Name: Die Beurteilung Transmissible Spongiforme Enzephalopathie Artgrenzen mit ein In-vitro- Prion Protein-Umwandlungsassay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Erfahren Sie, wie ein In-vitro-Prion-Protein-Umwandlungsassay die Artgrenze von übertragbaren spongiformen Enzephalopathien bewertet. Diese Methode ersetzt Tierversuche durch Gewebeproben und nutzt die Konversionseffizienzrate zur Risikobewertung.

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Wir danken John Olsen (Wisconsin Department of Natural Resources), Tom Cooley, Daniel O'Brien und Steve Schmitt (Michigan Department of Natural Resources) und Dr. Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) für ihre Unterstützung bei der Gewebeakquise. Wir danken auch dem Wisconsin State Laboratory of Hygiene für die diagnostischen Tests und Dr. Tonie Rocke und ihren Mitarbeitern (USGS National Wildlife Health Center) für die Nutzung der Geräte. Jegliche Verwendung von Handels-, Produkt- oder Firmennamen dient nur zu beschreibenden Zwecken und impliziert keine Billigung durch die US-Regierung.

Tier Arbeit an der USGS National Wildlife Health Center durchgeführt wurde, in Übereinstimmung mit der NIH Office of Laboratory Animal Welfare Richtlinien und unter institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschussprotokoll # EP080716 geführt. Gewebe von Jäger und geerntet Tiere waren Geschenke von der Wisconsin und Michigan Abteilungen für Naturressourcen. 1. Herstellung der Lösung HINWEIS: Die unten aufgeführten Lösungen sind für die Vorbereitung der CER-Assay-Substrat in Abschnitt 2 unten erforderlich. Planen jeder dieser Lösungen von höherer Konzentration Stammlösungen; empfohlene Konzentration für Stammlösungen werden in Klammern nach jeder jeweiligen chemischen Bezeichnung aufgeführt erhalten. Bereiten Sie alle Lösungen frisch auf Untergrundvorbereitung und bei 4 ° C bis zur Verwendung. <ol><li> Für Lysepuffer, bereiten eine Lösung der folgenden in 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5, Stammlösung empfohlen): 100 mM sOdium Chlorid (NaCl, 1 M Stammlösung), 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 Stammlösung), 0,5% NP-40 (10% Stammlösung), 0,5% Desoxycholat (DOC, 10% Stammlösung ). </li><li> Zur Umwandlung Puffer wird eine Lösung aus 0,05% Natriumdodecylsulfat (SDS, 10% ige Stammlösung) und 0,5% Triton X-100 (10% -ige Stammlösung) in 1 phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 10, pH 7,4 Stammlösung). </li><li> Für chaotropen Lösungen, bereiten zwei 3 M Lösungen von Guanidinhydrochlorid (GdnHCl, 8 M Lager) in 1x PBS (10x Stammlösung). Der pH-Wert einer der Lösungen auf 3,5 ± 0,05 unter Verwendung von konzentrierter Salzsäure (HCl). Prüfen, ob der pH-Wert der zweiten Lösung bei pH 7,4 ± 0,05 bleibt und stellen mit konzentrierter HCl oder Natriumhydroxid (NaOH), falls erforderlich. </li></ol> 2. Bereiten Sie CER Assay Substrat-Paare <ol><li> Erhalten gesunde, nicht-TSE-infizierten Hirngewebe von Spezies von Interesse und bereiten eine 10% Gewicht pro Volumen(W / v) Homogenat in Lysepuffer mit einer der folgenden Methoden: Dounce, Kugelmühle oder Mörser und Stößel Homogenisierung. Weiter verfeinern resultierenden Homogenate indem sie einer Spritze und Nadel-Homogenisierung mit Nadeln zunehmender Spur bis Substrat abgesaugt und mit Leichtigkeit durch eine 27G-Spritzennadel ausgestoßen werden. <ol><li> Für Substrate aus Nagetiere und andere kleine Säugetiere hergestellt homogenisieren gesamte Gehirn (s); für Substrate von größeren Säugetieren bereit, verwenden Obex (Hirnstamm) Gewebe-Homogenate vorzubereiten. Bei der Wahl der Menge von Hirnhomogenat vorzubereiten nicht mehr als 50% der Kapazität der Zentrifuge zur Eiweißfällung in Schritt 2.6 verwendet. </li><li> Wenn die Qualität der erworbenen Hirngewebe ist fraglich, bewerten PrP-C-Spiegel durch SDS-PAGE und Immunoblot 16 17 vor der Untergrundvorbereitung. </li></ol></li><li> Teilen Sie Hirnhomogenat in zwei gleiche Volumina in separaten gekennzeichnete Kunststoff konische Röhrchen. Fügen GdnHCl (3 M Lösung in 1 PBS) bei entweder pH 3,5 oder 7,4 zu jedem Röhrchen in einem 1: 1 Volumenverhältnis zu Hirnhomogenisat. </li><li> Überprüfen Sie die pH-Werte der beiden Lösungen. Den pH-Wert der pH 3,5 Substrat auf pH ± 0,05 unter Verwendung von konzentrierter HCl. Sicherstellen, dass der pH-Wert des anderen Substrats bei pH 7,4 ± 0,05 bleibt und der pH wird, falls notwendig, mit HCl oder NaOH nach Bedarf. Vermeiden Schwingen pH-Werte durch sorgfältige Zugabe von Säure oder Base. </li><li> Drehen Lösungen auf einem End-Over-End-Mixer bei Raumtemperatur (RT) für 5 Stunden. </li><li> Auszufällen Protein durch Zugabe vier Volumina Methanol zu den Substratlösungen in jeden konischen Rohr, Wirbel um gut zu mischen, und Inkubation bei -20 ° C für 16-18 Std. </li><li> Sedimentproben durch Zentrifugation bei 13.