Die Beurteilung Transmissible Spongiforme Enzephalopathie Artgrenzen mit ein

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Speziesbarriere von übertragbaren spongiformen Enzephalopathien, bekannt als TSE, gegenüber einer bestimmten Spezies zu bewerten, ohne lebende Tiere infizieren zu müssen. Dies wird erreicht, indem zunächst zwei Umwandlungs-Assay-Substrate für die Verwendung in einem In-vitro-Assay vorbereitet werden. Der zweite Schritt besteht darin, diese Substrate mit den TSE-Agenzien zu inkubieren, die Sie als nächstes testen möchten.

Nach der Verdauung mit Proteinase K werden die Proben einer SDS-Page und einer Immunschleuderung unterzogen. Im letzten Schritt wird die Menge an proteinase-K-resistentem Prion-Protein in jedem Substrat mittels Durchflusszytometrie gemessen und diese Mengen durch Berechnung eines Umwandlungs-Effizienz-Verhältnisses (CER) verglichen. Letztendlich liefert das CER ein Maß für die Speziesbarriere des getesteten TSE gegenüber der Wirtsart, aus der das Substrat hergestellt wurde.

Die Vorteile dieses Assays umfassen seine geringen Kosten, den kurzen experimentellen Zeitrahmen und den Ersatz lebender Tiere durch Gewebeproben. Obwohl diese Methode besonders gut geeignet ist, Einblicke in die Artenbarrieren von Prionerkrankungen bei Wildtieren zu gewinnen, kann sie auch auf jede andere interessierende Art angewendet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit der Substratpräparation, der Qualitätskontrolle und der Standardisierung.

Nachdem gesundes, nicht infiziertes Gehirngewebe der interessierenden Art gewonnen wurde, stellen Sie ein 10 % (Gewicht pro Volumen) Homogenat in Lysepuffer unter Verwendung einer Kugelmühle oder eines Mörser- und Pistill-Systems her. Anschließend verfeinern Sie die Homogenate weiter, indem Sie sie einer Homogenisierung mittels Spritze und Nadel unterziehen, wobei Nadeln mit zunehmendem Durchmesser verwendet werden, bis das Substrat mühelos durch eine 27-Gauge-Spritzennadel angesaugt und ausgestoßen werden kann. Danach teilen Sie das Gehirnhomogenat in zwei gleiche Volumina auf separate, beschriftete konische Plastikröhrchen auf und geben dreifache molare Guanidinhydrochloridlösung in XPBS entweder bei pH 3,5 oder pH 7,4 im Verhältnis 1:1 (Volumen pro Volumen) zum Gehirnhomogenat in jedes Röhrchen.

Überprüfen Sie nun die pH-Werte der Substratlösungen und verwenden Sie gegebenenfalls konzentrierte Salzsäure oder Natriumhydroxid, um sicherzustellen, dass der pH-Wert jedes Substrats innerhalb von ± 0,05 des Ziel-pH-Werts bleibt. Schwenken Sie die Lösungen fünf Stunden lang bei Raumtemperatur in einem End-over-End-Mischer. Fällen Sie anschließend das Protein, indem Sie vier Volumina Methanol zu den Substratlösungen in jedem kegelförmigen Vortex hinzufügen, gut vermischen und 16 bis 18 Stunden bei minus 20 Grad Celsius inkubieren.

Nach der Inkubation pelletieren Sie die Proben durch Zentrifugation bei 13.000 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Dekantieren und entsorgen Sie anschließend vorsichtig die Überstände S und lassen Sie das Methanol von den Pellets verdunsten. Verwenden Sie abgerundete Watteapplikatoren, um dabei zu helfen, das an der Innenseite des Röhrchens haftende Methanol aufzusaugen.

Lassen Sie die Pellets nicht zu stark austrocknen. Fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort, sobald kein Methanol mehr sichtbar ist. Verwenden Sie eine Menge Konvertierungspuffer, die der Menge des ursprünglichen Gehirnhomogenats entspricht, um die Proteinpellets aufzususpenderen. Nach der Resuspension sonizieren Sie die Substratlösungen kurz für 10 Sekunden.

