Name: Untersuchung Mast Cell Sekretgranula; von Biosynthese zu Exocytosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 1 s
Description: Lernen Sie die Untersuchung von Mastzell-Sekretgranula von der Biosynthese bis zur Exocytose. Diese Methode nutzt fluoreszente Reportergene und konfokale Bildgebung zur Analyse der Granularentwicklung.

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Wir danken Dr. U. Ashery für das Geschenk des NPY-mRFP cDNA. Wir danken Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani und Y. Zilberstein für wertvolle Unterstützung mit Mikroskopie und Bildanalyse. Wir danken auch Dr. Joseph Orly für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der Israel Science Foundation, durch die Israel Akademie der Wissenschaften gegründet, unterstützt (1139-1112 zu RS-E.).

1. Vorbereitung der RBL Zellkulturmedien <ol><li> Mischungs 500 ml niedrigen Glucose Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 56 ml fötalem Rinderserum (dies macht 10% FBS), und fügen 5.5 ml Penicillin Streptomycin (dies macht ~ 1% PEST). </li><li> Filtern Sie die Medien mit 500-1000 ml Bottle-Top Vakuumfilter mit 0,22 um Porengröße und bei 4 ° C. </li></ol> 2. Kultur der RBL-Zellen <ol><li> Wachsen RBL-Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C entweder in Platten oder Flaschen. RBL-Zellen, die in 10 cm-Platten wachsen, sollte mit 10 ml Medium, ergänzt werden und bilden konfluente Monoschicht von ~ 10 7 Zellen / Platte. </li><li> Wenn die Zellschicht nähert Fluss, Ausstrich der Kultur bei einer geringeren Dichte. <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium von der Platte / Kolben mit einer sterilen Pasteur-Pipette, um Vakuum verbunden. </li><li> Spülen Sie die Zellschicht mit vorgewärmten (37° C) 0,25% Trypsin / EDTA, die die gesamte Monoschicht (das Volumen ist abhängig von der Größe der Kulturplatte / Kolben erstreckt; 2 ml für 10-cm-Platte). Dadurch werden die Zellen abzulösen. </li><li> Alternativ spülen die Zellschicht mit Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), entfernen Sie die PBS und fügen vorgewärmten (37 ° C) Trypsin / EDTA. Dieser Schritt löst die Zellen schneller. </li><li> Legen Sie die Platte / Kolben in einem Brutschrank bei 37 ° C (nicht mehr als 10 min). </li><li> Überprüfen Sie die Zellen unter dem Lichtmikroskop zu überprüfen, ob sie gelöst haben. Wenn die Zellen nicht nach 10 Minuten zu lösen, klopfen Sie leicht auf der Platte / Kolben. </li><li> Hinzufügen Medium zur Kulturplatte / Kolben, um die Zellen zu suspendieren (das Volumen des Mediums sollte mindestens 2-fach größer ist als das Volumen der Trypsinlösung). </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für 3 Minuten bei 200 g bei 25 ° C. </li><li> Die Zellen in Medium. Verdünnen Sie die Zellen durch 1.10 und Samen in einem neuen Kulturschale. Inkubieren Sie die Zellen für 48-72 Stunden, bis sie REACh ca. 90% Konfluenz. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang (Abschnitt 2.2.1-2.2.8) für bis zu 3 Monate (30 Stellen). </li></ol></li></ol> 3. Herstellung der Transfektion Medien. <ol><li> Vorbereiten einer 100 mM Lösung von K-Pipes pH 7, 1 mM Lösung von Ca 2+ Acetat und 100 mM Lösung von Mg 2+ Acetat. </li><li> Verdünne das 100 mM Lösung von K-Pipes pH 7 in 20 mM mit DMEM-Medium, fügen die 1 mM Lösung von Ca 2+ Acetat zu einer Endkonzentration von 10 uM und 100 mM Lösung von Mg 2+ Acetat zu einer Endkonzentration von 2 mM. </li><li> Wiegen Kaliumglutamat und zu der Lösung bis zu einer Endkonzentration von 128 mM, gut mischen und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. Halten Sie die weiteren Lösungswege (dh., K-Rohre, die Ca 2+ Acetat, Mg 2+ Acetat) bei -20 ° C. </li></ol> 4. Transfektion von RBL-Zellen <ol><li> Entfernen Sie das Kulturmedium von der Platte / Kolben mit einsterilen Pasteur-Pipette, um Unterdruck verbunden ist. </li><li> Spülen der Zellschicht mit vorgewärmten (37 ° C) Trypsin / EDTA, die die gesamte Monoschicht abdecken sollte. Legen Sie die Platte / Kolben in einem Brutschrank bei 37 ° C (nicht mehr als 10 min). Überprüfen Sie, ob die Zellen gelöst mit dem Lichtmikroskop. </li><li> Hinzufügen Medium zur Kulturplatte / Kolben, um die Zellen zu suspendieren (das Volumen des Mediums sollte mindestens 2 größer mehr als das Volumen der Trypsinlösung sein). </li><li> Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit Zählkammer. </li><li> Pelle 1,5 × 10 7 Zellen wurden durch Zentrifugation für 3 Minuten bei 200 × g bei 25 ° C. Die Überstände verwerfen und fügen Sie 280 ul von Transfektionsmedium. Übertragen Sie die Reaktionsmischung in 4 mm Küvette. </li><li> In 20 ug NPY-mRFP Plasmid und entweder 30 ug der Steuer leeren