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Dekantieren Sie vorsichtig und entsorgen Sie die Überstände und lassen Methanol aus den Pellets verdampfen. Verwenden Sie Wattestäbchen, um bei der Aufnahme von Methanol zu der Innenseite des Rohres klammerte unterstützen. Lassen Sie keine Pellets zu über-dry und einmal Methanol nicht mehr sichtbar ist, mit dem nächsten Schritt fortzufahren. </li><li> Resuspendieren Proteinpellets in Konvertierungspuffer. Verwenden einer Menge des Umwandlungspuffers gleich der Menge Hirnhomogenat Ausgangsmaterial in Schritt 2.2 in jedem Röhrchen verteilt. HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Umwandlung Puffer verwendet werden, um Protein-Pellets von beiden pH 3,5 und 7,4 behandelte Substrat Vorbereitungen resuspendieren wird die in Schritt 1.2 (die geringe Reinigungsmittel und einen physiologischen pH-Wert enthält) definiert Lösung. </li><li> Kurz beschallen Substratlösungen in einem cuphorn Ultraschallgerät (10 sec bei ~ 30% der maximalen Leistung), Aliquots in 0,5 bis 1,0 ml-Volumina in der Bezeichnung 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie eine Qualitätskontrolle Immunoblot (Schritt 2.9) aus einem aliquoten Teil von jedem Substrat. Bewahren anderen Aliquots bei -80 ° C bis zum Gebrauch CER-Test (Abschnitt 4) durchzuführen. </li><li> Führen Sie die Qualitätskontrolle auf CER Substrat-Paare vor der Anwendung (Abbildung 2). Diese Schritte sicherzustellen, dass CER Substrate wird provide optimale Ergebnisse bei der Umwandlung Studien. <ol><li> Stellen Sie sicher, vergleichbare Mengen an PrP C in den beiden Substraten. Vergleichen PrP Ebenen in 10-25 ul jedes Substrat durch SDS-PAGE und Immunoblotting 16 17. Wenn Protein-Spiegel in der pH 7,4 und 3,5 Substrate innerhalb von ~ 10% voneinander unterscheiden, sind die Substrat-Paare für die Verwendung in CER Studien geeignet. HINWEIS: Die PrP Immunoblots nicht Beweise für umfangreiche PrP C Abbau zeigen. Das PrP Immunreaktivität sollte vor allem&gt; 20 kDa ist. Bands geringer als dieser Molekülmasse können Abbauprodukte sein. Bandenmuster sollte etwa gleich zwischen Substrat-Paare sein. </li><li> Da die PrP C in beiden Substraten sollte PK empfindlich sein, behandeln 10-25 ul jedes Substrats mit PK in einer Endkonzentration von 100 ug / ml und verdauen Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 1 Stunde in der Thermoschüttler. Beurteilen verbleibende PrP Signals durch SDS-PAGE und Immunoblotting 16 17.Substrate mit PrP res sind nicht für den Einsatz in CER Studien geeignet. </li></ol></li></ol> 3. Bereiten Sie TSE-Agent Seeds <ol><li> Erhalten TSE-infizierten Hirngewebe von Spezies von Interesse und bereiten eine 10% (w / v) Homogenat in 1x PBS, pH 7,4, unter Verwendung der in Schritt 2.1 oben genannten Methoden. HINWEIS: Saatgut kann auch aus anderen TSE-infizierten Geweben außerhalb des zentralen Nervensystems hergestellt werden, aber die Effizienz der Umwandlung der aus dem Gehirn stamm Substraten durch Samen von TSE-infizierten peripheren Geweben abgeleitet wurde noch nicht experimentell in der Literatur untersucht. </li><li> Aliquoten resultierende Homogenat (n) in 100-300 ul-Volumina in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und bei -80 ° C, bis bereit, die CER-Test durchzuführen. </li></ol> 4. CER Assay HINWEIS: Die CER Test umfasst Zugabe einer relativ kleinen Menge von PrP TSE (in der &quot;Samen&quot; zur Verfügung gestellt) von einer Speziesin einen relativen Überschuss von PrP C von einer anderen Spezies, das teilweise an entweder pH 3,5 oder 7,4 denaturiert (in der nicht-infizierten Hirn &quot;Substrat&quot;, zur Verfügung gestellt). Nach einer längeren Schütteln Inkubationszeit wird vorlagengesteuerten Umwandlung von PrP C von PrP TSE in jeder Reaktion durch densitometrische Signal des PrP res übrigen nach PK-Verdau und Immunoblot-Nachweis untersucht. Vergleichen PrP res Ebenen der Substrate zuvor bei pH 3,5 vs. 7,4 denaturiert liefert ein Maß für die Artenbarriere. Eine experimentelle Übersicht