Name: In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Lernen Sie die Calcium-Imaging-Methode für das enterische Nervensystem in Darmpräparationen. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen neuronaler und glialer Aktivität zur Erforschung von Darmfunktionen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Pharmaceutical Research and Manufacturers Association of America (PhRMA) Foundation (an B. Gulbransen), des Stipendiums K12 HD065879 der National Institutes of Health (Building Interdisciplinary Research Careers in Women's Health) (B. Gulbransen) und Startkapital der Michigan State University (B. Gulbransen) unterstützt.

HINWEIS: Die folgenden Verfahren mit Gewebe von Labortieren entsprechen den AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren 2013 und wurden im Vorfeld von der Michigan State University IACUC zugelassen. 1. Gewebepräparation <ol><li> Anesthetize Forschungstier in einer Kammer, die 2,5% Isofluran in Sauerstoff oder indem 3-5 ml Flüssigkeit Isofluran auf ein saugfähiges Material, auf dem Boden der Kammer, so dass eine physikalische Barriere verhindert Tiere vor einem direkten Kontakt mit der Isofluran. Test für die Tiefe der Anästhesie durch Einklemmen der Fußballen. HINWEIS: Die Narkosetiefe wird als angemessen erachtet, wenn es keinen Rückzug Reflex der hinteren Gliedmaßen. Sobald angemessen betäubt, einschläfern die Maus durch Genickbruch </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage und reinigen Bauchhaut mit 70% Ethanol. Verwenden einer Pinzette, um Bauchhaut eingeklemmt an der Mittellinie und verwenden chirurgische Scheren, ein 6 cm Medien machenl Schnitt entlang der Linea alba, interne Verdauungsorgane aussetzen. </li><li> Verwenden stumpfen Pinzette zu finden und setzen den Ileum in das Bauchfell. Schneiden Sie das Ileum / Doppelpunkt Gekröse mit Schere und beginnen Entschlüsselung der Darm. </li><li> Sobald die Länge des Darms ausreichend aufgeklärt, schneiden den Darm distal zum Magen und proximal zum Blinddarm eine Ileum Zubereitung. Für eine Dickdarmvorbereitung, schneiden Sie den Doppelpunkt distal der Blinddarm und proximal des Mastdarms. </li><li> Schnelles Entfernen des Darmsegment und legen Sie sie in ein Becherglas mit DMEM / F12-Medium mit 3 uM Nicardipinhydrochlorid und 1 uM Scopolamin-Hydrochlorid ergänzt auf Eis (im Folgenden als &quot;Medien&quot; bezeichnet). Die Zugabe dieser Inhibitoren erleichtert Mikrodissektion und die anschließende Bildgebung durch Lähmung der Darm glatten Muskulatur. </li><li> Geschnittenen Segmentes von Interesse (zB, Jejunum, Ileum, distalen oder proximalen Kolon) basierend auf den bekannten anatomischen Markierungen. Typischerweise utilize Gewebe vom distalen Ileum oder distale Kolon. Allerdings haben das gleiche Verfahren, um in allen Darmabschnitten zu isolieren, Last und Bild myentericus Neuronen und Gliazellen. </li><li> Entfernen Sie ein kleines Segment (4-6 cm) der gewünschten Darmsegment und in ein Sylgard-beschichtete Petrischale mit Kalt Medien gefüllt. </li><li> Sichern Sie das proximale und distale Ende des Darmsegment mit Insekten Stifte und öffnen Sie das Darmrohr, indem Sie eine gerade, in Längsrichtung des mesenterialen Grenze geschnitten. </li><li> Pin Flachgewebe unter leichter Spannung mit Schleimhautseite nach oben und sorgfältig sezieren entfernt Schleimhautschicht mit feinen Pinzetten (# 5 und # 5/45 funktionieren am besten) und sehr feine Feder Schere. HINWEIS: Die Entfernung der Schleimhaut kann für die ENS ziemlich traumatisch sein, wenn nicht richtig gemacht. Zur Qualitätspräparate, achten Sie darauf, abrupten Entfernung der Schleimhaut durch Schälen oder Abschaben begrenzen. Die beste Vorgehensweise ist es, die Schleimhaut zu heben und unter schneiden mit einer feinen Schere. </li><li> Schneiden Sie das Gewebe in kleinere Vorbereitungs (etwa 0,5 cm 2) und der Stift in die Abbildungsschalen (4 Ecken mit kreisförmigen Muskelschicht nach oben) auf Eis mit frischen Medien platziert. </li><li> Sorgfältig sezieren entfernt Ringmuskel durch Auseinander necken mit feinen Pinzette, um den Plexus myentericus aus. Vermeiden Sie übermäßige Dehnung. </li><li> Zeigen Bildschale wieder auf Eis und Veränderung Lösung durch frische Medien. </li><li> Planen 2 ml Enzymmischung pro Schale [Dispase 1 U / ml (4,48 mg / 8 ml), Collagenase Typ II 150 U / ml (5,45 mg / 8 ml) in Medium]. </li><li> Gerichte entfernen aus Eis und fügen Sie die Enzymmischung aus Schritt 1.13. </li><li> Geschirr Inkubieren bei RT für 15 min mit 5% CO 2/95% Luft. </li><li> Wash Gewebepräparaten mit Medien 3 Mal und wieder Stift Ecken. </li></ol> 2. Laden Fluo-4 Dye HINWEIS: Vermeiden Sie Photobleichung durch die Zusammenarbeit mit begrenztem Licht beim Umgang mit Fluoreszenzfarbstoffen und Gewebe mit Indikatorfarbstoffe geladen. <ol><li> Bereiten Sie 4 uM Fluo-4 Beladungslösung. <ol><li> 1,5 ml Medium und 1,2 ul einer 250 mM