Sonizieren Sie in einem Trichterhorn bei etwa 30 % der maximalen Leistung. Anschließend portionsweise die Lösungen in beschriftete 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu je 0,5 bis einem Milliliter abfüllen, da das zelluläre Prionprotein in beiden Substraten proteinase-K-empfindlich sein sollte. Jedes Substrat mit 10 bis 25 Mikrolitern Proteinase K bei einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter behandeln und die Proben eine Stunde lang bei 1000 U/min und 37 Grad Celsius im Thermomischer verdauen. Die proteinase-K-verdauten Substrate sowie 10 bis 25 Mikroliter jedes undigested Substrats auftragen.

Auf eine SDS-Seite, Gel und Immuno-Block mit einem Prion-Protein-spezifischen Antikörper auftragen, um das Wirtsprionprotein, die Proteinase-K-Resistenz und die Mengen an undigestedem Protein zu bewerten. Dieses Bild zeigt die Ergebnisse der Immuno-Blot-Analyse. Die ersten beiden Gelen enthalten die undigesteden Substrate, und die beiden Gelen auf der rechten Seite enthalten das mit Proteinase K digestede Substrat.

Wenn die Proteinspiegel in den Substraten mit pH 7,4 und 3,5 etwa innerhalb von 10 % zueinander liegen und nicht resistent gegen Proteinase K sind, eignen sich die Substratpaare für CER-Studien; lagern Sie andere Aliquote bei minus 80 Grad Celsius, bis der CER-Assay durchgeführt wird. TSE-Agenzien sollten unter Beachtung geeigneter Biosicherheitsmaßnahmen und gemäß den institutionellen Richtlinien gehandhabt werden. Nachdem Sie Gehirngewebe, das mit TSE infiziert ist, von der gewünschten Spezies erhalten haben, stellen Sie ein 10 %iges Gewicht-zu-Volumen-Homogenat in 1× PBS bei pH 7,4 her, wobei Sie die Homogenisierungsmethode verwenden, die zuvor bereits für die Herstellung der Substratpaare angewandt wurde.

Geben Sie die resultierenden Homogenate in Mengen von 100 bis 300 Mikroliter in 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius, bis der CER-Assay durchgeführt wird. Zum Beginn tauen Sie langsam gleiche Mengen des pH 3,5- und des pH 7,4-CER-Substrats aus nicht infiziertem Gewebe sowie der mit TSE infizierten Saamlösungen auf, indem Sie diese etwa eine Stunde lang auf eine Eisunterlage stellen. Nach dem Auftauen halten Sie die Lösungen auf Eis und homogenisieren sie erneut, indem Sie jede Substratlösung mehrmals durch eine 27-Gauge-Spritzennadel aufziehen und wieder ausstoßen.

Danach jede mit TSE infizierte Lösung kurz 10 Sekunden lang bei etwa 30 % der maximalen Leistung beschallen. Als Nächstes bereiten Sie die Umsetzungsreaktionen in beschrifteten Low-Bindung-Dünnwand-PCR-Röhrchen vor, indem Sie 95 Mikroliter CER-Substrat, das bei pH 7,4 hergestellt wurde, dupliziert in zwei der Röhrchen pipettieren und 95 Mikroliter CER-Substrat, das bei pH 3,5 hergestellt wurde, dupliziert in zwei weitere Röhrchen geben.

Fügen Sie dann fünf Mikroliter einer 10 %igen TSE-infizierten Samenlösung einem Gefäß mit jeweils dem Substrat pH 7,4 und 3,5 hinzu. Parallel dazu geben Sie fünf Mikroliter Konvertierungspuffer in das jeweils andere Gefäß mit dem Substrat pH 7,4 und 3,5, um eine unspezifische, nichtvorlagenabhängige Umwandlung auszuschließen. Bereiten Sie außerdem eine Kontrolle für das proteinase-K-resistente Prionprotein als Input vor.