dieses Testverfahrens ist in 1 bereitgestellt. <ol><li> Langsam tauen nicht infizierte CER Substrat-Paare (Assay erfordert gleiche Volumina Substrate zuvor sowohl auf pH 3,5 und 7,4 denaturiert) und TSE-infizierte Saatgut-Lösungen, indem sie auf einem Bett aus Eis (ca. 1 Stunde auftauen Zeit). </li><li> Sobald sie vollständig aufgetaut, absaugen und dann vertreiben jedes Substratlösung durch eine27 G Injektionsnadel mehrmals neu zu homogenisieren. Kurz beschallen jeden TSE-infizierten Samen Lösung für 10 s bei ca. 30% der maximalen Leistung. Bewahren Sie alle Lösungen auf Eis während der Vorbereitung Umwandlungsreaktionen. </li><li> Label 5 Einzel geringe Bindungs, dünnwandigen PCR-Röhrchen pro TSE-Erreger getestet. </li><li> Bereiten Umwandlungsreaktionen in diesen Rohren durch Zugabe von 5 ul 10% TSE-infizierten Samen Lösung in 95 &amp; mgr; l von (a) CER Substrat bei pH 7,4 und (b) CER Substrat bei pH 3,5 hergestellt. <ol><li> Für jede Versuchsprobe, bereiten Parallelreaktionen in CER Substrat-Paare zuvor sowohl auf pH 3,5 und 7,4 denaturiert. </li><li> Optimieren Verhältnisse von TSE-Erregern Samen nicht infizierten Gehirnsubstrat durch empirische Bestimmung. Gemeinsame Samen: Substrat Verhältnissen eingesetzt pflegen eine Gesamtreaktionsvolumen von 100 ul und beinhalten 1:99 ul, 2:98 und 5:95 ul ul. Für die meisten Anwendungen, die 5:95 ul Samen: angemessen ist Substrat-Volumen-Verhältnis und ist das, was in th vorgestelltist Protokoll. </li></ol></li><li> Bereiten Sie drei Kontrollproben pro TSE-Erreger wird wie folgt geprüft: (a) mit 5 ul 10% TSE-infizierte Saatgut Lösung auf 95 &amp; mgr; Konvertierungspuffer als Kontrolle für Eingabe PrP res; mit 5 ul Konvertierungspuffer 95 &amp; mgr; l Substrat in (b) pH 3,5 und (c) pH 7,4 als Kontrollen für nicht-spezifische, nicht-gestützten Umwandlung vorbereitet. </li><li> Vortexen Sie jede Probe in seiner geschlossenen PCR-Röhrchen, um Saatgut und Substrat gut mischen. Folgen Sie mit einem momentanen Impuls in einem Low-Speed-Tisch Mini-Zentrifuge, jede Volumen des Reaktionsgemisches in der PCR-Röhrchen Deckel gefangen zu entfernen. </li><li> Tragen Sie die Proben in individuell-markierten PCR-Röhrchen in einer Tischthermoschüttler ausgestattet, um PCR-Röhrchen zu akzeptieren. Schütteln Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 24 Stunden. </li><li> Nach Umschütteln Sarcosyl in einer Endkonzentration von 2% (w / v) und PK auf eine Endkonzentration von 100 ug / ml. Digest Proben bei 1000 Upm bei 37 ° C für 1 Stunde in der Thermoschüttler. NHINWEIS: Die Zugabe von Sarkosyl Proben nach der Konvertierung hilft bei der PK Verdauung von PrP C. Falsch positive Signale in ungeimpften Proben (Schritt 4.5) praktisch durch Zugabe von Sarkosyl eliminiert. </li><li> Hinzufügen SDS-PAGE-Probenpuffer, Wärme Proben auf 95 ° C für 5 Minuten und Lösung verbleibenden PrP res in jeder Probe durch SDS-PAGE 16 gefolgt von Immunoblotting 17. HINWEIS: Nach Zugabe von Probenpuffer und Heizung, Proben können sofort verarbeitet werden oder Proben können bei -20 ° C oder vor dem Immunoblotting gespeichert -80ºC. Alle hier vorgestellten Daten wurden unter Verwendung der Novex NuPAGE Gel und Transfersysteme erzeugt. Einzelne Proben aus dem CER-Test wurden mit Probenpuffer und Reduktionsmittel nach Herstellerangaben behandelt. Die Proben wurden anschließend bei 95 ° C für 5 min erhitzt und 30 ul jeder Probe wurde in eine 12% Bis-Tris Fertiggelen geladen. </li><li> Berechnen des Umwandlungswirkungsgrad (CER) als MaßArtenschranke. Maßnahme Ebenen PrP res densitometrisch 17 und unterteilen die Gesamtdichte des pH 7,4 Probe durch diejenige des pH 3,5 Probe. Mit 100 multipliziert, um einen Prozentsatz zu produzieren. </li><li> Kompilieren von Daten aus unabhängigen experimentellen Wiederholungen, um eine mittlere CER ± Standardabweichung für eine Spezies mit einer bestimmten TSE-Erreger zu generieren. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Bei erfolgreichem Abschluss des Protokolls sollte die Aufmerksamkeit auf PrP-C-Spiegel bei nichtinfizierten zur Untergrundvorbereitung (Schritt 2.1.2) und der Samen-Verhältnis für Umwandlungsreaktionen (Schritt 4.4.2) Substrat verwendet Hirngewebe zu zahlen. Nach unserer Erfahrung können Gehirne für die Verwendung als CER-Substrat nach einem beträchtlichen Zeitraum post mortem entnommen werden, solange PrP C durch Immunoblotting (Abbildung 4) vorhanden ist. In der Tat wurden einige...

Transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE, Prionenerkrankungen) sind eine Gruppe von tödlichen neurodegenerativen Erkrankungen mit verlängerten Inkubationszeiten, die eine Vielzahl von Tieren und Menschen zu beeinflussen. Die mutmaßliche ätiologische Agens von TSE besteht aus einer fehlgefalteten Isomer der Host Prionprotein (PrP), die in der Lage zur Selbstausbreitung von vorlagengesteuerten Umwandlung der normalen zellulären Form PrP (PrP C) in ein infektiöses, krankheitsassoziierte ist umfasste Formular (PrP TSE), die im zentralen Nervensystem Gewebe des infizierten Wirts 1 ansammelt. Infektiöse Prionen übertragen Säugetier Allgemeinen von Host-zu-Host in einem artenspezifisch, was zu dem Begriff der &quot;TSE Artengrenze&quot; Begrenzung Wirtsartwechsels Ereignisse 2 gegeben hat. Die biologischen Determinanten des Prion-Spezies-Barriere sind nicht gut verstanden. Aminosäuresequenz-Ähnlichkeit zwischen der infektiösen PrP TSE und dem Host-PrP C cein stark beeinflussen, ob die Umwandlung erfolgt 3-5, bleibt aber nicht aus, um alle in vivo 6,7 beobachtet Prionenübertragung Ereignisse erklären. Somit hat die Charakterisierung von TSE Artschranken weitgehend von Tierexpositionsstudien herangezogen: Belichten naiven Tieren aus einer bestimmten Art von Prionen von einer anderen und durch Messen der resultierenden Inkubationszeit zu Beginn der Erkrankung und Erkrankungsrate als Indikator für die Übertragungseffizienz. Mäuse, die PrP C von heterologen Spezies werden auch für diese Art von Untersuchung 8 verwendet. Die Kosten im Zusammenhang mit transgenen Maus Produktion und langwierigen Prion Biotests sowie ethischen Überlegungen der Tiernutzung verbunden sind, sind Hindernisse für die experimentelle Untersuchung von TSE Artgrenzen. Bewertung der menschlichen Spezies-Barriere auf TSE vertraut auf Mäuse entwickelt, um menschliche PrP C auszudrücken. Diese Mäuse erfordern langen Inkubationszeiten, um die menschliche TSE oder Modifikationen an t erliegener menschlichen PrP-C-Molekül für eine schnelle Krankheitsbeginn 9. Inkubationszeiten für nicht-menschlichen TSE bei diesen Mäusen kann über die normale Maus Lebensdauer machen Interpretation der negativen Ergebnissen anspruchs erweitern. Nichtmenschliche Primaten sind auch als Stellvertreter für das Studium der menschlichen Spezies Barrieren verwendet worden, aber diese Studien behaftet mit den gleichen Herausforderungen wie andere Arten von Tierversuchen und nicht-menschlichen Primaten nicht genau rekapitulieren Krankheit, wie es in den menschlichen Wirt geht. Tier Biotests bleiben der &quot;Goldstandard&quot; Verfahren zur Messung der Anfälligkeit einer Spezies auf eine TSE, aber die Hürden, Kosten und Ethik dieser Live-Tierstudien Untersuchung Alternativen gezwungen. Eine Reihe von in vitro-Tests, basierend auf der Beurteilung der Umwandlung von Wirts PrP C zu einer Proteinase K (PK) beständigen Zustand (PrP res), wenn sie von PrP TSE ausgesät, wurden entwickelt und verwendet, um zu untersuchen TSE spECIES Barrieren 10-12. Beispiele für in-vitro-Tests sind zellfreie Umwandlung Assays PMCA (PMCA) und die Umwandlungseffizienz-Verhältnis (CER) Assay 10-14. Während keiner dieser Tests in Betracht periphere Faktoren Artgrenzen nach einer natürlichen Infektion beteiligt zu nehmen, kann sinnvoll sein, alle potenziell anfälligen Wirten für TSE zu identifizieren. Hier präsentieren wir das Protokoll für die CER-Test, bei dem zwei denaturiert PrP C Substrate von normalen Hirnhomogenaten abgeleitet sind in Tisch Prion Umwandlungsreaktionen verwendet (Abbildung 1) 13. PrP C in der bei pH 7,4 denaturiert Substrat kann nur an PrP res von PrP TSE umgewandelt werden ausgesät in die Umsetzung in Abwesenheit eines Speziesbarriere 14. Demgegenüber Denaturierung von PrP C in dem anderen Substrat bei pH 3,5 erlaubt es, an PrP res nach Inkubation umgewandelt werdenmit PrP TSE von irgendeiner Spezies und dient als Kontrolle für die Konvertierung. Das Verhältnis der Umwandlung von PrP C zu PrP res in pH 7,4 Substrats relativ gegenüber der pH 3,5 Substrat liefert ein Maß für die Artenbarriere. Wir haben festgestellt, dass die CER-Test prognostiziert bekannten Arten Barrieren der Labormäuse, verschiedene TSE und haben den Test bei den Bemühungen um die Artengrenze zahlreicher Säugetierarten, einschließlich Dickhornschafe, Chronic Wasting Disease (CWD) und anderen TSE 14 vorherzusagen, 15. Ermittler an einer Werkzeug ermöglicht ein schnelles Screening von TSE Artgrenzen oder Bewertung von PrP C to-PrP res Konvertierung wird diese Methode nützlich.

