Transfektion, Selektion und Colony-Picking für Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit einem GFP-Gen in die AAVS1 Safe Harbor TALEN ziel

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Isolat AA im Vergleich zu einem Safe Harbor, gezielten induzierbaren pluripotenten Stammzellen oder IPSC-Klonen zu erzeugen, die GFP exprimieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein AAV mit einem Krallen und einem A VS einem C-A-G-E-G-F-P-Donor-Plasmid durch Nukleoaffektion effizient in IPCs eingebracht wird. Im zweiten Schritt werden die Zielzellen A a vs. eins durch pur Mycin auf embryonalen Feederzellen der Maus selektiert.

Als nächstes werden die einzelnen GFP-Klone, die A A VS one exprimieren, in eine mit Matrigel beschichtete 96-Well-Platte gepickt. Im letzten Schritt werden die Klone A A VS one G-F-P-I-P-S-C mit E 8 Medium und Standard-IPSC-Kulturtechniken erweitert. Letztendlich werden Immunfluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie verwendet, um die einheitliche und robuste Expression von GFP in AA VS One-zielgerichteten humanen IPSC-Klonen zu zeigen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Kolonie-Auswahl eine Mikrodissektion der Zielklone mit speziellen Kolonie-Picking-Werkzeugen unter einem Mikroskop beinhalten, was während des Side-by-Side-Unterrichts schwer zu erlernen ist. Beginnen Sie damit, die IPSC-Kulturen jeweils einmal mit PBS zu waschen. Geben Sie dann einen Milliliter 37 Grad Celsius sanftes Dissoziationsreagenz in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für etwa fünf Minuten, wenn mehr als 50 % der Zellen aus dem Kulturgefäß dissoziiert sind.

Verwenden Sie eine Pipette P 1000, um verbleibende Zellklumpen oder anhaftende Zellen mechanisch aufzubrechen. Geben Sie dann zwei Milliliter E 8 Medium in jede Vertiefung und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Kulturen weiter in Einzelzellsuspensionen zu zerlegen. Nun die geernteten Zellen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen geben und nach unten schleudern.

Das Pellet wird zum Zählen in einer minimalen Menge E acht Medium wieder suspendiert. Nach Bestätigung der Lebensfähigkeit der Kulturen durch Trianblau-Ausschluss sowie ihrer ausreichenden Dissoziation wurden jeweils 3 Millionen Zellen in zwei konische 15-Milliliter-Röhrchen übertragen, während die zentrifugierenden Zellen das Elektroporationssystem auf das zelltypspezifische Programm für die humane embryonale Stammzelllinie H neun einstellten. Dann fügen Sie 10 Mikrogramm des homologen Rekombinationsspenders allein zu einem Pellet für die Kontrollprobe und 10 Mikrogramm des homologen Rekombinationsspenderplasmids hinzu, zusammen mit fünf Mikrogramm jedes Talon-Plasmids für die Versuchsprobe.

Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter vollständige Transfektionslösung mit drei Primärzellen bei Raumtemperatur zu jedem der Kontroll- und Versuchspellets hinzu und resuspendieren Sie die Zellen. Übertragen Sie die Proben in einzelne Küvetten und essen Sie die Proben direkt nach der Transfektion. Geben Sie 500 Mikroliter E 8 Medium bei Raumtemperatur zu jedem Q vet und überführen Sie dann die transfizierten IPSC-Proben tropfenweise in einzelne 10-Zentimeter-Schalen, die DR vier embryonale Fibroblasten der Maus enthalten. Bevor Sie die Kolonien auswählen, lehren Sie eine 96-Well-Platte mit 50 Mikrolitern Basalmembran-Matrix-Lösung gut und lagern Sie die Platte dann am nächsten Morgen über Nacht bei vier Grad Celsius.

Wenn die Platte Raumtemperatur erreicht hat, aspirieren Sie die überschüssige Lösung und befüllen Sie jede Vertiefung mit 100 Mikrolitern E 8 Medium, ergänzt mit 10 Mikromolar Y 2 7 6 3 2. Stellen Sie anschließend ein inverses Mikroskop in eine biologische Sicherheitswerkbank und sterilisieren Sie es mit einem leichten Spray aus 70%igem Ethanol. Platzieren Sie dann eine Weidepipette aus Glas über einem Bunsenbrenner, um nach der Sterilisation mit 70% Ethanol ein Koloniepickwerkzeug mit einem winzigen Haken an der Spitze zu erstellen.

Setzen Sie den Haken zum Trocknen in die Haube ein und legen Sie dann die IPSE-Kultur auf den Mikroskoptisch, um die Klone zu entnehmen. Lokalisieren Sie ein geeignetes Volk unter geringer Vergrößerung und verwenden Sie das Koloniepickwerkzeug, um es nachzuzeichnen und zu vierteln. Kratzen Sie dann vorsichtig die geviertelte Kolonie aus dem Kulturgefäß und verwenden Sie eine auf etwa 30 Mikroliter eingestellte P 200-Pipette, um die frei schwebenden IPCs zu sammeln, die die Zellen direkt auf die Basalmembranmatrix plattieren.

Bei der Ernte sollten sich die IPCs innerhalb von zwei bis vier Stunden nach dem Plattieren anheften. Zum Schluss inkubieren Sie die gepflückten Kolonien über Nacht bei 37 Grad Celsius und frischen die Zellen am nächsten Morgen mit vollständigem E 8 Medium auf. Es ist wichtig, während des gesamten Experiments nur hochwertige I PSCs zu transfizieren.

Die IPSC-Kulturen sollten hauptsächlich unterschiedliche Kolonien enthalten, die eine kopfsteinpflasterartige Morphologie aufweisen, wie die hier gezeigten Zellen, und die differenzierten Zellen sollten nicht mehr als 10% der Kultur ausmachen, die Transfektfähigkeit der IPCs kann mit dem kleinen PAX GFP-Vektor beurteilt und optimiert werden, da die Transfektion mit PAX GFP aufgrund ihrer geringen Größe typischerweise die maximal erreichbare Effizienz darstellt. Die transiente Expression eines A VS One C-A-G-E-G-F-P Intels und transfizierter IPCs erreicht 48 bis 72 Stunden nach der Transfektion ihren Höhepunkt, was bei einem kleinen Teil der transfizierten Zellen durch Durchflusszytometrie bestätigt werden kann. Die Transfektionseffizienz kann stark variieren.

Selbst in Experimenten mit einem GFP-positiven Anteil von nur 10% sollten einzelne Klone, die eine einheitliche Fluoreszenz aufweisen, groß genug für die Koloniepickerei nach reiner Mycinselektion sein. Darüber hinaus sollten die erweiterten Ziel-IPSC-Klone, sobald sie sich in der 96er-Well-Formatierung befinden, eine stabile und einheitliche Expression von GFP aufweisen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie I-PSCs effizient durch nukleare Einwirkung transfiziert werden können und wie Sie AV in einem sicheren Hafen isolieren können.

IPSE-Klone mit Hilfe von Kolonie-Picking-Tools ins Visier genommen.