Plasmid oder einem Plasmid getestet. Das Endvolumen der Reaktionsmischung sollte 300 &amp; mgr; l sein. </li><li> Unmittelbar danach auf Eis für 10 min. Reinigen Sie die Küvette von Restwasser und p9 ms roceed der Elektroporation bei 300 V. </li><li> Für Messungen der Exozytose, Ausstrich die Zellen sofort in 24-Well-Gewebekulturplatten mit 300 &amp; mgr; l Medium. Hinzufügen 8 ul des Reaktionsgemisches (4 × 10 5 Zellen) in jede Vertiefung. In 4 x 10 5 nicht transfizierten Zellen auf weitere Bohrungen zur Kontrolle. Bereiten Sie genügend Brunnen für den zumindest zwei Vertiefungen für jede Behandlung für jede Transfektion. </li><li> Für Zeitraffer-Mikroskopie, Ausstrich die Zellen sofort in einem 8-Well-Kammerdeckglas Borosilikat-System, das 80 &amp; mgr; l Medium. Hinzufügen von 1,5 ul der Reaktionsmischung (7,5 × 10 4 Zellen) zu jeder Kammer. (Versuchen Sie zu vermeiden, mit den Kammern am Rand des Deckglas, sind die Kammern in der Mitte des Deckglas leichter Bild). Hinweis: Es ist wichtig, nicht alle Zellen als Reaktion auf ein Trigger- und gelegentlich die Zeitraffermikroskopie wird durch den Verlust der Ausrichtung und Verschiebung der 8-Well-Kammer Boro aufgehobensilicat Deckglas-System. Daher werden mindestens 8 Kammern für jede Behandlung für jede Transfektion. </li><li> Zur Sensibilisierung der Zellen für FcsRI vermittelte Aktivierung wird mit 1 ug / ml Maus DNP spezifische monoklonale IgE an die Medien (Inkubieren der Zellen mit IgE für mindestens 2 h). </li><li> Nach 18 bis 24 Stunden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Zellen zum Ausdruck bringen, die die Plasmide. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen der Fluoreszenz mRFP sind: &amp; lambda; ex 584, &amp; lambda; em 607 nm. NPY-mRFP sollte in vesikuläre Strukturen, die den SGs entsprechen scheinen. Wenn das zweite Gen von Interesse an eine fluoreszierende Markierung fusioniert ist mit einem Fluoreszenzmikroskop, um die Co-Expression von beiden Plasmiden in derselben Zelle zu bestätigen. Wenn beispielsweise der geprüfte Gens mit GFP fusioniert ist, die Anregungs- und Emissionswellenlängen von GFP-Fluoreszenz sind: &amp; lambda; ex 488, &amp; lambda; em 507 nm. Die GFP-markierte Protein sollte an den gleichen Zellen, die NPY-mRFP Ausdruck erscheinen. </li><li> Für Exozytose Messungen gehen to Schritt 5 und für Zeitraffer-Mikroskopie, fahren Sie mit Schritt 6 fort. </li></ol> 5. Mess NPY-mRFP Exocytosis <ol><li> Vorbereitung der Tyrode-Puffer: <ol><li> Es wird eine Lösung von 54 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 2,74 M NaCl und 8 mM NaH 2 PO 4 in DDW. Gut mischen und bei 4 ° C. Dieser Schritt ist für die Herstellung der 20x Tyrode Puffer. </li><li> Eine Lösung aus 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl 2, 1 mg / ml BSA, 5,6 mM Glucose und 1 bis 20 Verdünnung Tyrode 20x in DDW und gut mischen. Dieser Schritt ist für die Herstellung von 1x Tyrode Puffer. </li><li> Aliquot der 1x Tyrode Puffer und bei -20 ° C. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen. </li></ol></li><li> Entfernen Sie das Kulturmedium aus der 24-Well-Platte und 3 x waschen mit Tyrode-Puffer. Bereiten unstimulierten Zellen durch Zugabe von 200 ul Tyrode Puffer in Vertiefungen zu steuern. </li><li> Herstellung von 10 &amp; mgr; l / Vertiefung 20X konzentriert Aktivierungsreagenz [(zB 1.000 ng / ml DNP-BSA oder DNP-HSA (Ag), 200 &amp; mgr; M Ca 2+ Ionophor (zB 23187), und eine Kombination von 20 &amp; mgr; M Ca 2+ Ionophor und 1.000 nM 12-O- Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA)]. Wenn die Reagenzien in DMSO aufbewahrt, verdünnt den Reagenzien in 20x Konzentration in Tyrode-Puffer, der 1% DMSO. Bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Entfernen Sie die Überstände der Vertiefungen sorgfältig auf eine Platte mit 96 Vertiefungen, setzen auf Eis und vor Licht zu vermeiden. (Die Überstände enthalten, die das chimäre Peptid NPY-mRFP, die von den Zellen freigesetzt wurde). </li><li> Gib 200 ul Tyrode-Puffer, der 0,5% Triton X-100 in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 10 min. (Dieser Schritt ist wichtig für die Herstellung von Zelllysaten, die die restlichen von NPY-mRFP, die nicht aus den Zellen freigesetzt wurde, enthalten). Sammeln Sie die Zelllysate und Transfer zu einer Platte mit 96 Vertiefungen, setzen auf Eis und vor Licht zu vermeiden. </li><li> Messen der Fluoreszenz der Zellüberstände und Zelllysate unter Verwendung eines fluoreszierrenzPlattenLeseGerät, mit einem 590-, 20 nm Bandbreite Anregungsfilter und 635-, 35 nm Bandbreite Emissionsfilter. </li><li> Der prozentuale Anteil von NPY-mRFP Freigabe: HINWEIS: Der Fluoreszenzreader Maßnahme willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU). AFU Werte hängen von der Maschine und ihrer Empfindlichkeit und der Transfektionseffizienz. <ol><li> Stellen Sie die Autofluoreszenz der nichttransfizierten RBL-Zellen als leer. Teilen Sie die AFU jedes Überstands auf die Gesamtfluoreszenz (AFU der Überstände + AFU des entsprechenden Lysat) und mit 100 multipliziert. </li></ol></li></ol> 6. Zeitraffer-Mikroskopie der Exozytose <ol><li> Saatgut, 7,5 × 10 4 der transfizierten Zellen / Kammer in einem 8-Well-Kammerdeckgläser Borosilikat Systems. Nach 18 bis 24 Stunden, entfernen Sie das Kulturmedium aus den Kammern und wäscht 3 mal mit Tyrode-Puffer </li><li> In 72 ul Tyrode Puffer zu jeder Kammer. Verdünnen Sie die Aktivierungsreagenzien in Tyrode-Puffer zu 10x Konzentration. </li> &lt;li&gt; Verwenden Sie einen konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit einer beheizten Kammer (37 ° C) und CO 2-Controller (4,8%) und einem 40X oder 63X Ziel ausgestattet. Schalten Sie den Mikroskopsysteme: Quecksilberlampe, Computer und Laser. Stellen Sie sicher, dass die beheizte Kammer ist mit der richtigen Temperatur vor Beginn des Experiments. </li><li> Legen Sie die Kammer in der beheizten Kammer und stellen Sie sicher, dass die Kammer richtig und stabil installiert ist. </li><li> Schalten Sie das Fluoreszenzlicht nach dem jeweiligen Fluorophor und visualisieren transfizierten Zellen. Schalten Fluoreszenz sobald eine Zelle von Interesse ist auf dem Gebiet, um das Bleichen und Zytotoxizität zu minimieren. Es ist wichtig, dass dieser Bereich ungefähr 2-3 transfizierte Zellen enthalten. Die transfizierten Zellen sollten gut verteilt werden, jedoch nicht gegenseitig berühren. </li><li> Stellen Sie die Laserleistung (abhängig von dem Mikroskop), um Rauschen und Übersättigung sowie Toxizität zu minimieren, und stellen Sie die Verstärkung und Offset, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu ändern. Schnell einscannen oderder die Dauer der Laserexposition (Durchschnitt 2) zu minimieren. </li><li> Stellen Sie die Lochblendengröße zu einem Maximum, dies ermöglicht die Verringerung der Laserleistung und die Bilder für einen langen Zeitraum ausgerichtet zu halten. Wenn gewünscht, stellen Sie die Parameter für die Z-Stack, um das Bild im dreidimensionalen, stellen Sie die Lochgröße auf 1 luftigen Einheit (AU), die das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu erwerben gibt und sukzessive Abtasten der zweidimensionalen konfokalen optischen Scheiben in die Rekonstruktion die z-Achse mit optischen Scheiben ≤0.7 um. </li><li> Stellen Sie das Zeitintervall zwischen jedem Erwerb nach 15-30 sec und die Dauer der gesamten Anschaffungs bis 15 Minuten und starten Sie die Erfassung von Bildern. Nach 5 Minuten des Erwerbs halten Sie den Zeitreihen. In 8 ul der 10-fach Trigger und weiter die Übernahme sofort. </li><li> Speichern Sie die Bilder, führen Entfaltung mit einem Entfaltungs Software und rekonstruieren die Stapel, um dreidimensionale Bilder und zu einem Film mit Imaris Software. </li></ol><ol><li> Importieren Sie die Daten aus den entfalteten Zeitreihe Bilder, die von der konfokalen Fluoreszenzmikroskop zu Imaris Software erhalten. Diese Software liest über 40 Mikroskopie-Dateien. Wenn die Software die Dateien nicht lesen; die Dateien zu konvertieren, um TIF-Dateien und Import. </li><li> Zur Zeit zeigt auf das Ende eines offenen Datensatzes drücken bearbeiten hinzufügen -&gt; Add Zeitpunkte und importieren Sie die neuen Datensatzes. </li><li> Erstelle Oberfläche des mRFP Kanal mit Option Oberfläche Assistenten. Wählen Sie den Standard-Algorithmus. Wählen Sie den Kanal von NPY-mRFP. Markieren Sie die Option Glätten um Lärm zu reduzieren. Um einen Datenverlust zu vermeiden, von kleinen Details reduzieren den Bereich Detailebene bis 0,05 um. </li><li> Stellen Sie die Intensitätsschwelle. New graue Fläche angezeigt. Gehen Sie auf &quot;Einstellungen&quot; und schalten Sie den Stil von &quot;Mittelpunkt&quot; auf &quot;Surface&quot;. </li><li> Gehen Sie zur Registerkarte Statistik in den Eigenschaften des ausgewählten Objekts, wählen Sie die Registerkarte Detail und den spezifischen Wert such als Fluoreszenz-Intensität, Volumen usw. </li><li> Überprüfen Sie die Daten und bestätigen Sie, dass die Werte mit den Bildern kompatibel sind. Beispielsweise könnten zwei oder mehr benachbarten Körnchen als eine größere Granulat gemessen werden. Zur Quantifizierung der durchschnittlichen Korngröße zu teilen, die Größe der zusammengeführten Granulate auf die tatsächliche Anzahl der Körnchen. </li><li> Exportieren Sie die gewünschten Datensätze in Excel-Dateien und die Daten analysieren. </li></ol> f