<table><tbody><tr><td>12% Bis-Tris SDS-PAGE Gele</td><td>Life Technologies</td><td>NP0342</td><td></td></tr><tr><td>0,5 mm Zirkonoxid-Kügelchen</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td>Andere Arten von Beads sind ebenfalls wirksam</td></tr><tr><td>Antikörper</td><td>verschiedene Lieferanten</td><td></td><td>Wählen Sie geeignete Primär- und Sekundärantikörper für den Immunoblot-Nachweis von PrPres aus Spezies von Interesse</td></tr><tr><td>Bead-Homogenisator</td><td>Nächster Advance</td><td>BBY24M</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Coulter 369434</td><td>Hohe Geschwindigkeit mit Temperaturregelung</td></tr><tr><td>Konische Rohre</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applikator mit Wattespitze</td><td>Uline</td><td>S-18991</td><td></td></tr><tr><td>Cuphorn-Ultraschallgerät</td><td>Heat Systems-Ultrasonics</td><td>W-380</td><td>Heat Systems-Ultrasonics, Inc. ist jetzt Qsonica, LLC</td></tr><tr><td>Densitometry Softwareprogramm</td><td>UVP</td><td>Vision Works LS Software für Bilderfassung und -analyse</td><td>Andere Programme, wie z. B. NIH ImageJ, funktionieren auch Dounce</td></tr><tr><td>Homogenisator</td><td>Kimble Chase</td><td>885300</td><td></td></tr><tr><td>End-over-End-Mischer</td><td>Labnet International</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-770</td><td>Gefährliche Chemikalie: Augenreizung</td></tr><tr><td>Guanidinhydrochlorid, 8 M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24115</td><td>Gefährliche Chemikalie: akute Toxizität, Hautreizungen, Augenreizungen</td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718</td><td></td></tr><tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>435570</td><td>Gefährliche Chemikalie: stark saure</td></tr><tr><td>Lithiumdodecylsulfat-Probenpuffer, 4x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td>Gefährliche Chemikalie: Haut & Haut Reizung der Atemwege, schwere Augenschäden, brennbarer fester Methanol</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Gefährliche Chemikalie: akute Toxizität, entzündliche Flüssigkeit</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>jeder Marke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-Zentrifuge</td><td>Labnet International</td><td>C1301</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroyl-Sarcosin (Sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldbsp;</td><td>L-5125</td><td>Gefährliche Chemikalie: akute Toxizität, Hautreizung, Augenschädigung</td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Amresco</td><td>M158</td><td>Gefährliche Chemikalie: Hautreizung, Augenschädigung</td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gelsystem Life</td><td>Technologies</td><td>NuPAGE Elektrophoresesystem</td><td>Andere SDS-PAGE-Systeme funktionieren auch</td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen (geringe Bindung)</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Stößel-Homogenisator</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-392-106</td><td></td></tr><tr><td>pH-Messgerät</td><td>Sentron</td><td>SI600</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinyldifluorid-Membran</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>V3021</td><td>Gefährliche Chemikalie: Haut- und Augenreizungen, Sensibilisierung der Atemwege, Organtoxizität</td></tr><tr><td>Reduktionsmittel für SDS-PAGE-Proben, 10x</td><td>Life Technologies</td><td>NP0009</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdesoxycholat</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6750</td><td>Gefährliche Chemikalie: akute Toxizität</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28364</td><td>Gefährliche Chemikalie: akute Toxizität, Hautreizung, Augenschäden, entzündlicher Feststoff</td></tr><tr><td>Natriumhydroxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Gefährliche Chemikalie; starke Basis</td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD Biosciences</td><td>verschiedene</td><td>Verwenden Sie die Spritzengröße, die dem Volumen des zu homogenisierenden Substrats entspricht</td></tr><tr><td>Spritzennadeln</td><td>BD Biosciences</td><td>verschiedene</td><td></td></tr><tr><td>Thermoshaker (PCR-Röhrchenschüttler)</td><td>Hangzhou Alle Sheng Instruments</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1</td><td>Gefährliche Chemikalie: Haut, Auge, Atemwegsreizungen</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Integra Chemical Company</td><td>T756.30.30</td><td>Gefährliche Chemikalie: akute Toxizität, Augenreizung</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr></tbody></table>