Probenecid Lager in ein 1,5-ul-Aliquot von 4 mM Fluo-4 auf Lager. Bis 50 &amp; mgr; g Fluo-4 AM; 4 mM Fluo-4 Lager wird durch Zugabe von 11,4 &amp; mgr; l Pluronic F-127 (0,25% Cremaphor-EL ergänzt 20% DMSO) hergestellt. </li></ol></li><li> Minipreps Inkubieren in Fluo-4 Aufgabelösung für 45 min in einem dunklen Inkubator bei 37 ° C. </li><li> Von Inkubator ausziehen und Vorbereitungen mit Medien 3 mal. </li><li> Austauschmedium für Medien, enthaltend 200 uM Probenecid und Inkubation 15 min bei 37 ° C vor der Bilderzeugung. HINWEIS: Probenecid ist ein Medikament, das Multidrug-Resistenz-Transporter in Nervenzellen hemmt. Die Zugabe dieses Medikament hemmt die Fähigkeit der Neuronen Farbstoffe extrudieren und verbessert neuronalen Kennzeichnung. Massenladens von Ca 2+ Indikatorfarbstoffen in Abwesenheit von Probenecid produziert Gliazellen Belastung. Die Zugabe von Probenecid ermöglicht die Visualisierung der neuronalen und glialen Antworten. </li><li> Bereiten Geändert Krebs Puffer. <ol><li> Machen eine modifizierte Krebs-Puffer, so daß die Endkonzentrationen (in mM) der Komponenten sind wie folgt: 121 NaCl, 5,9 KCl, 2,5 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4, 10 HEPES, 21,2 NaHCO 3, 1 Brenztrauben Säure und 8 Glucose (pH-Wert mit NaOH auf 7,4 eingestellt). In 3 uM Nicardipin und 1 uM Scopolamin zu Muskelkontraktionen während Ca 2+ hemmt Bildgebung und ganze-mount Dissektionen. </li></ol></li></ol> 3. Imaging and Analysis HINWEIS: Verwenden Sie zumindest ein grundbildgebende Anlage mit einer Leuchtstofflampe, Mikroskop, einer Qualität CCD-Kamera und entsprechende Erfassungssoftware. Variieren die Zugabe von anderen Komponenten in Abhängigkeit von der Lichtquelle und der spezifischen Anwendung. Ein Filterrad und Verschluss muss mit einem herkömmlichen Xenon-Bogenlichtquelle verwendet werden. Allerdings sind LED-Lichtquellen und Beleuchtungssysteme erfordern diese Komponenten. <ol><li> Positionieren Sie die recording Kammer unter dem Mikroskop und mit einem Schwerkraftfluss Perfusionssystem mit mehreren beheizten Spritze Reservoirs ein ständiger Perfusionsrate von 2-3 ml / min von 37 ° C Krebs-Puffer. Achten Sie darauf, die Luftblasenbildung sowohl in der Eingangs- und Saugleitung an eine Vakuumfalle verbunden zu verhindern. </li><li> Bringen Sie die gewünschten Plexus in den Fokus unter Hellfeldbeleuchtung. Vermeiden Sie eine Überbelichtung Gewebe, das auf ein Foto, Bleich führen kann. </li><li> Untersuchen Sie die Fluo-4 Belastung innerhalb Ganglien und wählen gesunden Ganglien für die Bildgebung. Ungesunde / beschädigt Ganglien wird Autofluoreszenz oder punktförmige Morphologie aufweisen und sollte nicht für die Bildgebung verwendet werden. </li><li> Sobald Ganglion ausgewählt ist, abzulenken Lichtweg zur Kamera und Livebild mit Bildaufnahme-Software zu erhalten. Stellen Sie sicher, dass die Ganglien ist scharf und stellen Bildaufnahmerate und Belichtungszeiten. HINWEIS: Bildaufnahmeraten und Zeiten je nach den Ereignissen Ermittler aufnehmen möchten variieren. Für die meisten Experimente, Bilderwerden traditionell bei 0,5-1 Hz für Gliazellen und bis erworben 2-10 Hz für Neuronen aufgrund glial Ca 2+ Reaktionen sind nicht so schnell wie Ca 2+ Transienten in Neuronen. </li><li> Beginnen Sie experimentieren und zu etablieren Grundaktivität für 30 Sekunden. </li><li> Anwenden vorgewärmten Drogen von Interesse, wie Agonisten und Antagonisten unter Verwendung der Schwerkraftströmung Perfusionssystem mit einer Geschwindigkeit von 2-3 ml / min. Folgen Anwendung von Agonisten / Antagonisten durch die Rückkehr zu einer normalen Perfusion von Puffer und ermöglichen eine Wäsche / Erholungszeit von mindestens 10 min. HINWEIS: Die Drug Application-Zeiten hängen von der einzelnen Verbindung und experimentelles Design variieren. Im Allgemeinen ist ein 20-30 sec Anwendung Agonist ausreichend G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Neuronen und Gliazellen aktivieren. Jedoch ligandengesteuerten Ionenkanäle (wie Nikotinacetylcholinrezeptoren) erfordern Anwendungszeiten von nicht mehr als 5-10 sec. Weitere Dauer Expositionen verursachen Liganden gesteuerte Ionenkanäle, schnell desensitize. Antagonisten sollte für ca. 3-15 Minuten angewendet werden, um eine vollständige Blockade des Rezeptors Wege zu gewährleisten. Dies ist jedoch eine grobe Verallgemeinerung und Ermittler sollten immer optimieren jede experimentelle Droge in ihrem jeweiligen Paradigma. </li><li> Stoppen Sie die Aufnahme und Ansicht Zeitraffer-Film des Experiments. Sorgfältig ausgewählte Regions of Interest (ROI) mit dem entsprechenden Bildanalyse-Software. </li><li> Verwenden Sie Software, um zu normalisieren und vergleichen ROI Fluoreszenzintensität gegen seine ursprüngliche Ausgangsfluoreszenzwert. Veränderungen normalisierten Fluoreszenz direkt proportional zu den Änderungen der [Ca2 +]. <ol><li> Verwenden einer Modifikation eines Verfahrens unter Verwendung &amp; Delta; F / F = ((F 1 - F 0) / F 0), die vorher beschrieben 26 ROI - ((F 1 - F 0) / F 0) Hintergrund, wobei F1 die Fluoreszenz bei einer gegebenen Punkt und F0 ist die Grundlinie Fluoreszenz, um die Beurteilung Genauigkeit zu verbessern. Diese Modifikation Hilfsmittelbei der Verringerung der Lärm von Fluoreszenzänderungen in Gewebepräparaten, die Bewegung zu zeigen von der Muskelschicht der Plexus myentericus zugrunde liegen. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die in diesem Manuskript beschriebenen Methoden bieten einen konsistenten Ansatz zur effektiven Untersuchung von Neuronen und enterischen Gliazellen in der ENS. Obwohl die Bildgebung von Neuronen und enterischen Gliazellen in Kultur eine Fülle von Einblicken in die Funktion einzelner Zellen geliefert hat, ist die Untersuchung dieser Zellen in ihrer nativen, mehrzelligen Umgebung entscheidend für unser Verständnis ihrer Physiologie und Pathophysiologie. Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine entscheidende Technik zur Beurteilung multidirektionaler Wechselwirkungen von Zellen im ENS. Loading-Zellen des ENS mit selektiven Fluoreszenzmarkern und Bildaufnahme mit hochauflösender Mikroskopie ermöglichen quantitative Beobachtungen der zellulären Aktivität im ENS. Die Bildgebung von lebenden Gewebeproben des ENS erfolgt relativ schnell und erzeugt große Mengen an detaillierten funktionellen und räumlichen Daten. Präparate des myenterischen und submukösen Plexus der Maus, die in diesen Experimenten verwendet werden, ermöglichen molekulare und genetische Manipulationsansätze. Die Ca2+ -Bildgebung in Ganzpräparationen bietet ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung von Neuron-Glia-Interaktionen.
In fortschrittlichen experimentellen Paradigmen können mehrere Sonden kombiniert werden, um Informationen über verschiedene Ereignisse innerhalb der Zellen zu erhalten. Mit der Fluoreszenzmikroskopie können Bilder mit erhöhtem Kontrast bestimmter Moleküle aufgezeichnet werden, wenn eine geeignete Fluoreszenzmarkierung verwendet wird. Fluo-4 wurde gewählt, weil es einen großen Dynamikbereich besitzt. Eine ausreichende Inkubationszeit ist bei der Verwendung der AM-Farbstoffe in ENS von entscheidender Bedeutung. Die Farbstoffkonzentration und die Beladungsmethode müssen möglicherweise angepasst werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen. Ideale Präparate sollten mit ausreichend Farbstoff beladen sein, um Änderungen der Fluoreszenz sichtbar zu machen, aber nicht so sehr, dass der Farbstoff die Zielionen chelatisiert und die intrazelluläre Signalübertragung stört. Die Exposition gegenüber Fluoreszenzlicht sollte begrenzt werden, um Phototoxizität in Zellen und Photobleiche von Farbstoffen zu verhindern. 
Die Untersucher müssen bei mehreren Schritten dieses Experiments vorsichtig sein, insbesondere bei der Lösungs- und Gewebevorbereitung. Bei der Verarbeitung und Dissektion von ENS-Gewebe ist besondere Vorsicht geboten, um die zellulären Funktionen zu erhalten. Der Magen-Darm-Trakt enthält mehrere Schichten und Gewebevarianten, die eine Herausforderung für die Dissektions- und Bildgebungsqualität dieser Ganzpräparate darstellen 27. Darüber hinaus sind die miteinander verbundenen Faserbahnen des MP breiter und die Ganglien größer als die des SMP 2. Die neuronale Dichte des Plexus myentericus ist höher als die des Plexus submukösus 28. Langsame und ungenaue Dissektionen wirken sich nachteilig auf die Qualität der Plexuspräparate und damit auf den Gesamterfolg der Experimente aus. Daher sind saubere/unbeschädigte Werkzeuge, Übung und handwerkliches Geschick entscheidend für dieses Verfahren. 
Bei Whole-Mount-Gewebepräparaten sollte bei der Erstellung der Regionen von Interesse (ROI) sorgfältig überlegt werden, um die Kinetik und den Grad der beobachteten Änderung der Fluoreszenzintensität des gewünschten Zelltyps korrekt zu beurteilen. Da sich die Ganglien auf einer kontraktilen Muskelschicht befinden, sind Bewegungsartefakte, die durch die Darmmotilität verursacht werden, ein Hauptproblem bei der In-situ-Bildgebung . Die Unterdrückung dieser Bewegungsstörungen durch erneutes Fixieren von Gewebepräparaten nach der Inkubation mit Enzymen und die Zugabe von pharmakologischer Hemmung (Nicardipin/Scopolamin) zu den Puffern ermöglicht somit eine klare und zuverlässige Bildaufnahme. Neben der Pharmakologie und mechanischen Ansätzen zur Verhinderung von Gewebebewegungen veranschaulichen neuere Studien die Anwendung fortschrittlicher Softwaremethoden und Zelltyp-Reaktionsmerkmale, um die verbleibende Gewebebewegung in den Aufzeichnungen zu korrigieren und die Genauigkeit der Analyse zu verbessern 29. Abgesehen von diesen technischen Hürden bietet diese Methode physiologisch relevante Bedingungen, um morphologische und quantitative Eigenschaften von Neuronen und enterischen Gliazellen in der ENS zu beurteilen.