Fügen Sie für jeden zu testenden TSE-Erreger fünf Mikroliter einer 10 %igen TSE-infizierten Samenlösung zu 95 Mikrolitern Konvertierungspuffer als Kontrolle hinzu. Vortexen Sie kurzzeitig jede Probe in ihrem geschlossenen PCR-Röhrchen, Zeh und Substrat. Danach folgen Sie mit einem kurzen Impuls in einer kleinen Tischzentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit, um jegliche Menge der Reaktionsmischung, die im Deckel des PCR-Röhrchens eingeschlossen ist, nach unten zu befördern.

Füllen Sie die Röhrchen in einen Laborschüttler, der für PCR-Röhrchen geeignet ist, und schütteln Sie die Proben am folgenden Tag 24 Stunden lang bei 1000 U/min und 37 Grad Celsius. Geben Sie anschließend Sarco-Zellen auf eine Endkonzentration von 2 % Gewicht pro Volumen und Proteinase K auf eine Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter zu und verdauen Sie die Proben eine Stunde lang bei 1000 U/min und 37 Grad Celsius im Thermo-Schüttler. Fügen Sie SDS-PAGE-Probenpuffer hinzu, erhitzen Sie die Proben auf 95 Grad Celsius für 10 Minuten und trennen Sie das verbleibende Pronase-K-resistente Prionprotein in jeder Probe mittels SDS-PAGE, gefolgt von der Immundetektion wie zuvor. Berechnen Sie abschließend das Umwandlungs-Effizienz-Verhältnis als Maß für die Speziesbarriere.

Entsprechend den Anweisungen im schriftlichen Protokoll wurde das CER-Assay-Substrat für Mäuse, das entweder bei pH 7,4 oder pH 3,5 hergestellt wurde, mit RML-Maus-adaptiertem Scrapie, häuslichen Schafen, klassischem Scrapie, bei weißschwanzigen Hirschen auftretender chronischer Abmagerungskrankheit oder dem 263K-Stamm von hamster-adaptiertem Scrapie inkubiert. Im CER-Assay enthielten die als „keine“ gekennzeichneten Kontrollproben eine gleich große Menge infektiösen Agens, und es wurden keine Maus-Substratproben auf das Vorhandensein proteinase-K-resistenten Prionproteins mittels Immunblot mit dem monoklonalen Antikörper SAF 83 analysiert.

Die rohen Tric-Werte für jede Probe werden unterhalb jeder Lane angezeigt, die das resultierende Proteinase-K-resistente Prionprotein ergab. Die Mengen an proteinase-K-resistentem Prionprotein variierten je nach Maus-Substrat, das bei pH 7,4 denaturiert und mit verschiedenen TSE-Agenzien beladen wurde. Obwohl proteinase-K-resistentes Prionprotein in allen Substraten nachweisbar war, die bei pH 3,5 denaturiert und mit einem TSE-Agenz beladen wurden, zeigt dieses Balkendiagramm die durchschnittlichen Verhältnisse plus oder minus Standardabweichung zwischen den Maus-Substraten bei pH 7,4 und pH 3,5 für jedes infektiöse Agenz basierend auf mindestens drei unabhängigen Testdurchläufen.

Kleinbuchstaben bezeichnen statistisch homogene Teilmengen, die mittels Varianzanalyse mit einem p-Wert von weniger als 0,05 bestimmt wurden. Mit der Methode der kleinsten signifikanten Differenzen nach Tookie Kramer kann diese Technik, einmal beherrscht, in weniger als 48 Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Der CER-Assay kann als erste Einschätzung der Existenz einer TSE-Artenbarriere verwendet werden, die weitere Studien an lebenden Tieren rechtfertigen oder überflüssig machen könnte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Substrate herstellt, Umsetzungsreaktionen einrichtet und Umsetzungseffizienzraten berechnet, um Artbarrieren zu bewerten.