die beurteilung transmissible spongiforme enzephalopathie artgrenzen mit ein<em&gt; in-vitro-</em&gt; prion protein-umwandlungsassay

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studien zum Verständnis der Übertragung von transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSEs, Prionenkrankheiten) zwischen Spezies sind insofern eine Herausforderung, als sie typischerweise auf langwierigen und kostspieligen in vivo Tierprovokationsstudien beruhen. Eine Reihe von In-vitro-Assays wurden entwickelt, um die Messung von Prionen-Artenbarrieren zu unterstützen, wodurch der Tierverbrauch reduziert und schnellere Ergebnisse als bei Tier-Bioassays erzielt werden. Hier stellen wir das Protokoll für einen schnellen In-vitro-Prionen-Assay vor, der als Conversion Efficiency Ratio (CER)-Assay bezeichnet wird. In diesem Assay wird zelluläres Prionprotein (PrPC) aus einem nicht infizierten Wirtsgehirn sowohl bei pH 7,4 als auch bei 3,5 denaturiert, um zwei Substrate zu produzieren. Wenn das pH 7,4-Substrat mit einem TSE-Erreger inkubiert wird, wird die Menge an PrPC, die in einen Proteinase K (PK)-resistenten Zustand umgewandelt wird, durch die Speziesbarriere des ursprünglichen Wirts gegenüber dem TSE-Erreger moduliert. Im Gegensatz dazu wird PrPC im Substrat mit einem pH 3,5 von jedem TSE-Wirkstoff falsch gefaltet. Durch den Vergleich der Menge an PK-resistentem Prionprotein in den beiden Substraten kann eine Abschätzung der Speziesbarriere des Wirts vorgenommen werden. Wir zeigen, dass der CER-Assay die bekannten Prionen-Artenbarrieren von Labormäusen korrekt vorhersagt und zeigen als Beispiel einige vorläufige Ergebnisse, die darauf hindeuten, dass Rotluchse (Lynx rufus) anfällig für den Erreger der chronischen Auszehrungskrankheit des Weißwedelhirsches (Odocoileus virginianus) sein könnten.