Das enterische Nervensystem (ENS) ist in zwei ganglionated Plexus in der Wand des Verdauungstraktes 1 eingebettet organisiert. Diese intramuskuläre neuronalen Schaltkreise, die Plexus myentericus (MP) und submuköse Plexus (SMP), werden von Neuronen und Glia magensaftresistenten (Abbildung 1) 2 zusammen. Die MP und SMP Regulierung gastrointestinale (GI) Funktionen wie Motilität und epithelialen Absorption und Sekretion bzw. 3. Magensaftresistente Gliazellen sind in unmittelbarer Nähe zu Neuronen im Ganglion aber Populationen von magensaftresistenten Glia befindet Darüber hinaus bestehen innerhalb verbindenden Faserbahnen und außerGangLien Teile der Darmwand 3,4. Magensaftresistente Gliazellen wurden ursprünglich angenommen, dass nur nutritive Unterstützung Neuronen liefern. Doch neuere Studien deuten stark darauf hin, dass Neuron-Glia Interaktionen sind für die ENS-Funktionen 5,6. Zum Beispiel Daten zeigen, dass enterische Glia &quot;hören&quot; neuronale Aktivität 7und Modulieren neuronaler Schaltkreise 6,8, enterischen Neuronen zu schützen vor oxidativem Stress 9 und sind in der Lage zur Erzeugung von neuen enterischen Neuronen in Reaktion auf eine Verletzung 10,11. Die in diesem Beitrag vorgestellten Protokoll bietet eine einfache und robuste Methode, um das komplexe Zusammenspiel von Neuronen und Glia enterische Verwendung von in situ intrazellulären Ca 2+ Bildgebung zu untersuchen. Ca 2+ ist ein allgegenwärtiges Signalmolekül in erregbaren Zellen und spielt eine wesentliche Rolle bei der synaptischen Signalereignisse im Nervensystem 12. Die Anregung der Neuronen oder Gliazellen ente löst eine Erhebung in cytoplasmatischen Ca 2+ -Konzentration entweder durch Einstrom durch Ca 2+ durchlässige Kanäle oder Ca 2+ -Freisetzung aus intrazellulären Kalziumspeichern. Imaging Ca 2+ Transienten in Neuronen und Glia mit fluoreszierenden Farbstoffen ist eine etablierte und weit verbreitete Technik, um die funktionelle Organisation und Dynamik zu studierendie ENS 13-17. Ca2 + Imaging hat sich gezeigt, ein wichtiges Instrument bei der Untersuchung intakt GI Gewebesegmente, um die Ausbreitung der Erregbarkeit durch ICC Schrittmacher Netzwerke 18 und Darm der glatten Muskulatur 19,20 aufzuklären sein. Es ermöglicht es Forschern, ein breites Spektrum von physiologischen Parametern zu untersuchen und liefert Informationen über sowohl die räumliche Verteilung und zeitliche Dynamik. Die Zellen können effizient in einem minimal-invasiven Weise unter Verwendung membranpermeable Fluoreszenzindikatoren und optimierte Färbeprotokollen 21 gefärbt werden. Dies bietet die Möglichkeit, eine große Anzahl von Neuronen und Glia ente in funktionell erhaltenen Zubereitungen 14-16,22 überwachen, sowie in vivo 23. Whole-mount Gewebezubereitungen Masse mit einer hochaffinen Ca 2+ Indikatorfarbstoff beladen, wie Fluo-4, das seine Fluoreszenz steigt, wenn Ca 2+ gebunden. Veränderungen in der Fluoreszenz werden durch eine CCD-Kamera und ana zeichnetensiert digital 6. Das Aufkommen von Ca 2+ bot die Gelegenheit, Neuronen und Gliazellen Zell-Interaktionen, Reaktionsfähigkeit auf verschiedene Reize zu überwachen und die Beteiligung dieser Zelltypen im Magen-Darm-Prozesse in Echtzeit. In situ ist Ca2 + Imaging großen Einblick in die Signalmechanismen von enterischen Neuronen und Glia ergab und besitzt mehrere deutliche Vorteile gegenüber Zellkulturmodellen 6,24. Zum einen in situ Vorbereitungen halten die native Matrix-Umgebung von Neuronen und Glia und lassen den Großteil ihrer Verbindungen zu Gewebe intakt Ziel. Zweitens werden die Genetik und die Morphologie der kultivierten ente Glia signifikant verändert im Vergleich zu in vivo 6,24. Drittens werden viele hetero Wechselwirkungen in primären Zellkultur verloren, und diese Grenzen der Beurteilung der Zell-Zell-Interaktionen. Obwohl kultivierten Zellen sind gut für die Untersuchung der fundamentalen Eigenschaften, die usefulne geeignetss für die Untersuchung komplexer Interaktionen zwischen enterischen Gliazellen und Neuronen ist begrenzt. Untersuchung von Neuron-Glia-Wechselwirkung mit einem in situ Ansatz ist physiologisch relevant wie die synaptischen Bahnen intakt 25 bleiben. Im Vergleich zu Zellkulturansätzen, eine in-situ-Ansatz bietet bessere Bedingungen für die systematische Verständnis der komplexen Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Gliazellen ente. Darüber hinaus ist die planare Organisation der ganglionated Plexus ganz Montage Präparate ideal für Fluoreszenz-Bildgebung des intrazellulären Ca 2+ Transienten und diese Technik bietet eine einfache Methode zur Bewertung Neuron-Glia-Aktivität im ENS.