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Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte.

Wir beschreiben eine innovative Strategie, die Quantifizierung von MCs Exozytose und vier (x, y, z, t) Dimension Quantifizierungen kombiniert mit zeitversetzt dreidimensionale Abbildung der SGs in lebenden Zellen mit einem Reportergen zur Exozytose. Diese Technik ermöglicht Screening von Proteinfamilien auf ihre Auswirkungen auf MC-Funktion wie die Überwachung SGs bereits ab ihrem Austritt aus dem Golgi durch ihre Reifung, Erwerb von Exozytose Kompetenz und Degranulation. Die Kombination von Messungen der Exozytose mit ...

Mastzellen (MC) sind Immunzellen, die am besten für ihre Beteiligung an allergischen und entzündlichen Reaktionen wie Arthritis, Asthma, eosinophile Ösophagitis, chronische Hautentzündung und anaphylaktischer Schock 1,2 sowie andere Erkrankungen, einschließlich koronarer Herzkrankheit 3,5 und bekannt sind, Krebs 3,4. Darüber hinaus spielen MCs eine wichtige Rolle bei angeborenen und erworbenen Immunität, die beide in der Wirtsabwehr gegen Bakterien und Parasiten und durch Unterdrückung von Immunreaktionen, zum Beispiel induziert Transplantattoleranz 5,6. MCs stammen aus dem Knochenmark, die Entwicklung von CD34 + / CD117 + pluripotenten Vorläuferzellen 7. Engagierte Knochenmarksvorläuferzellen MC sind in die Blutbahn und wandern in den peripheren Geweben zu lokalisieren überwiegend im Bindegewebe und Epithel-Oberflächen 8. Reifung und terminale Differenzierung werden schließlich unter dem Einfluss o erreichtf Zytokine innerhalb der umgebenden Milieu 8,9. MCs kann durch ein Allergen (Antigen, Ag), deren Zusammentreffen führte zur Erzeugung von Immunglobulin E (IgE) Antikörper vom Typ aktiviert werden. Die Bindung eines solchen IgE an den MC FcsRI Rezeptoren, gefolgt von Vernetzen des zellgebundenen IgE bei erneutem Kontakt zu derselben Ag, Ergebnis in FcsRI Aggregation und Einleitung einer Signalkaskade, die in Mastzelldegranulation gipfelt [in 10,11 Bewertung] . MCs werden ebenfalls aktiviert, unabhängig von IgE durch Neuropeptide 5,12, Toxine 13, bakterielle und virale Antigene, 14,15, eine Reihe von positiv geladenen Peptide kollektiv als Grund Sekretagoga, Immunzellen und Zytokinen 5,13,12,16 bezeichnet , 17. MCs werden auch von vielen ihrer eigenen freigesetzten Mediatoren, die weiter verstärken die entzündliche Reaktion aktiviert. MCs mit sekretorischen Granula (DMS), die Immun enthalten verpacktRegelungsmediatoren einschließlich vasoaktive Amine, wie Histamin und Serotonin (bei ​​Nagern), Proteoglykane, Proteasen, wie Chymosin und Tryptase, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und verschiedene Zytokine und Chemokine 8,9. Diese Mediatoren sind &quot;ready to go&quot; und einmal MCs werden durch einen geeigneten Stimulus aktiviert werden diese Mediatoren aus den Zellen durch Exozytose (Degranulation) in einer Angelegenheit von Sekunden bis Minuten 18,19 freigegeben. Diese erste Veranstaltung wird von der De-novo-Synthese und Freisetzung von einer großen Auswahl an biologisch wirksamer Stoffe, einschließlich Arachidonsäure-Metaboliten, mehrere Zytokine und Chemokine 20,21,22 gefolgt. Freisetzung von neu synthetisierten Produkte erfolgt unabhängig von SG-Release. Zusammengenommen sind diese Mediatoren initiieren frühen und späten Phase entzündliche und allergische Reaktionen. Daher Verständnis der Mechanismen Anteil von MC-Aktivierung und Degranulation sind beide von theoretischen und klinischen importance. Die Schwierigkeit genetisch zu manipulieren primären und kultiviert MCs hat die Versuche, die Mechanismen MC Degranulation zugrunde, die schlecht aufgelöste blieb Aufklärung behindert. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir ein Reporter basierten Assay durch Co-Transfizieren des Schleimhaut-Mastzelllinie, Ratte Basophilenleukämie entwickelt (RBL) -2H3 (hierin als RBL bezeichnet) oder Knochenmark-abgeleitete (MCS BMMCs) 30 mit einem Gen von Interesse und Neuropeptid Y (NPY), fusioniert an monomeren RFP (mRFP) als SG Reporter. NPY wurde zuvor gezeigt, daß das Verhalten des endogenen SG Marker in anderen Systemen zu rekapitulieren. Da außerdem mRFP Fluoreszenz pH unempfindlich Expression von NPY-mRFP ermöglicht die Visualisierung der sauren SGs sowie quantitative Beurteilung der Exozytose durch Verwendung von 96-Well-Platten und einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät. Wir haben gezeigt, dass NPY-mRFP ist mit den sauren SGs von RBL-Zellen und BMMCs geliefert und wird aus den Zellen freigesetztin einer regulierten Weise neben dem endogenen SG Ladung (dh β-Hexosaminidase und Serotonin) 30, 32. Dieses Protokoll bietet eine hochauflösende Bildgebung basierende Methodik, die Screening Gene von Interesse für ihre phänotypische und funktionelle Auswirkungen auf SG Eigenschaften und Degranulation in RBL-Zellen 32 erlaubt. Insbesondere ermöglicht dieses Protokoll in Echtzeit-Verfolgung von MC SGs und Quantifizierung von deren Fläche oder Volumen Größe, ihrer Zahl, Kinetik der Montage, ihre Bewegung entlang der Zelle Zytoskeletts und ihre endgültige Fusion mit der Plasmamembran unter verschiedenen Bedingungen. Beispielsweise Sensibilisierung der Zellen mit DNP-spezifische IgE und Triggerung der Zellen mit einer multivalenten Ag (DNP konjugiert Serumalbumin) unter verschiedenen Störungen (dh Knockdown von Genen von Interesse, über die Expression von wt oder mutierten Genen oder pharmakologischen Manipulationen) und im Vergleich zu Kontrollzellen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td>Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>GE Gesundheitswesen Biowissenschaften</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Lebenstechnologien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celluloseacetat-Membran, Porengröße 0,22&nbsp; &mu; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning mit Gewebekulturen behandelte Kulturschalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Lösung (TE)</td><td>Life-Technologien</td><td>R001100</td><td>Warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>ROHRE Dikaliumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Calciumacetat-Hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetat-Tetrahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutaminsäure, Kaliumsalz-Monohydrat (Kaliumglutamat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>4 mm Elektroporationsküvetten,</td><td>Zellprojekte</td><td>, EP-104</td><td></td></tr><tr><td>GENPULSER MIT PULSREGLER & CAPACITANCE</td><td>Bio rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kammer-Deckglas</td><td>Thermowissenschaftliches</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>24 Well, flacher Boden</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3524</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Well-Platten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3367 oder CLS390</td><td></td></tr><tr><td>96 Well-Plattenfluoreszenz-Reader - Infinite 200</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium-Ionophor A23187</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7522</td><td></td></tr><tr><td>12-O-Tetradecanoyl-13-acetat (TPA)</td> vor direkter Lichteinwirkung <td>vermeidenCalbiochem</td><td>P3766</td><td></td></tr><tr><td>monoklonales Anti-DNP-IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406</td><td></td></tr><tr><td>DNP-BSA/ DNP-HAS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661</td><td>Direkte Lichteinwirkung vermeiden</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Fluoreszenzmikroskop:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Zeiss LSM 510</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 invertiert</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>BITLANE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft exel oder Prism oder andere Analysesoftware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anderes Reagenz:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>MERK</td><td>5833</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>MERK</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid&nbsp;</td><td>MERK</td><td>2382</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>BDH Laboratorien</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>Mononatriumphosphat&nbsp;</td><td>MERK</td><td>5345</td><td></td></tr><tr><td>Steriles Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung mast cell sekretgranula; von biosynthese zu exocytosis