Der erfolgreiche Einsatz des CER Assay hängt weitgehend von der Qualität der in Umwandlungsreaktionen verwendeten Substrat-Paaren. Aus diesem Grund folgt vor, um CER Substratpaare vorbereiten, eine Qualitätskontrolle Immunoblot sollte (Abbildung 2) durchgeführt werden. Für beide Substrate Assay 10-25 ul durch Immunoblotting. PrP C sollte in jedem Substrat leicht nachweisbar sein und PrP C Ebenen müssen etwa gleich zwischen den beiden. Immunreaktivität wird vor allem sichtbar oberha...

Die Messung der Barriere für die Übertragung von Prionenkrankheiten zwischen den Spezies ist eine Herausforderung und beinhaltet typischerweise tierische Herausforderungen oder biochemische Assays. Hier präsentieren wir einen in vitro Prionenprotein-Umwandlungsassay mit der Fähigkeit, Speziesbarrieren vorherzusagen.

Die Beurteilung Transmissible Spongiforme Enzephalopathie Artgrenzen mit ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Prion Protein-Umwandlungsassay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Speziesbarriere von übertragbaren spongiformen Enzephalopathien, bekannt als TSE, gegenüber einer bestimmten Spezies zu bewerten, ohne lebende Tiere infizieren zu müssen. Dies wird erreicht, indem zunächst zwei Umwandlungs-Assay-Substrate für die Verwendung in einem In-vitro-Assay vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, diese Substrate mit den TSE-Agenzien zu inkubieren, die Sie als nächstes testen möchten.Nach der Verdauung mit Proteinase K werden die Proben einer SDS-Page und einer Immunschleuderung unterzogen. Im letzten Schritt wird die Menge an proteinase-K-resistentem Prion-Protein in jedem Substrat mittels Durchflusszytometrie gemessen und diese Mengen durch Berechnung eines Umwandlungs-Effizienz-Verhältnisses (CER) verglichen. Letztendlich liefert das CER ein Maß für die Speziesbarriere des getesteten TSE gegenüber der Wirtsart, aus der das Substrat hergestellt wurde.Die Vorteile dieses Assays umfassen seine geringen Kosten, den kurzen experimentellen Zeitrahmen und den Ersatz lebender Tiere durch Gewebeproben. Obwohl diese Methode besonders gut geeignet ist, Einblicke in die Artenbarrieren von Prione

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Hier beschreiben wir eine neuartige Assays für die Überwachung der Prion-Aufnahme und-handel durch Immunzellen sofort nach intraperitonealer Inokulation durch Reinigung und Fluoreszenzmarkierung aggregierte Prion Stangen aus infizierten Gehirn Material dann die Überwachung ihrer Aufnahme und Bewegung an der Injektionsstelle und Charakterisierung der Zellen Vermittlung dieser Ereignisse.