<table><tbody><tr><td>BubbleStop Spritzenheizung&nbsp;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>10-4-35-G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase, Typ II, Pulver</td><td>Gibco</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42613-33-2</td><td></td></tr><tr><td>Präparierwerkzeuge</td><td>Roboz&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Festtischmikroskop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM Farbstoff</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Insektenstifte</td><td>Fine Science Tools</td><td>Minutien Pins</td><td></td></tr><tr><td>iQ Live Cell Imaging Software</td><td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS-Kamera</td><td>Andor</td><td>Neo 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Nicardipine</td><td>Sigma</td><td>N7510</td><td></td></tr><tr><td>Perfusionskammer</td><td>Kundenspezifische</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Harvard Apparat</td><td>Modell 720</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Molekulare Sonden</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>Scopolamin</td><td>Sigma</td><td>S1013&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sutter Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td>DG-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&nbsp;</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Temperaturregler</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344C</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ ca 2+ imaging des enterischen nervensystems

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Das Reflexverhalten des Darms wird durch das enterische Nervensystem (ENS) gesteuert. Das ENS ist ein integratives Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in zwei ganglionären Plexus, die in der Darmwand untergebracht sind. Enterische Neuronen und enterische Gliazellen sind die einzigen Zelltypen innerhalb der enterischen Ganglien. Die Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen ist für die Koordination der Darmfunktionen verantwortlich. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Beobachtung der Aktivität von Neuronen und Gliazellen innerhalb des intakten ENS durch Abbildung von intrazellulären Calcium (Ca2+)-Transienten mit fluoreszierenden Indikatorfarbstoffen. Im Mittelpunkt unseres Fachgesprächs stehen Methoden zur Ca2+-Bildgebung in Ganzpräparationen des Plexus myentericus aus dem Nagetierdarm. Die Massenbeladung von ENS-Ganz-Mounts mit einem hochaffinen Ca2+-Indikator wie Fluo-4 ermöglicht Messungen der Ca2+-Reaktionen in einzelnen Neuronen oder Gliazellen. Diese Reaktionen können wiederholt und zuverlässig hervorgerufen werden, was quantitative Studien mit pharmakologischen Instrumenten ermöglicht. Die Ca2+-Reaktionen in Zellen des ENS werden mit einem Fluoreszenzmikroskop aufgezeichnet, das mit einer CCD-Kamera (Cooled Charge-Coupled Device) ausgestattet ist. Fluoreszenzmessungen, die mittels Ca2+-Bildgebung in Ganzpräparaten durchgeführt werden, bieten eine einfache Möglichkeit, die Mechanismen und potenziellen funktionellen Konsequenzen von Ca2+-Reaktionen in enterischen Neuronen und Gliazellen zu charakterisieren.

Die richtige Anwendung dieser Technik können Forscher die genaue Messung der intrazellulären Ca 2+ [Ca2 +] i-Transienten in enterischen Neuronen und Glia ganz-mount Gewebezubereitungen. Ein repräsentatives Beispiel für einen Agonisten hervorgerufene Ca 2+ Antworten in Gliazellen in einem myentericus Ganglion von der Maus Doppelpunkt bei Video 1 gezeigt. Die folgenden Ergebnisse sind dazu gedacht, einige repräsentative Ergebnisse, die wir unter Verwendung dieses Verfahrens zu illustrieren. Erstens, Figur 2 zeigt die Ergebnisse eines Experiments Messente glial [Ca 2+] i im Ansprechen auf eine Stimulation durch ATP in Meerschweinchen colonic Längsmuskel-Plexus myentericus (LMMP) Zubereitungen. Insbesondere zeigt diese Figur die Methode für die korrekte Analyse der Versuchsprotokoll vor, einschließlich der Umriss des analysierten myentericus Ganglien und Sternchen bezeichnet die Lage des enterischen Neuronen aufgeführt. Diese Ergebnisse zeigen auch illustrate die optimale Dosis von hundert mikromolaren ATP über die Inanspruchnahme des [Ca 2+] i in Meerschweinchen myentericus Gliazellen. Diese Antwort kann verwendet werden, um enterische Glia-Stimulation zu kalibrieren und zu normalisieren Reaktionen auf Reize zu testen. Nächstes Bild 3 verdeutlicht, wie man richtig wählen Regions of Interest (ROIs) umgeben Gliazellen, mit umgebenden gelben Kreisen gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen auch die gewünschten Fluoreszenzänderungen unter basalen Bedingungen und in Reaktion auf pharmakologische Stimuli. Schließlich Abbildung 4 zeigt die räumliche Überlegungen für die Wahl enterischen Gliazellen und Neuronen für [Ca 2+] i Antworten ganz-Mount-Präparaten. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Organisation der ENS. Die ENS enthält zwei Haupt ganglionated Plexus. Der Plexus myentericus zwischen dem l liegtongitudinal und Kreismuskelschichten. Die submuköse Plexus zwischen der Schleimhaut und der Ringmuskelschicht entfernt. Die ENS ist ausschließlich von Neuronen und Glia ente zusammen. Nervenfaserbahnen verbinden den Ganglien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Enteric Glia im Meerschweinchen Kolon Plexus myentericus reagieren auf in situ ATP. (A) Fluo-4 Fluoreszenz in einem myentericus Ganglien unter basalen Bedingungen (durch eine gestrichelte Linie umrandet). Pfeile zeigen auf dicken interganglionic Faserbahnen. (B) Nach der Stimulation mit 100 mmol / L ATP, Gliazellen, aber nicht Nervenzellen, schnell zu erhöhen Fluo-4 Fluoreszenz, die eine Zunahme der [Ca 2+] <sub&gt; i. Beachten Sie, dass reagierenden Zellen klein sind und umgeben die viel größer Neuronen (durch Sternchen markiert dunklen Räumen). (C) Magensaft Glia ATP reagieren in einer Dosis-abhängige Weise mit 1 mmol / L entlocken Maximalreaktionen 24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um einen Blick Größere Version der Abbildung.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Murine S-100-GFP + Zellen in der Darm Plexus myentericus reagieren auf in situ ATP. (A) S-100-GFP + Gliazellen (grün) in einem Maus Kolon myentericus Ganglien (durch eine gestrichelte Linie umrandet). Sechs Regionen von Interesse (ROIs) umgeben Gliazellen in den Ganglien werden als gelbe Kreise dargestellt. Die Pfeile zeigen die dicken Faserbahnen, die in die Ganglien. Sternchen denote Speicherort 2 enterischen Neuronen. (B) Das gleiche Ganglion zeigt Rhod-2 Fluoreszenz unter basalen Bedingungen. (C) nach Stimulation mit 100 &amp; mgr; mol / l ATP, Gliazellen reagieren mit erhöhter [Ca 2+] i, wie durch erhöhte Rhod- gezeigten 2 Fluoreszenz. (D) Traces auf jede in A-C gezeigt ROI entspricht. (E) Mittelwert der Reaktion (Mittelwert ± SEM) der 6 in D 24 gezeigt ROIs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52506/52506fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Die In-situ-Bildgebung von magensaft Neuron-to-Glia-Kommunikation. (A) Repräsentative Bilder (pseudocolored) von einem Ca 2+ Imaging Experiment, bei dem eine ganze-mountHerstellung des Plexus myentericus wurden mit der neuronalen P2X7-Rezeptor-Agonist BzATP (100 &amp; mgr; M, 30 sec) in Frage gestellt. Man beachte, dass die neuronale Agonisten verursacht eine Erhöhung Fluo4 Fluoreszenz in dem Neuron (A &#39;) vor der umgebenden ente glial Zellen (A &quot;). (B) Analyse der Änderung in der Fluoreszenz mit der Zeit in der Glia (blau) und Neuronen (rote ) bei der Anwendung der neuronalen Agonist BzATP. (C), neuronale und gliale antwortet BzATP in normaler Puffer (durchgezogene Linien) und in einem Puffer mit niedrigem Ca 2+ und Mg 2+ (gestrichelte Linien), die neuronale P2X7-Rezeptoren 13 potenzieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/52506fig4large.jpg" target="_blank">Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Video 1 Agonist hervorgerufene Ca 2+ Reaktion in magensaftresistenten Glia insitu. Dieses Video zeigt eine myentericus Ganglien von der Maus distalen Kolon mit dem Ca 2+ Indikatorfarbstoff Fluo-4 beladen. Die Gliazellen Agonisten, ADP, wird dem Bad zugesetzt, wenn angegeben. ADP ruft eine Erhöhung der intrazellulären Ca 2+ in enterischen Glia durch den vorübergehenden Anstieg in Fluo-4 Fluoreszenz beobachtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52506/JOVE.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.</a>

