zugeordnet sind.

100%-Methylierungskontrollen führen zu kartierten Reads, die Cytosine enthalten, die auf CPG-Stellen abgebildet werden. In diesem Experiment wurden RNA und DNA aus einer Maus, einem Kleinhirn und einer Netzhaut gemeinsam isoliert. Die selektiv exprimierte Opsin-Expression im Netzhautgewebe wurde dann erwartungsgemäß mittels QPCR gemessen.

Die Opsin-RNA wurde erst in der Netzhaut nach Quantifizierung der CPG-Methylierungsniveaus in der Opsin-Promotorregion durch Bi-Sulfit-Amplifikationssequenzierung nachgewiesen. Die kumulativen Methylierungsniveaus in der Promotorregion betrugen jedoch mehr als 80 % im Kleinhirn im Vergleich zu weniger als 15 % in der Netzhaut. Die Quantifizierung der B-SAS-Methylierung profitiert von der ortsspezifischen Methylierungsquantifizierung, die den Vergleich der Methylierungsgrade auf CPG-spezifischer Basis in einer gegebenen genomischen Region ermöglicht.

In diesem Experiment wurde festgestellt, dass die CPG-Methylierungswerte über den Opsin-Promotor in den Kleinhirnproben im Vergleich zu den Netzhautproben signifikant höher waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die CPG-Methylierung in bestimmten Regionen von Interesse aus genomischer DNA quantifizieren können, die entweder aus Geweben oder Zellen isoliert wurde.