Überwachung Immunzellen Trafficking Fluorescent Prion Rods Stunden nach intraperitonealer Infektion

Proteinfehlfaltung zyklischen Amplifikation (PMCA) ist ein in vitro-Assay zur Untersuchung von Prionen Umwandlung und Dehnung und Artgrenzen. Es kann auch als ein Prion-Nachweis-Assay verwendet werden.

Proteinfehlfaltungen Cyclic Amplification von Prionen

Inkubieren Sie mit einem proteolytischen Enzym, um die normalen Prionen zu verdauen, wobei die resistenten Aggregate intakt bleiben.

Nachweis von fehlgefalteten Prionenproteinaggregaten im Hirngewebe von Mäusen mittels Western Blotting

Aasfresser haben Potenzial, infektiöse Prionen übertragbaren spongiformen Enzephalopathie in ihren Kot zu krankheitsfreien Gebieten transloziert. Wir detailliert Methoden verwendet werden, um festzustellen, ob der Maus-adaptierten Scrapie-Prionen bleiben nach dem Durchgang aber den Verdauungstrakt der amerikanischen Krähen (Corvus brachyrhynchos), einer gemeinsamen Verbraucher toter Tiere ansteckend.

Verfahren zur Identifizierung von Infektions Prionen Nach Passage durch das Verdauungssystem von eine Vogelart

Die Prionen-ähnliche Vermehrung von Proteinaggregaten hat sich in letzter Zeit als an vielen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu beschreiben, wie der Fadenwurm C. elegans als Modellsystem zur Überwachung der Proteinausbreitung und zur Untersuchung prionenähnlicher Phänomene verwendet werden kann.

Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus<em&gt; C. elegans</em

Dieses Protokoll beschreibt eine Hochdurchsatz-Methodik, funktionell für die Protein-basierten Vererbung in S. CerevisiaeBildschirm.

Hochdurchsatz-Screening für die Protein-basierten Vererbung in S. cerevisiae

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine einfache, schnelle und effiziente Prion-Verstärkung-Technik, die Echtzeit-Beben-induzierte (RT-QuIC) Konvertierungsmethode beschreiben.

Echtzeit-Beben-induzierte Umwandlung Test zur Erkennung von CWD Prionen in Fäkalien

Die Immunmarkierung abnormaler Prionproteine unter Verwendung immunhistochemischer Protokolle erfordert spezifische Methoden zur Herstellung von Proben- und Anti-PrP-Antikörpern. Das vorliegende Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte bei der Epitop-Demaskierung, um eine korrekte PrP-Immunmarkierung sicherzustellen und die unspezifische Hintergrundfärbung zu minimieren. Dieser Ansatz berücksichtigt auch Biosicherheitsmaßnahmen bei der Durchführung immunhistochemischer Studien mit den...

Nachweis von abnormalem Prionprotein durch Immunhistochemie

Es fehlt eine Methode, um häufig genutzte Bereiche in Laborumgebungen auf Prionenkontamination und eine effektive Dekontamination zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll bietet wichtige Grundlagen für die Implementierung eines Prionen-Sicherheits-Wischtests im Labor, der leicht an die individuellen Bedürfnisse bestimmter Labore angepasst werden kann.

Prion Safety Laboratory Wischtest

Wir beschreiben ein Rattenmodell der Posttraumatischen Belastungsstörung (PTSD), die die anhaltenden Veränderungen im neuroendokrinen Funktion und die verzögerte langfristige, übertriebene Angstreaktion, die charakteristisch für PTBS-Patienten zeigt. Das Tiermodell und hier beschriebenen Methoden sind nützlich zum Korrelieren Biomarkern in Gehirnkernen, die mechanistische sind, aber nicht bei Patienten gemessen werden, wobei Biomarkern in peripheren weißen Blutzellen, welches kann.

Biomarker in einem Tiermodell für die Aufdeckung Neural, hämatologischen und Behavioral Korrelate der PTSD

Erfahren Sie, wie ein In-vitro-Prion-Protein-Umwandlungsassay die Artgrenze von übertragbaren spongiformen Enzephalopathien bewertet. Diese Methode ersetzt Tierversuche durch Gewebeproben und nutzt die Konversionseffizienzrate zur Risikobewertung.

Die Beurteilung Transmissible Spongiforme Enzephalopathie Artgrenzen mit ein

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