Das enterische Nervensystem (ENS) ist ein Netzwerk von Neuronen und Gliazellen in der Darmwand, das die Darmreflexe steuert. Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Aufzeichnung der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Lebendpräparaten von ENS unter Verwendung von Ca2+-Bildgebung.

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in lebenden, ganz auspräparierten Darmabschnitten mithilfe fluoreszierender Kalziumindikatorfarbstoffe abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Darmabschnitt vom Tier entfernt und in ein vorgewärmtes Medium gelegt wird. Im zweiten Schritt wird der Darm entlang der mesenterialen Grenze geöffnet und unter leichter Spannung flach fixiert, wobei die Schleimhaut nach oben zeigt.Ganzpräparate des Plexus myentericus werden durch Mikrodissektion hergestellt und in Imaging-Schalen platziert. Anschließend werden die Ganzpräparate mit einem fluoreszierenden Indikatorfarbstoff, Fluohr Vier, in einem Inkubator beladen. In den letzten Schritten werden die beladenen Präparate mit einem fluoreszenzbildgebenden Mikroskop, das mit einer hochauflösenden Kamera ausgestattet ist, die über Software zur Bildaufnahme und -analyse gesteuert wird, abgebildet, um die Grundaktivität aufzuzeichnen.Anschließend werden die untersuchten Wirkstoffe zugegeben und Calciumtransienten in Neuronen und Gliazellen aufgezeichnet, letztlich in situ. Die Calcium-Bildgebung des enterischen Nervensystems dient dazu, zu untersuchen, wie die zelluläre Aktivität in Neuronen und Gliazellen zur Regulation physiologischer Darmfunktionen sowie zur Dysfunktion des enterischen Nervensystems bei Darmerkrankungen beiträgt.Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Etablierung eines Verständnisses der Physiologie und Pathophysiologie funktioneller Darmerkrankungen und entzündlicher Darmerkrankungen durch die Anwendung einer einfachen und robusten Methode, um das komplexe Zusammenspiel zwischen Neuronen und enterischen Gliazellen mittels NC-Zwei-Calcium-Bildgebung zu untersuchen. Diese Methode wird David frei für Wissenschaftler aus meinem Labor zugänglich gemacht. Die folgenden Verfahren mit Gewebe von Laborversuchstieren entsprechen den A VMA-Richtlinien für die Tötung von Tieren aus dem Jahr 2013 und wurden im Voraus von der Michigan State University I-A-C-U-C genehmigt. Nachdem das Tier gemäß den genehmigten Verfahren getötet wurde, positionieren Sie es in Rückenlage und desinfizieren Sie die Bauchhaut mit 70 %igem Ethanol. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Bauchhaut in der Mittellinie einzuklemmen, und führen Sie dann mit einer Schere einen sechs Zentimeter langen medianen Schnitt entlang der Linea alba durch, um die inneren Verdauungsorgane freizulegen.Verwenden Sie anschließend stumpfe Pinzette, um den Dickdarm innerhalb des Peritoneums zu lokalisieren und freizulegen. Durchtrennen Sie das Mesenterium des Ileozäkums mit der Schere und beginnen Sie, den Darm abzuwickeln. Sobald die Länge des Darms ausreichend abgewickelt ist, durchtrennen Sie den Dickdarm distal zum Z盲kum und proximal zum Mastdarm, um den Dickdarm vorzubereiten, wie dies in diesem Video gezeigt wird.Entfernen Sie dann schnell das Darmsegment und legen Sie es in ein Becherglas mit DM EMF 12 Medium, das mit drei Mikromolar Nicardipinhydrochlorid und einem Mikromolar S-Scopolaminhydrochlorid versetzt und auf Eis gekühlt ist. Die Zugabe dieser Inhibitoren erleichtert die Mikrodissektion und die anschließende Bildgebung, indem sie die glatte Darmmuskulatur lähmt. Entnehmen Sie ein kleines vier bis sechs Zentimeter langes Segment des gewünschten Darmabschnitts und geben Sie es in eine mit Sylgard beschichtete Petrischale, die mit gekühltem, supplementiertem Medium gefüllt ist.Befestigen Sie dann die proximalen und distalen Enden des Darmabschnitts mit Insektennadeln und öffnen Sie das Darmrohr, indem Sie einen geraden Längsschnitt entlang der mesenterialen Grenze ausführen. Nun fixieren Sie das Gewebe flach unter leichter Spannung mit der Mukosa-Seite nach oben und dissezieren Sie vorsichtig die Mukosaschicht ab, indem Sie die Mukosa mit feinen Pinzettenspitzen der Größe fünf anheben und darunter mit sehr feinen Feder-Scheren schneiden. Schneiden Sie das Gewebe in kleinere Präparate von etwa 0,5 Quadratzentimetern zu und legen Sie jedes Stück in eine Bildgebungsschale, die mit ergänztem Medium gefüllt ist, und stellen Sie es auf Eis.Fixieren Sie jede Probe an den vier Ecken mit der Ringschicht nach oben. Dissezieren Sie vorsichtig die Ringschicht, indem Sie sie mit feinen Pinzetten auseinanderziehen. Um das Plexus myentericus freizulegen, vermeiden Sie übermäßiges Dehnen, stellen Sie die Imaging-Schalen zurück auf Eis und ersetzen Sie die Lösung in jeder Schale durch frisches ergänztes Medium.Als Nächstes nehmen Sie die Schalen von Eis und geben zwei Milliliter Enzymgemisch zu jeder Schale hinzu. Inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft. Schließlich waschen Sie die Gewebepräparate dreimal mit Medium und spülen dabei die Ecken aus, während Sie unter lichtbegrenzten Bedingungen arbeiten, um eine Photobleiche zu vermeiden, mit 1,5 Milliliter supplementiertem Medium und 1,2 Mikroliter einer 250 Millimolar Probit-Standardlösung sowie 1,5 Mikroliter Eloqua einer vier Millimolar