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mastzellen (MC) sind sekretorische Zellen des Immunsystems, die den physiologischen und pathologischen Funktionen durch Lösen vorgeformt und neu synthetisierten allergischen, entzündlichen und immunMediaToren erreichen. MCs &quot;Mediatoren beeinflussen mehrere Gewebe und Organe ihren Höhepunkt in Allergien und Immunreaktionen. Die Synthese, Speicherung und Freisetzung der MC Mediatoren sind stark reguliert. Die vorgeformten Mediatoren in zytoplasmatischen sekretorischen Granula (SG), die mit der Plasmamembran verschmelzen und ihr Inhalt durch regulierte Exozytose verpackt. Wir stellen ein Protokoll, bezogen auf die Co-Expression eines Gens von Interesse mit einem Reportergen, das auf das SGs richtet ist und in einer geregelten Art und Weise entlang der endogenen Mediatoren freigesetzt SG. Das Protokoll ermöglicht hochauflösende vierdimensionalen konfokalen Analysen des MC SGs und Überwachung der Zeitleiste aus Biogenese ausgelöst Exozytose. Somit kann unter Verwendung dieses Protokolls zum Screenen Genen interest für ihre phänotypische und funktionelle Auswirkungen ermöglicht die Entschlüsselung der molekularen Mechanismen, die Biogenese und Exozytose des MC SGs zu regieren und die Ermittlung der Regulierungsbehörden beteiligt. Dabei sollten weitere Einblicke in die zellulären Mechanismen, die für die MCs Funktion in Gesundheit und Krankheit Konto zur Verfügung gestellt werden.

