Super-Resolution Imaging der natürlichen Killerzell Immunologische Synapse auf einem Glas-gestützten Planar Lipiddoppelschicht

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, zu demonstrieren, wie es gelingt, hochauflösende Bilder der immunologischen Synapsen von natürlichen Killer- oder NK-Zellen auf der getragenen Lipiddoppelschicht aufzunehmen. Dies wird durch die Konstruktion einer glasgestützten planaren Lipiddoppelschicht erreicht, die Antikörper gegen den NK-Zell-aktivierenden Rezeptor CD 16 enthält. Die zuvor isolierten NK-Zellen werden dann in die planare Antikörper-eingebettete Lipiddoppelschicht gegeben, gefolgt von der Färbung der Zellen mit f-Aktin und Perforin.

Der letzte Schritt ist die Bildgebung der resultierenden NK-Zellsynapsen mit dem Standmikroskop und schließlich die Abbildung der NK-Synapse auf der gestützten Lipiddoppelschicht. Die Verwendung von stead zeigt die NK-Zellsynapse in verbesserter Detailgenauigkeit, was die Visualisierung der Ultrastruktur des Aktin-Zytoskeletts und perranischer positiver litischer Granula ermöglicht, die über Regionen mit niedriger F-Aktindichte positioniert sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht also darin, dass die gläserne Stütz-Lipidbarriere die Plus-Membran der Tuck-Zelle, das Protein auf dieser einfachen Lipidbarriere, nachahmen kann.

Sie können sich seitlich bewegen, was die Bildung von sehr logisch relevanten Immunsynapsen besser rekapitulieren kann. Diese Botschaft kann helfen, wichtige Christen auf dem Gebiet der Immunologie zu beantworten, indem sie es den Forschern ermöglicht, die Synapsenbildung auf kontrollierte Weise detailliert zu visualisieren, was mit kommerziellen und mikroskopischen Ansätzen nicht möglich ist. Ein Postdoc-Stipendiat in der Malerei und ein Stipendium für Doktoranden werden das Verfahren zum Zusammenbau der glasgestützten planaren Lipiddoppelschicht demonstrieren.

Bereiten Sie zunächst 100 Milliliter Piranha-Lösung vor, indem Sie 30%iges Wasserstoffperoxid mit Schwefelsäure im Verhältnis eins zu drei in einem Becherglas in diese Lösung mischen. Legen Sie zwei rechteckige Deckgläser mit der Nummer 1,5 für 20 bis 30 Minuten ein, während die Deckgläser gereinigt werden. Entnehmen Sie ein Röhrchen mit zuvor aufbereiteten 400 mikromolaren DOPC-Lipiden und ein Röhrchen mit zuvor aufbereiteten 80 mikromolaren Biotin PE-Lipiden.

Transportieren Sie sie auf Eis in den Argontank, nachdem Sie ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit Argon mit Sauerstoff angereichert haben. Addieren Sie DOPC und Biotin PE im Verhältnis eins zu eins. Das spezifische Volumen variiert je nach experimentellem Bedarf, sollte jedoch mindestens zwei Mikroliter betragen.

Jedes Desoxy versorgt das Mischröhrchen und die einzelnen Reagenzröhrchen mit Sauerstoff, bevor die Leiter wieder in den Kühlschrank gestellt wird. Spülen Sie die Deckgläser nach der Reinigung gründlich mit destilliertem Wasser ab. Legen Sie die Deckgläser einige Minuten lang an der Luft trocknen und ziehen Sie dann 1,5 Mikroliter der Liposomenmischung und des aliquotierten Tropfens in einem einzigen Tropfen in eine der Bahnkammern eines Kammerobjektträgers zurück.

Die Verwendung von zwei Drops pro Bahn ist typisch, aber nicht notwendig. Legen Sie nun schnell und effizient den trockenen Deckglas über die Tröpfchen und achten Sie darauf, dass die Tropfen ausreichend verteilt sind, damit sie nach dem Platzieren des Deckglases nicht zusammenfließen. Achten Sie außerdem darauf, dass die Tropfen kreisförmig und gut definiert bleiben, ohne die Ränder der Kammerwände zu berühren.

Drücken Sie zwischen und um jede Bahn herum fest nach unten, um eine wasserdichte Abdichtung zwischen den Abdeckungen zu gewährleisten. Schieben und schieben Sie die Positionen der Tropfen mit einem Filzstift an. Führen Sie dann 100 Mikroliter wässriges 5%-Gehäuse durch die Kammer, um die Doppelschicht zu blockieren.

Versuchen Sie sicherzustellen, dass sich keine Blasen in der Strömungskammer befinden. Injizieren Sie dann 100 Mikroliter Strepto-Adin in einer Konzentration von 333 Nanogramm pro Milliliter in jede Bahn. Nach einer Inkubation von 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur waschen Sie, indem Sie drei Milliliter mit 1 % humanem Serumalbumin gepufferte Kochsalzlösung durch jede Bahn laufen lassen.

Um das überschüssige Tritin zu entfernen, werden 100 Mikroliter biotinyliertes, fluoreszenzmarkiertes Anti-CD 16 in der zuvor wie im Textprotokoll beschriebenen Proteinkonzentration nach einer Inkubation im Dunkeln für 20 bis 30 Minuten zugegeben. Waschen Sie erneut, indem Sie drei Milliliter gepufferte Kochsalzlösung mit 1 % Humanserumalbumin durch jede Bahn laufen lassen. Lassen Sie dann 100 Mikroliter D-Biotin in einer Konzentration von 25 Nanomolaren durch die Kammer, um überschüssiges STR-Tabin zu binden und so die Möglichkeit einer unspezifischen Bindung von STR-Tabin an die Zellen auszuschließen.