Fluro-vier-Standardlösung, um insgesamt etwa 1,5 Milliliter Fluro-vier-Lösung in die Bildgebungsschalen zu geben. Inkubieren Sie die Schalen 45 Minuten lang in einem dunklen Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Schalen aus dem Inkubator genommen haben, waschen Sie die Präparate dreimal mit Medium.Anschießend frisches Medium mit 200 Mikromolar Propionsäure hinzufügen, um die neuronale Markierung zu verbessern, und wie zuvor 15 Minuten inkubieren. Während der Inkubation einen modifizierten Krebs-Puffer gemäß den Anweisungen im schriftlichen Teil des Protokolls herstellen und 3 Mikromolar Nicardipin sowie 1 Mikromolar Scopolamin hinzufügen, um Muskelkontraktionen zu hemmen. Bei der Kalzium-2+-Bildgebung und den Ganzpräparat-Präparationen die Aufzeichnungskammer unter dem Fluoreszenzmikroskop positionieren und ein Perfusionssystem mit Schwerkraftfluss sowie mehreren beheizten Spritzenreservoiren verwenden.Stellen Sie eine kontinuierliche Perfusionsrate von zwei bis drei Milliliter pro Minute von 37 Grad Celsius warmer Krebs-Pufferlösung ein. Achten Sie darauf, die Bildung von Luftblasen sowohl in der Zuleitung als auch in der Absaugleitung, die mit einer Vakuumfalle verbunden ist, zu vermeiden. Bringen Sie das gewünschte Plexusgewebe unter Hellfeldbeleuchtung in den Fokus.Vermeiden Sie eine Überbelichtung des Gewebes, die zu einer Photobleiche führen kann. Überprüfen Sie die Beladung mit Fluoh4 in den Ganglien und wählen Sie gesunde Ganglien für die Bildgebung aus. Unhealthy geschädigte Ganglien weisen Autofluoreszenz oder eine punktförmige Morphologie auf und sollten nicht für die Bildgebung verwendet werden.Wenn ein Ganglion ausgewählt wurde, leiten Sie den Lichtweg zur Kamera um und erhalten Sie ein Live-Bild. Stellen Sie mit der Bildakquisitionssoftware sicher, dass das Ganglion scharfgestellt ist, und legen Sie die Bildaufnahmerate sowie die Belichtungszeiten fest. Die Bildaufnahmeraten und -zeiten variieren je nach den Ereignissen, die die Untersuchenden aufzeichnen möchten. Bei den meisten Experimenten werden Bilder traditionell mit 0,5 bis einem Hertz für Gliazellen und bis zu zwei bis zehn Hertz aufgenommen.Bei Neuronen, da die kalziumtransienten in Gliazellen nicht so schnell sind wie die kalziumtransienten in Neuronen, Aufnahme starten und die physiologische Basisaktivität des ausgewählten Ganglions ohne experimentelle Reize 30 Sekunden lang aufzeichnen. Anschließend vorgewärmte Substanzen wie Rezeptoragonisten und -antagonisten mittels eines Gravitations-Perfusionssystems mit einer Flussrate von zwei bis drei Milliliter pro Minute gemäß eines optimierten Protokolls für die jeweilige Substanz applizieren. Die Aufnahme beenden und den Zeitrafferfilm des Experiments betrachten.Wählen Sie die interessierenden Bereiche oder ROIs sorgfältig mithilfe der geeigneten Bildanalyse-Software aus. Normalisieren und vergleichen Sie abschließend die fluoreszente Intensität der interessierenden Bereiche mit der entsprechenden Anfangsbasislinie, indem Sie geeignete Bildverarbeitungssoftware verwenden. Änderungen im normalisierten Fluoreszenzwert sind direkt proportional zu Änderungen in der Kalziumkonzentration. Die folgenden drei Bilder zeigen, dass enterische Gliazellen im Meerschweinchen auf einen TP in situ reagieren.Unter basalen Bedingungen ist ein geringes Fluoro-vier-Fluoreszenzniveau, wie durch die gestrichelte Linie dargestellt, sichtbar. Die Pfeile zeigen auf dicke interganglionäre Faserzüge; nach Stimulation mit 100 µmol/L ATP nehmen gliale Zellen, jedoch nicht Neurone, rasch die Fluoro-vier-Fluoreszenz zu, was auf einen Anstieg des Calciums hinweist. Beachten Sie, dass die reagierenden Zellen klein sind und die viel größeren, durch dunkle Bereiche gekennzeichneten Neurone umgeben, die mit einem Sternchen markiert sind.Dieses Histogramm zeigt, dass enterische Gliazellen auf einen TP dosisabhängig reagieren, wobei ein Millimol pro Liter maximale Antworten hervorruft. Dieses Video zeigt ein Myenterisches Ganglion aus dem distalen Kolon der Maus, das mit einem Calcium-zwei-plus-Indikatorfarbstoff, Fluo-4, beladen ist. Der glialen Zellen aktivierende Wirkstoff ADP wird zum Bad hinzugefügt, wenn angegeben.Ein DP löst eine Erhöhung des intrazellulären Kalziums zwei plus in enterischen Gliazellen aus, wie durch die vorübergehende Zunahme der Fluoreszenz von Flu oh vier beobachtet werden kann. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das komplexe Zusammenspiel zwischen Neuronen und Gliazellen mittels Kalzium-Bildgebung genau untersuchen kann. Die Charakterisierung der Mechanismen und möglichen funktionellen Konsequenzen von Kalziumantworten in Ganzpräparaten erfordert präzise Dissektionen, um eine optimale Bildqualität zu gewährleisten.Die Verwendung fluoreszenter Markierungen und pharmakologischer Stimuli innerhalb dieser mikroskopiebasierten Technik ermöglicht eine verbesserte Beurteilung dieser Zellen in ihrem nativen multizellulären Umfeld.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll zeigt, wie Spannungs-sensitiven Farbstoffen optische Erfassung der elektrischen Aktivität ermöglichen aus intakten neuronalen Netzen wie dem Plexus des Meerschweinchens enterale Nervensystem, mit einer einstellbaren Auflösung reicht von Einzel-Zellen zu multi-ganglionären Schaltung.

