Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die CPG-Methylierung in gezielten Bereichen des Interesses aus genomischer DNA zu quantifizieren, die aus relevantem Gewebe oder Zellen isoliert wurde. Dies wird erreicht, indem zunächst PCR-Primer entworfen werden, die spezifisch für die Sulfitspaltung sind und die Bereiche des Interesses aus sulfithaltig umgewandelter genomischer DNA amplifizieren. Im zweiten Schritt wird der sulfithaltig umgewandelte Bereich des Interesses amplifiziert, und Next-Generation-Sequenzierungs- oder NGS-Bibliotheken werden aus den Amplifikationsprodukten erzeugt.

Anschließend werden die Bibliotheken sequenziert und FASTQ-Dateien zur Analyse generiert. Im letzten Schritt werden die Sequenzierungsreads an die bisulfitkonvertierte Referenzzielsequenz angepasst, und der 5-mC-Prozentsatz wird letztendlich durch Sulfitsamplikonsequenzierung oder BS A S genau und präzise quantifiziert, um die CPG-Methylierung in jedem gewünschten Bereich aus einem beliebigen Modellorganismus zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Sanger-Sequenzierung besteht darin, dass BS A S eine genaue und präzise Quantifizierung der CPG-Methylierung auf schnelle, hochdurchsatzfähige Weise ermöglicht und somit die Möglichkeit bietet, mehrere Regionen in einer hohen Anzahl von Proben zu analysieren.

Nach der Identifizierung des Zielbereichs und der Konstruktion des Primers setzen Sie die Reaktion zur Optimierung der Amplifikation eines einzelnen Amplikons zusammen und versiegeln eine PCR-Platte mit einer hitzeversiegelten Folie, um die Amplikone mittels PAGE-Elektrophorese sichtbar zu machen. Laden Sie anschließend die entsprechenden Gelen in die Vertiefungen mit je 30 Mikrolitern PCR-Reaktionen oder Ladder und führen Sie das Gel bei 200 Volt für etwa 45 Minuten durch. Sobald der erste Farbstoff das Ende des Gels erreicht hat, beenden Sie die Elektrophorese und bedecken das gesamte Gel mit fünf Mikrogramm pro Milliliter frisch zubereitetem AUM-Bromid.

Nach fünf Minuten das Gel mit einem UV-Transilluminator bei einer Anregungswellenlänge von 482 Nanometern aufnehmen. Mithilfe der Längenstandard-Markerbanden die Größe der PCR-AMPLICONS bestimmen, um die Spezifität der Reaktion zu überprüfen. Auf das Vorhandensein mehrerer Banden achten, die von der erwarteten Amplikonlänge abweichen, um die durchschnittliche Größe der detektierten Bibliothekspeaks sowie eine Abschätzung der Molarität zu ermitteln.

Führen Sie anschließend die Bibliotheken gemäß den Herstelleranweisungen auf einem DNA-Größenbestimmungs-Chip für die Kapillarelektrophorese mit einem Hochsensitivitäts-DNA-Assay durch. Quantifizieren Sie die Bibliotheken mittels QPCR. Verwenden Sie Primer, die gegen die Adaptersequenzen der erzeugten Bibliotheken gerichtet sind, sowie Standards mit bekannter Konzentration auf einem Echtzeit-Gerät, und nutzen Sie die Einstellungen für die absolute Quantifizierung gemäß den Herstelleranweisungen.

Verwenden Sie anschließend die Größe der Bibliotheken und die molare Quantifizierung aus der QPCR, um die molaren Konzentrationen der Bibliotheken zu berechnen. Importieren Sie nach der Sequenzierung die komprimierten FastQ-Dateien in die geeignete Sequenzierungs-Analyse-Pipeline, wählen Sie „Import“ und danach die zur Generierung der Reads verwendete Sequenzierungsmethode, um die Q-Werte für die Anwendungen zur Trimmen der Reads beizubehalten. Importieren Sie die entsprechenden komprimierten FastQ-Read-Dateien und deaktivieren Sie anschließend unter „Allgemeine Optionen“ die Auswahl „Qualitätsscores verwerfen“.

Wählen Sie einen Speicherort für die importierten Reads aus und klicken Sie auf „Fertig stellen“. Wählen Sie anschließend unter den NGS-Grundwerkzeugen „Sequenzen beschneiden“. Markieren Sie die zu beschneidenden Reads, wobei nur die Reads beibehalten werden, die Q-Scores größer oder gleich 30 aufweisen.