Wegen der geringen Transfektionseffizienz von MCs sind genetische Manipulationen kaum einen Einfluss auf die Messwerte von durchschnittlich Sekretion von endogenen Mediatoren gemessen SGs verlassen. Dennoch indem vollständige Co-Expression des Reportergens NPY-mRFP und der co-transfizierten Plasmid in die gleichen Zellen, die Überwachung der NPY-mRFP Ergebnisse der Überwachung ausschließlich der Zellpopulation, die das Gen von Interesse exprimiert. Daher ist der Vorteil dieses Assays im Vergleich zu herkömmlichen Verfah...

Das Ziel des vorliegenden Protokolls war es, eine Methode, die funktionelle Genomanalysen von Mastzellen Sekretion ermöglichen entwickeln wird. Das Protokoll basiert auf einer quantitativen Beurteilung der Freisetzung eines fluoreszierenden Reporter-Gen mit dem Gen von Interesse und den Echtzeit cotrasfected Analysen der sekretorischen Granula Morphologie.

Untersuchung Mast Cell Sekretgranula; von Biosynthese zu Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Mechanismen zu untersuchen, die die Entwicklung von Mastzellen, sekretorischen Granula und Zytose regulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Mastzellen mit einem Reportergen für Exozytose sowie einem Gen der Untersuchung kotransfiziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, den Einfluss des getesteten Gens auf die Exozytose zu bewerten, indem die Zellen stimuliert und das fluoreszierende Signal des Reportergens während der Exozytose überwacht wird.Anschließend wird der Einfluss des getesteten Gens auf die Bildung und Entwicklung von sekretorischen Granula in Mastzellen mittels konfokaler Bildgebung des Reporter Gens bewertet, das in den sekretorischen Granula lokalisiert ist. Der letzte Schritt besteht in der Durchführung einer morphometrischen Analyse der sekretorischen Granula. Letztendlich dient die Fluoreszenzmarkierung der sekretorischen Granula von Mastzellen mittels eines Reporter Gens dazu, Veränderungen in der Entwicklung der sekretorischen Granula und deren Exozytose in Mastzellen aufzuzeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Messung der Freisetzung endogener Mediatore

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt einen kolorimetrischen Assay zur Bestimmung der Degranulationsaktivität von Mastzellen. Das von den Mastzellen freigesetzte Enzym hydrolysiert das Substrat und produziert ein farbiges Produkt. Die Degranulationsaktivität der Mastzellen wurde gemessen, da sich die prozentuale Freisetzung von Enzymen außerhalb der Zelle mit dem Gesamtenzymgehalt in der Zelle normalisierte.

Mastzell-Degranulationsassay zur Untersuchung der Wirkung einer Zielchemikalie

Dieses Video zeigt die Mastzell-Exozytose, die durch ein aktivierendes Reagenz induziert wird, das ein Calcium-Ionophor enthält und die Freisetzung von sekretorischen Granulaten initiiert, die das fluoreszierende Reporterprotein NPY-mRFP enthalten. Anschließend beurteilen wir die Exozytose quantitativ, indem wir das freigesetzte NPY-mRFP mit einem Fluoreszenzplatten-Reader messen.