Optische Erfassung der elektrischen Aktivität in Guinea-pig Enteric Networks mit spannungsabhängigen Farbstoffen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung enterischer Gliazellen aus der Submukosa und der Lamina propria des Mausdarms. Es werden die Schritte beschrieben, die bei der Extraktion von Submukosa- und Lamina propria-Gewebe, der Isolierung der enterischen Gliazellen und der Kultivierung der Zellen auf einer beschichteten Well-Platte zur Etablierung einer enterischen Gliazellkultur erforderlich sind.

Isolierung enterischer Gliazellen aus der Submukosa und der Lamina propria einer Maus

Dieses Video zeigt die Immunfärbung des embryonalen murinen Magen-Darm-Trakts, um die Verteilung der neuronalen Population mittels Immunfluoreszenz und konfokaler Mikroskopie zu visualisieren und zu analysieren.

Immunfluoreszenzfärbung neuronaler Populationen im embryonalen gastrointestinalen Trakt der Maus

Quelle: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+{{}} Bildgebung des enterischen Nervensystems. J. Vis. Exp.  (2015){{}}Dieses Video demonstriert Kalzium Bildgebung zur Visualisierung und Analyse der Aktivität von enterischen Neuronen und Gliazellen in Präparaten des myenterischen Plexus colon der Maus.

Calcium-Bildgebung von enterischen Neuronen- und Gliaaktivitäten in einem myenterischen Plexus des Dickdarms der Maus

Quelle: Doser, R., et al. Subzelluläre Bildgebung des neuronalen Kalziumumgangs in vivo. J. Vis. Exp. (2023)Dieses Video zeigt in vivo die Bildgebung des subzellulären Kalziumflusses in den ventralen Nervenstrangneuronen von transgenen Caenorhabditis elegans-Stämmen. Es werden zwei unterschiedliche Kalziumindikatoren verwendet: ein zytoplasmatischer Indikator in einem Stamm und ein mitochondrialer Indikator in einem anderen. Neuronen werden unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, um...

Bildgebung der subzellulären Kalziumdynamik in Neuronen von Caenorhabditis elegans

Wir demonstrieren ein Zellkulturprotokoll für die direkte Untersuchung von neuronalen und glialen Komponenten des enterischen Nervensystems. Eine Neuron/Glia-Mischkultur auf Deckgläsern wird aus dem myenterischen Plexus einer adulten Maus hergestellt und bietet die Möglichkeit, die Funktion einzelner Neuronen und Gliazellen elektrophysiologisch, immunhistochemisch usw. zu untersuchen.

Ein<em&gt; In-vitro</em&gt; Vorbereitung von isolierten Neuronen und Glia Enteric vom Plexus myentericus der erwachsenen Maus

Das enterische Nervensystem wird von Neuralleistenzellen gebildet, die sich vermehren, wandern und den Darm besiedeln. Neuralleistenzellen differenzieren sich in Neuronen mit Markern, die spezifisch für ihren Neurotransmitter-Phänotyp sind. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zum Präparieren, Fixieren und Immunfärben des embryonalen Magen-Darm-Trakts der Maus, um die Expression von Neurotransmittern des enterischen Nervensystems sichtbar zu machen.

Immunfärbung zu Murine enterische Nervensystem Entwicklung visualisieren

Dieser Artikel beschreibt eine Videobildgebungstechnik und hochauflösende raumzeitliche Kartierung, um Veränderungen in der neuronalen Regulation der Dickdarmmotilität bei erwachsenen Mäusen zu identifizieren. Subtile Auswirkungen auf die gastrointestinale Funktion (GI) können mit diesem Ansatz in isolierten Gewebepräparaten nachgewiesen werden, um unser Verständnis von GI-Erkrankungen zu verbessern.

Video Imaging und Raum-Zeit-Karten zur Analyse Gastrointestinale Motilität bei Mäusen

Mesenteriale afferente Nerven übermitteln Informationen aus dem Magen-Darm-Trakt zum Gehirn bezüglich der normalen Homöostase sowie der Pathophysiologie. Die Aktivität des gastrointestinalen afferenten Nervs kann beurteilt werden, indem isolierte Darmsegmente mit angeschlossenen afferenten Nerven in ein Organbad eingebaut, der Nerv isoliert und die basale sowie stimulierte Aktivität beurteilt werden.

In - vitro - Aufnahme von Mesenteriale afferenten Nervenaktivität in Maus - Jejunal und Kolon - Segmente

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie ermöglicht eine markierungsfreie Bildgebung von Biomolekülen basierend auf ihrer intrinsischen Schwingung spezifischer chemischer Bindungen. In diesem Protokoll wird der instrumentelle Aufbau eines integrierten SRS- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops beschrieben, um zelluläre Strukturen im Rückenmark lebender Mäuse sichtbar zu machen.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca2+ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Lernen Sie die Calcium-Imaging-Methode für das enterische Nervensystem in Darmpräparationen. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Beobachtungen neuronaler und glialer Aktivität zur Erforschung von Darmfunktionen.

In Situ Ca ²⁺ Imaging des enterischen Nervensystems

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