Danach die Trimmen anhand der Qualitätsbewertungen auswählen und die Grenze auf 0,001 festlegen. Anschließend weitere Selektion, sodass nur noch Sequenzen mit weniger als oder gleich einer mehrdeutigen Base übrig bleiben. Mehrdeutige Nukleotide trimmen und die maximale Anzahl an Unklarheiten auf eins festlegen.

Wählen Sie anschließend einen Speicherort für die gekürzten Reads aus und klicken Sie auf „Fertig stellen“, um die gekürzten Reads der in silico durch Sulfid konvertierten Genreferenz zuzuordnen. Wählen Sie unter NGS-Grundfunktionen „Reads zuordnen“. Wählen Sie als Referenz die zuordnenden gekürzten Reads aus und klicken Sie auf „Weiter“.

Danach unter Referenzmaskierung die konvertierte Referenzsequenz auswählen und keine Maskierung wählen. Auf Weiter klicken und dann eine Punktzahl von drei für Mismatches, Insertionen und Deletionen vergeben. Eine Punktzahl von eins für den minimalen Bruchteil der Read-Länge, die auf die Referenz abgebildet wird, vergeben und eine Punktzahl von 0,9 für den minimalen Identitätsbruchteil zwischen der Abbildung, dem Read und der Referenz festlegen. Unter unspezifische Übereinstimmungshandhabung „ignorieren“ auswählen und unter Ausgabeoptionen auf Weiter klicken.

Als Nächstes wählen Sie „Einzelne Read-Mappings erstellen“ aus. Klicken Sie dann unter „Ergebnisverarbeitung“ auf „Speichern“. Wählen Sie einen Speicherort für das Read-Mapping aus und klicken Sie auf „Fertig stellen“, um die Variantenerkennung an den zugeordneten Reads durchzuführen.

Wählen Sie bei der Neusequenzierungsanalyse die Erkennung seltener Varianten aus und wählen Sie die zu analysierende Read-Mapping aus. Klicken Sie auf „Weiter“ und geben Sie dann unter den Parametern für seltene Varianten 0,01 % ein und klicken Sie erneut auf „Weiter“. Stellen Sie unter allgemeinen Filtern die minimale Abdeckung auf 1000 ein, um sicherzustellen, dass die Sequenz eine Tiefe von größer oder gleich 1000× aufweist.

Klicken Sie abschließend auf „Weiter“ und wählen Sie unter Ausgabeoptionen „Annotierte Tabelle erstellen“ aus. Wählen Sie einen Speicherort für die Variantentabelle-Datei, klicken Sie auf „Fertig stellen“ und verwenden Sie die Variantenhäufigkeiten an den annotierten CPG-Stellen im Bereich von Interesse aus der Variantentabelle-Datei, um die Häufigkeit der Cytosinmethylierung an einem Referenzcytosin im CG-Kontext zu berechnen. Sulfite-Amplicon-Sequenzierungsreads, die korrekt an die konvertierte Referenzsequenz aligniert sind, werden wie in der Abbildung dargestellt aussehen. Die CPG-Dinukleotide können eindeutig identifiziert werden, und die Methylierungszustände können durch Beobachtung der Basenaufrufe an den CPG-Stellen abgeschätzt werden. Bei den alignierten Reads führt eine 0 %ige Methylierung zu alignierten Reads, die Thymin an den CPG-Stellen enthalten.

100 % Methylierungskontrollen führen zu sequenzierten Reads, die an CPG-Stellen lokalisierte Cytosine enthalten. In diesem Experiment wurden RNA und DNA gemeinsam aus einem Mäusecerebellum und -retina isoliert. Die in retinalem Gewebe selektiv exprimierte Opsinexpression wurde anschließend mittels QPCR wie erwartet gemessen.

Die Opsin-RNA wurde nur in der Netzhaut nachgewiesen, nachdem die CPG-Methylierungsgrade im Opsin-Promotorbereich durch Bisulfit-Amplifikationssequenzierung quantifiziert worden waren. Die kumulativen Methylierungsgrade im gesamten Promotorbereich lagen jedoch im Kleinhirn bei über 80 %, verglichen mit weniger als 15 % in der Netzhaut. Die B-SAS-Methylierungsquantifizierung profitiert von der standortspezifischen Quantifizierung der Methylierung und ermöglicht den Vergleich der Methylierungsgrade auf CPG-spezifischer Basis über jeden gegebenen genomischen Bereich hinweg.

Tatsächlich zeigte sich in diesem Experiment, dass die CPG-Methylierungsgrade im Opsin-Promotor in den zerebellären Proben im Vergleich zu den Netzhautproben signifikant höher waren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die CPG-Methylierung in gezielten Bereichen des Interesses aus genomischer DNA, isoliert aus Geweben oder Zellen, quantifizieren kann.