Messung der Mastzell-Exozytose über die Freisetzung von monomeren rotfluoreszierenden Neuropeptid-Y-Proteinen

Dieses Video zeigt eine Technik zur Visualisierung von Exozytose in Mastzellen. Die Zellen werden mit FITC-Dextran – einem fluoreszierenden Reporter – inkubiert, das von Zellen in sekretorischen Granulaten (SGs) aufgenommen wird, wo der saure pH-Wert seine Fluoreszenz löscht. Bei Stimulation der Granula-Exozytose induziert der höhere pH-Wert des Mediums eine Reporterfluoreszenz innerhalb der fusionierten SGs, die mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wird.

Eine in vitro Technik zur Visualisierung der Exozytose von sekretorischen Granula in Mastzellen

Mastzelldegranulation, die Freisetzung von allergischen Mediatoren ist in Allergie, Asthma und Parasiten Verteidigung wichtig. Hier haben wir Techniken 1 für die Beurteilung Auswirkungen von Drogen und Giften auf Degranulation demonstrieren, Methodik kürzlich genutzt, um die leistungsfähige hemmende Wirkung von antibakteriellen Wirkstoff Triclosan 2 aufweisen.

Ein Mikroplatten Assay Chemical Auswirkungen auf die RBL-2H3 Mastzelldegranulation bewerten: Effekte von Triclosan ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung von in vitro abgeleiteten Mastzellen, deren Engraftierung in Mastzell-Mäuse und die Analyse des Phänotyps, der Anzahl und der Verteilung von transplantierten Mastzellen an verschiedenen anatomischen Standorten. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Funktionen von Mastzellen in vivozu bewerten.

Analysieren der Funktionen von Mastzellen in Vivo mit ' MastCell Knock-in' Mäuse

Osmotischen Stress wirkt sich Exozytose und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt während dieses Prozesses. Wir zeigen, wie Kombination elektrochemische Methoden zusammen mit Transmissions-Elektronenmikroskopie kann verwendet werden, um die Wirkung von extrazellulärer osmotischer Druck auf Exozytose Aktivität, Vesikel Quanten Größe und die Menge der Neurotransmitter freigesetzt untersuchen während der Exozytose.

Überwachung der Wirkung des osmotischen Druckes auf sekretorischen Vesikel und Exozytose

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu isolieren und kultivieren murinen peritonealen Mastzellen. Wir beschreiben auch zwei Protokolle für ihre funktionelle Charakterisierung: eine fluoreszierende Imaging der intrazellulären freien Ca2 + Konzentration und eine Degranulation Assay anhand der kolorimetrischen Quantifizierung der veröffentlichten β-Hexosaminidase.

Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca2 +-imaging und Degranulation Assays

Hier zeigen wir eine Methode für das live Cell Imaging von regulierten Exozytose. Diese Methode nutzt FITC-Dextran, die reichert sich in Lysosomen-bezogene Organellen, als Reporter. Diese einfache Methode ermöglicht auch die Unterscheidung zwischen verschiedenen Modi der regulierten Exozytose in Zellen, die schwer zu genetisch zu manipulieren sind.

Imaging-FITC-Dextran als Reporter für regulierte Exozytose

Die Live-Bildgebung der lysosomalen Exozytose auf mikromusterten Zellen ermöglicht eine räumliche Quantifizierung dieses Prozesses. Morphologie-Normalisierung mit Mikromustern ist ein hervorragendes Werkzeug, um allgemeine Regeln über die räumliche Verteilung zellulärer Prozesse aufzudecken.

Quantifizierung der raumzeitlichen Parameter der zellulären Exozytose in mikrogemusterten Zellen

Hier beschreiben wir die erste Good Manufacturing Practice (GMP)-kompatiblen Verfahren zur Herstellung virus-spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) aus Nabelschnurblut, eine Quelle von überwiegend naiven T-Zellen.

Ausbau zytotoxische T-Lymphozyten aus Nabelschnurblut, dass Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Virus und Adenovirus

Lernen Sie die Untersuchung von Mastzell-Sekretgranula von der Biosynthese bis zur Exocytose. Diese Methode nutzt fluoreszente Reportergene und konfokale Bildgebung zur Analyse der Granularentwicklung.

Untersuchung Mast Cell Sekretgranula; von Biosynthese zu Exocytosis

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