Als nächstes werden humane NK-Zellen gezählt und in einer Konzentration von 500.000 pro Milliliter in gepufferter Kochsalzlösung mit 1 % humanem Serumalbumin resuspendiert. Waschen Sie das D-Biotin mit weiteren drei Millilitern gepufferter Kochsalzlösung mit 1 % Humanserumalbumin pro Bahn aus der Kammer. Sobald die Zellen in der gewünschten Konzentration resuspendiert wurden, fügen Sie jeder Bahn 100 Mikroliter hinzu.

Stellen Sie die Kammer für 30 bis 60 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nach dieser Inkubationszeit fixieren Sie die Zellen 10 bis 20 Minuten lang mit 4%Paraformaldehyd bei Raumtemperatur. Beim Waschen werden drei Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung durch jede Spur geleitet, um das Paraformaldehyd zu entfernen.

Fügen Sie dann 400 Mikroliter Blockierungspuffer hinzu, bevor Sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes färben Sie Aktin und Perforin durch Zugabe von zwei Mikrolitern verdünnter fluoreszenzmarkierter Phin und fluoreszenzmarkierter monoklonaler Antiperran-Antikörper, inkubieren bei Raumtemperatur für eine Stunde vor dem Waschen, indem Sie drei Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung durch die Kammer laufen lassen. Die Kammer ist bereit für die Bildgebung.

Schalten Sie alle notwendigen Hardware-Module des Standmikroskops ein. Starten Sie die Bildanalysesoftware und aktivieren Sie sowohl die Resonanzabtast- als auch die Standmodule. Nachdem Sie diese Auswahl getroffen haben, warten Sie etwa drei bis fünf Minuten, bis die Software gestartet wird.

Klicken Sie auf die Registerkarte "Konfiguration" oben auf dem Bildschirm und wählen Sie "Laserkonfiguration". Schalten Sie dann das weiße Licht ein und stattdessen 592 Nanometer Laser. Wählen Sie das 100-fach-Objektiv und richten Sie den Anregungslaserstrahl mit einem 592-Nanometer-Verarmungslaser aus.

Wählen Sie das Laserkonfigurationsmodul aus, schalten Sie den 592-Verarmungslaser aus und den 660-Nanometer-Verarmungslaser ein. Platzieren Sie den Objektträger auf dem Tisch über der Linse. Bringen Sie die an den abgegrenzten Doppelschichtbereich gebundenen Zellen mit der Weißlichtlampe und den Okularen in den Fokus.

Kehren Sie dann zur Registerkarte "Erfassung" direkt rechts neben der Registerkarte "Konfiguration" zurück. Klicken Sie auf die Registerkarte "Auf weißes Licht umschalten", schalten Sie das Modul ein und ziehen Sie die Anregungslaserlinie auf die entsprechende Wellenlänge. Nachdem Sie den gewünschten Detektor ausgewählt und den Erfassungsbereich eingestellt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche "Sequenziell" in der linken Symbolleiste, um den Dialog für sequenzielles Scannen unten in der linken Symbolleiste aufzurufen.

Dies ermöglicht es dem Benutzer, mehrere Sequenzen mit jeweils unterschiedlichem Anregungsstrahl für eine andere Farbe hinzuzufügen. Klicken Sie zwischen den Frames und stellen Sie dann den Anregungsfrequenzdetektor und den Erfassungsbereich für jede weitere Farbe ein. Sobald alle Einstellungen optimiert sind, klicken Sie auf Start, um den Akquisitionsprozess zu starten.

Das dreifarbige Standbild der NK-Zellsynapse auf einer glasgestützten planaren Lipiddoppelschicht zeigt, dass sich der in Rot dargestellte Anti-CD 16-Antikörper auf der Lipiddoppelschicht ansammelt und die F-Aktinbildung auslöst, und die Polarisation und Penetration von Perforin in blauer Form durch das F-Aktinnetz an der fokalen Platte. Mit diesem kombinierten Ansatz kann man die Mikrocluster aus fluoreszenzmarkiertem Anti-CD 16 innerhalb der glasgestützten Lipiddoppelschicht sauber beobachten, was die Clusterbildung von CD 16 auf der NK-Zelle direkt widerspiegelt. Im Vergleich zum herkömmlichen konfokalen Bild ist die Ringstruktur des zentralen Clusters von CD 16 im Standbild aufgrund der abgereicherten Umgebungsfluoreszenz leichter zu erkennen.

Darüber hinaus ist die Ultrastruktur des Aktin-Zytoskeletts mit deutlich verbesserter Auflösung zu sehen. In Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen sind die perinpositiven lytischen Granula über Regionen mit geringer F-Aktindichte positioniert. Im Stead-Bild, ein entscheidendes Detail, das im konfokalen Bild meist verloren geht. Einmal gemeistert, kann diese Technik etwa vier Stunden lang durchgeführt werden, wenn sie beim Durchgehen richtig ausgeführt wird.

Es ist wichtig, daran zu denken, dass Ihre Probe sauerstoffarm bleibt, indem Sie den Sauerstoff wiederholt durch Argonnen ersetzen, und wenn Sie die Kammer zusammenbauen, indem Sie das Deckglas schnell über Ihre Probe legen und in die Gehäuselösung tauchen.